Optimasi Hipotermi Terpicu NIR dengan Nanopartikel Cs0.33WO3 untuk Pengobatan Kanker Hati HepG2

Abstrak

Hipotermi adalah salah satu metode paling ramah pasien untuk menyembuhkan penyakit kanker karena invasivitasnya yang rendah, efek samping dan toksisitas yang minimal, serta penerapan yang mudah, yang memicu pengembangan metode terapeutik baru seperti sistem pemberian obat yang dipicu termal secara foto. Penelitian ini menginterogasi variabel efek fototermal dari nanoparticle (NP) Cs_0.33WO₃, durasi iradiasi, kepadatan daya optik, dan konsentrasi NP, pada sel baris kanker hati HepG2 in vitro, guna merumuskan dosis termal yang dipicu inframerah dekat (NIR). Secara ekspresi, NP dengan ukuran fitur partikel 120 nm disintesis melalui serangkaian proses reaksi oksidasi–reduksi (REDOX), pemanasan termal, dan penggerusan basah, dan karakterisasi fisik, komposisi, optik, serta properti fototermal selanjutnya diperiksa menggunakan pencaharan cahaya dinamis (DLS), spektroskopi X-ray dispersif energi (EDS), mikroskop elektron semar dan transmisi (SEM dan TEM), difraksi X-ray (XRD) dan fotospektroskopi inframerah dekat-terlihan (VIS–NIR). Toksisitas NP dan parameter iradasinya diperoleh untuk sel HepG2. Dengan menginkubasi sel dengan NP, status endositosis diverifikasi, dan ketergantungan tingkat kelangsungan sel pada parameter variabel dosis fototermal ditentukan sambil mempertahankan suhu medium wadah budaya sel di suhu tubuh manusia sekitar 36,5 °C.

Pendahuluan

Secara global, pada tahun 2018 saja, penyakit kanker yang liar telah merampas sekitar 10 juta nyawa dan menambahkan estimasi 18 juta kasus baru [1]. Sampai sekarang, meski kemoterapi, radiasi, pengangkatan bedah, atau kombinasi yang disesuaikan dari ketiga metode ini telah meningkatkan tingkat kelangsungan hidup 5 tahun sedikit lebih dari 40% dari pasien kanker yang dirawat [2, 3], sifat beracun dan merusak dari kimia dan bombardemen ionik secara tak terhindarkan menyebabkan banyak efek samping seperti kerontokan rambut, kardiotoksisitas, infertilitas, abnormalitas kromosom, dan banyak lagi [4, 5]. Konsekuensi yang mematikan ini telah sangat mendorong pengembangan obat terapeutik yang ramah pasien termasuk gabungan NP.

Teknologi nano berdasarkan sistem bahan, struktur, bentuk, dan stoikiometri atom pada skala ukuran di bawah 100 nm menghasilkan sifat kimia, fisik, dan biokimia yang tak terdahulu yang ditingkatkan oleh fenomena kuantisasi dan telah ditemukan aplikasi preklinis dan in vitro di banyak cabang ilmu kedokteran [6, 7]. Meskipun kelemahan kemoterapi, NP yang berfungsi sebagai pembawa obat meningkatkan selektivitas pelepasan obat pada tumor yang sakit, memfasilitasi penyerapan obat oleh sel tumor, dan sangat mengurangi toksisitas kumulatif di jaringan sehat [8, 9]. Selain itu, kualitas citra yang dihasilkan oleh serangkaian modalitas citra berbasis NP sangat ditingkatkan dengan sensitivitas yang lebih tinggi, resolusi spasial yang lebih halus, dan penetrasi kedalaman yang lebih baik untuk mengungkap distribusi bio, memantau penyerapan obat, melokalkan tumor, dan mengevaluasi efektivitas pengobatan [10]. Selain fungsi diagnostik, NP saat dimanfaatkan dengan properti fisik inherent, seperti ablasi radiofrekuensi (RF) atau hipotermi yang dihasilkan secara fototermal, dapat lebih lanjut menginduksi kerusakan pada lokasi yang diinginkan dengan efisiensi yang ditingkatkan [11,12,13], di mana yang kedua biasanya lebih disukai dari pada pemberian dosis yang spesifik lokasi, tingkat nyeri yang rendah, efek samping yang rendah, dan risiko pembakaran jaringan yang jauh lebih kecil.

Sampai sekarang, sistem bahan NP yang mampu menginduksi hipotermi saat diiradiasi foto termasuk emas (Au), cesium tungstate (CsWO₃), oksida besi, sulfida tembaga, grafin dan tabung karbon dan telah menunjukkan keberlakuan untuk menginduksi kerusaka letharg pada sel kanker dengan meningkatkan suhu ekstraseluler atau intrakeluler secara in situ [14,15,16,17,18]. Seperti ablasi RF yang ditingkatkan NP, tingkat kepadatan daya insiden dari sumber fotonik adalah masalah kritis untuk keamanan klinis dan kenyamanan pasien [11], dan telah terbukti bahwa batas paparan maksimal untuk kulit manusia pada rentang panjang gelombang VIS dan NIR antara 400 hingga 980 nm adalah dari 0,2 hingga 0,726 W/cm² menurut Komisi Internasional terhadap Radiasi Non-Ionisasi (ICNIRP) yang diterbitkan pada 2013 [19]. Meskipun demikian, sebagian besar kepadatan daya optik yang dilaporkan dari studi sel kanker in vitro sebelumnya sangat melebihi batas keamanan untuk jaringan kulit, yang dapat menjadi masalah serius ketika mengobati jaringan biologis internal dengan ambang paparan foto yang rendah untuk kerentanan. Sebagai contoh, kepadatan daya optik NIR dari NP emas (Au) yang menunjukkan pemusnahan yang efektif sel kanker berkisar dari 2 hingga 80 W/cm² saat diiradiasi selama tidak lebih dari 10 menit [13, 14, 20,21,22]. Sebagai contoh lain, serangkaian sistem bahan lainnya seperti grafin oksida [18], besi platinum (FePt) [23] dan kristal nano NaYF₄:Yb,Er [24] memerlukan tidak kurang dari 150 mW/cm² untuk penerapan instrumen.

Sebagai bahan yang relatif kurang dieksplorasi untuk eksperimen in vitro, beberapa studi melaporkan pemusnahan sel kanker rahim (Hela) oleh NP CsWO₃ yang diiradiasi NIR dengan setidaknya 0,72 W/cm² [15, 25, 26] yang berada di dekat batas paparan kulit untuk panjang gelombang NIR yang ditetapkan oleh ICNRP dan dapat menyebabkan efek merusak pada jaringan sehat di bawah durasi paparan yang panjang [19]. Selain itu, suhu medium budaya yang dihasilkan oleh kombinasi dosis perawatan konsentrasi NP, durasi paparan foto, dan intensitas optik, dalam studi-studi sebelumnya, sangat melebihi 40 °C yang tidak dapat ditahan oleh sel manusia sehat, dan tingkat kematian sel kanker tidak digambarkan secara rinci.

NP CsWO₃ sangat penyerap pada rentang panjang gelombang NIR dari 800 nm hingga 2400 nm [27] dan secara fungsional cocok untuk aplikasi biomedis. Meskipun keberhasilannya yang luar biasa dalam memusnahkan sel kanker telah terbukti, toksisitasnya masih besar tidak diketahui dan penyediaan rumus dosis konsentrasi NP dengan toksisitas rendah, durasi iradiasi yang pendek, dan kepadatan daya optik dalam batas paparan foto yang aman untuk jaringan kulit masih belum ada.

Studi penelitian ini berusaya menilai in vitro kelayakan memusnahkan sel kanker hati HepG2 yang dibudidayakan dalam petri dish dengan diameter 5,2 cm menggunakan konsentrasi NP non-sitotoksik dan kepadatan daya optik yang berada dalam batas paparan foto kulit sambil mempertahankan suhu medium budaya sel pada suhu tubuh manusia normal 36,5 °C. Secara rinci, NP Cs_0.33WO₃ dengan ukuran fitur rata-rata yang berpusat sekitar 120 nm disintesis menggunakan serangkaian proses redox, pemanasan termal dan penggerusan basah, dan dikarakterisikan dengan morfologi permukaan, kristalin, serta properti optik dan fototermal seiring waktu. Selain itu, efek fototermal dari parameter dosis yang bervariasi, durasi iradiasi, konsentrasi NP, dan kepadatan daya optik iradiasi NIR yang beroperasi pada panjang gelombang sentral 980 nm, pada tingkat kelangsungan hidup sel kanker hati HepG2, telah diperiksa dan diadili untuk merumuskan kombinasi dosis perawatan yang aman.

Metode

Dalam penelitian ini, baris sel kanker hati HepG2 generasi ke-102 yang berasal dari tumor primer manusia dibudidayakan sebagai model eksperimental untuk mengevaluasi toksisitas yang ditimbulkan oleh NP Cs_0.33WO₃ buatan rumah yang diiradiasi NIR dan mengevaluasi efektivitas terapeutik dari berbagai dosis termal yang berada dalam batas aman untuk paparan kulit dan pada konsentrasi NP non-toksik.

Sintesis NP Cs_0.33WO₃

Panel kiri Gambar 1 mengilustrasikan diagram alur prosedur sintesis untuk bahan NP oksida tungsten cesium (Cs_0.33WO₃). Secara singkat, bahan kimia prekursor, ((NH₄)₂WO₄) (Alfa Aesar, kemurnian 99,9%) dan CsCl (Alfa Aesar, kemurnian 99,9%) dilarutkan secara terpisah dalam 100 ml air DI dan kemudian dicampur pada 25 °C di bawah pengacakan konstan 250 putaran per menit (rpm) menggunakan pengacak magnetik selama satu jam (hr). Setelah pengacakan selesai, suhu beaker yang mengandung larutan campuran disesuaikan menjadi 180 °C dan dipanaskan hingga kandungan air dalam larutan sepenuhnya menguap. Bubuk putih yang dihasilkan adalah prekursor akhir dari bahan Cs_0.33WO3. Dengan pendingin dihidupkan, peruncing kuarsa yang mengandung bubuk prekursor dimuat ke tengah tabung pemanas suhu tinggi, dan tekanan di dalam tabung pemanas diturunkan menjadi 0,08 torr. Kemudian, prekursor dipanaskan pada suhu 500 °C sambil memperkenalkan aliran campuran gas, H₂ dan N₂, dalam rasio 90 hingga 10 standar sentimeter kubik per menit (SCCM) untuk memfasilitasi reaksi redox. Setelah 1 jam, inlet gas H₂ dimatikan, aliran gas N₂ disesuaikan menjadi 100 SCCM, dan suhu pemanas dinaikkan ke 800 °C untuk pemanasan termal selama satu jam. Setelah proses selesai, pendingin dan pemanas yang dikontrol suhu dimatikan, dan peruncing kuarsa didinginkan hingga mencapai suhu ruangan dan dikeluarkan dari tabung pemanas. Bubuk biru tua yang dihasilkan dari peruncing kuarsa adalah bubuk Cs_0.33WO₃ berukuran mikron (µ). Untuk mengecilkan ukuran fitur granulat bubuk lebih lanjut, 150 g larutan campuran yang terdiri dari 15 g bubuk µ, 3,8 g agen dispersan berbasis kopolimer untuk mencegah agregasi partikel, 10 μl agen anti-gelembung dan air D.I disiapkan, dituangkan ke dalam mangkuk sampel yang berisi 600 g zarbut zirconia dan dipasang di ruang peralatan nanogrinder (Justnanotech Co., Taiwan). Dengan kecepatan dan suhu diatur ke 2400 putaran per menit (RPM) dan 15 °C, NP dihasilkan dengan menggerus bubuk µ dengan zarbut ZrO₂ 0,1 mm selama 4 jam, dan dengan zarbut ZrO₂ 0,05 mm selama 4 jam lagi. Total durasi setiap proses penggerusan tidak melebihi 4 jam untuk menghindari viskositas cairan berlebihan serta perubahan ukuran fisik yang tidak teratur dari bahan. Larutan akhir setelah proses penggerusan disaring melalui saringan pori 0,22-μm untuk semua karakterisasi dan eksperimen selanjutnya. Versi fluoresensi NP Cs_0.33WO₃ (fNPs) dibuat menggunakan protokol berikut. Larutan yang terdiri dari 2 ml fluorescein dengan konsentrasi 28 mg/ml dan 2 ml larutan NP Cs_0.33WO₃ dengan 1,5 mg/ml disiapkan dalam beaker dan ditempatkan dalam mangkuk penggetar ultrasonik selama 15 menit. Selanjutnya, larutan NP dan dispersan dicampur dalam rasio 1:1,25 dan mengalami getar ultrasonik selama 15 menit. Larutan yang dihasilkan kemudian dicuci dengan air D.I. dan difusigesenter pada 10.000 rpm selama 15 menit. dan diulang dua kali sebelum digunakan.

Optimasi Hipotermi Terpicu NIR dengan Nanopartikel Cs0.33WO3 untuk Pengobatan Kanker Hati HepG2

Karakterisasi Bahan

Selanjutnya, karakterisasi NP Cs_0.33WO₃ termasuk ukuran fitur statistik NP, struktur kristal, morfologi struktur, bentuk kontur, dan foto-absorpansi VIS–NIR dilakukan menggunakan analisis potensi zeta (ZS90, Malvern, UK), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Jerman), SEM (SU-5000, Hitachi, Jepang) bersama dengan spektrometri energi dispersif bawaan (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Jepang), pencaharan cahaya dinamis (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, AS), spektrometer UV–VIS–NIR (V-750, Jasco, Jepang), masing-masing. Spektra XRD diperoleh dengan memindai sinar X pada sampel dalam rentang sudut dari 20° hingga 80° dengan laju pemindaian 4° per menit. Sinyal difraksi yang bergantung pada sudut pemindaian dari sampel ditentukan dan dibandingkan dengan spektrum XRD standar Cs_0.32WO₃ dari kartu Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) No. 83-1334. Untuk mengonfirmasi ketergantungan waktu pada properti fototermal NP, perangkat eksperimental sederhana yang terdiri dari laser NIR dengan panjang gelombang 980 nm dan sonda pengukuran suhu disiapkan untuk meneliti kondisi suhu yang dihasilkan oleh larutan yang diiradiasi NIR. Larutan yang diperiksa termasuk larutan NP yang dicampur dengan air DI dan campuran larutan NP dalam medium budaya sel. Diameter sinar optik untuk sampel dalam petri dish diperluas untuk mencakup seluruh permukaan petri dish, menghasilkan 0,05 W/cm² dalam estimasi kepadatan daya optik, atau tetap utuh pada 2 W/cm². Pengaturan optik yang ditampilkan pada panel kanan Gambar 1 digunakan untuk melakukan iradiasi NIR. Di tengah sistem optik adalah sinar laser NIR yang diarahkan ke lensa bi-konkav yang memperluas diameter sinar dari 4 mm menjadi 5,2 cm, setara dengan diameter permukaan petri dish yang ditempatkan pada panci panas yang diatur ke 36,8 °C, yang merupakan suhu fisiologis untuk pertumbuhan sel; juga, petri dish dikelilingi oleh penutup silinder plastik untuk membantu menyeimbangkan suhu lingkungan dan medium. File tambahan 1: Gambar S1 menggambarkan pemetaan intensitas optik sinar laser NIR yang diukur di kelurahan lubang keluar sinar yang ditunjukkan oleh panah merah di samping sinar laser pada Gambar 1. Profil sinar menyajikan distribusi 3D dari intensitas optik dan memverifikasi keberaturan medan cahaya di seluruh lubang petri dish.

Uji Sitotoksisitas dan Fototermal

Untuk memulai siklus budaya sel, 500 ml larutan medium yang terdiri dari 440 ml campuran nutrisi Ham’s F-12 dan medium esensial Dulbecco yang dimodifikasi (HDMEM), 50 ml serum bayi sapi (FBS), 5 ml L-glutamin dan 5 ml P/S (Penicillin–Streptomycin), yang telah sterilisasi dengan saringan jaring dengan ukuran pori 0,22 μm, disiapkan. Petri dish yang berisi sel, berdiameter 10 cm atau 5,2 cm, diisi dengan 8 ml dan 2 ml medium masing-masing digunakan untuk budaya primer dan sub-kultur dan diinkubasi dalam inkubator yang dikondisikan dengan 5% CO₂ dan pada suhu 37 °C. Pengamatan pertumbuhan sel dan pemutaran medium budaya dilakukan sekali dalam dua hari.

Untuk mendapatkan tingkat kelangsungan hidup untuk kasus uji sel yang meliputi (1) kontrol tanpa masukan eksternal, (2) hanya iradiasi NIR, (3) inkubasi dengan NP, dan (4) inkubasi dengan NP disertai iradiasi NIR setelahnya, medium budaya dalam wadah budaya dihisap, dan 0,4 ml trypsin ditambahkan ke wadah budaya dan ditempatkan dalam inkubator selama sekitar 10 menit. Setelah pemisahan sel dari dinding wadah dikonfirmasi, 10 μl medium yang berisi sel diambil dari wadah budaya dan ditambahkan ke 10 μl larutan trypan blue dalam tabung sentrifuge mikro, dan pengesanan nanoparticle sisa yang terapung dilakukan melalui beberapa kali pencuci dengan larutan buffer fosfat (PBS). Setelah itu, perhitungan sel dilakukan dengan mengisi papan perhitungan dengan 10 μl larutan sel yang diwarnai melalui lubang injeksi, dan sel dapat diamati pada bidang fokus mikroskop stereo dan dihitung dengan penghitung manual; setiap titik data yang ditampilkan dalam semua gambar mengenai tingkat kelangsungan sel adalah rata-rata dari tiga percobaan eksperimental (N = 3) ditambah selang simpangan baku.

Untuk menyiapkan penilaian sitotoksisitas NP dan efek fototermalnya terhadap tingkat kelangsungan sel, medium dalam petri dish 5,2 cm dihilangkan, diisi ulang dengan jumlah yang tepat larutan NP dalam medium baru untuk membuat array konsentrasi pengujian, 2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml dan 0,5 mg/ml, dan kemudian diinkubasi selama satu hari sebelum eksperimen.

Sebelum uji fototermal, penilaian sitotoksisitas dilakukan untuk memeriksa respons sel terhadap array konsentrasi NP dan dilakukan sebagai berikut. Medium yang berisi sel dan NP diambil dari inkubator dan dihisap. Satu mililiter PBS yang telah dipanaskan digunakan untuk mencuci sel kanker dan hisap nanoparticle CsWO₃ yang terapung sisa yang tidak melalui endositosis, prosedur ini diulang beberapa kali untuk memastikan bahwa mortalitas sel yang potensial tidak disebabkan oleh kenaikan suhu yang diinduksi NP dalam medium baru. Setelah perawatan fototermal, prosedur perhitungan kemudian diterapkan untuk uji sitotoksisitas dan fototermal pada sel.

Hasil

Properti optik dan fototermal nanomaterial Cs_0.33WO₃ sangat bergantung pada struktur kristal, suhu pemanasan pasca, stoikiometri atom, dan ukuran fitur partikel [28, 29].

Untuk mengkarakterisasi morfologi permukaan bubuk µ Cs_0.33WO₃, citra SEM dengan pembesaran 10.000X diperoleh untuk konfirmasi visual struktur hexagon kolumnal yang ditunjukkan oleh panah merah pada Gambar 2a. Selain itu, citra TEM menunjukkan bentuk kontur dan ukuran fitur granulat bubuk µ pada Gambar 2b di mana ukuran fiturnya sekitar 1 μm atau kurang. Geometri batang NP dan histogram distribusi DLS dari ukuran fitur skala nano yang berpusat sekitar 120 nm juga diverifikasi dan ditampilkan pada Gambar 2c dan citra TEM inset yang sesuai. Juga, karakterisasi kristalin bubuk µ dan NP dengan XRD ditampilkan pada Gambar 2d. Seperti yang dapat diamati dari spektrum XRD bubuk µ di panel atas, bidang kristalisasi ikonik di sepanjang (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220), (222), (204), (400) dan (224) sesuai dengan baik dengan spektrum standar Cs_0.32WO₃ dari kartu Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) No. 83-1334. Ketika ukuran fitur bubuk µ menurun menjadi 120 nm, intensitas semua puncak difraksi berkurang monoton, dan beberapa puncak karakteristik yang menunjukkan absorpsi NIR kuat, seperti bidang (102) dan (220), terlupakan tidak terlihat dalam spektrum. Demikian pula, identifikasi unsur atom, cesium (Cs), tungsten (W) dan oksigen (O), ditampilkan pada Gambar 2e, tidak hanya mengonfirmasi kehadiran atom, tetapi juga mengautentikasi rasio persentase atom Cs terhadap W, 0,315, yang mirip dengan stoikiometri yang dirancang awal.

Di atas karakterisasi material, spektrum absorpsi optik NP dan modulasi termal seiring waktu diukur dan ditampilkan pada Gambar 3. Pada (a, b), ketergantungan absorpsi NIR dan profil kenaikan suhu yang diinduksi oleh larutan NP yang diiradiasi NIR sebagai fungsi konsentrasi NP digambarkan, di mana plot suhu seiring waktu dari 1 mg/ml, misalnya, mencapai puncak 40 °C, dan tetap stabil selama setidaknya 1 jam yang mengonfirmasi stabilitas dan daya tahan material fototermal. Demikian pula, profil suhu seiring waktu pada Gambar 3c menunjukkan 5 siklus berulang dalam 190 menit, memverifikasi responsivitas fototermal material NP. Pada Gambar 3d, profil suhu temporal dari medium budaya dan medium budaya yang diinkorporasi NP, yang diambil dari inkubator, ditempatkan pada panci panas dan mengalami iradiasi NIR, stabil pada sekitar 37 °C selama 10 menit, dan suhu larutan NP murni yang diiradiasi NIR naik dari 24,6 °C menjadi 33,6 °C setelah 10 menit. Oleh karena itu, dengan mempertimbangkan fungsionalitas fototermal NP, iradiasi NIR untuk eksperimen selanjutnya dilakukan selama 10 menit, 30 menit dan 60 menit, mempertahankan daya tahan NP selama sesi eksperimental dan potensialmente dapat diterapkan pada studi preklinis.

Selanjutnya, dosis non-toksik dari parameter eksperimental termasuk durasi iradiasi NIR dan konsentrasi NP ditentukan dengan mengiradiasi sel selama 1 jam dan 2 jam pada 50 mW/cm² dan melalui interaksi langsung dengan NP dengan konsentrasi 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml dan 2 mg/ml, yang masing-masing ditampilkan pada Gambar 4a, b. Tingkat kelangsungan sel tetap sangat di atas 95% selama 2 jam iradiasi NIR, mengonfirmasi non-toksisitas sel untuk paparan jangka panjang pada foton 980 nm, dan juga, konsentrasi NP non-toksik di bawah 1,5 mg/ml ditentukan.

Tujuan pemberian dosis sel kanker pada 1,5 mg/ml atau lebih rendah, yang hampir tidak memiliki efek merusak pada sel HepG2, adalah untuk memeriksa efek dosis fototermal pada sel kanker tanpa implikasi toksisitas inherent NP. Untuk memeriksa apakah NP yang diiradiasi NIR dapat menjadi solusi yang feasible untuk memusnahkan sel kanker, sel diinkubasi dengan NP pada 1,5 mg/ml selama satu hari, dan kemudian diberi radiasi NIR selama 1 jam. Seperti yang dapat dilihat dari citra optik bidang terang (BF) Gambar 5d–f, jumlah sel jelas berkurang ketika waktu paparan berlangsung 1 jam (e) atau 2 jam (f). Secara kuantitatif, tingkat kelangsungan hidup menurun monoton dari 84,2% menjadi 58,4% seiring bertambahnya durasi iradiasi dari 10 menit menjadi 1 jam, dan garis tren linier cocok dengan baik di antara titik data yang berserakan, yang memprediksi 20% tingkat kelangsungan hidup ketika iradiasi berlangsung 2 jam. Selain itu, Gambar 5h menunjukkan bahwa untuk 1 jam iradiasi, tingkat kelangsungan hidup menurun dari 73 menjadi 58% seiring bertambahnya kepadatan daya optik dari 12,5 hingga 50 mW/cm², memastikan fungsionalitas NP yang diiradiasi NIR sebagai pemicu fototermal dalam pemusnahan sel kanker.

Selanjutnya, ketidakpastian apakah tindakan fototermal ini terjadi secara intrakeluler atau ekstraseluler diatasi dengan mempersiapkan fNPs, melakukan prosedur pencuci dan inkubasi yang sama, dan mengamati kehadiran intrakeluler fNPs. Gambar 6 menggambarkan citra BF konfokal (b, e) dan fluoresensi (a, d) serta komposit yang tumpang tindihnya (c, f) dari sel yang diinkubasi dengan dan tanpa fNPs. Jelas, sel tanpa inkubasi fNPs sebagai kontrol menunjukkan fluoresensi hijau yang dapat diabaikan, yang terutama disebabkan oleh autofluoresensi sel, yang berkontras tajam dengan eksperimen di mana distribusi fluoresensi hijau ada di semua sitoplasma yang ditemukan dalam citra. Intensitas fluoresensi rata-rata dalam citra kontrol dan sampel eksperimental juga diukur dan ditampilkan dalam histogram Gambar 6g di mana fluoresensi fNPs yang mengalami endositosis setidaknya sembilan kali lebih kuat dari kontrol.

Pembahasan

Konsep hipotermi terapeutik menggunakan gelombang elektromagnetik dalam pengobatan penyakit kanker telah ada sejak awal tahun 1900-an dan berhasil dalam pengobatan kembali beberapa bentuk malignitas, namun kemudian menurun karena kegunaan agen antibakteri yang menginduksi demam dan ketiadaan akses yang presisi ke tumor lokal yang diminati in situ [30]. Baru pada tahun 1980-an, minat dibangkitkan kembali dengan beberapa studi in vitro yang menemukan banyak aspek perubahan metabolik, alterasi mikrocirculasi tumor dan asidosis setelah perawatan hipotermi yang menghasilkan efek letal pada sel kanker [31]. Secara mekanisme, selain sitotoksisitas langsung di mana sel kanker mengalami nekrosis dengan apoptosis yang berkurang ketika suhu yang diterapkan > 42 °C, aliran darah yang berkurang yang terkait dengan kemampuan pendinginan yang rendah dan pH rendah (< 6,8) membuat sel kanker lebih rentan terhadap pemanasan dan akibatnya, tingkat pembunuhan sel yang lebih tinggi [32, 33]. Namun, secara klinis, karena kelemahan berabad-abad dari lokalisasi yang tidak presisi dan tidak spesifik, hipotermi hanya menemukan efektivitas terapeutik yang ditingkatkan ketika diterapkan bersamaan dengan terapi chemo- atau radiasi [34, 35].

Bahan berbasis NP yang memungkinkan targeting dan pemantauan yang presisi, dan memiliki berbagai properti fisik seperti muatan permukaan, fluoresensi, konversi fototermal, cocok dengan niche ketidakakurasan tersebut dalam aplikasi hipotermi. Namun, meskipun kegunaan banyak materi NP yang diiradiasi NIR dalam studi sel kanker telah terbukti, batas aman paparan foto sering tidak diperiksa dengan baik seperti pada kasus NP CsWO₃. NP CsWO₃, meskipun, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4b, memiliki sitotoksisitas yang relatif rendah pada 1,5 mg/ml dibandingkan dengan beberapa materi NP populer, seperti Ag, Au, grafin, yang ambangnya berada pada skala 1 μg/ml [18, 36, 37], masih memerlukan 0,7 W/cm² untuk pemusnahan yang efektif sel Hela meskipun absorpsi NIR yang kuat dalam rentang panjang gelombang dari 800 nm hingga 2400 nm [15, 25, 26].

Studi penelitian ini berusaya merumuskan rumus dosis termal berbasis NP Cs_0.33WO₃ yang dipicu iradiasi NIR yang efektif untuk sel kanker hati HepG2 in vitro sebagai fungsi konsentrasi NP, durasi iradiasi dan kepadatan daya optik yang berada dalam batas paparan NIR untuk jaringan kulit.

Eksperimen dimulai dengan sintesis NP, di mana prosedur sintesis langkah demi langkah termasuk reaksi redox, proses pemanasan dan metode penggerusan basah diuraikan pada Gambar 1. Reaksi redox memasukkan elemen ternari besar, Cs dalam hal ini, ke dalam cincin struktur oktahedral WO₆ dalam lingkungan fisik yang tepat, yang memungkinkan pembentukan struktur kristal unik dan pemasukan elektron beas ke dalam senyawa molekuler logam, yang adalah alasan intrinsik untuk konversi fototermal yang kuat saat absorpsi NIR [26, 27]. Juga, proses pemanasan dan penggerusan basah yang berikutnya membantu menyempurnakan pembentukan kristal dan mengurangi ukuran fitur partikel yang lebih meningkatkan konversi fototermal NIR. Setelah itu, larutan NP yang disintesis dilanjutkan dengan serangkaian karakterisasi fisik dan material yang memverifikasi ukuran fitur rata-rata 120 nm, optimasi kritis dari absorpsi NIR, dan mengautentikasi komposisi atom (Gambar 2). Selain itu, pengukuran potensi zeta yang sesuai untuk 0,5 mg/ml, 1 mg/ml dan 1,5 mg/ml adalah − 53,2 mV, − 54,3 mV, − 60,1 mV. Secara umum, proses endositosis adalah jalur masuk utama untuk sebagian besar jenis NP, dan tingkat penyerapan NP kationik dan ionik untuk sel non-fagositik lebih tinggi daripada entitas netral, meskipun yang pertama lebih baik dari pada yang kedua [38]. Juga, banyak laporan sebelumnya menemukan NP dengan muatan negatif kurang beracun untuk sel non-fagositik [39, 40], yang merupakan nilai tambah yang menguntungkan saat akumulasi NP intrakeluler yang berlebihan untuk dosis fototermal dengan toksisitas rendah dipertimbangkan.

Untuk menentukan nada untuk uji fototermal pada sel HepG2, penilaian daya tahan NP sebagai pemanas fototermal, stabilitas jangka panjang pada suhu saturasi dalam keseimbangan dengan lingkungan selama lebih dari satu jam dan keulangan untuk 5 siklus berturut-turut dalam 3 jam telah ditunjukkan (Gambar 3b, c). Juga, untuk mengukur efektivitas hipotermi NP itu sendiri dalam memberi dosis pada sel kanker dengan mengeluarkan pengaruh suhu lingkungan (secara nominal 25 °C), kalibrasi aparatur eksperimental dilakukan dengan mengatur panci panas ke 37 °C, di atasnya semua uji sel dilakukan, dan karakteristik fototermal seiring waktu dari medium budaya murni dan medium budaya yang diinkorporasi NP tetap pada 37,1 °C (Gambar 3d). Kemudian, ketergantungan sitotoksisitas pada durasi iradiasi dan konsentrasi NP diperiksa secara terpisah dan ditampilkan pada Gambar 4 yang menunjukkan kurang dari 5% pembunuhan sel untuk lebih dari 2 jam iradiasi NIR dan 1,5 mg/ml sebagai titik tolak menuju konsentrasi letal. Dengan menetapkan konsentrasi NP pada 1,5 mg/ml, yang digunakan selama sisa uji fototermal, dosis termal untuk hipotermi medis didefinisikan sebagai fungsi durasi pemberian dosis yang bervariasi dan kepadatan daya optik. Gambar 5 menggambarkan tindakan pembunuhan sel dengan pembesaran rendah (a–c) dan tinggi (d–f) ketika iradiasi NIR untuk 0 jam, 1 jam dan 2 jam diimplementasikan, jumlah sel yang tampak berkurang mencerminkan analisis kuantitatif dari tingkat kelangsungan sel seperti yang ditampilkan pada (g), dan garis tren linier memprediksi 80% kematian sel untuk 2 jam iradiasi. Demikian pula, penurunan tingkat kelangsungan sel seiring dengan peningkatan kepadatan daya optik juga ditunjukkan pada (h). Terakhir, sebagaimana dijelaskan dengan jelas oleh citra BF, fluoresensi dan komposit tumpang tindih pada Gambar 6, di mana histogram analisis fluoresensi ditampilkan, endositosis fNPs diverifikasi.

Kesimpulan

Secara ringkasan, studi ini menyajikan sintesis dan karakterisasi material NP Cs_0.33WO₃, memeriksa uji sitotoksisitas in vitro dari interaksi NP langsung, dan terpisah, dengan iradiasi NIR, dan membuktikan endositosis NP serta efektivitas NP yang diiradiasi NIR pada pemusnahan sel kanker hati HepG2. Selain itu, studi ini menyarankan kombinasi dosis larutan NP Cs_0.33WO₃ yang diiradiasi NIR untuk sel kanker hati HepG2, 1,5 mg/ml konsentrasi NP, durasi iradiasi antara 30 menit hingga 1 jam, dan kepadatan daya optik iradiasi NIR di bawah 50 mW/cm² yang berada di bawah batas paparan NIR aman untuk jaringan kulit sambil memungkinkan tingkat kematian sel kanker mendekati 40% dan potensialmente dapat diterapkan pada pengembangan obat yang ramah pasien dan dipersonalisasi. Studi seperti ini dalam setting klinis akan memerlukan tindakan tambahan seperti modifikasi permukaan dengan molekul yang mengenali reseptor permukaan tipe sel kanker tertentu.