Folate Receptor-targeted Bioflavonoid Genistein-loaded Chitosan Nanopartikel untuk Meningkatkan Efek Antikanker pada Kanker Serviks
Abstrak
Dalam penelitian ini, nanopartikel kitosan terkonjugasi asam folat baru diformulasikan untuk pengiriman spesifik bioflavonoid, Genistein (GEN), ke sel kanker serviks. Nanopartikel kitosan (GCN) dan GCN (FGCN) terkonjugasi asam folat yang disiapkan menunjukkan ukuran yang lebih kecil dengan profil pelepasan obat yang terkontrol. FGCN menunjukkan peningkatan potensi internalisasi dalam sel HeLa dibandingkan dengan GCN. Internalisasi spesifik FGCN terutama disebabkan oleh afinitas asam folat (FA) dengan FRs-α yang terdapat dalam jumlah besar dalam sel HeLa. Hasil penelitian mengungkapkan bahwa FGCN memiliki afinitas spesifik terhadap sel HeLa yang akan berkontribusi pada pengobatan yang lebih baik. Nanoformulasi yang diberi tag asam folat menunjukkan efek sitotoksik yang lebih unggul dibandingkan dengan formulasi yang tidak ditargetkan. Secara konsisten, nilai IC50 GEN menurun dari 33,8 menjadi 14,6 g/ml saat diobati dengan FGCN setelah inkubasi 24 jam. Studi apoptosis menunjukkan bahwa nanopartikel FGCN kemudian menjadi GCN atau GEN bebas dalam hal aktivitas antikanker. Secara keseluruhan, hasil mengungkapkan bahwa konjugasi folat ke sistem pengiriman mungkin memiliki efek besar pada kelangsungan hidup kanker serviks yang akan bermanfaat untuk pengobatan kanker secara keseluruhan.
Latar Belakang
Kanker serviks pada manusia merupakan salah satu kanker populer pada wanita usia reproduksi di seluruh dunia yang terutama disebabkan oleh human papillomavirus (HPV) [1]. Badan Internasional untuk Penelitian Kanker telah mengutip penurunan pertahanan kekebalan tubuh, merokok, dan aktivitas seksual yang tidak teratur sebagai penyebab utama di balik kanker serviks [2]. Kemajuan terbaru dalam teknologi medis dan diagnosis memiliki dampak besar dalam mengurangi tingkat kematian pada kanker serviks; Namun, kelas kanker ini masih meningkat di negara berkembang seperti Cina. Dua vaksin HPV profilaksis (Gardasil dan Cervarix) telah dipasarkan untuk pengobatan kanker serviks; namun, itu menunjukkan efektivitas hanya pada pasien dewasa dan gagal menghibur pada pasien secara keseluruhan [3, 4]. Oleh karena itu, pilihan pengobatan seperti kemoterapi, pembedahan, dan radioterapi digunakan secara teratur; Namun, tidak ada yang efektif dalam mengobati kanker serviks. Agen kemoterapi atau molekul kecil lainnya telah dilaporkan meningkatkan efisiensi pengobatan kanker jika diberikan secara khusus [5].
Baru-baru ini, senyawa alami telah mendapatkan perhatian yang signifikan dalam pengobatan kanker karena diketahui memiliki toksisitas yang lebih rendah dibandingkan dengan obat kemoterapi [6]. Terutama, flavonoid hadir di banyak tanaman telah dilaporkan memiliki sifat anti-inflamasi dan antikanker. Genistein (4′,5,7-trihydroxyisoflavone) (GEN) adalah isoflavon kedelai yang berpotensi efektif yang telah mendapat perhatian yang meningkat karena sifat antikankernya yang kuat [7, 8]. Studi telah mengungkapkan bahwa GEN menghambat protein tirosin kinase dan NF-κB dan menghentikan siklus sel pada fase G2/M. Hal ini akan menyebabkan downregulation gen yang terkait dengan proliferasi sel dan pertumbuhan sel kanker [9, 10]. Penghentian fase G2/M akan menekan migrasi sel kanker, invasi, dan menginduksi apoptosis sel dan kematian sel [11]. Namun, potensi klinis GEN terhambat karena kelarutannya yang terbatas (~1,45 g/ml) dan bioavailabilitas yang terbatas [12]. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk meningkatkan sifat fisikokimia GEN dan sifat antikankernya.
Penerapan nanoteknologi dalam bidang kedokteran semakin mendapat perhatian karena kemampuannya dalam meningkatkan sifat antikanker dari berbagai molekul kecil [13]. Enkapsulasi obat dalam nanopartikel menawarkan banyak keuntungan seperti stabilitas tinggi, peningkatan pemuatan obat, internalisasi yang lebih tinggi, biodistribusi yang menguntungkan, dan peningkatan farmakokinetik [14]. Yang penting, nanopartikel meningkatkan efek antikanker dari senyawa yang dienkapsulasi dengan akumulasi preferensial dalam jaringan tumor. Juga, nanopartikel bisa membalikkan resistensi multi-obat (MDR) sel tumor [15, 16]. Dalam penelitian ini, kami telah menggunakan nanopartikel kitosan turunan alami karena biodegradabilitas dan profil biokompatibilitasnya yang sangat baik. Selain itu, gugus amina primer kitosan menawarkan beberapa sifat penting termasuk kelarutan dalam air dan hemokompatibilitas. Juga, gugus amina dapat digunakan untuk mengubah permukaan nanopartikel [17]. Untuk meningkatkan spesifisitas target, kami telah mengkonjugasikan asam folat pada permukaan nanopartikel kitosan. Asam folat dipilih sebagai ligan penargetan karena ekspresinya yang berlebihan dalam sel kanker serviks. Reseptor folat hadir dalam jumlah tinggi atau besar dalam sel kanker serviks. Untuk lebih spesifik, FRs-α hadir dalam sel normal juga tetapi tidak terkena sirkulasi darah sedangkan sangat terkena sirkulasi darah dalam kasus sel kanker menjadikannya sebagai target menarik untuk nanopartikel terkonjugasi folat yang mungkin diinternalisasi melalui endositosis mekanisme [18, 19].
Dalam penelitian ini, kami terutama bertujuan untuk meningkatkan sifat antikanker GEN terhadap sel kanker serviks HeLa yang diekspresikan secara berlebihan oleh FR-α dengan mengenkapsulasi dalam nanopartikel kitosan terkonjugasi FA. Nanopartikel dikarakterisasi dalam hal ukuran partikel, bentuk, dan kinetika pelepasan in vitro. Efek penargetan FA dipelajari dengan uji serapan seluler dalam sel kanker HeLa. Efek antikanker dari GEN dan nanopartikel bermuatan GEN dipelajari dengan uji sitotoksisitas, uji hidup/mati, dan analisis apoptosis.
Metode
Materi
Genistein dibeli dari Aladdin Chemicals (Shanghai, Republik Rakyat Cina). Asam folat, kitosan (85% deasetilasi), dibeli dari Sigma-Aldrich, Cina. EDC dan NHS juga dibeli dari Sigma-Aldrich, China. Semua bahan kimia lainnya memiliki tingkat reagen dan digunakan tanpa modifikasi apa pun.
Preparat Nanopartikel Kitosan Terkonjugasi Asam Folat Bermuatan GEN
Sebelum mempersiapkan nanopartikel, asam folat kitosan konjugat disiapkan. Secara singkat, 44,1 mg asam folat dilarutkan dalam DMSO bersama dengan campuran 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil karbodiimida hidroklorida (EDAC.HCl) dan N-hidroksi suksinimida (NHS) (rasio molar 1:1,5:1,5 ). Campuran diaduk selama 30 menit untuk memungkinkan aktivasi gugus fungsi. Larutan organik ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan kitosan (0,5% b/b) sambil terus diaduk. Pengadukan dilanjutkan semalaman dalam kondisi gelap. PH dibuat hingga pH 8 dengan menambahkan 1 M natrium hidroksida. Terakhir, campuran disentrifugasi untuk memisahkan endapan kuning dan dicuci dengan natrium karbonat kemudian didialisis kembali dengan air.
Untuk membuat nanopartikel, konjugat GEN, kitosan dan kitosan-FA (10:1) dilarutkan dalam DMSO. Larutan DMSO kemudian ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan Tween 80 0,5% sambil terus diaduk. Campuran diaduk selama 3 jam, dan setelah semua pelarut menguap, suspensi dipintal selama 30 menit pada 10.000 rpm pada 4 °C. Supernatan dibuang dan dievaluasi dengan metode HPLC. Sampel dikuantifikasi dengan HPLC (LC 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) menggunakan kolom C-18 fase terbalik pada 25 °C. Fase gerak metanol/air (60/40, v /v) digunakan sebagai fase gerak dengan laju aliran 1 ml/menit.
Ukuran partikel dan distribusi ukuran nanopartikel diamati oleh Malvern Mastersizer 2000 (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments Ltd., UK). Sampel yang sesuai diencerkan sebelum analisis. Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga.
Morfologi permukaan nanopartikel dievaluasi dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, JEM-1230, JEOL, Tokyo, Jepang). Secara singkat, dispersi nanopartikel dicampur dengan 2% PTX dan diletakkan di grid TEM dan dikeringkan selama 10 menit di bawah radiasi inframerah rendah. Sampel diwarnai dengan asam fosfotungistik (2%) dan diamati di bawah TEM pada tegangan percepatan 100 kV.
Studi Pelepasan Obat In Vitro
Studi pelepasan obat dilakukan dengan metode dialisis. Secara singkat, 5 mg ekivalen GEN nanopartikel disuspensikan dalam 1 ml buffer pelepas (PBS, pH 7,4) dan dipindahkan ke tabung dialisis (MWCO:3500). Tabung dialisis ditempatkan dalam tabung Falcon yang berisi 25 ml buffer pelepas. Tabung Falcon ditempatkan dalam shaker dengan pengadukan lembut pada suhu 37 °C. Pada interval yang telah ditentukan sebelumnya, volume spesifik sampel diambil dan diganti dengan buffer atau media baru. Obat yang dilepaskan dari media pelepasan dipelajari oleh HPLC.
Budaya Sel
Garis sel karsinoma serviks manusia (sel HeLa) diperoleh dari ATCC, MS, USA dan ditanam di DMEM yang mengandung 10% FBS dan campuran antibiotik pada 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5% karbon dioksida.
Serapan Seluler
Efisiensi penargetan nanopartikel (GCN dan FGCN) dipelajari dengan analisis serapan seluler. Dalam penelitian ini, probe fluoresen yang digunakan adalah Coumarin-6. Sel-sel ditempatkan di piring 96-sumur dan dibiarkan menempel selama 24 jam. Media kultur dikeluarkan dan diganti dengan media segar yang mengandung GCN dan FGCN dan diinkubasi untuk interval yang berbeda. Sel-sel kemudian dicuci dengan PBS, dilisiskan (Triton-X), disentrifugasi, dan supernatan dikumpulkan. Supernatan digunakan untuk mengevaluasi intensitas fluoresensi dengan pembaca lempeng mikro (GENios, Tecan, Swiss). Penyerapan diukur pada panjang gelombang eksitasi 430 nm dan panjang gelombang emisi 485 nm.
Pencitraan Serapan Seluler
Mikroskop pemindaian laser confocal (Olympus Fluoview FV-1000, Tokyo, Jepang) digunakan untuk menentukan serapan seluler kualitatif dalam sel kanker. 2 × 10
5
sel diunggulkan dalam piring 6-sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Media dikeluarkan dan diganti dengan media baru yang mengandung GCN dan FGCN dan diinkubasi selama 2 jam. Sel-sel dicuci dengan PBS, difiksasi, dan dicuci lagi. Sel-sel tersebut kemudian diamati menggunakan CLSM.
Uji Sitotoksisitas
Efisiensi pembunuhan sel GEN, GCN, dan FGCN bebas dipelajari dengan menggunakan protokol uji MTT. Sel HeLa dengan kepadatan penyemaian 1 × 10
4
sel ditempatkan di piring 96-sumur dan dibiarkan menempel selama 24 jam. Hari berikutnya, sel diperlakukan dengan GEN, GCN, dan FGCN gratis dalam 100 l media segar dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah itu, media dikeluarkan dan dicuci dua kali dengan PBS. Sepuluh mikroliter DMEM yang mengandung MTT (5 mg/ml) ditempatkan di piring 96-sumur dan didiamkan selama 4 jam. Larutan MTT disedot dan DMSO ditambahkan untuk melarutkan kristal formazan yang sesuai dengan sel hidup. Absorbansi formazan dipelajari pada panjang gelombang 570 nm menggunakan pembaca pelat (Bio-Tek Instruments Inc., USA). IC50 juga dihitung menggunakan perangkat lunak GraphPad Prizm (versi 17).
Pengujian Langsung/Mati
Sel HeLa dengan kepadatan penyemaian 2 × 10
5
sel diunggulkan dalam piring 6-sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Hari berikutnya, sel diperlakukan dengan GEN, GCN, dan FGCN gratis dalam 100 l media segar dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah itu, media dikeluarkan dan dicuci dua kali dengan PBS. Sel-sel diproses sesuai dengan instruksi yang diberikan oleh pabrikan (Molecular Probes, USA). Calcein AM dan ethidium homodimer adalah pewarna sel hidup dan mati yang digunakan untuk pewarnaan.
Analisis Statistik
Data dianalisis secara statistik menggunakan t tes. P nilai kurang dari 0,05 digunakan untuk menunjukkan signifikansi statistik. Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.
Hasil dan Diskusi
Kanker serviks pada manusia merupakan salah satu kanker yang populer pada wanita usia reproduksi di seluruh dunia yang terutama disebabkan oleh human papillomavirus. Oleh karena itu, pilihan pengobatan seperti kemoterapi, pembedahan, dan radioterapi digunakan secara teratur; Namun, tidak ada yang efektif dalam mengobati kanker serviks. Agen kemoterapi atau molekul kecil lainnya telah dilaporkan meningkatkan efisiensi pengobatan kanker jika diberikan secara khusus. Baru-baru ini, senyawa alami telah mendapatkan perhatian yang signifikan dalam pengobatan kanker karena diketahui memiliki toksisitas yang lebih rendah dibandingkan dengan obat kemoterapi. Genistein telah menerima perhatian yang meningkat karena sifat antikankernya yang kuat. Namun, potensi klinis GEN terhambat karena kelarutannya yang buruk (~ 1,43 g/ml) dan bioavailabilitas yang rendah. Dalam penelitian ini, kami terutama bertujuan untuk meningkatkan sifat antikanker GEN terhadap sel kanker serviks HeLa yang diekspresikan secara berlebihan oleh FR-α dengan mengenkapsulasi dalam nanopartikel kitosan terkonjugasi FA (Gbr. 1).
Ilustrasi skema persiapan nanopartikel kitosan terkonjugasi asam folat yang mengandung Genistein
Karakterisasi Fisikokimia Sistem Nanopartikel bermuatan GEN
Ukuran dan potensi zeta dari sistem partikel memainkan peran penting dalam internalisasi seluler dan kinerja sistemik obat antikanker. Hamburan cahaya dinamis (DLS) digunakan untuk menentukan ukuran partikel dan distribusi ukuran nanopartikel bermuatan GEN (Gbr. 2). Ukuran partikel rata-rata GCN adalah ~140 nm sedangkan FGCN ~165 nm dengan indeks polidispersitas yang sangat baik. Diameter hidrodinamik rata-rata FGCN kurang dari 200 nm, yang cukup untuk menembus jaringan tumor menggunakan efek permeasi dan retensi yang ditingkatkan. Ukuran partikel yang kecil dapat menahan properti pembersihan cepat nanopartikel dari tubuh (RES) [20]. Muatan permukaan dianggap sebagai indikator kunci stabilitas partikel dalam bentuk suspensi. Potensi zeta rata-rata GCN adalah +26 mV sedangkan FGCN adalah +21.5 mV. Sedikit penurunan muatan permukaan mungkin disebabkan oleh substitusi gugus amina kitosan. Selain itu, GCN dan FGCN menunjukkan efisiensi jebakan yang tinggi lebih dari>95% yang menunjukkan kesesuaiannya untuk aplikasi sistemik. Ukuran partikel dan potensi zeta FGCN tetap tidak berubah selama penyimpanan selama 3 bulan yang menunjukkan stabilitas penyimpanan yang tinggi (Gbr. 3).
Mikroskop elektron transmisi FGCN
Profil pelepasan GCN dan FGCN in vitro dalam saline buffer fosfat (pH 7.4). Jumlah obat yang dilepaskan dihitung dengan metode HPLC, dan percobaan dilakukan dalam rangkap tiga
Analisis Morfologi Permukaan
Morfologi permukaan FGCN yang dioptimalkan dicirikan oleh TEM. Nanopartikel menunjukkan morfologi berbentuk bola dan terdistribusi secara merata dalam jaringan tembaga. Ukuran partikel yang diamati dari analisis TEM konsisten dengan pengamatan DLS (Gbr. 4).
Analisis serapan seluler GCN dan FGCN dalam sel kanker serviks HeLa. a Analisis kuantitatif serapan seluler nanopartikel dengan metode fluoresensi. b Analisis serapan seluler berbasis mikroskop laser confocal (CLSM). Coumarin-6 digunakan sebagai probe fluoresen
Kinetika Pelepasan Obat In Vitro
Pelepasan GEN dari GCN dan FGCN dilakukan dengan metode dialisis. PBS digunakan untuk melakukan studi pelepasan untuk mensimulasikan kondisi fisiologis. Seperti yang diharapkan, profil rilis GCN dan FGCN hampir serupa. Kedua formulasi menunjukkan profil pelepasan terkontrol untuk GEN dan kinetika pelepasan monofasik. Sekitar 35-40% obat dilepaskan dari kedua sistem nanopartikel pada akhir 24 jam. Tren laju pelepasan GEN berlanjut hingga akhir masa studi, dan akhirnya, ~90% obat dilepaskan. Konjugasi folat pada permukaan mempengaruhi rendahnya pelepasan obat yang menunjukkan pengaruh adanya bahan terkonjugasi. Telah dilaporkan bahwa pelepasan terkontrol obat dari NP dikaitkan dengan pemanjangan panjang jalur obat ke media pelepasan luar. Secara keseluruhan, pelepasan obat yang terkontrol dalam kondisi pH 7,4 menunjukkan bahwa sebagian besar obat akan tetap utuh dan akan terakumulasi dalam jaringan tumor seiring waktu.
Studi Serapan Seluler In Vitro
Konsentrasi GEN intraseluler sangat penting untuk mendapatkan aksi sitotoksiknya dalam sel kanker. Oleh karena itu, potensi serapan seluler sistem NP sangat penting dari perspektif kemanjuran terapeutik. GCN dan FGCN yang mengandung kumarin-6 diinkubasi ke sel kanker untuk titik waktu yang berbeda. Kedua sistem NP menunjukkan serapan seluler bergantung waktu dengan serapan seluler maksimum pada 4 jam. Seperti yang diharapkan, FGCN yang ditargetkan reseptor asam folat menunjukkan secara statistik (p < 0,05) serapan seluler yang lebih tinggi dalam sel kanker HeLa. Sekali lagi, penyerapan FGCN yang dominan dalam banyak kasus akan disebabkan oleh ketersediaan FA pada permukaan partikel yang dapat memfasilitasi interaksi ligan dengan reseptor yang sesuai dan yang terdapat dalam jumlah tinggi dalam sel HeLa [21].
Serapan seluler selanjutnya dikonfirmasi oleh pencitraan mikroskopis. Sel-sel diinkubasi dengan formulasi yang dihormati dan diinkubasi selama 2 jam. Seperti yang terlihat, intensitas fluoresen tinggi diamati untuk sel kanker yang terpapar FGCN dibandingkan dengan sel yang diobati dengan GCN. Hasil ini menunjukkan bahwa FGCN terkonjugasi asam folat memiliki afinitas spesifik untuk sel HeLa yang bersifat kanker karena pengenalan reseptor ligan (FA-FR-α).
Sitotoksisitas In Vitro
Aktivitas sitotoksik in vitro GEN, GCN, dan FGCN pada sel kanker HeLa dipelajari dengan protokol uji MTT. Seperti yang terlihat, formulasi nano GEN lebih efektif dalam membunuh sel kanker dibandingkan dengan GEN bebas. Namun semua formulasi menunjukkan efek sitotoksik tergantung dosis yang khas pada sel kanker. Seperti yang diharapkan, nanoformulations tag asam folat menunjukkan statistik (p < 0,05) efek sitotoksik lebih tinggi dibandingkan dengan formulasi non-target. Efek antikanker yang unggul dari FGCN dikaitkan dengan internalisasi nanopartikel yang dimediasi reseptor spesifik dalam sel kanker yang dapat meningkatkan konsentrasi obat di lingkungan intraseluler. Selanjutnya, kemampuan nanopartikel untuk mengontrol pelepasan senyawa yang dienkapsulasi juga berkontribusi terhadap sitotoksisitas FGCN yang tinggi. Nilai IC50 digunakan untuk mengevaluasi efek sitotoksik nyata dari formulasi pada sel kanker. Umumnya, itu adalah konsentrasi yang diperlukan untuk membunuh setengah dari sel asli. Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai IC50 GEN menurun dari 33,8 menjadi 26,5 g/ml saat diberi GCN. Yang penting, nilai IC50 turun menjadi 14,6 g/ml saat diobati dengan FGCN setelah inkubasi 24 jam. Nanopartikel telah dilaporkan mengurangi efek MDR dan dengan demikian diharapkan dapat meningkatkan kemanjuran antikanker GEN dengan mengurangi penghabisannya dari sel yang dimediasi oleh P-glikoprotein. Efek antikanker yang unggul dari FGCN konsisten dengan serapan selulernya yang tinggi dalam sel kanker HeLa [22].
Analisis Mikroskopis
Analisis morfologi sel kanker dilakukan setelah pengobatan dengan obat antikanker. Formulasi terkena sel kanker dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel kontrol normal dan menyebar pada slip penutup pelat sumur sedangkan sel-sel menyusut pada kelompok yang diberi formulasi. Konsisten dengan uji sitotoksisitas, morfologi sel kanker berbeda untuk formulasi yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan, sel-sel yang diobati dengan FGCN lebih sedikit jumlahnya dan morfologi bulat menunjukkan sitotoksisitas yang lebih tinggi dari formulasi. GCN juga menginduksi perubahan luar biasa pada sel kanker karena penyerapannya yang cukup tinggi dalam sel kanker. Hasil dengan jelas mengungkapkan bahwa nanopartikel yang dilapisi kitosan akan bermanfaat untuk pengobatan kanker serviks (Gbr. 5).
Analisis sitotoksisitas in vitro GEN, GCN, dan FGCN dalam sel kanker HeLa. Sel-sel diperlakukan dengan formulasi masing-masing dan diinkubasi selama 24 jam. **p < 0,01 adalah perbedaan statistik antara FGCN dan GEN.A
Pengujian Langsung/Mati
Potensi sitotoksik formulasi individu dipelajari lebih lanjut dengan uji hidup/mati. Jumlah sel hidup dan mati setelah pengobatan (selama 24 jam) divisualisasikan dari intensitas fluoresensi hijau. Calcein AM dan pewarna etidium bromida adalah penanda sel hidup dan mati yang representatif yang diterapkan pada sel yang diperlakukan dengan formulasi. Sel-sel hidup yang tersisa yang ada setelah perawatan obat mengambil calcein dan memancarkan emisi cahaya fluoresen hijau (488 nm). Seperti yang ditunjukkan, sel-sel yang tidak diobati menunjukkan intensitas fluoresensi tinggi (fluoresensi hijau), dan pengobatan GEN bebas juga tidak mengurangi sel-sel yang tumbuh. Di sisi lain, FGCN menunjukkan lebih sedikit sel hidup dan sel mati yang lebih tinggi (intensitas fluoresensi rendah), menunjukkan efek yang kuat. Tingkat kematian sel yang tinggi dari kelompok yang diobati dengan FGCN dikaitkan dengan internalisasi nanopartikel yang lebih tinggi dalam sel kanker. Hasilnya konsisten dengan uji sitotoksisitas (Gbr. 6).
Analisis morfologi sel kanker HeLa setelah pengobatan dengan GEN, GCN, dan FGCN
Analisis Apoptosis
Dalam penelitian ini, kami telah merancang sistem pengiriman target reseptor asam folat yang unik yang dapat meningkatkan konsentrasi GEN intraseluler dan meningkatkan efek antikanker pada sel kanker serviks. Oleh karena itu, untuk menganalisis sifat induksi apoptosis dari GEN bebas, GCN, dan FGCN NP, sel-sel dinilai dengan flow cytometry setelah pewarnaan ganda annexin V/PI. Gambar 7 menunjukkan bahwa sel yang diobati dengan GEN bebas tidak menginduksi apoptosis sel kanker yang cukup besar sementara GCN (~22%) efektif dalam menginduksi apoptosis pada sel kanker ini. Seperti yang diharapkan, FGCN menunjukkan apoptosis sel kanker yang luar biasa (~ 55%) yang menunjukkan efek antikanker yang unggul. Efek antikanker yang lebih tinggi dari formulasi adalah karena afinitas spesifik ligan ke reseptor yang sesuai yang pada gilirannya meningkatkan konsentrasi obat dalam sel kanker. Hasil dengan jelas mengungkapkan bahwa nanopartikel yang dilapisi kitosan akan bermanfaat untuk pengobatan kanker serviks. Platform nanoteknologi untuk obat antikanker meningkatkan toksisitas dalam sel kanker dan meningkatkan kemanjuran terapi agen antitumor (Gbr. 8).
Uji hidup/mati sel kanker HeLa setelah pengobatan dengan GEN, GCN, dan FGCN. Fluoresensi hijau menunjukkan sel hidup
Analisis apoptosis sel kanker HeLa setelah pengobatan dengan GEN, GCN, dan FGCN. Flow cytometer digunakan untuk menganalisis proporsi apoptosis sel. **p < 0,01 adalah perbedaan statistik antara FGCN dan GEN
Kesimpulan
Dalam penelitian ini, nanopartikel kitosan terkonjugasi asam folat baru diformulasikan untuk pengiriman spesifik bioflavonoid, Genistein (GEN), ke sel kanker serviks. FGCN menunjukkan peningkatan potensi internalisasi dalam sel HeLa dibandingkan dengan GCN. Hasil penelitian mengungkapkan bahwa FGCN memiliki afinitas spesifik terhadap sel HeLa yang akan berkontribusi pada pengobatan yang lebih baik. Nanoformulasi yang diberi tag asam folat menunjukkan efek sitotoksik yang lebih unggul dibandingkan dengan formulasi yang tidak ditargetkan. Secara konsisten, nilai IC50 GEN menurun dari 33,8 menjadi 14,6 g/ml saat diobati dengan FGCN setelah inkubasi 24 jam. Studi apoptosis menunjukkan bahwa nanopartikel FGCN baik GCN atau GEN bebas dalam hal aktivitas antikanker. Secara keseluruhan, hasil mengungkapkan bahwa konjugasi folat ke sistem pengiriman mungkin memiliki efek besar pada kelangsungan hidup kanker serviks yang akan bermanfaat untuk pengobatan kanker secara keseluruhan. Studi tentang model hewan klinis akan menjadi prospek langkah selanjutnya dari penelitian ini.
Singkatan
EPR:
Permeasi dan retensi yang ditingkatkan
FGCN:
nanopartikel kitosan bermuatan GEN terkonjugasi asam folat
