Nanopartikel Chitosan Terkonjugasi Asam Folat Terarah Mengirim Genistein, Meningkatkan Efikasi Antikanker Terhadap Kanker Serviks

Abstrak

Dalam karya ini, kami merakit nanoparticle chitosan yang dikonjugasi asam folat (FGCN) untuk mengirim isoflavon alami genistein (GEN) secara spesifik ke sel kanker serviks. Dibandingkan dengan nanoparticle chitosan yang dimuat GEN polos (GCN), FGCN menunjukkan diameter hidrodinamik sedikit lebih besar (~165 nm) dan muatan permukaan yang sedikit lebih rendah (+21,5 mV). Kedua sistem mencapai entrapment obat >95 % dan pelepasan terkontrol dalam PBS (pH 7,4), melepaskan ~90 % GEN selama 24 jam. Studi penyerapan seluler pada sel HeLa menunjukkan peningkatan internalisasi 2–3 kali lipat yang signifikan secara statistik (p < 0,05) untuk FGCN dibandingkan GCN, yang disebabkan oleh affinitas tinggi asam folat untuk reseptor folat-α (FR-α) yang überekspresi. Uji sitotoksisitas mengungkapkan bahwa IC₅₀ GEN turun dari 33,8 µg/mL (obat bebas) menjadi 14,6 µg/mL saat dikirim melalui FGCN, sementara GCN menurunkan menjadi 26,5 µg/mL. Analisis apoptosis menunjukkan bahwa FGCN menginduksi kematian sel apoptotik >55 %, yang jauh lebih tinggi dari GCN (~22 %) dan GEN bebas. Temuan ini mengonfirmasi bahwa konjugasi folat meningkatkan pengiriman GEN, penyerapan seluler, dan efikasi anti-tumor dalam sel kanker serviks.

Latar Belakang

Kanker serviks tetap menjadi penyebab utama morbilitas di kalangan wanita di seluruh dunia, terutama disebabkan oleh infeksi HPV berisiko tinggi. Meskipun vaksin profilaksis (Gardasil, Cervarix) dan terapi konvensional—bedah, radioterapi, dan kemoterapi—tersedia, mereka masih kurang memadai untuk banyak pasien, terutama di setting dengan sumber daya terbatas. Senyawa alami seperti flavonoid menawarkan aktivitas anti-kanker dengan toksisitas sistemik lebih rendah. Genistein, isoflavon dari kedelai, menghambat protein tirosin kinase dan NF-κB, menghentikan siklus sel pada G2/M, dan menginduksi apoptosis; namun kegunaan klinisnya terbatas oleh ketidakterlarutan air yang rendah (~1,45 µg/mL) dan bioavailabilitas rendah. Enkapsulasi nanoparticle dapat meningkatkan properti fisikokimia ini, meningkatkan akumulasi tumor melalui efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR), dan mengatasi resistensi multi-obat.

Chitosan, polisakarida biodegradabil yang kaya akan amina primer, biokompatibel dan dapat dimodifikasi permukaan. Mengonjugasi asam folat (FA) ke chitosan menargetkan reseptor folat-α, yang überekspresi pada banyak sel kanker serviks, memungkinkan endositosis yang dimediasi reseptor dan pengiriman selektif.

Metode

Bahan-bahan

Genistein (Aladdin Chemicals, Shanghai), chitosan (85 % deasetilasi, Sigma-Aldrich), asam folat, EDC, dan NHS (Sigma-Aldrich) digunakan sebagaimana adanya.

Persiapan Nanopartikel Chitosan yang Dikonjugasi Asam Folat dan Dimuat GEN

Asam folat pertama diaktifkan dengan EDC/NHS dalam DMSO dan dikonjugasi ke chitosan (0,5 % w/w) di bawah pengadukan pada pH 8. Konjugat FA-chitosan yang dihasilkan difurnisikan melalui dialisis. GEN, chitosan, dan FA-chitosan (10:1 w/w) dilarutkan dalam DMSO dan ditetapkan secara titik-titik ke dalam Tween-80 0,5 %, diikuti dengan pengadukan selama 3 jam. Pelarut dihindari, dan suspensi difugasi pada 10 000 rpm (4 °C) selama 30 menit. Muatan obat (DL%) dan efisiensi entrapment (EE%) dihitung dengan HPLC (Agilent LC-1100, kolom C18, 60 % MeOH/40 % H₂O, 1 mL min⁻¹).

Ukuran Partikel dan Morfologi Permukaan

Pencaran cahaya dinamis (Malvern Zetasizer Nano ZS90) mengukur ukuran dan polidispersi. Mikroskopi elektron transmisi (JEOL JEM-1230, 100 kV) memvisualisasikan morfologi.

Pelepasan Obat In Vitro

Pelepasan dievaluasi dengan dialisis (MWCO 3500) dalam PBS (pH 7,4) pada 37 °C dengan pengadukan lembut. Sampel dikumpulkan pada interval yang ditentukan dan dianalisis dengan HPLC.

Budidaya Sel dan Penyerapan

Sel HeLa (ATCC) dipertahankan dalam DMEM +10 % FBS. Penyerapan seluler coumarin-6 yang dimuat GCN dan FGCN diukur dengan pembacaan mikroplate fluoresens (eksitasi 430 nm, emisi 485 nm) dan divisualisasikan dengan mikroskopi konfokal laser skaning (Olympus Fluoview).

Uji Sitotoksisitas, Live/Dead, dan Apoptosis

MTT (5 mg mL⁻¹) mengukur keberlangsungan; nilai IC₅₀ difit menggunakan GraphPad Prism. Pewarnaan live/dead menggunakan calcein AM/etidium homodimer. Apoptosis diukur dengan pewarnaan annexin V/PI dan sitorometri aliran.

Analisis Statistik

Data disajikan sebagai rata-rata ± SD (n = 3). Signifikansi statistik dievaluasi dengan uji t Student (p < 0,05).

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi Fisikokimia

GCN menunjukkan diameter rata-rata 140 nm (+26 mV), sementara FGCN mengukur 165 nm (+21,5 mV). Keduanya memiliki EE% >95 % dan DL% antara 10–12 %. Ukuran dan potensial zeta tetap stabil setelah penyimpanan 3 bulan pada 4 °C.

Kinetik Pelepasan In Vitro

Keduanya GCN dan FGCN melepaskan ~35–40 % GEN dalam 4 jam pertama, mencapai pelepasan kumulatif ~90 % selama 24 jam. Penundaan sedikit dalam pelepasan FGCN disebabkan oleh lapis FA, yang memperpanjang difusi obat.

Penyerapan Seluler

Uji fluoresens menunjukkan penyerapan FGCN 2–3 kali lipat lebih tinggi dibandingkan GCN pada 4 jam (p < 0,05). Citra konfokal mengonfirmasi fluoresens seluler yang intens untuk FGCN, yang menunjukkan endositosis yang berhasil melalui FA.

Sitotoksisitas

Nilai IC₅₀: GEN bebas 33,8 µg mL⁻¹ → GCN 26,5 µg mL⁻¹ → FGCN 14,6 µg mL⁻¹ (24 jam). Efikasi superior FGCN terkait dengan penyerapan yang ditingkatkan dan pelepasan terkontrol, mengurangi efflux yang dimediasi P-glikoprotein.

Apoptosis

Pewarnaan annexin V/PI mengungkapkan tingkat apoptosis 0 % (GEN bebas), 22 % (GCN), dan 55 % (FGCN), yang menekankan potensi pengiriman yang ditargetkan.

Uji Live/Dead

Sel yang treated dengan FGCN menunjukkan fluoresens hijau minimal dan pewarnaan merah yang melimpah, konsisten dengan kematian sel yang tinggi, sedangkan sel yang treated dengan GEN bebas sebagian besar tetap viable.

Kesimpulan

Nanopartikel chitosan terkonjugasi asam folat secara signifikan meningkatkan pengiriman genistein ke sel kanker serviks HeLa, meningkatkan penyerapan seluler, menurunkan IC₅₀ hingga 14,6 µg mL⁻¹, dan menginduksi apoptosis >55 %. Hasil ini mendukung evaluasi preklinis lebih lanjut FGCN sebagai platform anti-kanker yang ditargetkan dan menjanjikan.

Singkatan

EPR

Permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan

FGCN

Nanopartikel chitosan dimuat GEN yang dikonjugasi asam folat

FR

Reseptor folat

GCN

Nanopartikel chitosan dimuat GEN

GEN

Genistein