Terapi Gen Kanker Kolon Efisien dengan Mikel DOTAP–PEG‑PCL Kationik untuk Pengiriman siRNA

Abstrak

Terapi gen berbasis siRNA menawarkan jalan yang menjanjikan untuk pengobatan kanker kolon, namun pengiriman yang aman dan efisien masih menjadi hambatan. Kami merakit mikel kationik (DMP) dengan mengintegrasikan polimer biokompatibel mPEG‑PCL dengan lipid kationik DOTAP, menghasilkan pengangkut yang stabil dan bermuatan positif. Kompleks DMP/siRNA yang menargetkan Bcl‑xl dan Mcl‑1 menunjukkan efisiensi transfeksi tinggi (>85%) dalam sel kanker kolon C26, sitotoksisitas minimal (IC₅₀ = 3,7 µg/mL dalam sel 293T), dan penyamitan gen yang kuat. Dalam model xenograft C26 subkutem, intratumoral injeksi DMP/siBcl‑xl dan DMP/siMcl‑1 mengurangi volume tumor sebesar 65% dan 55%, masing-masing, tanpa toksisitas organ yang terlihat. Temuan ini menetapkan mikel DMP sebagai platform pengiriman siRNA yang aman dan efektif untuk terapi gen kanker kolon.

Pendahuluan

Kanker kolorektal tetap menjadi penyebab utama kematian kanker di seluruh dunia, yang menuntut strategi terapi inovatif. Terapi gen, terutama melalui penurunan ekspresi gen onkogen yang diedarkan oleh siRNA, dapat secara selektif memicu apoptosis pada sel tumor. Namun, terjemahan klinis bergantung pada vektor non‑virus yang menggabungkan efisiensi transfeksi tinggi, imunogenisitas rendah, dan biokompatibilitas. Polimer amfifilik mPEG‑PCL menawarkan biodegradabilitas dan properti stealth, sementara lipid kationik DOTAP menyediakan ikatan asam nukleat yang kuat. Pekerjaan sebelumnya telah menunjukkan mikel DMP dapat mengirimi DNA plasmid secara aman; di sini kami mengevaluasi kapasitasnya untuk mengangkut siRNA yang menargetkan protein anti‑apoptosis Bcl‑xl dan Mcl‑1, pengkondisi utama kelangsungan hidup kanker kolon.

Bahan dan Metode (Ringkas)

• Persiapan DMP: mPEG‑PCL (Mn ≈ 4 kDa) dan DOTAP (5–20 mg) dicairkan bersama dalam klorida metilena, diavaporasi menjadi tipis tipis, dan direhidrasi dalam air. Mikel yang dihasilkan memiliki diameter rata‑rata 145 nm dan potensial zeta +46 mV.
• Kompleksasi siRNA: siRNA (50 nM) dicampur dengan DMP pada rasio massa 30:1 (DMP:siRNA) untuk membentuk kompleks stabil, dikonfirmasi oleh retrasi gel agrosa.
• Uji In Vitro: Efisiensi transfeksi diukur dengan sitometri aliran menggunakan siRNA berlabel FAM; sitotoksisitas melalui MTT; apoptosis melalui pewarnaan Annexin V/PI; penurunan ekspresi gen dievaluasi dengan qPCR.
• Studi In Vivo: tikus BALB/c yang membawa tumor subkutem C26 menerima injeksi intratumoral DMP/siRNA (10 µg per dosis) setiap hari selang hari untuk lima siklus. Volume dan berat tumor dicatat; histologi (H&E) dan uji TUNEL mengevaluasi keamanan dan apoptosis.

Hasil

Karakterisasi Mikel

Mikel DMP menampilkan distribusi ukuran yang sempit (PDI = 0,32), muatan permukaan positif (+46 mV), dan tetap stabil selama >96 jam dalam larutan air. Retrasi gel mengungkapkan enkapsulasi siRNA yang lengkap pada rasio DMP/siRNA ≥30:1.

Sitotoksisitas Rendah dan Transfeksi Tinggi

Nilai IC₅₀: 3,7 µg/mL (293T) dan 0,50 mg/mL (C26), jauh lebih rendah dibandingkan PEI25K (IC₅₀ < 0,1 µg/mL). Efisiensi transfeksi melebihi 85% dalam kondisi bebas serum dan 71–81% dalam kondisi 30% FBS, setara dengan PEI.

Penyamitan Gen yang Diedarkan oleh siRNA

qPCR menunjukkan pengurangan >70% transkrip Bcl‑xl dan Mcl‑1 pada 50–100 nM DMP/siRNA. Uji pembentukan klon dan MTT mengonfirmasi inhibisi yang signifikan terhadap proliferasi C26 (viabilitas sel 56–70%). Tingkat apoptosis meningkat menjadi 33–38% dalam sel yang diobati.

Efisiensi Antitumor In Vivo

Injeksi intratumoral DMP/siBcl‑xl dan DMP/siMcl‑1 mengurangi volume tumor sebesar 65% dan 55%, masing-masing, dan berat tumor menurun menjadi 0,34–0,42 g dari 0,85 g dalam kontrol. Tidak ada abnormalitas histopatologis yang terlihat pada jantung, hati, limpa, paru-paru, atau ginjal.

Pembahasan

Penghalang sebagian dari muatan positif DOTAP oleh mPEG‑PCL mengurangi gangguan protein serum dan sitotoksisitas sambil mempertahankan ikatan dan pengiriman siRNA. Desain ini mengatasi keterbatasan utama lipid kationik konvensional dan mendemonstrasikan keberadaan mikel DMP sebagai pengangkut siRNA yang serbaguna dan bertoksisitas rendah untuk tumor padat.

Kesimpulan

Mikel DMP secara efektif mengirim siRNA Bcl‑xl dan Mcl‑1, yang menginduksi apoptosis dan menghambat pertumbuhan tumor in vitro dan in vivo dengan toksisitas minimal. Mikel ini mewakili platform non‑virus yang menjanjikan untuk terapi gen kanker kolon.