Tabung Nano Karbon Berdinding Tunggal yang Ditargetkan untuk Terapi Fototermal Dikombinasikan dengan Penghambatan Pos Pemeriksaan Imun untuk Pengobatan Kanker Payudara Metastatik
Abstrak
Kontributor terbesar kematian akibat kanker adalah metastasis dan konsekuensi pengobatannya. Di sini, kami menyajikan pengobatan baru kanker payudara metastatik yang menggabungkan terapi fototermal dengan karbon nanotube berdinding tunggal yang ditargetkan (SWCNTs) dan imunostimulasi dengan inhibitor pos pemeriksaan. Kami menemukan bahwa ablasi fototermal inframerah-dekat selektif tumor payudara EMT6 ortotopik primer pada mencit BALB/cJ syngeneic menggunakan annexin A5 (ANXA5) biokonjugat SWCNT yang difungsikan secara sinergis meningkatkan protein terkait-limfosit anti-sitotoksik 4 (anti-CTLA- 4) tergantung respon abscopal, menghasilkan peningkatan kelangsungan hidup (55%) pada 100 hari setelah inokulasi tumor. Sebagai perbandingan, tidak ada kelangsungan hidup pada 100 hari baik untuk terapi fototermal sendiri atau imunostimulasi dengan sendirinya. Sebelum terapi fototermal, biokonjugat SWCNT-ANXA5 diberikan secara sistemik dengan dosis yang relatif rendah 1,2 mg/kg, di mana ia kemudian terakumulasi dalam pembuluh darah tumor melalui pengikatan yang bergantung pada ANXA5. Selama terapi fototermal, suhu maksimum rata-rata di tumor mencapai 54 °C (durasi 175 detik). Mekanisme kelangsungan hidup berkepanjangan yang dihasilkan dari ablasi fototermal kombinatorial dan stimulasi imun dievaluasi dengan kuantifikasi aliran sitometrik sel efektor imun antitumor limpa dan kuantifikasi sitokin serum.
Pengantar
Metastasis dan konsekuensi pengobatannya adalah penyebab tunggal kematian terbesar pada kanker [1]. Misalnya, ketika kanker payudara bermetastasis, tingkat kelangsungan hidup pasien selama 5 tahun turun di bawah 25%. Meskipun dalam 60 tahun terakhir lebih dari 200 obat antineoplastik baru telah meningkatkan hasil pasien, kelangsungan hidup secara keseluruhan tetap buruk pada penyakit metastasis [2]. Di sini, kombinasi baru terapi fototermal yang difasilitasi oleh biokonjugat karbon nanotube berdinding tunggal tumor (SWCNT) yang ditargetkan tumor dan penghambatan pos pemeriksaan terkait protein 4 (anti-CTLA-4) anti-sitotoksik T-limfosit dipelajari untuk mengobati kanker payudara metastatik di model murine ortotopik.
Sifat unik SWCNTs sebagai bahan nano telah menghasilkan minat yang signifikan dalam penggunaannya sebagai alat potensial dalam memerangi kanker. Sementara SWCNTs mengerahkan berbagai efek biologis, penggunaan SWCNTs dalam pengobatan kanker telah difokuskan terutama pada interaksi mereka dengan cahaya inframerah-dekat (NIR) dan efek fototermal yang dihasilkan, di mana SWCNTs dengan cepat memanaskan tumor dalam proses yang disebut terapi fototermal. (PTT). Banyak kelompok telah menyelidiki potensi SWCNTs untuk digunakan dalam strategi pengobatan berbasis PTT di beberapa model kanker payudara [3,4,5,6,7,8,9,10]. Karya-karya ini sebagian besar berfokus pada kemampuan PTT untuk mengobati tumor primer pada kedalaman tidak lebih dari beberapa mm, di mana redaman cahaya NIR hampir selesai.
Sebelumnya, kami menunjukkan bahwa tumor payudara ortotopik primer pada mencit syngeneic hampir dapat dihilangkan sepenuhnya menggunakan sinar laser NIR ringan dalam hubungannya dengan biokonjugat SWCNT peningkat fototermal [11]. Dalam biokonjugat ini, SWCNTs difungsikan dengan protein annexin A5 (ANXA5), yang berikatan dengan afinitas tinggi terhadap fosfolipid fosfatidilserin anionik yang diekspresikan secara eksternal pada sel tumor dan pada sel endotel pembuluh darah tumor, tetapi tidak pada sel normal dalam pembuluh darah. 12,13,14]. Konjugat ini divisualisasikan menggunakan mikroskop kekuatan atom (AFM) untuk menunjukkan bahwa ketinggian konjugat adalah antara 2,5 dan 5,0 nm, yang mirip dengan konjugat protein SWCNT lainnya [11]. Sementara mampu memberantas tumor primer dalam model metastasis sebelumnya, terapi fototermal saja hanya sedikit memperpanjang kelangsungan hidup. Namun, kami menemukan bukti awal yang menunjukkan bahwa pengobatan bersamaan dengan imunomodulator seperti siklofosfamid mampu meningkatkan kelangsungan hidup.
Baru-baru ini, potensi imunomodulator seperti siklofosfamid untuk secara sinergis meningkatkan PTT yang diarahkan SWCNT telah menjadi topik yang menarik. Salah satu kategori agen imunomodulasi yang menjanjikan adalah inhibitor pos pemeriksaan. Inhibitor pos pemeriksaan adalah antibodi seperti anti-CTLA-4, anti-PD-1, dan anti-PDL-1 yang mengikat protein sel penting yang bertanggung jawab untuk memodulasi respons tubuh terhadap kanker. Antibodi ini memblokir "pos pemeriksaan" biologis utama di mana tubuh dapat menurunkan respons sistem kekebalan terhadap kanker. Protein ini biasanya berperan penting dalam mengendalikan respons imunologis tubuh. Dengan menghalangi aksi protein ini, inhibitor pos pemeriksaan menghilangkan mekanisme di mana sistem kekebalan biasanya menekan respons antitumor alaminya. Baru-baru ini, beberapa kelompok telah mengamati bahwa kombinasi penghambatan titik pemeriksaan anti-CTLA-4 dengan PTT yang ditingkatkan SWCNT memiliki potensi untuk meningkatkan respons imun yang kuat pada kanker payudara [15, 16].
Dalam penelitian saat ini, kami mengevaluasi kombinasi modalitas PTT baru kami dalam hubungannya dengan agen imunostimulan, anti-sitotoksik T-limfosit terkait protein 4 (anti-CTLA-4). Awalnya disetujui untuk pengobatan melanoma metastatik [17], anti-CTLA-4 sekarang sedang diuji untuk mengobati kanker payudara dalam uji klinis yang dikombinasikan dengan agen imunostimulator lainnya [18]. Kami mengevaluasi mekanisme peningkatan kekebalan antineoplastik di PTT dalam kombinasi dengan penghambatan pos pemeriksaan anti-CTLA-4, serta nasib jangka panjang SWCNT di organ target.
Bahan dan Metode
Materi
Pengkodean plasmid ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, sebelumnya dibuat di laboratorium ini [11]. Albumin serum sapi (BSA), Triton X-100, EDTA, -mercaptoethanol, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), dan buffer Tris-acetate-EDTA berasal dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Natrium fosfat dan natrium dodesil sulfat (SDS) berasal dari Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). Etanol kelas HPLC berasal dari Acros Organics (Waltham, MA). Kolom perangkapnya berasal dari GE Healthcare (Chicago, IL). Buffer pewarnaan flow cytometry, buffer fiksasi/permeabilisasi, buffer permeabilisasi, kit kuantifikasi endotoksin kromogenik, dan kaset dialisis Slide-A-Lyzer (3,5 kDa) berasal dari Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Membran dialisis 2 dan 100 kDa berasal dari Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Media sel Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) dan larutan garam seimbang Hank berasal dari ATCC (Manassas, VA). Fetal bovine serum (FBS) berasal dari Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Tripton, ekstrak ragi, dan kanamisin monosulfat diperoleh dari Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Natrium hidroksida, kalium klorida, dan natrium klorida berasal dari VWR Inc (Radnor, PA). Protease HRV-C3 berasal dari Sino Biologics (Portland, OR). Antibodi monoklonal tikus anti-CTLA-4 (klon:9H10) dan kit ELISA sitokin tikus (TNF-α, IFN-γ, IL-6) diperoleh dari BioLegend (San Diego, CA). CoMoCAT SWCNTs (diameter rata-rata 0,8 ± nm, panjang rata-rata 1,5 ± 0,5 µm) diperoleh dari CHASM (Boston, MA). Metode CoMoCAT diketahui menghasilkan SWCNT dari sejumlah kecil (n ,m ) kiralitas dengan selektivitas tinggi [19]. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini sangat diperkaya dengan [5, 6] SWCNT, yang menunjukkan penyerapan cahaya NIR yang kuat pada panjang gelombang 980 nm. Penyerapan ini sesuai dengan S11 transisi untuk jenis nanotube ini antara singularitas van Hove yang terisi ke singularitas kosong yang sesuai. Oleh karena itu, untuk memaksimalkan penyerapan radiasi oleh SWCNT yang disimpan pada tumor, panjang gelombang laser yang digunakan dalam penelitian ini adalah 980 nm agar sama persis dengan S11 transisi optik [20]. Gambar S1 dalam file tambahan 1 menunjukkan spektrum fluoresensi, dengan jelas menunjukkan S11 Emisi NIR setelah menggairahkan transisi S22 dengan cahaya tampak.
Pembiakan Sel
Sel kanker payudara EMT6 dari ATCC (Manassas, VA) dikultur dalam media MB 752/1 Waymouth dengan 2 mM L-glutamin yang dilengkapi dengan 15% FBS. Semua sel ditumbuhkan pada suhu 37 °C dan kelembaban 100% di bawah 5% CO2 . Semua sel dilewatkan menggunakan tripsin 0,25% (b/v) dalam 0,53 mM EDTA. Garis keturunan sel dan status bebas mikoplasma dikonfirmasi melalui pengujian STR (Sungai Charles) dan diuji menjadi bebas endotoksin dengan pengujian limulus.
Produksi ANXA5 dan SWCNT-ANXA5
Konjugat SWCNT-ANXA5 disiapkan menggunakan prosedur yang kami kembangkan sebelumnya yang memberikan 2,5 mg ANXA5/mg SWCNT [11]. Secara singkat, E. koli ditransfeksi dengan plasmid encoding ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, ditumbuhkan dan dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas logam amobil dengan Ni
2+
amobil untuk mengisolasi ANXA5, yang melibatkan pembelahan enzimatik untuk menghilangkan (His)6 menandai. SWCNT CoMoCAT kering-beku didispersikan dalam 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) menggunakan dua siklus sonikasi probe pada 20 W dan sentrifugasi pada 29.600 g masing-masing selama 30 menit. SWCNT yang ditangguhkan dicirikan oleh fluoresensi NIR (File tambahan 1:Gambar S1) dan kemudian dikonjugasikan ke penaut 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-phosphoethanolamine-polyethylene glycol-maleimide (DSPE-PEG-maleimide) selama 30 menit pada suhu kamar untuk memungkinkan interaksi hidrofobik antara SWCNT dan gugus fungsi DSPE. Ini kemudian diikuti oleh dialisis 8 jam dalam air suling untuk menghilangkan kelebihan linker dan SDS. Konjugat yang didialisis kemudian direaksikan dengan ANXA5, yang mengandung satu gugus sistein, selama 2 jam dan diblokir dengan 1,5 mg ml
−1
L-sistein. Produk akhir, SWCNT-ANXA5, didialisis terhadap 20 mM buffer natrium fosfat selama 8 jam untuk menghilangkan kelebihan ANXA5 dan L-sistein. Berat dan kemurnian protein dikarakterisasi melalui SDS-PAGE. Kandungan SWCNT dan ANXA5 dari biokonjugat dikarakterisasi dengan spektroskopi fluoresensi UV–Vis–NIR, analisis Raman Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), dan uji Bradford (File tambahan 1:Gambar S2).
Studi Di Vivo
Semua prosedur mematuhi protokol yang disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dari University of Oklahoma. Digunakan tikus betina BALB/cJ betina usia 6 minggu (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Tikus diberi makan makanan chow standar. Selama penyinaran fototermal tumor dengan sinar laser NIR, tikus dibius dengan isofluran 2% dan oksigen 98% menggunakan kerucut hidung.
Tumor diinduksi dengan injeksi ortotopik 10
6
Sel kanker payudara tikus EMT6 dalam 100 L PBS ke dalam bantalan lemak payudara IV. Tumor dibiarkan tumbuh selama 12 hari, dan saat mencapai volume 60 mm
3
(diameter ~ 5 mm), tikus menerima i.v. sistemik. injeksi 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT per kg berat badan) biokonjugasi melalui vena ekor lateral. Setelah 3 jam, area 5 mm yang melebihi batas tumor diiradiasi dengan cahaya NIR (980 nm) pada tingkat energi dan daya 175 J/cm
2
dan 1 L/cm
2
, masing-masing (waktu 175 dtk; laser Diodevet-50 NIR, B&W Tek Inc., Newark, DE). Penghambatan pos pemeriksaan dilakukan dengan serial i.p. pemberian 200 g antibodi anti-CTLA-4 dalam 100 l PBS pada hari ke 8, 11 dan 16 setelah inokulasi tumor. Volume tumor dihitung dengan rumus ellipsoid yang dimodifikasi \(V =\frac{1}{2} \times {\text{length}} \times {\text{width}}^{2}\) menggunakan pengukuran caliper dari dimensi terpanjang dan lebar tegak lurus. Suhu tumor dipantau oleh kamera termal FLIR TG165 Spot genggam (Raymarine ITC, Fareham, UK) yang disetel ke pemindaian otomatis untuk suhu maksimum yang terdeteksi. Organ target diambil untuk evaluasi toksisitas dan difiksasi dalam formalin buffer netral 10%, dan slide yang diwarnai dengan formalin-fixed-paraffin-embedded (FFPE) disiapkan dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin untuk analisis toksisitas.
Deteksi SWCNT Ex Vivo
Tikus menerima injeksi sistemik 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT/kg berat badan) melalui vena ekor lateral. Pada titik waktu tertentu, tikus (n = 3) di-eutanasia, dinekropsi, dan organ target diambil untuk dianalisis. Sampel jaringan disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [21]. Kehadiran SWCNT dalam sampel jaringan ex vivo kemudian ditentukan dengan spektroskopi fluoresensi NIR relatif menggunakan NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).
Flow Cytometry
Tikus di-eutanasia 14 hari pasca perawatan, dan sel efektor imun antitumor limpa dikuantifikasi seperti yang dijelaskan sebelumnya [21].
Deteksi Sitokin
Setelah perawatan seperti dijelaskan di atas, tikus (n = 4–5) di-eutanasia 7 hari setelah terapi fototermal untuk pengambilan darah. Konsentrasi tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interferon gamma (IFN-γ), dan interleukin 6 (IL-6) dalam sampel serum yang diencerkan diukur dengan ELISA sesuai dengan protokol pemasok.
Analisis Statistik
Data dianalisis dengan software Graphpad Prism. Signifikansi statistik dinilai menggunakan ANOVA satu arah dan uji perbandingan ganda Tukey-Kramer. Signifikansi statistik kurva kelangsungan hidup ditentukan oleh uji log-rank Mantel-Haenszel. Signifikansi statistik konsentrasi serum sitokin dianalisis dengan ANOVA satu arah dan uji perbandingan berganda Dunnett. Beberapa perbandingan dikoreksi oleh ambang Bonferroni. Kesalahan direpresentasikan secara grafis sebagai kesalahan standar rata-rata kecuali kesalahan tidak melebihi ukuran simbol titik rata-rata yang diplot, dalam hal ini batang dikecualikan untuk kejelasan.
Hasil
Kinetika Termal
Menggunakan dosis 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5, suhu maksimum tumor dicatat selama pengobatan dengan cahaya NIR, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Tikus yang menerima SWCNT-ANXA5 sebelum iradiasi memiliki suhu tumor yang lebih tinggi untuk seluruh perlakuan cahaya NIR dibandingkan dengan mencit yang menerima salin fisiologis. Suhu rata-rata tumor untuk tikus yang menerima SWCNT-ANXA5 berbeda secara signifikan dibandingkan dengan tikus yang menerima salin fisiologis (54 °C vs. 37 °C, p < 0,05). Sebagai hasil dari terapi fototermal yang ditingkatkan ini, hanya pada kelompok SWCNT-ANXA5 terjadi ablasi tumor yang terlihat. Ablasi tumor ditandai dengan perubahan warna yang cepat, diikuti oleh kontraktur kulit dan munculnya kerutan. Dalam 48 jam, eschar yang signifikan terbentuk di lokasi ablasi fototermal. Pertumbuhan kembali kulit secara menyeluruh membutuhkan waktu beberapa minggu.
Kinetika termal yang dihasilkan dari radiasi tumor dengan cahaya NIR pada 980 nm. Tikus BALB/cJ yang membawa tumor EMT6 disuntik dengan i.v. di vena ekor dengan 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. Setelah menunggu 3 jam untuk memungkinkan pembersihan SWCNT dari sirkulasi, tumor diiradiasi dengan laser NIR pada energi dan kepadatan daya 175 J/cm
2
dan 1 L/cm
2
, masing-masing (t = 175 s). Suhu maksimum tumor dicatat sebagai fungsi waktu. Suhu tumor dari tikus yang menerima SWCNT secara signifikan lebih tinggi daripada tikus yang menerima garam fisiologis pada t = 175 s (p < 0,05). Data disajikan sebagai mean ± SE (n = 3)
Terapi Fototermal dan Penghambatan Pos Pemeriksaan
Hasil dari kombinasi terapi fototermal dengan inhibisi pos pemeriksaan menggunakan antibodi monoklonal anti-CTLA-4 ditunjukkan pada Gambar 2. Sementara terapi fototermal saja dapat membasmi neoplasia kanker payudara primer, ketidakmampuan sinar laser NIR untuk menembus lebih dari beberapa mm membatasi pengobatan metastasis kanker payudara. Untuk mengatasi kekurangan pengobatan antineoplastik fototermal NIR lokal, kami mengeksplorasi kombinasi modalitas pengobatan terapeutik yang unik ini dengan penghambatan pos pemeriksaan sistemik (Gbr. 2). Sementara terapi fototermal unggul dalam menghancurkan tumor EMT6 primer (Gbr. 2a), pengobatan ini gagal memberantas metastasis dan hanya sedikit meningkatkan kelangsungan hidup tikus yang membawa tumor ortotopik EMT6 (Gbr. 2b). Sebaliknya, penghambatan pos pemeriksaan dengan anti-CTLA-4 meningkatkan kelangsungan hidup secara keseluruhan tetapi hanya menunda pertumbuhan tumor primer untuk sementara. Meskipun tidak ada terapi saja yang menghasilkan peningkatan kelangsungan hidup secara keseluruhan, kombinasi terapi fototermal SWCNT-ANXA5 yang ditingkatkan dan penghambatan pos pemeriksaan anti-CTLA-4 meningkatkan kelangsungan hidup secara keseluruhan, yang mengarah pada kelangsungan hidup 55% pada 100 hari setelah inokulasi tumor.
Hasil terapi fototermal kombinatorial (PTT) dan penghambatan pos pemeriksaan (anti-CTLA-4) pada tumor EMT6. Tikus dengan tumor syngeneic orthotopic berkembang dengan baik (d 5 mm) diberikan secara i.v. dosis sistemik 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5. a Volume tumor kemudian dipantau setelah penyinaran (panah) dengan sinar laser NIR selama 175 dtk dengan kepadatan daya 1 W/cm
2
pada hari ke 12 setelah inokulasi. Selain PTT, kelompok tertentu menerima anti-CTLA-4 (100 g) pada hari ke 8, 11, dan 16. Tikus pada kelompok kontrol disuntik i.v. dengan garam fisiologis. Volume tumor ditampilkan sebagai mean ± SE (n = 7). Signifikansi dibandingkan dengan kontrol ditunjukkan oleh * (p < 0,05). b Kombinasi terapi fototermal dan penghambatan pos pemeriksaan kekebalan secara signifikan meningkatkan kelangsungan hidup dibandingkan dengan kontrol (p < 0,05, n = 7). c , d Hanya ketika tikus menerima terapi fototermal dalam hubungannya dengan penghambatan pos pemeriksaan anti-CTLA-4 meningkat secara signifikan dalam jumlah relatif CD4
+
dan CD8
+
splenosit diamati 2 minggu setelah PTT. Splenosit ditampilkan sebagai mean ± SE (n = 3). Signifikansi ditunjukkan oleh *** (p < 0.005)
Analisis sitometrik sel efektor limpa setelah pengobatan mengungkapkan mekanisme dugaan peningkatan kelangsungan hidup pada tikus yang menerima terapi fototermal kombinatorial dan penghambatan pos pemeriksaan. Tikus diinokulasi dengan EMT6 dan diperlakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Dua minggu setelah pengobatan, tikus dikorbankan dan persentase dan jumlah relatif dari beberapa tipe efektor imun dikuantifikasi. Populasi sel T pembantu, sel T sitotoksik, neutrofil, monosit sel penekan turunan myeloid (MDSC), sel T regulator FoxP3, dan makrofag dievaluasi (File tambahan 1:Gambar S3). Analisis populasi ini mengungkapkan perbedaan yang signifikan antara populasi perlakuan dan kontrol hanya pada tikus yang menerima kombinasi terapi fototermal dan penghambatan pos pemeriksaan anti-CTLA-4 bersama-sama. Pada hewan yang menerima kombinasi ini, kami mengamati peningkatan jumlah relatif sel T pembantu (CD4
+
) dan sel T sitotoksik (CD8
+
), (Gbr. 2c, d). Peningkatan CD4
+
dan CD8
+
jumlah sel berkorelasi dengan peningkatan ukuran limpa yang diamati setelah nekropsi.
Selain analisis sitometrik sel efektor limpa, konsentrasi sitokin serum ditentukan 7 hari setelah PTT untuk membantu menjelaskan mekanisme imunitas antitumor. Tingkat sitokin pro-inflamasi IL-6, IFN-γ, dan TNF-α disajikan pada Gambar. 3. Baik pengobatan SWCNT maupun anti-CTLA-4 saja secara signifikan meningkatkan kadar sitokin dibandingkan dengan kelompok kontrol yang tidak diobati. Namun, pengobatan PTT saja mampu meningkatkan TNF-α secara signifikan. Penambahan lebih lanjut dari anti-CTLA-4 pada pengobatan PTT secara signifikan meningkatkan kadar TNF-α, IL-6, dan IFN-γ.
Konsentrasi sitokin serum. Kuantifikasi kadar sitokin serum dalam serum tikus 7 hari setelah PTT menunjukkan peningkatan signifikan kadar IL-6, IFN-γ, dan TNF-α pada tikus yang mengikuti PTT dalam hubungannya dengan penghambatan check-point (anti-CTLA-4). Hasil ditunjukkan untuk kontrol yang tidak diberi perlakuan, hanya pengobatan SWCNT, pengobatan anti-CTLA-4 saja, pengobatan PTT, dan pengobatan PTT + anti-CTLA-4. Data disajikan sebagai mean ± SE (n = 4–5). Signifikansi statistik dianalisis untuk kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol yang tidak diobati dengan ANOVA satu arah dengan uji perbandingan ganda Dunnett. Signifikansi statistik ditunjukkan dengan * (p < 0.05) dan **** (p < 0,0001)
Biodistribusi dan Toksisitas SWCNT-ANXA5
Biodistribusi SWCNT-ANXA5 setelah pemberian untuk peningkatan terapi fototermal di berbagai organ dipantau dengan kuantifikasi fluoresen SWCNT dalam lisat jaringan ex situ dibandingkan dengan standar (File tambahan 1:Gambar S4). Biodistribusi di organ target diikuti selama 4 bulan setelah i.v. injeksi 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 pada tikus sehat (Gbr. 4a, b). Sebaliknya, akumulasi SWCNT-ANXA5 pada tikus yang mengandung tumor EMT6 setelah pemberian, sesuai dengan protokol injeksi yang dijelaskan sebelumnya, ditentukan pada 3 jam setelah pemberian. (Waktu di mana terapi fototermal dilakukan dalam studi pengobatan.) Selama periode 4 bulan sebelum pengambilan organ, tikus dipantau untuk efek samping fisik dan perilaku abnormal. Tidak ada efek samping yang diamati pada setiap tikus yang disuntik dengan SWCNT-ANXA5 selama periode waktu ini. Tidak ada toksisitas histopatologi yang diamati selama pemeriksaan bagian FFPE yang diwarnai hematoxylin dan eosin dari organ target pada akhir penelitian (File tambahan 1:Gambar S5).
Biodistribusi SWCNT-ANXA5 diukur sebagai % dari dosis yang disuntikkan (a ) dan konsentrasi jaringan dalam g/L (b ). Konjugat SWCNT-ANXA5 adalah i.v. disuntikkan ke tikus Balb/cJ dengan dosis 1,2 mg/kg. Konsentrasi SWCNT diukur pada berbagai organ mencit tanpa tumor setelah 1, 2, 3, dan 4 bulan (kiri ke kanan). Untuk tikus dengan tumor, konsentrasi SWCNTs diukur pada waktu yang akan segera sebelum pengobatan terapi fototermal. Data ditampilkan sebagai mean ± SE (n = 3)
Diskusi
Data yang disajikan di sini memberikan dukungan untuk efektivitas menggabungkan terapi fototermal yang ditargetkan dan penghambatan pos pemeriksaan kekebalan untuk pengobatan kanker payudara metastatik. Fenomena ini dikenal sebagai "efek abscopal," yang menggambarkan kemampuan radiasi lokal untuk memulai respon antitumor yang menekan pertumbuhan tumor jauh ke target utama. Pada awal tahun 1950-an, peneliti mengamati bahwa penyinaran tumor lokal memiliki efek yang signifikan pada tumor jauh [22]. Studi telah menetapkan bahwa sifat sistemik dari efek abscopal disebabkan oleh respon imun pejamu [23,24,25]. Sementara -iradiasi telah menjadi fokus utama dari sebagian besar penelitian abscopal, semakin banyak pekerjaan menunjukkan bahwa terapi fototermal dapat menginduksi efek abscopal juga. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa ablasi termal dalam kombinasi dengan inhibitor pos pemeriksaan anti-CTLA-4, menghasilkan respon imun yang tinggi [16, 26,27,28,29]. Kami mengamati respons abscopal serupa setelah ablasi fototermal yang ditargetkan dan blokade anti-CTLA-4 dalam model kanker payudara EMT6.
Efek abscopal diilustrasikan oleh data pada Gambar. 2a, b. Tumor orthotopic EMT6 tumbuh dengan cepat dan telah bermetastasis pada saat mereka dirawat dengan terapi fototermal. Inilah alasan mengapa tikus dengan tumor yang diobati hanya dengan terapi fototermal hanya memiliki sedikit peningkatan kelangsungan hidup dibandingkan dengan tikus kontrol yang tidak diobati, meskipun tumor primer telah sepenuhnya dihilangkan. Pemberian anti-CTLA-4 saja menunda pertumbuhan tumor dibandingkan dengan kontrol dan meningkatkan waktu kelangsungan hidup hingga 68 hari tetapi tidak mengarah pada penyembuhan. Hasil serupa dari pertumbuhan tumor EMT6 yang tertunda diamati oleh Jure-Kunkel et al. ketika anti-CTLA-4 diberikan [30]. Untuk kombinasi terapi fototermal dan anti-CTLA-4, 55% tikus yang diobati bertahan hidup 100 hari setelah inokulasi tumor dan kemungkinan sembuh.
Pemahaman tentang mekanisme imunitas antitumor dievaluasi dengan menggunakan flow cytometry untuk mengukur populasi sel efektor imun di limpa. Dibandingkan dengan terapi fototermal atau anti-CTLA-4 saja, terapi kombinasi menghasilkan peningkatan tujuh kali lipat dalam CD4 pembantu
+
Sel T dan peningkatan CD8 sitolitik tiga kali lipat
+
sel T, kedua hasil ini sangat signifikan secara statistik (p < 0,005). Hasil ini memberikan bukti lebih lanjut dari respon abscopal potensial dengan kombinasi fototerapi dan terapi co-stimulasi sel T dengan penghambatan pos pemeriksaan imun.
Peningkatan CD4
+
dan CD8
+
jumlah sel berkorelasi dengan peningkatan ukuran limpa yang diamati selama nekropsi. Peningkatan ukuran limpa menunjukkan respon imun yang meningkat. Limpa terdiri dari beberapa jenis sel, yang paling umum adalah CD4
+
, CD8
+
, dan garis keturunan sel B [31, 32]. Meskipun tidak dieksplorasi dalam kerangka kerja ini, kami memperkirakan jumlah sel B meningkat seiring dengan CD4
+
dan CD8
+
Jumlah sel T [33]. CD4 Pembantu
+
Sel T membantu dalam imunitas humoral dengan memfasilitasi sel imun lain dengan stimulasi sitokin dan interaksi sel-sel langsung. CD8 sitolitik
+
Sel T langsung membunuh sel tumor. Peningkatan CD4
+
dan CD8
+
jumlah sel menunjukkan respon imun abscopal sistemik.
Kehadiran respon imun abscopal sistemik setelah pengobatan kombinasi lebih lanjut didukung oleh peningkatan kadar sitokin pro-inflamasi serum tikus (Gbr. 3). TNF-α mengaktifkan makrofag terkait tumor untuk memberikan efek antitumor [34, 35]. IFN-γ memainkan peran penting dalam pengawasan tumor [36, 37]. IL-6 mempromosikan proliferasi makrofag dan limfosit [38]. Peningkatan signifikan dalam molekul efektor ini dalam serum tikus 7 hari setelah pengobatan PTT yang dikombinasikan dengan anti-CTLA-4 semakin mendukung adanya respons imun antitumoral.
Pada akhir iradiasi mencit yang menerima SWCNT, suhu maksimum rata-rata tumor adalah 54 °C; suhu ini cukup untuk sepenuhnya mengikis tumor (Gbr. 1). Ini berada dalam kisaran 45-60 °C di mana inaktivasi enzim dan kerusakan mitokondria terjadi [39]. Suhu tumor pada kelompok kontrol salin tetap di bawah 40 °C, suhu yang memberikan manfaat terapeutik minimal [39,40,41].
Kami mengamati sebagian besar akumulasi SWCNT-ANXA5 berdasarkan konsentrasi terutama di hati, jantung, limpa, ginjal, paru-paru, dan tumor (Gbr. 4a). Pada tikus dengan tumor EMT6, kami mengamati bahwa konsentrasi SWCNT-ANXA5 serupa dengan konsentrasi di hati dan ginjal (Gbr. 4a, b). Jumlah jejak SWCNT-ANXA5 terdeteksi di otak, usus besar, dan usus kecil. Penting untuk dicatat bahwa biodistribusi SWCNT berdasarkan % dosis injeksi (ID) tidak berkorelasi baik dengan konsentrasi absolut SWCNT dalam jaringan target. Hal ini terutama disebabkan oleh perbedaan antara berat organ. Misalnya, % ID yang diberikan dalam suatu organ akan sesuai dengan konsentrasi yang lebih tinggi di dalam organ yang lebih kecil, dan konsentrasi yang lebih kecil di dalam organ yang lebih besar. Membandingkan sampel berdasarkan konsentrasi SWCNT mengungkapkan bahwa konsentrasi tertinggi ada di dalam ginjal, diikuti oleh hati dan limpa (Gbr. 4a).
Ada beberapa bukti degradasi SWCNTs di berbagai organ selama periode studi biodistribusi (Gbr. 4a, b). Degradasi SWCNTs di organ diharapkan berdasarkan temuan sebelumnya bahwa nanotube karbon berdinding banyak terdegradasi dalam makrofag [42]. SWCNT yang digunakan dalam penelitian kami memiliki diameter rata-rata 0,8 nm dan panjang rata-rata 1500 µm. Ukuran ini diperkirakan tidak bersifat sitotoksik berdasarkan penelitian Zhu et al. [43], yang mengklasifikasikan potensi kerusakan lapisan ganda lipid oleh toksisitas karbon nanotube berdasarkan panjang dan diameter. Menurut klasifikasi ini, SWCNT yang kami gunakan berada dalam kategori "lunak secara biologis", meminimalkan sitotoksisitas, yang konsisten dengan pengamatan kami dalam penelitian pada tikus di mana kami tidak mengamati efek samping atau toksisitas histopatologis sebagai akibat dari pemberian SWCNT -ANXA5 konjugasi.
Kesimpulan
Di sini, kami mendemonstrasikan modalitas pengobatan kombinatorial baru di mana kami memperoleh tingkat kelangsungan hidup yang relatif tinggi pada tikus dengan kanker payudara metastatik agresif menggunakan terapi fototermal dengan biokonjugat SWCNT-ANXA5 yang dikombinasikan dengan penghambatan pos pemeriksaan berbasis anti-CTLA-4. Penggunaan protein penargetan tumor vaskular ANXA5 meminimalkan jumlah SWCNT yang dikirim secara sistemik yang diperlukan untuk memberantas tumor primer dalam dosis satu kali yang rendah. Menariknya, kami mencatat peningkatan kelangsungan hidup tikus dengan kanker metastatik yang diobati dengan terapi kombinatorial, meskipun hanya tumor primer yang diradiasi. Sebuah studi mekanistik yang mengukur jumlah sel efektor antitumor limpa yang penting mengungkapkan bahwa hanya kombinasi dari kedua modalitas pengobatan yang meningkatkan jumlah CD4
+
pembantu dan CD8
+
sel T sitotoksik. We hypothesize that this increase in T cells reflects an abscopal response, where antitumoral effector cells suppressed tumor metastasis. Although SWCNTs were still found to be present in organs 4 months after administration, no side effects or apparent tissue toxicity were observed during the course of experiments.
Ketersediaan Data dan Materi
All data are fully available without restriction.
Singkatan
SWCNT:
Single-walled carbon nanotube
ANXA5:
Annexin A5
anti-CTLA-4:
Anti-cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
EDTA:
Ethylenediamine tetraacetic acid
SDS-PAGE:
Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis
