Terapi Fototermal Nanotub Karbon Target Terpadu dengan Penghematan Checkpoint: Strategi Baru untuk Kanker Payudara Metastatik

Abstrak

Penyebab terbesar dari kematian kanker adalah metastasi dan konsekuensi dari pengobatannya. Di sini, kami menyajikan perawatan baru untuk kanker payudara metastatik yang menggabungkan terapi fototermal dengan nanotub tunggal karbon (SWCNT) yang ditargetkan dan immunostimulasi dengan inhibitor checkpoint. Kami menemukan bahwa ablasi fototermal inframerah dekat selektif terhadap payudara EMT6 ortotopik primer pada tikus BALB/cJ sinygenik menggunakan biokonjugat SWCNT yang difungsikan dengan aneksin A5 (ANXA5) secara sinergis meningkatkan respons abskopal yang bergantung pada anti-protein asosien limfosit T sitotoksik 4 (anti-CTLA-4), resulting in increased survival (55%) at 100 days after tumor inoculation. Dibandingkan, tidak ada kelangsungan hidup pada hari ke-100 baik untuk terapi fototermal sendiri maupun immunostimulasi sendiri. Sebelum terapi fototermal, biokonjugat SWCNT-ANXA5 diberikan secara sistemik pada dosis relatif rendah 1,2 mg/kg, di mana kemudian mengakumulasi pada vaskulatur tumor melalui binding yang bergantung pada ANXA5. Selama terapi fototermal, suhu maksimum rata-rata dalam tumor mencapai 54 °C (durasi 175 s). Mekanisme kelangsungan hidup yang panjang yang dihasilkan dari ablasi fototermal kombinatorial dan stimulasi imun dievaluasi dengan pengukuran citometrik sel efesif antitumor limpa dan pengukuran sitokin serum.

Pendahuluan

Metastasi dan konsekuensi dari pengobatannya adalah penyebab utama kematian pada kanker [1]. Misalnya, ketika kanker payudara metastasis, tingkat kelangsungan hidup pasien 5 tahun jatuh di bawah 25%. Meskipun selama 60 tahun terakhir lebih dari 200 obat antineoplasia baru telah meningkatkan hasil pasien, kelangsungan hidup secara keseluruhan masih buruk pada penyakit metastasis [2]. Di sini, kombinasi baru dari terapi fototermal yang diakses oleh biokonjugat SWCNT ditargetkan tumor dan penghematan checkpoint anti-protein asosien limfosit T sitotoksik 4 (anti-CTLA-4) dipelajari untuk pengobatan kanker payudara metastasis dalam model murin ortotopik.

Properti unik SWCNT sebagai nanomaterial telah menghasilkan minat signifikan dalam penggunaannya sebagai alat potensial dalam perjuangan melawan kanker. Meskipun SWCNT memiliki berbagai efek biologis, penggunaan SWCNT dalam pengobatan kanker telah difokuskan terutama pada interaksinya dengan cahaya inframerah dekat (NIR) dan efek fototermal yang dihasilkan, di mana SWCNT dengan cepat memanaskan tumor dalam proses yang disebut terapi fototermal (PTT). Banyak kelompok telah menyelidiki potensi SWCNT untuk digunakan dalam strategi pengobatan berbasis PTT dalam beberapa model kanker payudara [3,4,5,6,7,8,9,10]. Karya-karya ini terutama difokuskan pada kemampuan PTT untuk mengobati tumor primer pada kedalaman tidak lebih dari beberapa mm, di mana peredaman cahaya NIR hampir lengkap.

Sebelumnya, kami telah menunjukkan bahwa tumor payudara ortotopik primer pada tikus sinygenik dapat hampir sepenuhnya dihilangkan menggunakan cahaya laser NIR ringan dalam gabungan dengan biokonjugat SWCNT yang meningkatkan fototermal [11]. Dalam biokonjugat ini, SWCNT difungsikan dengan protein aneksin A5 (ANXA5), yang terikat dengan affinitas tinggi pada fosfolipid anionik fosfatidilserin yang diekspresi secara eksternal pada sel tumor dan pada sel endotel vaskulatur tumor, tetapi tidak pada sel normal dalam vaskulatur [12,13,14]. Konjugat ini divisualisasikan menggunakan mikroskop gaya atom (AFM) untuk menunjukkan bahwa tinggi konjugat antara 2,5 dan 5,0 nm, yang serupa dengan konjugat SWCNT-protein lainnya [11]. Sementara mampu menghilangkan tumor primer dalam model metastasis sebelumnya, terapi fototermal sendiri hanya modest memperpanjang kelangsungan hidup. Namun, kami menemukan bukti awal yang menunjukkan bahwa perawatan bersama dengan imunomodulator seperti siklofosfamida mampu meningkatkan kelangsungan hidup.

Baru-baru ini, potensi imunomodulator seperti siklofosfamida untuk secara sinergis meningkatkan PTT yang diarahkan SWCNT telah menjadi subjek minat yang besar. Salah satu kategori agen imunomodulasi yang menjanjikan adalah inhibitor checkpoint. Inhibitor checkpoint adalah antibodi seperti anti-CTLA-4, anti-PD-1, dan anti-PDL-1 yang terikat protein sel penting yang bertanggung jawab untuk memodulasi respons tubuh terhadap kanker. Antibodi ini memblokir titik kritis “checkpoint” biologis di mana tubuh dapat menurunkan respons sistem kekebalan tubuh terhadap kanker. Protein-protein ini biasanya memainkan peran penting dalam mengontrol respons imunologis tubuh. Dengan memblokir tindakan protein ini, inhibitor checkpoint menghilangkan mekanisme di mana sistem kekebalan tubuh biasanya menekan respons antitumor alami. Baru-baru ini, beberapa kelompok telah mengamati bahwa kombinasi penghematan checkpoint anti-CTLA-4 dengan PTT yang ditingkatkan SWCNT memiliki potensi untuk mempromosikan respons imun yang kuat pada kanker payudara [15, 16].

Dalam studi saat ini, kami mengevaluasi kombinasi modalitas PTT baru kami dengan agen immunostimulasi anti-protein asosien limfosit T sitotoksik 4 (anti-CTLA-4). Awalnya disetujui untuk pengobatan melanoma metastasis [17], anti-CTLA-4 sekarang diuji untuk pengobatan kanker payudara dalam uji klinis bersama dengan agen immunostimulasi lainnya [18]. Kami mengevaluasi mekanisme imunitas antineoplasia yang ditingkatkan dalam PTT dalam kombinasi dengan penghematan checkpoint anti-CTLA-4, serta nasib jangka panjang SWCNT pada organ target.

Bahan dan Metode

Bahan

Plasmid yang mengkode ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, sebelumnya telah dibuat dalam laboratorium ini [11]. Albumin serum sapi (BSA), Triton X-100, EDTA, β-merkaptoetanol, fluorida fenilmetilsulfonil (PMSF), dan buffer asetat-EDTA tris dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Fosfat natrium dan sulfat dodekil natrium (SDS) dari Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, NJ). Etanol grade HPLC dari Acros Organics (Waltham, MA). Kolom His-trap dari GE Healthcare (Chicago, IL). Buffer pewarnaan sitometri aliran, buffer fixasi/permeabilisasi, buffer permeabilisasi, kit kuantifikasi endotoksina kromogenik, dan kaset dialisis Slide-A-Lyzer (3,5 kDa) dari Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Membran dialisis 2 dan 100 kDa dari Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Medium sel RPMI-1640 dan larutan garam seimbang Hank dari ATCC (Manassas, VA). Serum fetal sapi (FBS) dari Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Trypton, ekstrak ragi, dan sulfat kanamisin monohidrat dari Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Hidroksida natrium, klorida kalium, dan klorida natrium dari VWR Inc (Radnor, PA). Protease HRV-C3 dari Sino Biologics (Portland, OR). Antibodi monoclonal anti-CTLA-4 tikus (clone: 9H10) dan kit ELISA sitokin tikus (TNF-α, IFN-γ, IL-6) dari BioLegend (San Diego, CA). SWCNT CoMoCAT (diameter rata-rata 0,8 ± nm, panjang rata-rata 1,5 ± 0,5 µm) dari CHASM (Boston, MA). Metode CoMoCAT dikenal menghasilkan SWCNT dengan sejumlah kecil kiralitas (n,m) dengan selektivitas tinggi [19]. Sampel yang digunakan dalam studi ini sangat kaya pada SWCNT [5, 6], yang menunjukkan penyerapan cahaya NIR yang kuat pada panjang gelombang 980 nm. Penyerapan ini sesuai dengan transisi S₁₁ untuk jenis nanotub ini antara singularitas van Hove yang terisi ke yang tidak terisi yang sesuai. Oleh karena itu, untuk memaksimalkan penyerapan radiasi oleh SWCNT yang ditetapkan pada tumor, panjang gelombang laser yang digunakan dalam studi ini adalah 980 nm untuk cocok persis dengan transisi optik S₁₁ [20]. Gambar S1 dalam File Tambahan 1 menunjukkan spektrum fluoresensi, yang jelas menunjukkan emisi NIR S₁₁ setelah mengangsang transisi S22 dengan cahaya visible.

Budidaya Sel

Sel kanker payudara EMT6 dari ATCC (Manassas, VA) dibudidayakan dalam medium Waymouth’s MB 752/1 dengan 2 mM L-glutamin yang disuplai dengan 15% FBS. Semua sel dibudidayakan pada 37 °C dan 100% kelembaban di bawah 5% CO₂. Semua sel di-passaging menggunakan tripsin 0,25% (b/v) dalam 0,53 mM EDTA. Keturunan sel dan status bebas mioplasma dikonfirmasi melalui uji STR (Charles River) dan dianalisis bebas endotoksin dengan uji limulus.

Produksi ANXA5 dan SWCNT-ANXA5

Konjugat SWCNT-ANXA5 disiapkan menggunakan prosedur yang sebelumnya kami kembangkan yang menghasilkan 2,5 mg ANXA5/mg SWCNT [11]. Singkatnya, E. coli yang ditransfeksi dengan plasmid yang mengkode ANXA5, pET-30 Ek/LIC/ANX, dibudidayakan dan dipurnikan menggunakan kromatografi afinitas logam imobilisir dengan Ni²⁺ imobilisir untuk mengisolasi ANXA5, yang melibatkan pemisahan enzimatik untuk menghapus tag (His)₆. SWCNT CoMoCAT yang sudah dikeringkan dengan pendinginan disperdi dalam SDS 1% menggunakan dua siklus ultrasonik probe pada 20 W dan sentrifugasi pada 29.600 g selama 30 min masing-masing. SWCNT yang tersuspendi dikarakterisasi oleh fluoresensi NIR (File Tambahan 1: Gambar S1) dan kemudian dikonjugatkan ke pengait DSPE-PEG-maleimide untuk 30 min pada suhu ruangan untuk memungkinkan interaksi hidrofobik antara SWCNT dan grup fungsional DSPE. Ini diikuti oleh dialisis selama 8 h dalam air distil untuk menghilangkan pengait dan SDS berlebih. Konjugat yang sudah dialisis kemudian bereaksi dengan ANXA5, yang mengandung satu grup cystein, selama 2 h dan diblokir dengan 1,5 mg ml⁻¹ L-cystein. Produk akhir, SWCNT-ANXA5, dialisis terhadap larutan fosfat natrium 20 mM selama 8 h untuk menghilangkan ANXA5 dan L-cystein berlebih. Bobot protein dan keurnian dikarakterisasi melalui SDS-PAGE. Konten SWCNT dan ANXA5 dari biokonjugat dikarakterisasi oleh spektroskopi fluoresensi UV–Vis–NIR, spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR) analisis Raman, dan uji Bradford (File Tambahan 1: Gambar S2).

Studi In Vivo

Semua prosedur mematuhi protokori yang disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium (IACUC) Universitas Oklahoma. Tikus betina BALB/cJ berusia 6 minggu digunakan (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Tikus diberi makan pakan standar. Tijdens iradiasi fototermal tumor dengan cahaya laser NIR, tikus dianestesikan dengan 2% isoflurane dan 98% oksigen menggunakan hidung kerucut.

Tumor diinduksi oleh injeksi ortotopik 10⁶ sel kanker payudara tikus EMT6 dalam 100 µL PBS ke dalam pad lemak payudara IV. Tumor diizinkan untuk tumbuh selama 12 hari, dan ketika mencapai volume 60 mm³ (~ 5 mm diameter), tikus menerima injeksi sistemik i.v. 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT per kg berat badan) biokonjugat melalui vena ekor lateral. Setelah 3 h, wilayah 5 mm di luar batas tumor diiradiasi dengan cahaya NIR (980 nm) pada level energi dan daya 175 J/cm² dan 1 W/cm², masing-masing (waktu 175 s; laser NIR Diodevet-50, B&W Tek Inc., Newark, DE). Penghematan checkpoint dilakukan oleh administrasi i.p. berurutan 200 µg antibodi anti-CTLA-4 dalam 100 µl PBS pada hari 8, 11 dan 16 setelah inoculasi tumor. Volume tumor dihitung dengan rumus elipsoid modifikasi \(V = \frac{1}{2} \times {\text{length}} \times {\text{width}}^{2}\) menggunakan pengukuran kaliber dari dimensi terpanjang dan lebar tegak lurus. Suhu tumor dipantau dengan kamera thermal handheld FLIR TG165 Spot (Raymarine ITC, Fareham, UK) yang diatur ke autoscan untuk suhu terdeteksi maksimum. Organ target diambil untuk evaluasi toksisitas dan diperbaiki dalam formalin netral buffer 10%, dan slide FFPE yang diwarnai hematoxylin dan eosin disiapkan untuk analisis toksisitas.

Deteksi SWCNT Ex Vivo

Tikus menerima injeksi sistemik 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 (mg SWCNT/kg berat badan) melalui vena ekor lateral. Pada titik waktu yang dipilih, tikus (n = 3) diutanasia, diseksi, dan organ target diambil untuk analisis. Sampel jaringan disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [21]. Keberadaan SWCNT dalam sampel jaringan ex vivo kemudian ditentukan oleh spektroskopi fluoresensi NIR relatif menggunakan NS3 NanoSpectralyzer (Applied NanoFluorescence, Houston, TX).

Sitometri Aliran

Tikus diutanasia 14 hari setelah perawatan, dan sel efesif imun antitumor limpa dikuantifikasi seperti yang dijelaskan sebelumnya [21].

Deteksi Sitokin

Setelah perawatan seperti yang dijelaskan di atas, tikus (n = 4–5) diutanasia 7 hari setelah terapi fototermal untuk pengambilan darah. Konsentrasi faktor nekrosis tumor alfa (TNF-α), interferon gamma (IFN-γ), dan interleukin 6 (IL-6) dalam sampel serum yang dicairkan dikuantifikasi oleh ELISA sesuai dengan protokol pemasok.

Analisis Statistik

Data dianalisis dengan perangkat lunak Graphpad Prism. Signifikansi statistik dievaluasi menggunakan ANOVA satu arah dan uji perbandingan berganda Tukey–Kramer. Signifikansi statistik kurva kelangsungan hidup ditentukan oleh uji log-rank Mantel–Haenszel. Signifikansi statistik konsentrasi sitokin serum dianalisis oleh ANOVA satu arah dan uji perbandingan berganda Dunnett. Perbandingan berganda dikoreksi oleh ambang Bonferroni. Kesalahan direpresentasikan secara grafik sebagai standar error rata-rata kecuali kesalahan tidak melebihi ukuran titik mean yang diplot, dalam hal ini bar diabaikan untuk kejelasan.

Hasil

Kinetika Termal

Menggunakan dosis 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5, suhu maksimum tumor direkam selama perawatan dengan cahaya NIR, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Tikus yang menerima SWCNT-ANXA5 sebelum iradiasi memiliki suhu tumor yang lebih tinggi selama seluruh perawatan cahaya NIR dibandingkan dengan tikus yang menerima larutan fisiologis. Suhu rata-rata tumor untuk tikus yang menerima SWCNT-ANXA5 secara signifikan berbeda daripada tikus yang menerima larutan fisiologis (54 °C vs. 37 °C, p < 0,05). Akibat dari terapi fototermal yang ditingkatkan ini, hanya dalam kelompok SWCNT-ANXA5 ablasi tumor yang terlihat terjadi. Ablasi tumor ditandai oleh dekoloran cepat, diikuti oleh kontraksi kulit dan munculnya kerutan. Dalam 48 h, eskar yang signifikan terbentuk di lokasi ablasi fototermal. Pertumbuhan ulang kulit lengkap memakan waktu beberapa minggu.

Terapi Fototermal Nanotub Karbon Target Terpadu dengan Penghematan Checkpoint: Strategi Baru untuk Kanker Payudara Metastatik

Terapi Fototermal dan Penghematan Checkpoint

Hasil kombinasi terapi fototermal dengan penghematan checkpoint menggunakan antibodi monoclonal anti-CTLA-4 ditunjukkan pada Gambar 2. Meskipun terapi fototermal dengan sendirinya dengan mudah menghilangkan neoplasia payudara primer, ketidakmampuan cahaya laser NIR untuk menembus lebih dari beberapa mm membatasi pengobatan metastasis payudara. Untuk mengatasi kekurangan dari pengobatan antineoplasia fototermal NIR lokal ini, kami mengeksplorasi kombinasi dari modalitas terapi unik ini dengan penghematan checkpoint sistemik (Gambar 2). Meskipun terapi fototermal unggul dalam menghancurkan tumor primer EMT6 (Gambar 2a), perawatan ini gagal menghilangkan metastasis dan hanya modest meningkatkan kelangsungan hidup tikus yang menderita tumor ortotopik EMT6 (Gambar 2b). Sebaliknya, penghematan checkpoint dengan anti-CTLA-4 meningkatkan kelangsungan hidup secara keseluruhan tetapi hanya menunda pertumbuhan tumor primer sementara. Sementara tidak ada perawatan sendiri yang menghasilkan peningkatan kelangsungan hidup secara keseluruhan, kombinasi keduanya antara terapi fototermal yang ditingkatkan SWCNT-ANXA5 dan penghematan checkpoint anti-CTLA-4 meningkatkan kelangsungan hidup secara keseluruhan, yang mengarah pada kelangsungan hidup 55% pada hari ke-100 setelah inoculasi tumor.

Analisis citometrik sel efesif limpa setelah perawatan mengungkapkan mekanisme yang diyakini dari peningkatan kelangsungan hidup pada tikus yang menerima terapi fototermal kombinatorial dan penghematan checkpoint. Tikus diinokulasi dengan EMT6 dan diobati seperti yang dijelaskan sebelumnya. Dua minggu setelah perawatan, tikus diutanasia dan persentase serta jumlah relatif berbagai tipe sel efesif imun dikuantifikasi. Populasi sel T pembantu, sel T sitotoksik, neutrofil, sel monosit penekan asur side mioid (MDSC), sel T regulatori FoxP3, dan makrofag dievaluasi (File Tambahan 1: Gambar S3). Analisis populasi ini mengungkapkan perbedaan signifikan antara populasi perawatan dan kontrol hanya pada tikus yang menerima kombinasi keduanya antara terapi fototermal dan penghematan checkpoint anti-CTLA-4 bersama-sama. Pada hewan yang menerima kombinasi ini, kami mengamati peningkatan jumlah relatif sel T pembantu (CD4⁺) dan sel T sitotoksik (CD8⁺), (Gambar 2c, d). Peningkatan jumlah sel CD4⁺ dan CD8⁺ berkaitan dengan peningkatan kasar ukuran limpa yang diamati setelah disseksi.

Selain analisis citometrik sel efesif limpa, konsentrasi sitokin serum ditentukan 7 hari setelah PTT untuk membantu mengklarifikasi mekanisme imunitas antitumor. Tingkat sitokin pro-inflamasi IL-6, IFN-γ, dan TNF-α ditampilkan pada Gambar 3. Tidak ada perawatan SWCNT atau anti-CTLA-4 sendiri yang secara signifikan meningkatkan tingkat sitokin dibandingkan dengan kelompok kontrol yang tidak diobati. Namun, perawatan PTT sendiri mampu meningkatkan TNF-α secara signifikan. Penambahan lebih lanjut anti-CTLA-4 pada perawatan PTT secara signifikan meningkatkan tingkat TNF-α, IL-6, dan IFN-γ.

Distribusi dan Toksisitas SWCNT-ANXA5

Distribusi SWCNT-ANXA5 setelah administrasi untuk peningkatan terapi fototermal di berbagai organ dipantau dengan kuantifikasi fluoresens SWCNT dalam lisat jaringan ex situ dibandingkan dengan standar (File Tambahan 1: Gambar S4). Distribusi pada organ target diikuti selama periode 4 bulan setelah injeksi i.v. 1,2 mg/kg SWCNT-ANXA5 pada tikus sehat (Gambar 4a, b). Sebaliknya, akumulasi SWCNT-ANXA5 pada tikus menderita tumor EMT6 setelah administrasi, sesuai dengan protokol injeksi yang sebelumnya dijelaskan, ditentukan pada 3 h setelah administrasi. (Waktu di mana terapi fototermal dilakukan dalam studi perawatan.) Selama periode 4 bulan sebelum pengambilan organ, tikus dipantau untuk efek samping fisik dan perilaku abnormal. Tidak ada efek samping yang diamati pada tikus mana pun yang diinjak SWCNT-ANXA5 selama periode waktu ini. Tidak ada toksisitas histopatologis yang diamati selama pemeriksaan bagian FFPE yang diwarnai hematoxylin dan eosin dari organ target pada akhir studi (File Tambahan 1: Gambar S5).

Diskusi

Data yang disajikan di sini memberikan dukungan untuk efektivitas kombinasi terapi fototermal target dan penghematan checkpoint imun untuk pengobatan kanker payudara metastasis. Fenomena ini dikenal sebagai “efek abskopal,” yang menggambarkan kemampuan radiasi lokal untuk memulai respons antitumor yang menekan pertumbuhan tumor yang jauh dari target primer. Sejak awal tahun 1950, peneliti telah mengamati bahwa iradiasi tumor lokal memiliki efek signifikan pada tumor yang jauh [22]. Studi telah menetapkan bahwa sifat sistemik efek abskopal adalah karena respons imun host [23,24,25]. Meskipun irradiasi gamma telah menjadi fokus utama dari sebagian besar penelitian abskopal, sejumlah besar karya menunjukkan bahwa terapi fototermal juga dapat menginduksi efek abskopal. Banyak studi telah menunjukkan bahwa ablasi termal dalam kombinasi dengan inhibitor checkpoint anti-CTLA-4, menghasilkan respons imun yang ditingkatkan [16, 26,27,28,29]. Kami mengamati respons abskopal yang serupa setelah ablasi fototermal target dan blokade anti-CTLA-4 dalam model kanker payudara EMT6.

Efek abskopal diilustrasikan oleh data pada Gambar 2a, b. Tumor ortotopik EMT6 tumbuh dengan cepat dan telah metastasis pada saat diobati dengan terapi fototermal. Ini adalah alasan mengapa tikus dengan tumor yang diobati hanya dengan terapi fototermal hanya memiliki peningkatan kelangsungan hidup yang sedikit dibandingkan dengan tikus kontrol yang tidak diobati, meskipun tumor primer telah sepenuhnya diablasi. Administrasi anti-CTLA-4 sendiri menunda pertumbuhan tumor dibandingkan dengan kontrol dan meningkatkan waktu kelangsungan hidup hingga 68 hari tetapi tidak mengarah pada penyembuhan. Hasil serupa tentang penundaan pertumbuhan tumor EMT6 diamati oleh Jure-Kunkel et al. ketika anti-CTLA-4 diadministrasi [30]. Untuk kombinasi terapi fototermal dan anti-CTLA-4, 55% tikus yang diobati selamat pada hari ke-100 setelah inoculasi tumor dan kemungkinan telah disembuhkan.

Wawasan ke dalam mekanisme imunitas antitumor dievaluasi dengan menggunakan sitometri aliran untuk mengkuantifikasi populasi sel efesif imun dalam limpa. Dibandingkan dengan terapi fototermal atau anti-CTLA-4 sendiri, terapi kombinasi menghasilkan peningkatan tujuh kali lipat sel T pembantu CD4⁺ dan peningkatan tiga kali lipat sel T sitotoksik CD8⁺, kedua hasil ini sangat signifikan secara statistik (p < 0,005). Hasil ini memberikan bukti lebih lanjut tentang potensi respons abskopal oleh kombinasi terapi foto dan terapi kostimulasi sel T dengan penghematan checkpoint imun.

Peningkatan jumlah sel CD4⁺ dan CD8⁺ berkaitan dengan peningkatan ukuran limpa yang diamati selama disseksi. Peningkatan ukuran limpa menunjukkan respons imun yang ditingkatkan. Limpa terdiri dari berbagai tipe sel, yang paling umum adalah dari keturunan CD4⁺, CD8⁺, dan sel B [31, 32]. Meskipun tidak dijelajahi dalam karya ini, kami akan mengharapkan jumlah sel B untuk meningkat bersama dengan jumlah sel T CD4⁺ dan CD8⁺ [33]. Sel T pembantu CD4⁺ membantu imun humoral dengan memfasilitasi sel imun lain melalui stimulasi sitokin dan interaksi sel-sel langsung. Sel T sitotoksik CD8⁺ secara langsung membunuh sel tumor. Peningkatan jumlah sel CD4⁺ dan CD8⁺ mengindikasikan respons imun abskopal sistemik.

Keberadaan respons imun abskopal sistemik setelah perawatan kombinasi lebih didukung oleh peningkatan tingkat sitokin pro-inflamasi serum tikus (Gambar 3). TNF-α mengaktifkan makrofag terkait tumor untuk menampilkan efek antitumor [34, 35]. IFN-γ memainkan peran penting dalam pengawasan tumor [36, 37]. IL-6 mempromosiasi proliferasi makrofag dan limfosit [38]. Peningkatan signifikan dari molekul efesif ini dalam serum tikus 7 hari setelah perawatan PTT bersama dengan anti-CTLA-4 lebih mendukung keberadaan respons imun antitumor.

Pada akhir iradiasi tikus yang menerima SWCNT, suhu maksimum tumor rata-rata adalah 54 °C; suhu ini cukup untuk mengablasi tumor sepenuhnya (Gambar 1). Ini berada dalam rentang 45–60 °C di mana inaktivasi enzim dan cedera mitokondria terjadi [39]. Suhu tumor dalam kelompok kontrol fisiologis tetap di bawah 40 °C, suhu yang memberikan manfaat terapeutik minimal [39,40,41].

Kami mengamati bahwa sebagian besar akumulasi SWCNT-ANXA5 berdasarkan konsentrasi terutama di hati, jantung, limpa, ginjal, paru-paru, dan tumor (Gambar 4a). Pada tikus dengan tumor EMT6, kami mengamati bahwa konsentrasi SWCNT-ANXA5 serupa dengan yang ada di hati dan ginjal (Gambar 4a, b). Jumlah jejak SWCNT-ANXA5 terdeteksi di otak, usus besar, dan usus kecil. Penting untuk dicatat bahwa distribusi SWCNT berdasarkan % dosis yang diinjak (ID) tidak berkaitan baik dengan konsentrasi absolut SWCNT dalam jaringan target. Ini terutama karena perbedaan antara berat organ. Misalnya, % ID tertentu dalam organ akan sesuai dengan konsentrasi yang lebih tinggi dalam organ yang lebih kecil, dan konsentrasi yang lebih rendah dalam organ yang lebih besar. Membandingkan sampel berdasarkan konsentrasi SWCNT mengungkapkan bahwa konsentrasi tertinggi ada di ginjal, diikuti oleh hati dan limpa (Gambar 4a).

Ada beberapa bukti degradasi SWCNT di berbagai organ selama periode studi distribusi (Gambar 4a, b). Degradasi SWCNT di organ diharapkan berdasarkan temuan sebelumnya bahwa nanotub multi-dinding terdegradasi dalam makrofag [42]. SWCNT yang digunakan dalam studi ini memiliki diameter rata-rata 0,8 nm dan panjang rata-rata 1500 µm. Ukuran ini tidak diprediksi sitotoksik berdasarkan studi oleh Zhu et al. [43], yang mengklasifikasikan potensi kerusakan lapisan lipid oleh toksisitas nanotub karbon berdasarkan panjang dan diameter. Menurut klasifikasi ini, SWCNT yang kami gunakan berada dalam kategori “biologis lunak”, yang meminimalkan sitotoksisitas, yang konsisten dengan observasi kami dalam studi pada tikus di mana kami tidak mengamati efek samping atau toksisitas histopatologis sebagai akibat dari administrasi konjugat SWCNT-ANXA5.

Kesimpulan

Di sini, kami menunjukkan modalitas perawatan kombinasi baru di mana kami mendapatkan tingkat kelangsungan hidup yang relatif tinggi pada tikus dengan kanker payudara metastasis yang agresif menggunakan terapi fototermal dengan biokonjugat SWCNT-ANXA5 yang digabungkan dengan penghematan checkpoint berbasis anti-CTLA-4. Penggunaan protein target vaskulatur tumor ANXA5 meminimalkan jumlah SWCNT yang diberikan secara sistemik yang diperlukan untuk menghilangkan tumor primer dalam dosis satu kali rendah. Menariknya, kami mencatat peningkatan kelangsungan hidup pada tikus dengan kanker metastasis yang diobati dengan terapi kombinasi, meskipun hanya tumor primer yang diiradiasi. Studi mekanisme yang mengukur jumlah sel efesif antitumor limpa penting mengungkapkan bahwa hanya kombinasi kedua modalitas perawatan yang meningkatkan jumlah sel T pembantu CD4⁺ dan sel T sitotoksik CD8⁺. Kami hipotesis bahwa peningkatan sel T ini mencerminkan respons abskopal, di mana sel efesif antitumor menekan metastasi tumor. Meskipun SWCNT masih ditemukan ada di organ 4 bulan setelah administrasi, tidak ada efek samping atau toksisitas jaringan yang terlihat selama eksperimen.

Ketersediaan Data dan Bahan

Semua data sepenuhnya tersedia tanpa keterbatasan.

Singkatan

SWCNT:: Nanotub Tunggal Karbon
ANXA5:: Aneksin A5
anti-CTLA-4:: Anti-protein Asosien Limfosit T Sitotoksik 4
EDTA:: Asam Etilenediamina Tetraasetat
SDS-PAGE:: Elektroforesis Gel Akrilamida Poli Sulfat Dodekil Natrium
DSPE:: 1,2-Distearoyl-sn-gliserol-3-fosfoetanolamina
PTT:: Terapi Fototermal

Fotoanoda Nanotub SnIn4S8/TiO₂ yang Diformasi Mandiri untuk Perlindungan Katodik Foto Cahaya Visible yang Ditingkatkan pada Baja Q235 Meningkatkan Emisi UV ZnO dengan Array Nanopartikel Perak melalui Resonansi Permukaan Plasmon

bahan nano