Analisis Aktin dan Organisasi Adhesi Fokus dalam Sel U2OS pada Struktur Nano Polimer

Hasil

Menggunakan protokol yang telah ditetapkan sebelumnya, kami telah membuat kaca penutup-slip yang didekorasi dengan susunan yang ditentukan secara tepat dari nanopilar SU-8 (NP) berorientasi vertikal dengan pemisahan variabel dan geometri yang ditentukan [63]. Permukaan dengan kepadatan area NP 456, 205, 115, dan 29 NP/100 μm ² (sesuai dengan nada 500 nm,750 nm, 1000 nm, dan 2000 nm) digunakan. Pertama kami memeriksa tren umum dalam morfologi sel, struktur sitoskeleton aktin dan interaksi sel-substrat. Kami mengikuti ini dengan perbandingan kuantitatif morfologi sel dan FA pada berbagai substrat berstrukturnano dan kontrol kaca datar. Kami menggabungkan mikroskop resolusi tinggi dengan fabrikasi throughput tinggi untuk melakukan analisis kualitatif setidaknya \({\kira-kira 100}\) sel untuk setiap jenis permukaan, dengan pencitraan setelah 24 jam dan 48 jam. Secara total kami menganalisis> 400 gambar beresolusi tinggi dan 20 set data 3D.

Gambar 7 menunjukkan representasi skema dari susunan NP (A, B) dan gambar mikroskop elektron dari substrat yang dibuat (C,D). Slide kaca yang mengandung struktur nanofabricated dipasang menggunakan parafin di bawah dasar berongga, kultur 35 mm dengan struktur mengarah ke atas. Gambar mikroskop elektron tampak samping atas-bawah dan berjudul ditunjukkan, pada Gambar. 1C,D menunjukkan susunan pilar-nano dengan pitch dan tinggi 1000 nm. Tabel 1 menunjukkan parameter geometris array yang digunakan dalam pekerjaan ini, klasifikasinya, serta kepadatan nomor area NP yang sesuai. Kami mengklasifikasikan susunan NP menjadi padat dan jarang tergantung pada perilaku adhesi sel yang diamati (lihat di bawah).

Gambar 1 menunjukkan sel U2OS representatif yang dikultur pada kaca (A) dan permukaan berstruktur nano (B–F) selama 24 jam. Sel-sel telah ditransfeksi bersama dengan pCMV-LifeAct-GFP dan pTAG-RFP-Vinculin, yang memungkinkan visualisasi F-Actin dan vinculin melalui produksi fluorescent LifeAct-TagGFP2 (selanjutnya:LifeActGFP) dan protein fusi TagRFP-vinculin masing-masing. Jaringan F-aktin dan area kaya vinculin di FA terdeteksi dengan jelas. Di pinggiran sel, sinyal LifeActGFP berada di dekat membran dan oleh karena itu kami menggunakan sinyal ini untuk memvisualisasikan morfologi sel. Sinyal dari NP SU-8 ditampilkan dengan warna biru (lihat bagian “Eksperimental”).

U2OS mengekspresikan LifeActGFP fluorescent (hijau) dan TagRFP-vinculin (merah) pada tipe permukaan yang berbeda. Pewarnaan kuning menunjukkan sinyal yang tumpang tindih dari saluran LifeActGFP dan TagRFP-vinculin. Di bawah setiap mikrograf, tampilan samping skema dari susunan NP yang sesuai ditampilkan, bersama dengan perkiraan posisi bidang akuisisi. Sel yang dicitrakan pada A permukaan kaca datar tidak terstruktur dan pada susunan pilar dengan tinggi susunan dan tinggi struktur yang berbeda:B Pitch 500 nm dan tinggi 500 nm, C Pitch 1000 nm dan tinggi 500 nm, D Pitch 750 nm dan tinggi 1000 nm, E Pitch 1000 nm dan tinggi 1000 nm, dan F Pitch 2000 nm dan tinggi 1000 nm. Semua gambar yang disajikan adalah sel yang representatif. Bilah skala 25 μm. Perhatikan bahwa C memiliki skala yang berbeda dari gambar lainnya

Tes awal menggunakan sel yang ditransfeksi menunjukkan bahwa sel yang diunggulkan pada permukaan kaca dan permukaan terstruktur tampaknya menyebar sepenuhnya setelah kira-kira 6 jam. Tidak ada perbedaan yang jelas dalam penyebaran sel antara permukaan yang berbeda yang diamati, dan inspeksi visual tidak menunjukkan tanda-tanda penurunan viabilitas sel karena susunan pilar pada saat ini atau dalam eksperimen selanjutnya. Dalam percobaan berikut, sel ditransfeksi 6 jam setelah penyemaian, dan kemudian dicitrakan 24 jam, 48 jam setelah transfeksi, sesuai dengan transfeksi 30 jam, 54 jam setelah penyemaian. Berikut ini, kedua titik waktu tersebut akan dirujuk oleh waktu pengamatan setelah penyemaian, yaitu 24 jam, 48 jam.

Sel diunggulkan pada larik NP dengan tinggi 500 nm, 1000 nm dan pitch 750 nm, 1000 nm, 2000 nm. Setelah penyebaran awal, sel-sel diamati berbentuk bulat atau memanjang, mirip dengan situasi pada permukaan datar. Morfologi umum ini ditemukan konsisten selama beberapa percobaan. Sel yang diunggulkan pada larik NP jarang umumnya memiliki bentuk yang mirip dengan sel pada permukaan kaca, lihat Gambar 1F yang menggambarkan sel representatif pada larik bernada 2000 nm. Serat F-aktin hadir juga di dasar NP dan di dekat permukaan kaca, menunjukkan bahwa sel dapat mengakses area yang dekat dengan substrat. Seperti yang diamati sebelumnya [45, 62, 64], sel-sel pada susunan padat biasanya tampak digantung di atas NP (Gbr. 1B, D, E). Sel pada susunan padat tampaknya memiliki aktin F yang kurang menonjol di dekat permukaan kaca, menunjukkan bahwa serat aktin tidak terbentuk di antara pilar yang dekat dengan substrat. Hubungan antara tinggi NP dan pemisahan ditentukan jika sel menempel pada substrat atau ditangguhkan di bagian atas susunan NP. Ini misalnya diilustrasikan pada Gambar. 1C di mana NP yang lebih pendek menyebabkan sel menghubungi substrat, sedangkan NP yang lebih panjang menghalangi kontak, Gambar. 1E. Pengamatan serat aktin ini selanjutnya dikuatkan oleh tumpukan-z yang dilakukan untuk beberapa permukaan, seperti yang disajikan pada Gambar 2.

Untuk mendapatkan pemahaman yang lebih terperinci tentang bagaimana sel menempel pada permukaan terstruktur dan tidak terstruktur, kami mengevaluasi distribusi FA seperti yang divisualisasikan oleh keberadaan protein fusi TagRFP-vinculin. Sel pada permukaan datar biasanya membentuk FA memanjang yang didistribusikan di bawah seluruh badan sel, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1A.

Pada susunan yang jarang, U2OS dapat menghubungi permukaan kaca antara NP dan melekat mirip dengan sel pada kaca, ditunjukkan pada Gambar. 1C, F. Untuk susunan NP ini, FA terbentuk pada kaca di antara NP, dan sinyal F-aktin juga terdeteksi pada gambar yang diperoleh dekat dengan dasar NP. Ini menunjukkan bahwa sel mampu menekuk membran di sekitar struktur nano. Namun, sel pada susunan yang lebih padat, seperti pemisahan 750 nm, 1000 nm, dan tinggi 1000 nm, jelas terhalang untuk menempel pada substrat di antara struktur nano, seperti yang ditunjukkan pada gambar Gambar 1D, E yang diperoleh dekat dengan dasar NP. Namun, di sekitar perifer, sel biasanya dapat menempel pada substrat antara struktur nano yang membentuk FA, sering kali diarahkan oleh simetri susunan pilar yang mendasarinya.

Sel-sel yang menyebar pada susunan NP dengan panjang yang lebih pendek, dan dengan jarak antar-pilar 1000 nm membentuk adhesi baik ke arah pinggiran maupun di bawah badan sel. Orientasi serat F-aktin diarahkan oleh simetri susunan yang mendasarinya, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1C. Namun, lokasi dan orientasi vinculin yang mengandung FA tidak menunjukkan pola yang jelas, dengan pembentukan FA di antara NP.

Sel U2OS pada pilar 500 nm dengan jarak antar pilar 500 nm umumnya membentuk adhesi yang lebih sedikit dan lebih kecil dibandingkan dengan permukaan planar seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1B. Untuk sel yang diunggulkan pada susunan ini, serat aktin terutama diamati di dekat permukaan kaca pada posisi di mana mereka diakhiri di FA. Sekali lagi, ini adalah tanda bahwa jaringan aktin terhalang untuk menghubungi permukaan, dan oleh karena itu sel-sel diasumsikan ditangguhkan di atas susunan. Namun, sel-sel tampaknya memiliki jaringan F-aktin yang lebih utuh yang terbentuk di atas pilar. Bagian dari jaringan aktin yang diamati di antara pilar, tampak sejajar dengan struktur dalam susunan NP yang mendasarinya. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 1B, karena serat F-aktin dan FA sebagian besar terbentuk di sepanjang salah satu arah kisi, yaitu sejajar dengan "garis" terbuka, dari susunan pilar.

Pada susunan padat dan jarang, kami mengamati struktur F-aktin "seperti cincin" yang terbentuk di sekitar NP yang menonjol ke atas ke dalam badan sel. Struktur cincin F-aktin tampak lebih menonjol pada susunan yang jarang, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1E, F.

A Gambar sel U2OS pada permukaan yang berbeda diperoleh pada tiga bidang fokus yang ditunjukkan. Gambar diperoleh dekat dengan dasar pilar, kira-kira setinggi setengah pilar, dan dekat dengan puncak pilar. Bidang pencitraan terletak 0,0 μm, 0,4 μm, 0,8 m dari permukaan kaca datar. B –B ) Gambar fluoresensi gabungan yang menunjukkan U2OS mengekspresikan LifeActGFP fluorescent (hijau) dan TagRFP-vinculin (merah) pada jenis permukaan yang berbeda, warna kuning menunjukkan LifeActGFP dan TagRFP-vinculin yang tumpang tindih. Permukaan yang dicitrakan adalah B permukaan kaca tidak terstruktur, C Array pilar bernada 1000 nm, D Array pilar bernada 2000 nm. Gambar yang disajikan mewakili sel pada setiap jenis permukaan. Jarak vertikal antara bidang fokus untuk setiap jenis permukaan kira-kira 400 nm. Scalebar 25 μm

Berdasarkan hasil yang disajikan di atas, kami telah memilih tiga permukaan untuk deskripsi morfologi sel dan FA yang lebih rinci dan kuantitatif. Kami mempelajari sel pada susunan rapat (pitch 1000 nm, panjang 1000 nm), susunan sparse (pitch 2000 nm, panjang 1000 nm) dan membandingkan hasilnya dengan sel pada permukaan kaca datar yang digunakan sebagai kontrol.

Dengan menggunakan detektor Airyscan bersama dengan pasca-pemrosesan gambar khusus, kami dapat melakukan pencitraan dengan resolusi xy sekitar 140 nm dan resolusi z sekitar 400 nm [65]. Gambar 2 menunjukkan gambar sel pada tiga permukaan, dengan bidang pencitraan yang dipisahkan sekitar 400 nm. Investigasi bundel F-aktin pada z . yang berbeda . Sel pada permukaan datar memiliki jaringan aktin F yang terlihat jelas pada bidang fokus yang sama atau tepat di atas FA, (lihat Gambar 2-B2). Untuk sel pada susunan padat, jaringan F-aktin ditemukan pada bidang fokus yang lebih tinggi di dalam sel dibandingkan dengan bidang FA, yang bersentuhan dengan penyangga kaca (Gbr. 2-C1 dan C2/C3). Untuk sel pada susunan jarang, situasinya mirip dengan sel pada kontrol kaca dan jaringan aktin dan FA terdeteksi pada ketinggian yang sama (Gbr. 2-D2). Data ini mendukung pengamatan awal bahwa sel-sel pada susunan jarang menempelkan permukaan di antara struktur, sedangkan sel-sel pada susunan padat terutama mampu menempel pada permukaan di sekitar pinggiran sel.

Untuk menganalisis dan mengukur perbedaan dalam FA dan morfologi sel untuk tiga permukaan yang dipilih, skrip analisis gambar berbasis Python digunakan (lihat “Eksperimental”). Untuk analisis kuantitatif, lebih dari 300 gambar beresolusi tinggi dianalisis. Dalam gambar ini,> 400 sel dan> 7700 FA telah diidentifikasi, Tabel 2 mencantumkan jumlah sel dan FA yang terdeteksi untuk tiga jenis permukaan yang termasuk dalam analisis. Untuk semua permukaan, sel dicitrakan dalam 24 jam, 48 jam setelah transfeksi. Dalam analisis berikut, parameter geometris seperti luas permukaan, lingkaran, dan rasio tinggi lebar untuk sel pada 3 jenis permukaan dan setelah 24 jam, 48 jam dibandingkan. Analisis tambahan dapat ditemukan di Informasi Tambahan. Luas permukaan, sirkularitas dan rasio aspek untuk sel ditunjukkan pada Gambar. 3 dan untuk jumlah FA, gabungan luas FA per sel dan fraksi luas FA ke sel pada Gambar. 4. Parameter geometris didefinisikan seperti yang dijelaskan dalam "Eksperimen" bagian.

Area sel yang dihitung, sirkularitas sel, dan rasio aspek sel untuk sel U2OS yang mengekspresikan LifeActGFP fluorescent dan protein fusi TagRFP-vinculin pada permukaan yang berbeda yang dicitrakan 24 jam dan 48 jam setelah transfeksi. Deteksi gambar dilakukan berdasarkan intensitas sinyal LifeActGFP. Setiap titik abu-abu sesuai dengan satu sel dan plot kotak menunjukkan nilai median (Q 2) serta yang pertama (Q 1) dan kuartil ketiga (Q 3). Perbedaan statistik antara distribusi dinilai menggunakan uji non-parametrik Mann-Whitney

Gambar 3 merangkum data yang dikumpulkan untuk permukaan datar dan terstruktur. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3A, perbedaan signifikan dalam area sel diamati setelah kultur sel 24 jam. Namun, setelah 48 jam, tidak ada perbedaan yang signifikan antara rata-rata luas sel pada permukaan yang diteliti. Saat mempertimbangkan sirkularitas sel (Gbr. 3B), tidak ada perbedaan signifikan yang terdeteksi antara permukaan yang berbeda, kecuali antara sel yang diunggulkan pada pilar padat dan jarang yang dicitrakan setelah 24 jam. Sel pada ketiga permukaan memiliki rasio aspek rata-rata yang sama, seperti yang disajikan pada Gambar 3C.

Jumlah FA, gabungan area FA per sel dan fraksi area FA ke area sel untuk sel yang dicitrakan pada tiga jenis permukaan yang berbeda (array datar dan pilar dengan pitch 1000 nm dan 2000 nm). Setiap titik abu-abu sesuai dengan pengamatan dari satu sel. Signifikansi statistik antara distribusi ditentukan menggunakan uji non-parametrik Mann-Whitneys

Gambar 4 menunjukkan distribusi jumlah FA yang terdeteksi per sel, total luas permukaan FA di setiap sel dan rasio luas FA terhadap luas sel. Setelah 24 jam, jumlah FA yang dibentuk oleh sel pada tiga permukaan berbeda secara signifikan berbeda. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4B, luas permukaan FA total per sel berbeda untuk sel yang diunggulkan pada permukaan datar dan terstruktur. Hal yang sama dapat dilihat ketika membandingkan jumlah relatif FA (luas total FA yang terdeteksi dibagi dengan luas sel total) untuk permukaan yang berbeda, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4C.

Namun, setelah 48 jam kultur, perbedaan yang signifikan antara populasi sel tidak lagi diamati. Saat mempertimbangkan jumlah FA per sel, gabungan area FA per sel atau fraksi permukaan FA, tidak ada perbedaan antara ketiga permukaan yang ditemukan.

Contoh sel pada larik pilar 2000 nm yang mengekspresikan A LifeActGFP (hijau) dan B TagRFP-vinculin (merah). Ditumpangkan pada kedua gambar adalah tepi sel yang terdeteksi ditentukan dengan menggunakan sinyal dari ekspresi LifeActGFP (seperti yang ditunjukkan pada A ). C Menampilkan peta jarak dari tepi sel yang terdeteksi serta FA yang terdeteksi. Jarak terpendek (dilambangkan dengan d dalam gambar) dari setiap titik vinculin tersegmentasi (area putih) ke pinggiran sel (ditunjukkan dengan garis putih solid) dihitung untuk semua FA dalam gambar

Untuk memahami apakah keberadaan NP mempengaruhi lokalisasi FA dalam sel, kami melakukan analisis lebih lanjut menggunakan lokasi FA. Data mikroskopi menunjukkan bahwa FA dalam sel pada susunan NP padat terletak lebih dekat ke pinggiran sel, seperti yang ditunjukkan oleh Gambar. 1 dan 2. Untuk mengukur tren ini, kami menghitung jarak terpendek dari setiap FA ke tepi sel. Ini dilakukan seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 5. F-aktin digunakan untuk menentukan lokasi pinggiran dan dengan membangun peta jarak, jarak antara setiap pusat FA yang terdeteksi ke pinggiran sel dihitung. Untuk memperhitungkan perbedaan ukuran sel, kami menormalkan jarak antara tepi sel yang terdeteksi dan FA dengan jarak maksimum dari tepi ke pusat geometrik untuk setiap sel (jarak yang setara dengan radius untuk sel yang memiliki bentuk melingkar). Data yang dinormalisasi dengan jarak maksimum disajikan pada Gambar. 6 dan Tabel 3. Untuk sel pada permukaan datar, FA didistribusikan lebih ke tengah sel, sedangkan pada larik 2000 nm yang jarang dan larik 1000 nm yang padat, FA terletak lebih dekat ke pinggiran sel. Efek ini paling menonjol untuk larik padat dengan nada 1000 nm. Hasil pendekatan normalisasi alternatif, di mana lokasi FA dinormalisasi oleh luas permukaan sel, termasuk dalam Informasi Tambahan. Data ini menunjukkan tren kualitatif yang sama dengan data yang dinormalisasi dengan jarak maksimum ke tepi di setiap sel yang disajikan pada Gambar 6.

Distribusi posisi FA dalam kaitannya dengan tepi sel terdekat dinormalisasi dengan jarak maksimum dari pusat geometris sel ke tepi. Jarak diperoleh dengan menghitung jarak dari setiap FA yang diamati ke tepi sel yang ditentukan oleh sinyal LifeActGFP dan diplot untuk tiga jenis permukaan pada 24 jam dan 48 jam. Titik abu-abu mewakili pengamatan individu FA dan distribusinya dirangkum dalam plot kotak. Untuk menguji kemungkinan bahwa FA dari permukaan dan titik waktu yang berbeda berasal dari distribusi yang sama, uji Mann-Whitney dilakukan pada semua distribusi dengan tingkat signifikansi yang ditunjukkan pada gambar

Conclusions

In order to create more physiologically relevant systems for cellular studies, a plethora of 3D and 2.5D approaches have been proposed. One approach is to use flat-surfaces decorated with vertically aligned nanostructures as a simple model system. High resolution live cell imaging of co-transfected U2OS cells expressing pCMV-LifeAct-GFP and pTAGRFP-Vinculin have been used to study the influence of nanopillar arrays on actin cytoskeleton focal adhesion organisation. Our present results indicate that the U2OS cells spreading on surfaces decorated with nanopillars can be categorised into three different regimes by how they respond to the nano-structures. These observed changes are quantified by analysing more than 400 high-resolution images, and indicate that tuning geometrical properties of the nanostructured surface can be used to direct cell behaviour.

More specifically, the U2OS cells were found to either contact the substrate, attach preferably around the cell edge, or be fully suspended on top of the vertical NP arrays. In the latter case, we hypothesise that the resulting reorganisation of FA and cytoskeleton is an effect analogous to what is seen for softer substrates.

Increased understanding of how cells behave on nano-structured surfaces, such as pillar arrays, could help us discover more details about complex cellular processes. For example, it is still poorly understood how changes in the actin cytoskeleton and its architecture influence cell signalling. By studying the cell response on nanostructured surfaces in a systematic way, the potential connection between actin cytoskeleton, cell adhesions and a plethora of biochemical signalling pathways could be further explored. We therefore envision that further development of the presented platform and analysis could have implications for advanced in vitro applications or for development of smarter in vivo biointerfaces.

Methods

Fabrication of Nanostructures and Sample Mounting

SU-8 nanostructures were fabricated as previously explained [63]. Briefly, 24 mm by 24 mm glass cover slips (#1.5, Menzel-Gläser, thickness 170 μm) were cleaned by immersion in acetone, isopropyl alcohol, rinsed in de-ionised water and dried. The cover slips were then oxygen plasma treated for 2 min (Diener Femto plasma cleaner, power 100 W, base pressure 0.3 torr), followed by dehydration for 10 min on a 150 °C hot plate. Samples were then placed in a desiccator containing an open vial of Hexamethyldisilazane (HMDS, Sigma Aldrich product no:440191). HMDS was applied by vapour deposition, the desiccator was pumped to low vacuum using a diaphragm pump for 5 min and the samples were kept in HMDS atmosphere for 60 min.

Substrates for EBL were prepared directly after HMDS treatment by spin coating SU-8 2001 (Microchem Corp.) to a desired thickness of 500 nm and 1000 nm. SU-8 was made fluorescent by adding either Oxazine 170 perchlorate, Rhodamine 800 or Coumarin 102 (all Sigma Aldrich) to a final concentration of 100 μg mL ⁻¹ resist. After spin coating samples were dehydrated on a hot plate at 95 °C. To mitigate charging during EBL exposure samples were then covered by a layer of conductive polymer AR-PC 5091 Electra 92 (AllResist GmbH) by spin coating at 2000 rpm for 60 s to thickness of 50 nm.

An Elionix ELS-G100 100 kV EBL-system was used to fabricate SU-8 nanopillars (NPs) with processing parameters as described in our previous work [63]. Table 1 summarise the arrays fabricated for this work. Pillar arrays were exposed using the Elionix dot-pattern generator where each pillar is exposed in a single exposure. Arrays were exposed over an area of 2000 μm by 4000 μm, with a current of 500 pA in write fields of 500 μm by 500 μm. NPs had a tip diameter of about 100 nm as a base diameter of 150 nm and 200 nm for structures of length 500 nm and 1000 nm respectively.

After EBL exposure, the samples were rinsed in DI-water to remove the conductive polymer, then post exposure baked for 2.3 min at 95 °C and developed twice in mr-Dev 600 (Micro Resist Technology GmbH) developer for 20 s, rinsed in isopropyl alcohol and dried. Samples were then treated with oxygen plasma (Diener Femto plasma cleaner, power 50 W, base pressure 0.3 torr) for 30 s to render SU-8 hydrophilic and to give it similar surface chemistry as glass by oxidising surface epoxy-groups to hydroxyl.

Fabricated structures were imaged using Scanning electron microscopy (SEM) and samples sputter coated with 5 nm Platinum/Palladium alloy deposited with a 208 HR B sputter coater (Cressington Scientific Instruments UK). SEM was performed with a FEI Apreo SEM, at 5 kV and 0.2 nA with sample 45° pre-titled stage and with additional tilting of 30°.

A Side view schematic representation of nano-structured surface mounted in petri dish. Glass slides are mounted using paraffin such that structures are pointing upwards. B Tilted schematic representation of nano-pillar array on flat surface, and two important parameters for the nano-pillar arrays (height and pitch). These figures are not drawn to scale. C , D Overview of the nanopillar arrays employed in this work. Top-down and tilted side-view scanning electron micrographs of fabricated nano-pillar array with pillars of height 1000 nm and pitch 1000 nm. Scalebars 2000 nm

When exposing the pillars, an indexing system was also exposed to make navigation during live-cell imaging more reliable. Arrays were optically inspected after fabrication to ensure free and standing pillars. The short Oxygen plasma treatment to render the SU-8 structures did not lead to any optically visible change to the structures. Lastly, the samples were mounted underneath 35 mm diameter dishes (Cellvis, Mountain View, CA, USA) with 14 mm holes and nano-structures pointing upwards, as indicated schematically in Fig. 7. As flat surfaces, areas outside the structured part of the same samples were used. Before usage, all dishes were disinfected with 70% ethanol twice and dried.

Cell Culture and Transfection

U2OS-cells (ATCC) were cultivated in Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM Prod. 41965039, Fischer Scientific) with 10% fetal bovine serum (FBS) and kept at 5% CO₂ and 37 °C. Before detachment, cells were washed with PBS and detached with Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (trypsin-EDTA) and seeded on nanostrucutred or flat surfaces. For the diameter 14 mm glass wells 15,000 cells were seeded.

For the standard transfection experiments, cells were allowed 6 h for adhering to surfaces before transfection. U2OS cells were transiently transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Fischer Scientific) by adapting the manufacturer protocol to our system. Briefly, 2 μL Lipofectamine 2000 was added to 50 μL Opti-MEM I Reduced Serum Media (Prod. 11058021, Gibco , Fischer Scientific) and incubated for 5 min at room temperature. Plasmid DNA coding for fluorescent LifeAct-TagGFP2 and TagRFP-vinculin fusion proteins were co-transfected by using 0.5 μg plasmid DNA (vinculin-pTagRFP and pCMVLifeAct plasmids) was diluted in 50 μL Opti-MEM I and incubated at room temperature for 5 min. For co-transfection of TagRFP-vinculin and pCMVLifeAct 0.5 μg of each plasmid was used.

The diluted DNA was added to the diluted Lipofectamine 2000 in a 1:1 ratio, and left to incubate for 20 min at room temperature. 40 μL of the combined transfection complex was then added to each well. After 18 h, 1.5 mL DMEM (Prod. 41965039) supplemented with 10% FBS and 1% 10000U/mL Penicillin-Streptomycin was added to each dish.

For reverse transfection experiments, the same amounts of reactants were used, but the transfection complex was added to a suspension of U2OS cells, and the suspension was then added to the wells.

Microscopy

Live cell imaging was performed usin g a Zeiss LSM 800 Airyscan with an inverted Axio Observer Z1 stand connect to a PeCon compact incubator. Imaging was performed in an humidified environment at 37 °C, with 5% CO₂ flow. High resolution imaging was performed using a Zeiss Plan-Apochromat 63x/1.4NA DIC M27 oil objective with Cargille Immersion Oil Type 37 (n =1.51) suited for use at 37 °C. All images were taken using the system optimised pixel size both in-plane (typically 34 nm) and for stacks in the vertical axis (typically 180 nm).

To minimise imaging bias, imaging was performed in a standardised manner where each pillar array was raster scanned and cells expressing both LifeActGFP and Vinculin RFP were imaged. The high resolution images were then processed using a Zeiss algorithm for reconstruction of AiryScan images and exported as CZI-files for further manual and automatised image processing.

Image Analysis

For all cells, cell shape was based on the expression LifeActGFP fusion protein and expression of TagRFP-vinculin was used to identify FAs. Segmentation of images was performed using a script written in Python 3 [72] using CZIfile [73] (version 2017.09.12) for reading the microscopy images in Zeiss-format. The python packages Scipy [74] and Scikit-image [75] were used for multi-dimensional image processing and image segmentation respectively.

To reduce the influence from fluorescence cross-talk from pillars (due to Oxazine 170 perchlorate, Rhodamine 800 or Coumarin 102), the pillar/surface channel was used as a background and subtracted from the TagRFP-vinculin imaging channel. A median filter (size:10 pixels) was applied to remove noise from the TagRFP-vinculin channel, followed by classification of the image into regions based on their intensity value using a Multi-Otsu approach. Multi-Otsu thresholding with three classes was applied. The first class was typically the background, the second class constituted the cytosolic vinculin, whereas vinculin rich areas in FAs appeared brighter and could be classified into a third class. The quality of the image segmentation was briefly assessed by comparison to manual segmentation.

Area of cells and vinculin rich regions were described by counting pixel numbers and from this the actual area was found by correcting for the pixel size. Shape geometries were described by fitting each region with an ellipse with the same second-moment as the segmented region. In order to describe the cell area geometry, three measures were used:(1) Aspect ratio defined as the ratio of the ellipse major axis to the minor axis. (2) Circularity given as,

$$\begin{aligned} C =\frac{4\pi *\text{Area}}{\text{Perimeter}^2}, \end{aligned}$$ (1)

and roundness given as,

$$\begin{aligned} R =\frac{4*\text{Area}}{\pi *\text{MajorAxis}^2}. \end{aligned}$$ (2)

Segmented vinculin areas with a fitted ellipse that were too round (aspect ratio \(\le 1.5\)) or too elongated (aspect ratio \(\ge 8.5\)) were rejected. In addition, vinculin areas smaller than 0.05 μm ² were filtered out. In order to find the distance between each vinculin area and the cell edge, the shortest euclidean distance between each centroid (the centre of the fitted ellipse for each vinculin area) and the cell edge was calculated.

Statistical Analysis

Statistical comparisons of distributions were performed by using the non-parametric two-tailed Mann-Whitney test neither assuming normal distribution nor equal standard deviation. P -values \(\ge {0.05}\) were considered to represent a non-significant (ns) difference between the two populations. Significant values were denoted with * for p in 0.01 to 0.05, ** for p in 0.001 to 0.01, *** for p in 0.0001 to 0.001 and lastly **** for p \(\le {0.0001}\).

Singkatan

DMEM:

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

EBL:

Electron Beam Lithography

ECM:

Extracellular Matrix

EDTA:

Ethylenediaminetetraacetic Acid

FA:

Focal Adhesion

FBS:

Fetal Bovine Serum

GFP:

Green Fluorescent Protein

HMDS:

Hexamethyldisilazane

NP:

Nanopillar

RFP:

Red Fluorescent Protein

SEM:

Scanning Electron Microscopy

Gold Nanobiosensor Berdasarkan Resonansi Plasmon Permukaan Terlokalisasi Mampu Mendiagnosis Brucellosis Manusia, Memperkenalkan Metode yang Cepat dan Terjangkau Menyetel Toksisitas Spesies Oksigen Reaktif menjadi Terapi Tumor Tingkat Lanjut