Teknik Nano Menonaktifkan Sel Punca Kanker

Metode

Percobaan dilakukan pada tikus Balb/C betina berumur 8 bulan. Tikus dipelihara dalam kondisi standar vivarium (suhu kamar 20 ± 2 °C, kelembaban relatif 50–70%, siklus terang-gelap 12:12 jam). Semua protokol eksperimental telah disetujui oleh Komite Etika Hewan dari Institut Masalah Kriobiologi dan Kriomedisin dari Akademi Ilmu Pengetahuan Nasional Ukraina, Kharkiv, Ukraina, (rek. no. 1 tanggal 23.01.2017) dan sesuai dengan Konvensi Eropa tentang Penggunaan Hewan Eksperimental (Strasbourg, 1986), disetujui oleh Kongres Nasional Pertama Ukraina dalam Bioetika (Kiev 2004).

Budaya Sel EC Di Vivo

Sel-sel karsinoma Ehrlich (EC) dilewatkan di rongga peritoneum (PC) tikus Balb / C. Cryopreserved dalam sel EC cairan asites digunakan sebagai kultur primer [20]. Setelah pencairan, sel-sel EC tiga kali ditransplantasikan kembali secara in vivo, untuk mengurangi pengaruh faktor pembekuan-pencairan dan memperoleh fitur morfologis dan fungsional sel asli dari mereka [21]. “Distabilkan” dengan demikian sel-sel EC disuntikkan secara intraperitoneal dalam dosis 3 × 10 ⁶ sel/tikus dalam 0,3 ml saline dan dikultur selama 7 hari in vivo. Setelah 7 hari, hewan percobaan dikeluarkan dari percobaan dengan anestesi eter ringan. Cairan asites dari PC diambil dengan spuit melalui jarum berdiameter dalam 2,69 mm dan dimasukkan ke dalam tabung ukur 10 ml. Jumlah sel absolut ditentukan dengan memperbesar volume akumulasi cairan asites rongga peritoneum (ml) dengan jumlah sel EC yang dihitung di ruang Goryaev. Peningkatan jumlah total hingga 35.00 × 10 ⁷ Sel EC pada PC mencit hingga hari ke 7 merupakan kriteria perkembangan karsinoma [21]. Di masa depan, sel-sel itu sendiri berfungsi sebagai objek penelitian.

Penilaian fenotipik subpopulasi EC

Itu dilakukan dengan flow cytometer “FACS Calibur” (“Becton Dickinson,” USA) menggunakan antibodi monoklonal (US “BD Biosciences”) ke CD44 (FITC) (no. 553133, clone IM7), CD117 (FITC) (no. 553354, klon 2B8) dan Sca-1 (FITC) no. 553333, kloning E13-161.7), dan CD24 (PE) no. 553262, clone M1/69) sesuai dengan instruksi pabrik. Sebagai kontrol, sampel dengan menambahkan antibodi monoklonal berlabel FITC dan PE nonimun dari isotipe yang sama (“BD Biosciences”), no. 553988, kloning A95-1 dan no. 553989, klon A95-1), sebagai antibodi terhadap penanda yang diuji digunakan. Pewarnaan ganda imunofenotipik dilakukan menggunakan antibodi monoklonal CD44 (FITC) dan CD24 (PE). Sel-sel dengan fluoresensi rata-rata penanda CD44 lebih tinggi 10 ³ (menurut skala logaritmik) dirujuk ke CD44 ^tinggi subpopulasi. Perekaman dan analisis hasil dilakukan dengan perangkat lunak “WinMDi 2.9” (Joseph Trotter, La Jolla, USA).

Pemisahan CD44 ⁺ Fraksi Sel EC Menggunakan Penyortiran Imunomagnetik

Perlu diingat bahwa CSC dengan tingkat ekspresi penanda CD44 yang tinggi (CD44 ^tinggi ), terdiri dari populasi CD44 yang heterogen ⁺ sel, memiliki aktivitas tumorigenik tertinggi, mereka diisolasi dari populasi EC total dengan penyortir magnetik (BDTM Imagnet). Untuk mengisolasi CD44 ⁺ fraksi, ada digunakan antibodi monoklonal tidak berlabel primer untuk penanda CD44 (BD, 558739) dan Mouse IgG1 Magnetic Particles-DM sekunder (BD, 557983) sesuai dengan protokol pabrikan. Kemurnian pemisahan untuk CD44 ⁺ sel dari total populasi EC adalah 90%.

Penentuan aktivitas tumorogenik sel total populasi dan CD44  terisolasi ⁺ dan CD44 ^– - pecahan EC

Kemampuan tumorigenik dari total populasi dan CD44 terisolasi ⁺ dan CD44 ^– Fraksi EC dianalisis secara komparatif dengan metode kultur in vivo yang dijelaskan di atas. Penyiapan eksperimental ditunjukkan pada Gambar. 1.

Desain eksperimental ketika menganalisis secara komparatif kemampuan tumorigenik dari total populasi dan CD44 yang diisolasi ⁺ dan CD44 ^– pecahan EC

Dalam rangkaian percobaan pertama, kami mengevaluasi kemampuan tumorigenik dari total populasi dan CD44 yang diisolasi ⁺ dan CD44 ^– Fraksi EC saat diberikan kepada hewan dalam dosis standar yang digunakan untuk inisiasi EC (3 × 10 ⁶ sel dalam 0,3 ml saline).

Hewan dibagi menjadi beberapa kelompok berikut (n = 10):

• Kelompok 1.1–pemberian total populasi sel EC (3 × 10 ⁶ sel/hewan)

• Grup 2.1–pemberian CD44 ⁺ fraksi sel EC (3 × 10 ⁶ sel/hewan)

• Grup 3.1–pemberian CD44 ^– pecahan sel EC (3 × 10 ⁶ sel/hewan)

Dalam 7 hari setelah inokulasi di masing-masing kelompok eksperimen, jumlah total sel dalam PC hewan dihitung, karakteristik fenotipik sel dinilai (seperti dijelaskan di atas), dan CD44 ^tinggi /CD117 ⁺ rasio sel EC ditentukan sebagai rasio CD44 ^tinggi persentase menjadi CD117 ⁺ sel [22]. Potensi proliferasi sel dari total populasi EC dan CD44 terisolasi ⁺ dan CD44 ^– fraksi diperkirakan berdasarkan data sebagai berikut:faktor multiplisitas (MF) surplus populasi sel selama waktu kultur, M = T/T₀; dan penggandaan waktu (TD), TD = (log₂ 2)* t /[log₂ (T /T ₀ )], di mana t adalah waktu kultur sel (h), N adalah jumlah sel di t waktu; T ₀ adalah nomor sel awal [23].

Pada set percobaan kedua, ada perkiraan dosis minimum sel yang diberikan dari total populasi dan CD44 yang diisolasi ⁺ dan CD44 ^– Fraksi EC, menginduksi pertumbuhan tumor. Suspensi sel total dan CD44 terisolasi ⁺ dan CD44 ^– Fraksi EC diberikan secara intraperitoneal pada tikus dengan dosis 3 × 10 ⁶ , 3 × 10 ⁵ , 3 × 10 ⁴ , dan 3 × 10 ³ sel per tikus dalam larutan garam 0,3 ml dan dibiakkan selama 7 hari di PC.

Hewan yang digunakan dalam rangkaian eksperimen ini telah dibagi menjadi beberapa kelompok berikut (n = 10):

• Kelompok 1.1–pemberian total populasi sel EC (3 × 10 ⁶ hewan sel)

• Kelompok 1.2–pemberian total populasi sel EC (3 × 10 ⁵ sel/hewan)

• Kelompok 1.3–pemberian total populasi sel EC (3 × 10 ⁴ sel/hewan)

• Kelompok 1.4–pemberian total populasi sel EC (3 × 10 ³ sel/hewan)

• Grup 2.1–pemberian CD44 ⁺ fraksi sel EC (3 × 10 ⁶ sel/hewan)

• Grup 2.2–pemberian CD44 ⁺ fraksi sel EC (3 × 10 ⁵ sel/hewan)

• Grup 2.3–pemberian CD44 ⁺ fraksi sel EC (3 × 10 ⁴ sel/hewan)

• Grup 2.4–pemberian CD44 ⁺ fraksi sel EC (3 × 10 ³ sel/hewan)

• Grup 3.1–pemberian CD44 ^– pecahan sel EC (3 × 10 ⁶ sel/hewan)

• Grup 3.2–pemberian CD44 ^– pecahan sel EC (3 × 10 ⁵ sel/hewan)

• Kelompok 3.3–pemberian CD44 ^– pecahan sel EC (3 × 10 ⁴ sel/hewan)

• Kelompok 3.4–pemberian CD44 ^– pecahan sel EC (3 × 10 ³ sel/hewan)

Di setiap kelompok eksperimen, jumlah total sel di PC dan hewan dengan perkembangan asites ditentukan 7 hari kemudian setelah inokulasi EC.

Sintesis Nanokompleks

Nanokompleks hibrida yang mengandung spherical nanoparticles (NPs) (diameter 2-3 nm) pada konsentrasi 1,30 g/l dan kolesterol domba dalam konsentrasi 0,55 g/l (“Acros organics”, Belgia) disintesis di Institute for Scintillation Materials dari Akademi Ilmu Pengetahuan Nasional Ukraina (Kharkiv) seperti yang dilaporkan [18]. NP berdasarkan orthovanadates dari elemen tanah jarang GdYVO₄ :Eu ³⁺ berbentuk bola dalam konsentrasi 1,30 g/l disiapkan seperti yang dijelaskan [24]. Larutan koloid berair berdasarkan ortovanadat telah dimurnikan dari pengotor dengan dialisis menggunakan membran “Cellu Sep H1” 3.5 KDa.

Dalam nanokompleks hibrida, NP bermuatan negatif terlokalisasi di sepanjang pinggiran partikel kolesterol karena van der Waals dan interaksi hidrofobik. NP menstabilkan nanokompleks melalui interaksi elektrostatik. Ukuran nanokompleks yang disintesis tidak melebihi 100 nm. Selain itu, NP menunjukkan sifat antioksidan dan tidak mengalami oksidasi. Fakta ini berkontribusi pada peningkatan resistensi dispersi air kolesterol dalam kaitannya dengan spesies oksigen reaktif. Struktur skematis nanokompleks hibrida ditunjukkan pada Gambar. 2.

Nanokompleks hibrida:a representasi skematik dan b mikroskop elektron transmisi fotomikrografi hibrid nanokompleks, diperoleh dari larutan air kolesterol yang ditempatkan pada jaringan karbon

Untuk merekam akumulasi hibrid nanokompleks dalam sel selama studi in vitro, pewarna fluoresen hidrofobik 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) dapat ditambahkan ke dalam dispersi berair kolesterol, memungkinkan dalam spektroskopi luminesen lokal untuk mengevaluasi dinamika integrasi kompleks ke dalam membran sel dengan rasio pita pendaran monomer––“J-agregat” [25]. Studi kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa nanokompleks hibrid mampu diintegrasikan tidak lebih dari 10% sel dari total populasi EC dan hampir ke semua sel CD44 yang terisolasi ⁺ fraksi yang memiliki potensi karsinogenik tertinggi. Hal ini memungkinkan penggunaan nanokompleks hibrid dalam modifikasi ini (NPs + kolesterol + DiI) sebagai metode untuk mengidentifikasi akumulasi lokal nanokompleks dalam sel kanker [26, 27].

Pra-Perawatan Sel EC dengan Nanomaterials

Suspensi total sel EC dengan nanokompleks hibrida atau NP diinkubasi dalam larutan glukosa 5% ("Infus" CJSC, Kyiv) pada suhu kamar selama 3 jam. Waktu inkubasi seperti itu sebelumnya ditemukan sebagai waktu yang optimal untuk mengikat nanokompleks ke sel [26].

Varian pra-perawatan sel EC berikut dengan bahan nano telah diuji:

• Opsi 1–900 μl sel EC (1 × 10 ⁷ ) 100 μl NP bulat (1,3 g/l) ditambahkan.

• Opsi 2–900 μl sel EC (1 × 10 ⁷ ) 100 μl kompleks hibrida (NP bulat (1,3 g/l) + kolesterol (0,55 g/l)) ditambahkan.

Kontrol adalah sel-sel populasi total EC, yang diinkubasi dalam larutan glukosa 5% tanpa perlakuan dengan nanokomposit. Jumlah hewan di setiap kelompok eksperimen tidak kurang dari 20.

Setelah inkubasi, sel-sel EC dari semua kelompok yang diuji dicuci tiga kali dengan saline (1:1) dengan sentrifugasi (10 menit pada 300 g).

Intensitas perkembangan EC setelah pra-perawatan dengan nanomaterial dievaluasi dengan injeksi intraperitoneal dalam dosis 3 × 10 ⁶ sel dalam 0,3 ml saline. Dalam 7 hari setelah inokulasi sel EC di semua kelompok yang dipelajari, ditentukan:

• Jumlah total (TN) sel EC di rongga peritoneum.

• Laju penghambatan (Ri) pertumbuhan EC menurut rumus Ri = (TN (c) – TN(e)):TN (c) × 100%, di mana TN (c)––jumlah total sel EAC di PC dari kelompok kontrol, TN (e)—jumlah total sel EAC di PC kelompok eksperimen.

• Laju pertumbuhan (Rg) EC dihitung dengan menggunakan rumus Rg (e) = Rg (c) – Ri, di mana Rg (e)—laju pertumbuhan tumor kelompok hewan percobaan; Rg (c)—laju pertumbuhan tumor kelompok kontrol, Ri—laju penghambatan pertumbuhan EC pada kelompok hewan percobaan; tingkat penghambatan pertumbuhan EC pada kontrol diambil sebagai 100%, pada saat itu, tidak ada penghambatan pertumbuhan EC.

• CD44 ^tinggi /CD117 ⁺ rasio (rasio CD44 ^tinggi persentase menjadi CD117 ⁺ sel).

• Kelangsungan hidup hewan dinilai hingga hari ke 20 setelah injeksi intraperitoneal yang tidak diobati dan diobati dengan semua jenis sel EC nanokomposit.

Pemrosesan statistik dilakukan menggunakan Mann-Whitney non-parametrik U uji dalam perangkat lunak Statistica 6.0. Perbedaan dianggap signifikan secara statistik pada P < 0,05.

Hasil

Hasil yang diperoleh menunjukkan adanya populasi heterogen sel EC yang membawa penanda CD44, CD24, Sca-1 pada permukaannya dan penanda yang dapat dikaitkan dengan elemen aksesori-pengaturan lingkungan mikro (CD117). Konsentrasi sel dengan karakteristik ini dalam kumpulan EC total (grup 1.1) ditunjukkan pada Tabel 1 dan sepenuhnya konsisten dengan temuan sebelumnya pada komposisi subpopulasi EC [28]. Identifikasi struktur Sca-1 secara virtual di semua sel EC memungkinkan untuk mempertimbangkannya sebagai penanda serbaguna dari jenis tumor ini.

Yang paling informatif dalam hal identifikasi fenotipik CSC adalah ekspresi molekul CD44, yang baik itu sendiri atau dalam kombinasi dengan penanda permukaan lain digunakan untuk mengisolasi populasi sel ini dari berbagai tumor, termasuk EC. Menurut pandangan klasik, diferensiasi sel tumor selama perkembangan kanker payudara disertai dengan penurunan ekspresi reseptor CD-44 dengan hilangnya secara bertahap dan munculnya sel-sel yang mengekspresikan penanda CD24 [3].

Kandidat untuk peran CSC selama EC dapat berupa sel dengan CD44 ^tinggi fenotipe menjadi bagian dari CD44 ⁺ CD24 ^– - populasi. Anggapan ini tentang ketergantungan EC pada aktivitas fungsional subpopulasi CD44 ⁺ sel diuji ketika mengevaluasi intensitas pertumbuhan tumor yang disebabkan oleh CD44 ⁺ dan CD44 ^– fraksi dan EC total populasi. Tabel 1 menunjukkan bahwa aktivitas pemicu tumor tertinggi melekat pada sel CD44 ⁺ pecahan. Sebenarnya setelah pemberian 3x10 ⁶ CD44 ⁺ sel (kelompok 2.1), jumlah absolut sel di PC adalah 23 kali lebih tinggi daripada setelah jumlah total populasi sel EC (kelompok 1.1), dan 105 kali lebih banyak daripada saat CD44 ^– fraksi diberikan (Grup 3.1).

Dengan ini, ditemukan perubahan tidak hanya komposisi kuantitatif tetapi juga kualitatif dari tumor yang sedang berkembang. Pecahan CD44 ⁺ membentuk asites dengan konten dominan CD44 ⁺ sel, mis., CD44 ^tinggi , CD44 ⁺ CD24 ^– , dan CD44 ⁺ CD24 ⁺ sel. Selain itu, konsentrasi CD44 ^tinggi sel adalah 2 kali lebih tinggi jika dibandingkan dengan kelompok 1.1 dan 16 kali lebih tinggi pada kelompok 3.1. Pecahan CD44 ^– , sebaliknya, terbentuk tumor yang mengandung lebih banyak sel dewasa, yaitu sel-sel dengan CD44 ^– CD24 ⁺ fenotipe. Redistribusi komposisi subpopulasi sel dalam kelompok 3.1 tampaknya menentukan kandungan absolut minimum sel di PC.

Penting adalah fakta mapan keberadaan di antara sel-sel EC dari subpopulasi dengan CD117 ⁺ penanda. Molekul CD117 adalah reseptor tirosin kinase transmembran. Dalam kondisi normal, ini diaktifkan oleh ligan yang sesuai, yaitu faktor pertumbuhan sel induk (SCGF) [29]. Dalam patologi onkologi, aktivasi reseptor c-KIT yang bergantung pada ligan terjadi, yang paling sering (sampai 92% kasus) merupakan konsekuensi dari mutasi onkogen c-kit atau disebabkan oleh mekanisme regulasi fungsi reseptor ini yang tidak teratur. [30].

Mempertimbangkan CD117 ⁺ sel sebagai sel lingkungan mikro tumor fakta yang mapan tentang ketergantungan intensitas pertumbuhan tumor pada ada atau tidak adanya CD117 ⁺ sel dan hubungan konsentrasinya dengan CD44 ^tinggi sel adalah logika. Seperti yang ditunjukkan Tabel 1, saat memulai EC dengan memasukkan total populasi sel (grup 1.1.) di PC, terbentuklah 34,80 ± 1,27 × 10 ⁷ sel pada CD44 ^tinggi /CD117 ⁺ rasio, yang sama dengan 0,02 unit relatif.

Potensi tumorigenik CD44 ^– fraksi 4 kali lebih rendah (kelompok 3.1) yang dimanifestasikan oleh penurunan CD44 ^tinggi /CD117 ⁺ rasio yang sama (4 kali) jika dibandingkan dengan kelompok 1.1. Perubahan ini pada CD44 ^tinggi /CD117 ⁺ indeks terutama disebabkan oleh penurunan CD44 ^tinggi konsentrasi (dalam 8,5 kali) pada latar belakang pengurangan konten CD117 ⁺ sel (dalam 2 kali) juga.

Saat mengevaluasi intensitas pertumbuhan asites, yang dihasilkan oleh CD44 ⁺ fraksi, peningkatan yang signifikan dalam jumlah sel di PC (hampir 24 kali lipat jika dibandingkan dengan kelompok 1.1) tercatat. Juga, yang penting adalah kelebihan dalam dua kali CD44 ^tinggi konsentrasi dan kurangnya CD117 ⁺ sel. Pada materi awal CD44 ⁺ fraksi (sebelum kultur) menurut analisis aliran cytometric data, kandungan CD44 ^tinggi sel 15 kali lebih tinggi daripada total populasi sel EC (data tidak disajikan).

Untuk meringkas yang disebutkan di atas, kami dapat berpendapat bahwa peran penting dalam inisiasi EC dimainkan oleh CSC dengan tingkat ekspresi penanda CD44 yang tinggi (CD44 ^tinggi ), sedangkan salah satu fungsi terpenting CD117 ⁺ subpopulasi adalah regulasi (“penahanan”) aktivitas tumorigenik CD44 ^tinggi sel. Tidak adanya CD117 ⁺ sel (grup 2.1) tampaknya melipatgandakan potensi proliferasi dan diferensiasi dari seluruh kumpulan CD44 ⁺ sel, menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam jumlah total sel di PC.

Analisis potensi proliferatif dari kumpulan total sel EC dan CD44 ⁺ faksi mendukung interpretasi ini. Ditunjukkan bahwa faktor perkalian (MF) pada populasi keseluruhan yang dikultur dalam PC pada kelompok 2.1. selama 7 hari meningkat hampir 24 kali lipat jika dibandingkan dengan kelompok 1.1. Hal ini disertai dengan penurunan waktu sel dua kali lipat dari 24,47 ± 2,75 jam pada kelompok 1.1–14.70 ± 1,35 pada kelompok 2.1 yang dapat mencirikan populasi sel asites yang tumbuh dari CD44 ⁺ fraksi, karena lebih aktif berkembang biak (Tabel 1).

Untuk membuktikan peran khusus CD44 ⁺ sel dalam inisiasi dan pemeliharaan tumor ketika diberikan EC bahkan dalam dosis minimal, menarik untuk menilai secara komparatif kapasitas tumorigenik dari CD44 yang diisolasi ⁺ dan CD44 ^– fraksi bila diberikan pada berbagai konsentrasi. Telah ditemukan bahwa setelah pengenalan 3 × 10 ⁶ sel total populasi EC, pertumbuhan tumor diamati pada 100% hewan (10/10) (Tabel 2). Mengurangi 10 kali dosis sel yang diberikan (3 × 10 ⁵ ) resulted in a proportional decrease in absolute number of cells in the PC, tumor developed only in 50% of animals (Table 2). Reducing the administered dose of total EC population of cells down to 3 × 10 ⁴ did not lead to tumor formation in the PC.

Initiations of EC by introducing of CD44 ⁺ cells at concentrations of 3 × 10 ⁶ dan 3 × 10 ⁵ cells per animal resulted in almost 100% tumor development for both cases. Herewith, tumorigenic potential of CD44 ⁺ fraction exceeded that of total population of EC cells administered in the same doses (in 23 and 21 times, respectively). Moreover, introduction of 3 × 10 ⁴ cells of CD44 ⁺ fraction caused a tumor formation in 33% of animals, while total population of EC cells used in the same dose, did not cause the formation of ascites. With the introduction of 3 × 10 ³ cells of CD44 ⁺ fraction, no animals with the developed EC have been identified.

Fraction of CD44 ^– cells just in a dose of 3 × 10 ⁶ was capable of forming tumors in 50% of animals, the number of cells in the PC in this case was 4.5 times less than when introducing the total population and in 105.9 times less than when inducing by CD44 ⁺ fraction. Thus, the results of this part of research suggest that CSCs are mainly present in the pool of cells with CD44 ⁺ phenotype. This emphasizes the importance of this subpopulation of cells in initiation and development of EC.

As noted above, identification and inactivation of CSCs is a major theoretical and practical issue of oncology. On this basis, the next task of our study was to investigate the impact of hybrid nanocomplexes designed at the Institute for Scintillation Materials of National Academy of Sciences of Ukraine on the tumorigenic activity of EC cells.

As Table 3 demonstrates an incubation of EC cells with only NPs as a component of hybrid nanocomplexes (option 1) decreased the concentration of CD44 ^high virtually twice if compared to the control and 5 times the content CD44 ⁺ CD24 ^– cells in ascites formed in vivo. The number in it of more differentiated CD44 ⁺ CD24 ⁺ , CD44 ^– CD24 ⁺ cells remained practically unchanged if compared to the control. In this group, there was established reduction of CD117 ⁺ cells (35%) at a slightly changed content of Sca-1 ⁺ subpopulation. Based on the data, the inhibition rate of EC growth (59.41 ± 3.45%) in variant 1 was accompanied by a twofold decrease in the concentrations of CD44 ^high cells in comparison with the control that was also reflected in the reduction of CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio (Table. 3).

Pretreatment of EC cells with hybrid nanocomplexes (option 2) reduced almost 10 times the concentration of CD44 ^high and CD44 ⁺ CD24 ^– cells in the developed ascites if compared to the control (Table 3). It should be noted that the concentration of more differentiated CD44 ⁺ CD24 ⁺ and CD44 ^– CD24 ⁺ cells after this treatment increased slightly if compared to the control. The redistribution pattern of EC subpopulation composition in this option was accompanied with a pronounced enhancement of tumor growth inhibition compared to option 1 (74.70 ± 4.38 and 59.41 ± 3.45%, respectively, P  < 0.05) that underlined the importance of cholesterol as a targeted compound of antitumor therapy. Pretreatment with hybrid nanocomplexes (option 2) led to maximal reduction there was found a maximum reduction of CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio (10 times) as compared with option 1, that again confirmed a specific role of ratio of these cell subpopulations in the EC growth.

For all the types of EC pretreatment, the reduction of CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio was accompanied by a decrease in tumor growth rate and increased survival of animals to day 20 of EC development (Fig. 3).

Tumor growth rate of EC, survival of animals and CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio after incubation with nanocomplexes. Note:differences are statistically significant as compared with administration of the control (*), option 1 (**) (P  < 0.05)

Discussion

One of the tasks of current oncology is elucidation of the mechanisms of initiation and development of malignant neoplasms. Mandatory participants in these events are the CSCs and so-called accessory-regulatory cells of tumor microenvironment. The variety of functional and structural characteristics of the CSCs in the development of different types of tumors determines the need for their further study. This is facilitated by the expansion of experimental model systems. One of them is the transplantable line of tumor cells of EC.

The elucidation of the peculiarities of this experimental model development, the subpopulation composition of tumor and tumorigenic potential of individual cell populations within the general pool of the EC cells will facilitate the development of new approaches to cancer therapy.

Using the method of phenotypic evaluation of progenitor cells of various levels of differentiation in the tumor focus makes it possible the identifying the stages, dynamics of development and invasiveness of the process. The established fact of heterogeneity of the EC subpopulation composition is important and there has been emphasized the value of CD44 ⁺ subpopulation in maintaining the growth of this type of tumor.

The most important role in implementing a tumorigenesis is played by an expression rate of the molecule. Indeed, in contrast to leukocytes for adhesion of those normally a low expression rate of CD44 receptor is required, triggering and self-maintenance in CSCs are implemented its much greater density on a cell surface [31].

It is known that CD44-glycoprotein is a hyaluronic acid (HA) receptor, a main component of extracellular matrix. The emerging set of HA-CD44 activates many receptor tyrosine kinases, resulting in activation of PI3K/Akt/ mTOR way [32, 33], which plays the role of a single universal signal transmission mechanism to the translation apparatus and is responsible for the integration of proliferative stimuli.

Among two known CD44-isoforms in normal hematopoietic cells its standard isoform (CD44s) is predominantly expressed [34]. In most malignant tissues there were detected both CD44s and variable isoforms of CD44- molecule (CD44v), resulting from alternative splicing of exons 6-15. Namely alternative splicing leads to a lengthening of CD44-extracellular domain, promoting its greater interaction with HA and tumor metastasis [35]. Due to that the role of CD44 ^high cells in triggering and maintaining the tumorogenesis is clear. It was previously found that a minor subpopulation of CD44 ^high cells had a high proliferative potential and played a critical role in EC developing [20].

In this paper, a special role of CD44 ⁺ -cells of the EC in initiation and maintenance of the tumor process in the EC under administration even in minimal doses has been shown. CD44 ⁺ cells were able to form a tumor even at a cell concentration of 100 times lower (10 ⁴ cells/ mouse) if compared with the introduction of a total EC population (10 ⁶ cells / mouse). The belonging of tumor cells to the CD44 ⁺ fraction was also confirmed by the fact that the EC initiation by the fraction of CD44-cells even at a dose of 10 ⁶ cells / mouse caused the formation of a tumor only in 50% of cases, with an absolute number of cells in the PC 5 times less than in under introduction of a similar amount of the total population of EC and more than 100 times less than after the introduced CD44 ⁺ -fraction.

This is in accordance with the data of Shipitsin M et al. has shown that CD44 ⁺ and CD24 ⁺ cells in breast cancer development there are cell populations with different genetic profiles [36]. The research performed by Shipitsin M CD24 ⁺ cells have been noted to be more differentiated, while more progenitor-like functions are inherent to CD44 ⁺ cells. The research performed by Shipitsin M CD24 ⁺ cells have been noted to be more differentiated, while more progenitor-like functions are inherent to CD44 ⁺ cells. The authors suggest that CD24 ⁺ cells can be derived from CD44 ⁺ cells [36]. Fillmore C. and Kuperwasser C. supposed that CD24 ⁺ population was mainly characterized by less differentiated basal type of breast cancer, and CD44 ⁺ cells caused the development of luminal form of breast cancer, being more differentiated type of tumor [37].

Analyzing the patterns of tumor development, the classic hypothesis of «seed and soil» looks very actual [38], which postulated that an appropriate microenvironment (soil) is required for optimal growth of tumor cells (CSCs).

Most often the carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) act as a tumor stroma in breast cancer and pancreatic cancer [39]. It has been shown that the CAFs, derived from invasive forms of human breast carcinomas, activated much stronger the growth of human breast cancer cell line MCF-7-Ras when administered to immunodeficient mice if compared with normal fibroblasts [9]. This function is implemented by the microenvironment cells due to the secretion by them of cytokines, chemokines and growth factors [10, 40].

Although so far the phenotypic identification of the microenvironment cells for various types of tumor has remained a subject of debate, most often used for this purpose the surface markers of primitive hematopoietic and endothelial cells, including c-kit (CD 117), CD133, VE-cadherin, VEGFR-2 and endoglin are used [41]. In this experimental model the most probable candidate to the role of tumor microenvironment cells is CD 117 ⁺ .

It is known that the c-KIT receptor (CD117 ⁺ ) is highly expressed in normal epithelium of the breast and progressively decreases with the development of breast carcinoma in situ and is almost completely lost in invasive breast cancer [42, 43]. Some authors proposed this kind of change in the expression rate of this marker as a possible test to assess the effectiveness of antitumor therapy [44].

Previously, after analysis of the significance of the content ratios for different subpopulations of EC cells when maintaining tumor growth, we proposed to use the CD44 ^high /CD117 ⁺ ratio as a prognostic criterion of tumor development [22].

Adequacy of using this index is confirmed in this study using the applied nanocomposites as therapeutic agents when treating the EC. The inhibition rate of EC growth (59.41 ± 3.45%) when treated with spherical NPs (option 1) was accompanied by a 2-fold decrease if compared to the control in the CD44 ^high -cell concentration, which was reflected in the reduced CD44 ^high / CD117 ⁺ indeks. The maximum decrease in the CD44 ^high /CD117 ⁺ index (10 times if compared to option 1) was established using the hybrid nanocomplexes for a pre-treatment of EC cells. Thus, many cells of a total pool of EC, but primarily those with the phenotype CD44 ^high and CD117 ⁺ , can be the target of the effect of the studied nanocomplexes (both direct and indirect). A significant decrease in their concentrations in the growing pool of EC after pretreatment with hybrid nanocomplexes clearly coincides with a reduced intensity of tumor growth.

Judging by the decrease in the amount of CD44 ^high as the most potent CSCs forming the entire subsequent series of advanced tumor cells, the main component in manifestation of antitumor effect of the synthesized hybrid nanocomplexes is spherical NPs. Introduction of cholesterol having affinity to tumor cell membranes into composition of hybrid nanocomplexes enhanced an inhibitory activity of NPs. Similar data were obtained by Betker J.L. et al. after analysis of the structure and functioning principles of the membranes of tumor cells. The authors concluded that the incorporation of cholesterol into membranes of tumor cells could be a prerequisite for a targeted delivery of liposomes with therapeutic agents directly into a cell.

Thus, the importance of cooperative interactions of cells with different phenotypic signs in maintaining the EC growth has been proven. The cells with the CD44 ^high phenotype being the part of the population of CD44 ⁺ CD24 ^– can be considered as CSCs in this model system. The use of new forms of nanocomposites that are capable to bind to CSCs and induce tumor destruction as the EC is a promising direction the treatment of oncopathology.

Conclusions

1. 1.

   On the base of the findings of phenotypic assessment and functional potential studies, the Ehrlich carcinoma is a heterogeneous population of tumor cells of varying differentiation extent referred to high and less potent tumor-inducing precursors, as well as the cells composing their microenvironment.

2. 2.

   A high (tenfold) tumorigenic activity of the EC CD44 ⁺ cells if compared to CD44 ^– cells was proven. In this pair of comparison, the CD44 ⁺ cells had a higher potential of generating in PC of CD44 ^high , CD44 ⁺ CD24 ^– , CD44 ⁺ CD24 ⁺ cell subpopulations, highlighting the presence of CSCs in a pool of CD44 ⁺ cells.

3. 3.

   There was found an ability of the synthesized nanocomplexes based on rare earth orthovanadates and cholesterol to inhibit the growth of CD44 ⁺ cell pool (CD44 ^high , CD44 ⁺ CD24 ^– , CD44 ⁺ CD24 ⁺ ) that was accompanied by a reduced intensity of EC growth (by 75%) and increased survival of the animal with tumors (in 3.5 times) in comparison with the control.

4. 4.

   It has been shown that the reduction in tumor growth rate after pretreatment with hybrid nanocomplexes was accompanied with a change in the composition of EC subpopulation that was reflected in a decrease in the CD44 ^high /CD117 ⁺ perbandingan. This ratio can be offered as one of diagnostic and prognostic tests of the severity and extent of oncology inactivation.

Singkatan

BC:

Breast cancer

CAFs:

Carcinoma-associated fibroblasts

CSCs:

Cancer stem cells

DiI:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

EC:

Ehrlich carcinoma

HA:

Hyaluronic acid

MF:

Multiplicity factor

NOD/SCID mice:

Nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency mice

NPs:

Nanoparticles

PC:

Peritoneal cavity

Rg:

Growth rate of EC

Ri:

Inhibition rate of EC growth

SCID mice:

Severe combined immunodeficiency mice

TD:

Time doubling

Menuju Nanofluida TiO2—Bagian 1:Persiapan dan Sifat Efek Permukaan pada Transportasi Minyak di Nanochannel:Studi Dinamika Molekuler