Thiacalix[4]arena Menghilangkan Efek Inhibisi Kation Zn pada Aktivitas Myosin ATPase

Hasil

Ketergantungan Aktivitas Myosin S1 ATPase pada Zn ²⁺ Konsentrasi

Ditemukan bahwa efek penghambatan yang paling menonjol pada aktivitas myosin S1 ATPase dari rahim adalah pada 5 mM (43 ± 8%, M ± SD) untuk kation Zn. Rentang konsentrasi Zn ²⁺ adalah 0,5−5 mM dalam media inkubasi (mengandung 3 mM ATP, 5 mM Mg ²⁺ , dan 0,01 mM Ca ²⁺ ). Seratus persen adalah nilai aktivitas ATPase tanpa penambahan kation Zn (kontrol) (Gbr. 2). Dengan demikian, efek samping kation Zn pada hidrolisis ATP miosin S1 dipelajari lebih lanjut dengan 5 mM Zn ²⁺ .

Aktivitas miosin S1 ATPase dari miometrium dengan adanya konsentrasi kation Zn 0,5–5,0 mM (M ± SD, n = 6). 100% adalah nilai aktivitas ATPase tanpa penambahan kation Zn

Aktivitas Myosin S1 ATPase Ketergantungan pada Konsentrasi ATP yang Ada 5 mM Zn ²⁺

Zn ²⁺ efek pada afinitas aktivitas myosin S1 ATPase ke substratnya (ATP) diselidiki. Meningkatkan konsentrasi ATP dalam media inkubasi dari 0,5 menjadi 5 mM pada MgCl₂ tetap konsentrasi (5 mM) baik dalam kontrol maupun dengan adanya 5 mM Zn ²⁺ menghasilkan grafik berbentuk kubah dengan nilai aktivitas ATPase maksimum pada 3 mM ATP. Nilai aktivitas enzimatik pada puncak ini dengan adanya seng adalah 30% lebih rendah daripada kontrol (Gbr. 3). Grafik ketergantungan aktivitas myosin S1 ATPase pada konsentrasi ATP di kontrol dan keberadaan 5 mM Zn ²⁺ di bagian menaik dilinearkan menurut metode Lineweaver-Burk [27]. Perhitungan parameter kinetik yaitu konstanta imajiner Michaelis (K _m ) dan kecepatan maksimal myosin S1 ATPase untuk ATP (V _{maks, ATP} ) mengungkapkan bahwa V _{maks, ATP} aktivitas enzimatik miosin dengan adanya 5 mM Zn ²⁺ menurun 1,6 kali (38 ± 7 dan 22 ± 6 nmol Pi/menit per 1 mg protein pada kontrol dan adanya Zn ²⁺ masing-masing, n = 5). Nilai К _m untuk hidrolisis ATP oleh miosin S1 tidak berubah secara statistik, meskipun cenderung menurun (0,49 ± 0,15 mM pada kontrol, 0,38 ± 0,12 mM dengan adanya Zn ²⁺ ; M ± SD; n = 5).

Pengaruh 0,5–5 mM ATP pada aktivitas miosin S1 ATPase dari rahim dengan adanya 5 mM Zn ²⁺ dibandingkan dengan kontrol (M ± SD, n = 5)

Ketergantungan Aktivitas Myosin S1 ATPase pada Mg ²⁺ Konsentrasi dalam Kehadiran 5 mM Zn ²⁺

Efek 5 mM Zn ²⁺ di Mg ²⁺ ketergantungan konsentrasi pada aktivitas ATPase miosin uterus dipelajari. Meningkatkan Mg ²⁺ konsentrasi dalam media inkubasi dari 0,5 hingga 5 mM pada konsentrasi ATP tetap (3 mM) dengan adanya 5 mM Zn ²⁺ tidak mengakibatkan perubahan aktivitas miosin S1 ATPase. Pada saat yang sama, Mg ²⁺ ketergantungan konsentrasi aktivitas ATPase dalam kontrol (dalam kondisi standar) terdeteksi. Tingkat hidrolisis ATP miosin tertinggi pada kontrol dicapai pada 3 mM Mg ²⁺ (Gbr. 4). Oleh karena itu, aktivitas enzim miosin S1 uterus tidak bergantung pada konsentrasi Mg ²⁺ dengan adanya konsentrasi tinggi Zn (5 mM).

Ketergantungan aktivitas Myosin S1 ATPase pada Mg ²⁺ konsentrasi dengan adanya 5 mM Zn ²⁺ dibandingkan dengan kontrol (M ± SD, n = 6)

Situs Pengikat Zn di Myosin S1

Simulasi komputer menunjukkan bahwa kation Zn memiliki beberapa daerah pengikatan di kepala miosin. Salah satunya terletak di bagian bawah celah antara subdomain 50-kDa atas dan bawah, dekat dengan situs pengikatan nukleotida, dan langsung di dekat P-loop. Zn ²⁺ dikoordinasikan dengan atom oksigen Glu177 (panjang ikatan 0,23 dan 0,39 nm), dengan atom oksigen Ser178 (panjang ikatan 0,31 nm), dan Arg236 (panjang ikatan 0,32 nm).

Wilayah pengikatan Zn lainnya terletak di bagian bawah subdomain 50-kDa atas (Leu218-Asp463, Glu605-Phe621) dan dekat dengan sakelar 1 (Gly233-Phe246) dan P-loop. Zn ²⁺ dapat berkoordinasi dengan atom oksigen Glu327 (panjang ikatan 0,21 nm), dengan atom oksigen Glu326 (panjang ikatan 0,34 nm) dan atom oksigen Asp323 (panjang ikatan 0,32 nm). Kation Zn juga dapat berinteraksi dengan miosin S1 di wilayah yang menghubungi sakelar 2, berinteraksi dengan Glu 465 (0,24 nm), Asp468 (panjang ikatan 0,31 nm), dan Leu653 (panjang ikatan 0,37 nm). Wilayah pengikatan ini berada di dekat situs pengikatan aktin dan celah antara subdomain 50 kDa atas dan bawah. Bagian bawah celah ini terletak di kantong pengikat ATP. Zn yang mengikat ini ²⁺ domain myosin S1 memainkan peran penting dalam pengikatan dan hidrolisis ATP. Daerah ini mengalami transformasi konformasi kompleks dalam proses transfer energi dari situs hidrolisis ATP ke permukaan pengikatan aktin.

Thiacalix[4]arena Menghilangkan Efek Penghambatan Zn ²⁺ pada Aktivitas ATPase Myosin

Seratus mikromolar larutan C-800 atau C-798 dalam 50 mM buffer Tris-HCl (pH 7,2) ditambahkan ke media inkubasi yang mengandung kation Zn 5 mM untuk menghilangkan dampak negatif Zn ²⁺ pada aktivitas ATPase otot polos uterus myosin S1. Sebagai kontrol digunakan aktivitas enzimatik tanpa penambahan seng dan/atau tiakaliks[4]arena ke dalam media inkubasi. Ditunjukkan (Gbr. 5) bahwa senyawa C-800 tidak mempengaruhi aktivitas ATPase miosin S1 miometrium. Meskipun, senyawa C-798 menunjukkan efek penghambatan kecil pada aktivitas myosin S1 ATPase yang kemungkinan besar terkait dengan ekstraksi sejumlah Mg ²⁺ [21], penting untuk pengikatan ATP di pusat aktif dan hidrolisisnya, dari media inkubasi. Meskipun demikian, 100 μM C-798, serta C-800, menghilangkan efek penghambatan 5 mM Zn ²⁺ pada proses hidrolisis ATP yang dikatalisis oleh miosin S1.

Pengaruh 100 μM C-798 dan C-800 pada aktivitas miosin S1 ATPase dengan adanya 5 mM Zn ²⁺ (M ± SD, n = 5–6). 100% adalah nilai aktivitas ATPase tanpa penambahan kation Zn. Perbedaan antara "Zn" dan "Zn + C-798," serta antara nilai "Zn" dan "Zn + C-800," signifikan secara statistik (p < 0.05) dan masing-masing ditampilkan sebagai * dan **

Mekanisme Kemungkinan Tindakan Pemulihan C-798 dan C-800 pada Aktivitas Myosin S1 ATPase dengan Adanya Zn ²⁺

Salah satu mekanisme yang paling mungkin dari aksi pemulihan C-798 dan C-800 pada aktivitas miosin S1 ATPase di Zn ²⁺ Kehadiran dapat menjadi kemampuan thiacalix[4]arena untuk mengikat kation Zn dan, akibatnya, mengeluarkan kation-kation ini dari media inkubasi. Menariknya, thiacalix[4]arena ini dapat mengikat kation zinc yang sudah terikat pada myosin.

Simulasi komputer menunjukkan bahwa thiacalix[4]arena C-798 dan C-800 dengan jembatan atom sulfur antara cincin aromatik berada dalam konformasi “kerucut” yang distabilkan oleh ikatan intra-hidrogen antara gugus fenolik. Struktur kaliks[4]arena yang diminimalkan energi ini diperoleh. Energi total C-798 setelah minimalisasi adalah 64,5 kkal/mol. Adanya gugus terionisasi pada pelek kaliks[4]arena (khususnya yang lebih rendah) secara signifikan meningkatkan kontribusi interaksi elektrostatik terhadap energi total interaksi tuan rumah-tamu. Kami juga melakukan “minimisasi” C-798—Zn ²⁺ kompleks; energi totalnya adalah 83 kkal/mol.

C-798 tertanam dalam struktur miosin S1 yang bekerja sama dengan kation Zn yang sebelumnya terikat pada protein di daerah loop P. Dalam hal ini, Zn ²⁺ berinteraksi dengan atom oksigen tepi bawah dan belerang jembatan C-798 (O3, 0,21 nm; S1, 0,30 nm; O2, 0,34 nm). Terlihat bahwa Zn ²⁺ menyimpang sampai batas tertentu dari residu asam amino loop-P dan melemahkan interaksinya dengan atom oksigen Glu177 (panjang ikatan 0,43 nm) (Gbr. 6).

Parameter geometrik interaksi Zn ²⁺ dengan daerah P-loop myosin S1 (a ) dan pengaruh C-798 terhadap kerjasama kation Zn dengan wilayah ini (b )

Fiksasi C-798 di "rongga" wilayah pengikatan ATP miosin terjadi dengan partisipasi beberapa residu asam amino. Khususnya, keranjang hidrofobik thiacalixarene telah difiksasi oleh residu asam amino aromatik myosin dari Phe467 dan Phe469; thiacalixarene atom oksigen bermuatan negatif berinteraksi dengan residu asam amino bermuatan positif dari Arg570, Asn572, dan His689.

Kajian pengaruh C-798 terhadap perubahan Zn ²⁺ posisi selama docking di daerah dekat situs pengikatan ATP miosin menunjukkan bahwa Zn ²⁺ dengan adanya thiacalix[4]arena berinteraksi dengan atom oksigen dari gugus sulfonil ketiga (O16–0,26 nm; O15–0,27 nm), hampir tidak berinteraksi dengan atom oksigen Asp134 dan Glu326, dan koordinasi dengan Glu327 jauh lebih lemah (0,43 panjang kopling nm) (Gbr. 7). Dalam hal ini, thiacalixarene dipasang di "rongga" protein dengan partisipasi beberapa residu asam amino. Secara khusus, atom oksigen bermuatan negatif dari gugus tiacalixarene sulfonil berinteraksi dengan residu asam amino myosin yang bermuatan positif dari Lys188, Lys195, dan Gln221.

Parameter geometrik interaksi Zn ²⁺ di daerah dekat saklar myosin 1 dan P-loop myosin S1 (a ) dan pengaruh C-798 terhadap kerjasama Zn ²⁺ dengan wilayah ini (b )

Terlihat bahwa bidang energi kondisional kation Zn bersentuhan dan bahkan agak tumpang tindih dengan permukaan sebaran interaksi elektrostatik karena adanya atom oksigen dan atom belerang pada C-798. Hal ini menunjukkan bahwa kation yang dipelajari berada dalam interaksi yang cukup dekat dengan atom bermuatan negatif dari mahkota C-798 atas dan bawah. Ada kemungkinan bahwa thiacalixarene menarik sendiri Zn ²⁺ , akibatnya interaksi kation dengan residu asam amino enzim melemah.

Akibatnya, hasil docking C-798 di wilayah myosin S1, yang mengandung Zn ²⁺ terikat, menunjukkan kemungkinan adanya interaksi gugus fungsi C-798 dengan kation Zn. Dalam hal ini, ikatan kation Zn dengan residu asam amino dari miosin S1 melemah secara signifikan, dan jarak di antara mereka meningkat. Akibatnya, efek merugikan dari kation Zn pada aktivitas ATPase miosin dapat dihilangkan.

Kami juga melakukan simulasi komputer dari efek kaliks[4]arena C-800, dengan docking di area yang dekat dengan wilayah pengikatan ATP dari S1 miosin, untuk mengubah geometri kation Zn. Pada saat yang sama, Zn ²⁺ bersentuhan dengan Arg236 (panjang ikatan 0,37 nm), Glu675 (panjang ikatan 0,41 nm), dan atom-atom dari residu kaliks[4]arena fungsional atas (H26, 2,36 nm; H30, 2,96 nm; C30, 0,31 nm; O5, 3,7 nm; O16, 0,4 nm; O7, 0,48nm; dan O11, panjang ikatan 0,51 nm). Zn ²⁺ berinteraksi dengan kaliks[4]arena C-800, mirip dengan C-798. Kation juga ditarik dari situs pengikatan sebelumnya di wilayah ini, dan berkontak dengan Asp468 (panjang ikatan 0,2 nm) dan atom-atom dari mahkota kaliksarena bawah (C4, 1,96 nm; C14, 2,07 nm; S3, 2,16 nm; O2 , 2.26 nm; C3, 2.97 nm; C20, 3.10 nm; O4, 4.2 nm; C14, 3.0 nm; dan O3, 4.1 nm).

Docking C-798 dan C-800 ke dalam region myosin subfragment-1 menunjukkan bahwa thiacalix[4]arena ini dapat berinteraksi dengan kation Zn yang mengikat residu asam amino myosin di dekat tempat aktif ATPase. Oleh karena itu, efek perlindungannya mungkin merupakan hasil dari melemahnya interaksi antara kation-kation ini dan miosin S1.