Peran Jalur Apoptosis dalam Sitotoksisitas yang Diinduksi oleh Nanopartikel Seng Oksida Segar dan Tua
Abstrak
Nanopartikel seng oksida (ZnO NPs) digunakan dalam berbagai aplikasi termasuk industri, produk komersial dan bidang kedokteran. Sejumlah studi mekanistik untuk toksisitas ZnO NP dilakukan pada NP murni (segar). Namun, sitotoksisitas yang diinduksi oleh NP ZnO yang diubah (berumur) dan mekanisme yang mendasarinya tetap tidak jelas. Di sini, kami mengamati transformasi fisikokimia NP ZnO yang berlangsung dari waktu ke waktu, diikuti dengan mengevaluasi sitotoksisitas NP segar dan tua. Kami menemukan bahwa NP ZnO segar menginduksi tingkat apoptosis yang lebih tinggi daripada rekan-rekan mereka yang sudah tua. Oleh karena itu, data sekuensing RNA dari hibrida manusia-hamster yang diolah dengan ZnO NP (AL ) sel menunjukkan bahwa jalur pensinyalan p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutathione, ErbB, HIF-1, Oksitosin dan Jak-STAT diperkaya tetapi tidak ada jalur apoptosis. Hasil PCR kuantitatif mengungkapkan tingkat mRNA IL1B . yang jauh lebih tinggi secara signifikan dan CD69 pada kelompok yang diobati dengan NP segar dibandingkan dengan kelompok yang diberi ZnO NP- dan seng klorida yang sudah tua. Hasil di atas menunjukkan bahwa sitotoksisitas yang lebih rendah dari NP ZnO tua sebagian dikaitkan dengan penurunan potensinya dalam menginduksi apoptosis. Regulasi transkripsi dari beberapa jalur sinyal yang diaktifkan oleh NP yang sudah tua dapat membantu membangun homeostasis seluler. Secara keseluruhan, temuan kami menyoroti pengaruh proses penuaan (transformasi lingkungan) NP ZnO pada toksisitas dan konsekuensi biologisnya.
Pengantar
Dengan pesatnya perkembangan nanoteknologi selama beberapa dekade terakhir, nanopartikel (NPs) telah diterapkan di berbagai bidang, termasuk industri, kehidupan sehari-hari manusia dan nanomedicine [1, 2]. Inventarisasi Produk Konsumen (CPI) Nanoteknologi menunjukkan peningkatan 30 kali lipat antara tahun 2005 dan 2015 dalam jumlah produk nano, termasuk 762 produk kesehatan (kebugaran), 72 makanan (minuman) dan 23 produk bayi [2]. Meningkatnya penerapan NP dalam produk konsumen dan berbagai bidang meningkatkan kemungkinan masuknya NP ke lingkungan, yang menimbulkan masalah keamanan sehubungan dengan potensi dampak buruknya. Seng oksida (ZnO) NP adalah salah satu NP yang paling umum digunakan, dan output tahunan globalnya telah mencapai hampir 3400 ton [3, 4]. Beberapa zat yang sebelumnya dianggap inert secara biologis dapat menjadi toksik dalam keadaan nanopartikel. Semakin banyak penelitian menjelaskan bahwa ZnO NP dapat menimbulkan risiko yang signifikan terhadap sel mamalia dan hewan dengan menginduksi toksisitas yang signifikan [5,6,7].
Berbagai strategi termasuk pelapisan, fungsionalisasi permukaan dan modifikasi keadaan oksidasi telah digunakan untuk melemahkan potensi toksisitas NP dengan memodifikasi sifat fisik dan kimianya (seperti pembubaran, aglomerasi dan gangguan membran sel) [8,9,10, 11]. Meskipun modifikasi NP ini melemahkan efek toksiknya pada tingkat tertentu, penggunaan NP tidak selalu aman, terutama dalam kondisi dan lingkungan paparan tertentu [12,13,14]. Sebenarnya banyak jenis TN yang tidak stabil dan cenderung mengalami “penuaan” atau “transformasi lingkungan” setelah secara sengaja atau tidak sengaja dilepaskan ke lingkungan alam [14,15,16,17]. Dalam beberapa tahun terakhir, banyak pekerjaan dilakukan untuk mengeksplorasi proses transformasi lingkungan TN; namun, penelitian tentang efek toksik dari NP yang “berubah (berumur)” masih sangat terbatas, apalagi mekanisme toksiknya.
Sebagai perwakilan khas dari NP non-persistent, NP ZnO memiliki reaktivitas yang sangat tinggi, dan cenderung berubah dalam sifat fisik dan kimia dan keadaan kejadian setelah dilepaskan ke lingkungan atau dicerna oleh hewan, yang secara signifikan dapat mempengaruhi efek toksikologinya [17 , 18]. Sebagai contoh, penelitian telah menunjukkan bahwa proses sulfidasi NP ZnO mengubah muatan, hidrofobisitas, dan keadaan agregasi, menghasilkan adsorpsi NP keadaan sulfida dalam air liur manusia, keringat, dan cairan lavage bronkoalveolar. Selanjutnya protein yang teradsorpsi oleh ZnO NPs membentuk mahkota protein khusus yang biasanya mempengaruhi efek biologisnya [19]. Fosfat dalam larutan fisiologis dapat mengubah ZnO NP menjadi ZnHPO yang metastabil4 dan Zn3 (PO4 )2 dalam waktu sekitar 5-10 jam [20]. Proses transformasi lengkap NP ZnO (≤ 3 μg/mL) dalam sistem paparan in vitro terhadap limfosit T manusia (37 °C, media kultur sel RPMI1640 yang mengandung 10% FBS selama 24 jam) diselidiki dengan menggunakan radiasi sinkrotron X- spektroskopi struktur dekat-tepi serapan sinar (XANES) [21]. Studi di atas menunjukkan meremehkan risiko lingkungan dan kesehatan NP ZnO dengan hanya mengevaluasi efek biologis NP ZnO murni (segar). Mengingat masalah ini, ada kebutuhan mendesak untuk memahami secara komprehensif proses penuaan dan transformasi lingkungan NP [22].
Penelitian kami sebelumnya mengungkapkan bahwa ZnO NP yang berumur 40-120 hari dalam air ultra murni mengalami transformasi fisikokimia dan berubah menjadi Zn5 (CO3 )2 (OH)6 , Zn(OH)2 , dan Zn
2+
[23]. Menariknya, NP ZnO tua menunjukkan sitotoksisitas yang lebih rendah daripada rekan-rekan baru [23], namun mekanisme toksisitas dari variasi semacam itu tidak jelas. Dalam penelitian ini, kami mulai mengeksplorasi alasan yang mendasari sitotoksisitas yang berbeda antara NP ZnO segar dan tua. ZnO NP dengan dua ukuran partikel yang berbeda (20 nm dan 90–200 nm) diterapkan secara sistematis. Uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa NP ZnO yang sudah tua menginduksi kelainan morfologis yang kurang menonjol dan viabilitas sel yang relatif lebih tinggi daripada rekan-rekan mereka yang baru. Data sekuensing RNA mengungkapkan bahwa gen apoptosis diperkaya dalam sel yang diobati dengan ZnO NP, sedangkan gen ini jauh lebih sedikit terpengaruh oleh pengobatan ZnO NP yang sudah tua. Selain itu, sel-sel yang terpapar NP ZnO tua menunjukkan penurunan tingkat protein Caspase-3 yang dibelah, lebih lanjut menunjukkan potensi yang lebih tinggi dari NP ZnO segar dalam memunculkan apoptosis dalam sel yang dikultur. Dikombinasikan dengan temuan kami sebelumnya, penelitian ini menunjukkan bahwa penurunan sitotoksisitas NP ZnO tua dikaitkan dengan kemampuannya yang dilemahkan dalam memicu apoptosis sel.
Bahan dan Metode
Nanopartikel dan Reagen
ZnO nanopowders (ZnO NPs) yang tersedia secara komersial, dengan ukuran rata-rata yang dilaporkan pabrikan 20 nm (kemurnian 99,5%, hampir bulat) dan 90–200 nm (kemurnian 99,9%, morfologi tidak teratur), dibeli dari Nanostructured &Amorphous Materials (Houston, TX ). Kecuali dinyatakan lain, semua reagen dan bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dari Sigma-Aldrich (Shanghai, China).
Dispersi, Penuaan, dan Karakterisasi Nanopartikel
Suspensi stok ZnO NPs (1 mg/mL) dibuat dengan menangguhkan bubuk nano kering dalam Mili-Q H2 O (Millipore, 18 MΩ cm) dan disterilkan dengan autoklaf (120 °C, 30 mnt) lalu disimpan pada suhu 25 °C untuk periode penuaan alami mulai dari 0 hingga 60 hari. NP ZnO yang diubah secara alami 0 dan 60 hari masing-masing ditetapkan sebagai NP segar dan tua. Untuk memastikan dispersi yang tepat, suspensi segar dan tua disonikasi (100 W) selama 30 menit dalam rendaman ultrasonik sebelum karakterisasi atau inkubasi dengan sel. Morfologi, ukuran partikel dan agregasi NP ZnO segar dan tua dikarakterisasi dengan menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM, JEOL JEM-2010, Tokyo, Jepang). Struktur kristal NP ZnO segar dan tua ditentukan menggunakan difraksi sinar-X daya (XRD, PANalytical B. V., Shanghai, Cina) dengan membandingkan dengan standar otentik. Detail proses penuaan alami dan karakterisasi pada NP ZnO telah dijelaskan sebelumnya [23].
Kultur dan Perawatan Sel dengan ZnO NP
AL garis sel, sejenis sel hibrida manusia-hamster yang dibentuk oleh fusi gly2A mutan dari ovarium hamster Cina (CHO) dan fibroblas manusia digunakan dalam penelitian ini. Sel-sel hibrida ini mengandung satu set standar kromosom CHO-K1 dan satu salinan kromosom manusia 11 dan dibiakkan dalam media Ham F12 (Hyclone, Grand Island, NY) yang dilengkapi dengan serum janin sapi (8%, Hyclone, Grand Island, NY ), gentamisin (25 g/mL) dan glisin (2 × 10
–4
M) pada 37 °C dalam 5% CO2 yang dilembabkan2 inkubator [24]. Suspensi stok NP ZnO segar dan tua didispersikan dengan ultrasonikasi selama 30 menit (100 W) untuk mencegah aglomerasi, kemudian diencerkan hingga konsentrasi yang sesuai dengan media kultur sel untuk pemaparan sel. Sel yang dipelihara dalam media kultur sel tanpa NP disajikan sebagai kontrol dalam setiap percobaan.
Pengujian untuk Mendeteksi Sitotoksisitas
AL sel pada fase pertumbuhan logaritmik dikultur pada slide kaca dalam cawan Petri 35 mm (6 × 10
4
sel/piring) selama 24 jam sebelum stimulasi, diikuti dengan perlakuan dengan 2 mL media kultur yang mengandung 1, 5, 10, 12, 15 dan 20 g/mL ZnO NP segar atau berumur 72 jam. Setelah waktu perawatan selesai, gambar morfologi sel diperoleh menggunakan mikroskop Leica DM4B (Leica, Jerman). ZnCl2 dimasukkan sebagai referensi ion seng untuk membandingkan sitotoksisitas dengan ZnO NP.
Kit penghitungan sel (CCK-8) (APExBIO, Shanghai, China) digunakan untuk mendeteksi viabilitas sel. Secara detail, AL sel diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur (4 × 10
3
sel/sumur) dengan media kultur sel selama 24 jam dan diperlakukan dengan media yang mengandung berbagai konsentrasi ZnCl2 , NP ZnO segar dan tua masing-masing selama 24, 48 dan 72 jam. Untuk solusi kerja, volume NP yang ditambahkan dari suspensi stok kurang dari 5% dari total volume media kultur di setiap sumur. Setelah waktu perawatan selesai, media kultur disedot, dan sel diinkubasi dengan 100 L CCK-8 larutan kerja selama 2 jam pada 37 ° C mengikuti instruksi pabrik. Kemudian, absorbansi dicatat pada 450 nm menggunakan pembaca fluoresensi Spectra Max M2 (Molecular Devices, Wokingham, Berks, UK). Viabilitas sel dihitung sebagai persentase absorbansi di sumur, dengan setiap konsentrasi NP dinormalisasi dengan absorbansi sel kontrol (100%).
Ekstraksi RNA, Transkripsi Terbalik, dan PCR Kuantitatif
AL sel-sel pada fase pertumbuhan logaritmik diunggulkan ke dalam cawan Petri berdiameter 35 mm (6 × 10
4
sel/piring) dengan media kultur sel selama 24 jam. Kemudian, media tersebut diganti dengan 2 mL media kultur yang mengandung 12 µg/mL ZnCl2 , NP ZnO segar dan tua selama 72 jam. Setelah waktu perawatan selesai, media kultur disedot, dan sel dicuci 3 kali dengan PBS. Selanjutnya, 1 mL reagen Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ditambahkan ke setiap cawan untuk mengekstrak RNA total sesuai dengan instruksi pabrik. Konsentrasi dan kemurnian RNA total yang diperoleh setelah ekstraksi dikuantifikasi menggunakan Spektrofotometer Q5000UV-Vis (Quawell, USA). Setelah kuantifikasi, transkripsi terbalik dilakukan menggunakan kit TransGene RT-PCR (TransGene Biotech, Beijing, China) untuk mendapatkan cDNA dari template RNA sesuai dengan protokol pabrikan. Sampel cDNA yang dihasilkan dikuantifikasi dengan menggunakan Q5000 UV-Vis Spectrophotometer dan kemudian dianalisis menggunakan SYBR-Green sebagai pewarna fluoresensi (TransGene Biotech, Beijing, China) pada sistem Roche RT-PCR (Applied Biosystems) [25].
Gen housekeeping yang mengkode Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (Gapdh ) digunakan sebagai kontrol internal untuk mengevaluasiIl-1α , Il-1β , Caspase 3 , CD69 , Jun dan MT1 ekspresi mRNA. Hasilnya dinyatakan sebagai rasio ekspresi relatif antara gen yang ditargetkan dan Gapdh . Urutan primer yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 1.
Analisis Data Urutan RNA
Total sampel RNA AL sel dari kelompok kontrol, kelompok perlakuan NP ZnO tua dan ZnCl2 kelompok perlakuan diurutkan oleh BangFei Bioscience (Beijing, Cina). Secara singkat, total RNA AL sel diekstraksi mengikuti protokol TRIZOL, sampai presipitasi isoproponal. Kemudian, sampel RNA disuspensi kembali dalam buffer ekstraksi sebelum diurutkan. Data pengurutan RNA jumlah mentah dianalisis menggunakan paket R Deseq2 [Eric1]. Diagram venn dihasilkan oleh paket R VennDiagram [Eric1.2]. Gen yang berubah secara signifikan digunakan untuk analisis pengayaan jalur lebih lanjut. Percobaan dilakukan tiga ulangan independen. gen rRNA, gen mitokondria, dan gen yang terdeteksi kurang dari 40 bp dikeluarkan dari analisis.
Data sekuensing RNA, seri referensi GSE97852, GSE60159 dan GSE39444, diperoleh dari Gene Expression Omnibus [Eric 2, 3, 4]. Plot Analisis Pengayaan Gen Set dihasilkan oleh R (versi 3.6.2) menggunakan paket fgsea [Eric 5]. Gen apoptosis dengan perubahan signifikan 1,5 kali lipat &p nilai <0,05 digunakan untuk analisis lebih lanjut. Peta panas dengan pohon gen dihasilkan oleh paket R “ComplexHeatmap” [Eric 6]. Average linkage digunakan sebagai metode clustering, dan Euclidean digunakan sebagai metode pengukuran jarak. Analisis pengayaan jalur didahului menggunakan STRING2.0 [Eric 7].
Western Blotting
AL sel-sel pada fase pertumbuhan logaritmik diunggulkan ke dalam cawan Petri berdiameter 60 mm (1,5 × 10
5
sel/piring) dengan media kultur sel selama 24 jam. Kemudian, media diganti dengan 4 mL media kultur yang mengandung 12 g/mL ZnO NP segar atau yang sudah tua selama 24 jam. Pada akhir periode pemaparan, media kultur disedot, dan kemudian, sel dicuci 3 kali dengan PBS dan dilisiskan di atas es dengan buffer lisis RIPA (Beyotime, Cina) untuk mengumpulkan protein seluler. Jumlah protein seluler yang sama dipisahkan pada 12% gel SDS-PAGE dan kemudian dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (PVDF) (Roche, Swiss). Secara singkat, setelah 2 jam pemblokiran dengan 5% susu tanpa lemak dalam TBST pada suhu 25 °C, membran selanjutnya diinkubasi dengan antibodi primer pada pengenceran yang sesuai (menurut protokol pabrikan) pada suhu 4 °C semalaman, diikuti dengan inkubasi dengan sekunder terkonjugasi HRP antibodi (1:5000, Promega, Madison, USA) selama 2 jam pada 25 °C. Akhirnya, immunolabeling dideteksi menggunakan solusi Enhanced chemiluminescence (ECL) (BOSTER, China). Antibodi utama anti-pro/cleaved Caspase-3 dan anti-Actin masing-masing dibeli dari Cell Signaling Technology dan ImmunoWay.
Statistik
Analisis statistik disusun berdasarkan rata-rata hasil yang diperoleh dari setidaknya tiga percobaan independen. Semua Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD) dan secara statistik dibandingkan menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA). Di semua plot p nilai < 0,05 ditunjukkan sebagai * dan dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Karakterisasi NP ZnO
Untuk menentukan perbedaan karakteristik fisikokimia rinci antara NP ZnO segar dan tua, pertama-tama kami mengamati morfologi NP menggunakan TEM (Gbr. 1A). Hasil kami menunjukkan bahwa NP ZnO segar 20 nm hampir berbentuk kristal dan 90-200 nm NP ZnO segar berbentuk kristal berbentuk batang/kubik tidak beraturan. Ukuran partikel tunggal konsisten dengan ukuran yang disediakan oleh pabrikan. Jelas, baik NP ZnO 20 nm dan 90-200 nm cenderung beragregasi dalam air ultra murni. Selain itu, terlepas dari bentuk dan ukuran NP asli, struktur mikro NP ZnO 20 nm dan 90-200 nm berubah secara dramatis dari struktur kristal bening menjadi amorf atau seperti lembaran/jarum setelah berumur 60 hari. Selanjutnya, sifat kristal dan kemurnian fase NP segar dan tua ditentukan dengan menggunakan difraksi sinar-X (XRD) dengan radiasi Cu Kα (λ = 0.15418 nm) mendekati pada 25 °C, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1B. Pola XRD NP ZnO segar menunjukkan bahwa sampel terdiri dari struktur kristal wurtzite dan tidak ada puncak pengotor karakteristik yang diidentifikasi, menunjukkan kualitas tinggi NP segar. Untuk NP tua, pola XRD menunjukkan neoformasi Zn5 (CO3 )2 (OH)6 (nomor kartu 00-011-0287) dan Zn (OH)2 (nomor kartu 00-003-0888) fase padat, menunjukkan transformasi kimia NP ZnO (20 dan 90–200 nm) selama proses penuaan.
Karakteristik fisikokimia NP ZnO segar dan tua. A Mikrograf representatif dari NP segar dan tua (100 μg/mL, 20 dan 90–200 nm) dalam Mili-Q air menggunakan TEM resolusi rendah, B Pola XRD NP segar, NP tua, ZnO, Zn (OH)2 dan Zn5 (CO3 )2 (OH)6 referensi dalam bentuk kering
Pengamatan Morfologi AL Sel Terkena ZnO NP Segar dan Tua
Perawatan NP menghasilkan perubahan nyata dalam bentuk seluler, atau morfologi, in vitro [26]. Oleh karena itu, AL sel-sel yang terpapar NP ZnO segar atau tua pada 10 &15 g/mL selama 72 jam diperiksa di bawah mikroskop stereoskopik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, morfologi sel pada kelompok kontrol tetap normal. Sel-sel menempel dengan baik, dengan sebagian besar menempel dalam waktu 2 jam. Sebagian besar sel berbentuk gelendong atau poligonal, dengan beberapa sel yang baru membelah menunjukkan sitoplasma yang lebih transparan dan dispersi yang lebih baik selama proses perlekatan. Pengobatan dengan 12 g/mL NP ZnO segar (20 nm &90-200 nm) selama 72 jam mengubah morfologi sel secara signifikan. Meskipun sebagian besar sel menempel dalam waktu 3-5 jam, mereka tidak dapat menyebar dengan baik, dan beberapa sel menjadi bulat dan kehilangan bentuk poligonal. Ketika konsentrasi NP ZnO ditingkatkan menjadi 15 g/mL, sel-sel yang dirawat mengalami atrofi dan tidak dapat menempel, menunjukkan viabilitas sel yang secara signifikan lebih rendah daripada sel-sel yang diobati dengan 10 g/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa LC100 untuk NP ZnO segar mungkin kurang dari 15 g/mL dengan perlakuan 72 jam. Sebaliknya, morfologi sel pada kelompok perlakuan NP berusia 20 nm dan 90-200 nm (15 g/mL) tidak terpengaruh secara signifikan, dan sebagian besar sel yang masih hidup dapat menempel dan menyebar, dengan kurang dari setengah sel mati yang diamati, mengungkap bahwa NP ZnO tua bersifat sitotoksik jauh lebih rendah daripada NP ZnO segar.
Perubahan morfologi di AL sel setelah terpapar NP ZnO segar atau tua selama 72 jam dalam media F12 Ham tambahan, dan sel yang tidak terpapar digunakan sebagai kelompok kontrol. AL morfologi sel diamati dengan mikroskop optik pada perbesaran 10 ×
NP ZnO yang Berumur Menginduksi Sitotoksisitas Lebih Rendah daripada NP Baru
Untuk menyelidiki lebih lanjut perbedaan sitotoksisitas antara NP ZnO segar dan tua, kami memeriksa viabilitas sel dengan menggunakan kit CCK-8. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, inkubasi AL sel dengan dosis gradien NP ZnO segar dan tua (berkisar dari 0 hingga 20 g/mL, 20 nm dan 90-200 nm) selama 24 jam, 48 jam, atau 72 jam menunjukkan penurunan viabilitas sel yang bergantung pada dosis. Tidak ada sitotoksisitas yang diamati dengan merawat sel dengan ZnO NPs ≤ 10 μg/mL. Ketika dosis NP ZnO segar dan tua meningkat menjadi 12 dan 15 g/mL, viabilitas sel menunjukkan kecenderungan penurunan tergantung waktu. Jelas, viabilitas sel pada kelompok yang diobati dengan NP tua secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok yang diobati dengan NP yang baru. Selain itu, ZnCl2 -pengobatan juga mengganggu viabilitas sel dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu, sedangkan sitotoksisitas ZnCl2 jauh lebih sedikit daripada NP ZnO segar dan tua.
Viabilitas sel yang diinduksi oleh NP ZnO segar dan tua di AL sel. AL sel diinkubasi dengan berbagai konsentrasi NP ZnO segar dan tua (20 dan 90–200 nm) selama 24 jam (A ), 48 j (B ) dan 72 jam (C ). DAL sel terkena berbagai konsentrasi ZnCl2 untuk waktu yang berbeda. Data didasarkan pada ≥ 3 eksperimen independen dan dinyatakan sebagai mean ± SD, *p < 0,05
Pengobatan ZnO Baru Mengaktifkan Jalur Apoptosis dan Meningkatkan Ekspresi Gen Apoptosis
Untuk mengungkap mekanisme yang mendasari yang mengarah ke sitotoksisitas yang lebih rendah dari NP tua, kami menganalisis data sekuensing RNA dari NP ZnO segar dan tua. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4A, B, setelah pengobatan dengan NP ZnO segar, jalur apoptosis diaktifkan dalam sel Jurkat (p = 0,017) dan sel HMDM (p = 0.041). Gen apoptosis:ANXA1 , CYLD , TNFSF10 , IER3 , CDKN1A , Juni , SAT1 , PMAIP1 , CD38 dan ISG20 diperkaya secara signifikan dalam sel Jurkat ZnO NP-treated segar. Gen apoptosis:CD38 , TNFRSF12A , CCNA1 , BMP2 , PPP2R5B , EREG , IFNGR1 , CD44 , CD14 , GNA15 , GCH1 , TIMP1 , BTG2 , IL1B , IL1A , BTG3 , BCL2L11 , SC5D dan SPTAN1 diperkaya secara signifikan dalam sel HMDM ZnO NP-treated segar (Gbr. 4C, D). Karena sel Jurket (sel limfosit T darah tepi) dan sel HMDM (makrofag turunan monosit manusia) adalah jenis sel yang berbeda, cara mereka memicu apoptosis mungkin berbeda. Singkatnya, hasil ini menunjukkan bahwa paparan ZnO NPs baru dapat mengaktifkan jalur apoptosis yang berbeda di berbagai jenis sel.
Jalur apoptosis diperkaya dalam data RNA-seq dari sel Jurket dan HMDM yang diobati dengan ZnO NP. Skor pengayaan gen yang diekspresikan secara signifikan dari jalur apoptosis sel Jurket segar yang diobati dengan NP ZnO (A ) dan sel HMDM (B ). Peta panas ekspresi gen apoptosis sel Jurket segar yang diobati dengan NP ZnO (C ) dan sel HMDM (D ) dan grup kontrolnya
NP ZnO yang Berumur Tidak Mengatur Ekspresi Gen Apoptosis sebagai NP ZnO Baru
Data sekuensing RNA kami dari A . yang diolah dengan ZnO NP tua L sel menunjukkan bahwa jalur pensinyalan p53, PI3k–Akt, FoXO, Glutathione, ErbB, HIF-1, Oxytocin dan Jak-STAT diperkaya (Gbr. 5A). Gen apoptosis yang diperkaya dalam sel Jurket dan HMDM tidak terpengaruh secara signifikan pada sel yang dirawat dengan ZnO NP (Gbr. 5B). Untuk lebih mengkonfirmasi temuan, kami menguji ekspresi gen terkait dengan PCR waktu nyata. Kami menemukan bahwa beberapa gen apoptosis:BMP2 , PMAIP1 , IL1α , CD69 , CCNA1 , CD38 dan IL1β tidak terdeteksi pada A . yang diobati dengan ZnO NP usia L sel (data tidak ditampilkan), mungkin karena sebagian besar gen ini diekspresikan dalam sel sistem kekebalan. Gen apoptosis lain yang diatur ke atas (IL1α , IL1β dan CD59 ) yang diamati pada kelompok yang diobati dengan NP ZnO segar tidak berubah secara signifikan dalam tingkat ekspresi dengan pengobatan ZnO NP yang lebih tua. Sementara MT1 yang berfungsi sebagai kontrol positif meningkat secara signifikan dalam level ekspresi, ekspresi Caspase 3 tidak berubah secara signifikan (Gbr. 5C). Data ini menunjukkan bahwa NP ZnO tua, tidak seperti rekan-rekan baru mereka, kurang kuat dalam mengaktifkan gen jalur apoptosis di AL sel.
Jalur apoptosis tidak diperkaya dalam data RNA-seq dari ZnO NP tua yang diobati AL sel. (A ) Analisis ontologi gen dari jalur yang diperkaya dari ZnO NP tua yang diobati AL sel. (B ) Peta panas ekspresi gen apoptosis dari ZnO NP tua yang diobati AL sel dan kelompok kontrol. (C ) Ekspresi gen apoptosis terpilih dan gen kontrol (MT1 ) dalam A . yang diolah dengan ZnO NP segar dan tua L sel
ZnO NP yang Segar Tapi Tidak Berumur Meningkatkan Level Ekspresi Protein Caspase 3 yang Diaktifkan
Deteksi ekspresi gen Caspase 3 saja tidak dapat secara langsung menunjukkan aktivasi jalur apoptosis. Untuk analisis lebih lanjut apakah pengobatan ZnO NPs dapat mengubah tingkat protein apoptosis, ekspresi protein Caspase 3 yang dibelah, biomarker yang umum digunakan untuk menunjukkan aktivasi apoptosis sel [27], diperiksa dengan analisis Western blotting. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, dibandingkan dengan kelompok kontrol, perlakuan NP ZnO baru (20 nm) meningkatkan tingkat seluler protein Caspase 3 yang dibelah sebesar 1,31 ± 0,023 kali lipat, yang secara signifikan lebih tinggi daripada NP ZnO berusia 20 nm- kelompok perlakuan (1,12 ± 0,039 kali lipat). Ketika ukuran partikel NP ZnO segar ditingkatkan menjadi 90–200 nm, ekspresi protein Caspase 3 yang dibelah yang diinduksi oleh NP segar meningkat 1,46 ± 0,078 kali lipat, secara signifikan lebih besar daripada NP tua (1,07 ± 0,075 kali lipat) . Data ini lebih lanjut menggambarkan potensi yang lebih tinggi dari NP ZnO segar dalam menginduksi apoptosis sel, dibandingkan dengan rekan-rekan mereka yang sudah tua.
Tingkat apoptosis di AL sel diinkubasi dengan NP ZnO segar dan tua (20 dan 90–200 nm). Analisis Western Blotting (A ) dan kuantifikasi (B ) kadar protein Caspase 3 yang terbelah ketika sel diinkubasi dengan 12 g/mL ZnO NP segar dan berumur (20 dan 90-200 nm) selama 72 jam. Data didasarkan pada ≥ 3 eksperimen independen dan dinyatakan sebagai mean ± SD, *p < 0,05
Diskusi
NP ZnO dilaporkan mengalami transformasi fisikokimia menjadi Zn5 (CO3 )2 (OH)6 dengan dirilisnya Zn
2+
selama proses penuaan alami [23, 28]. Namun, sitotoksisitas yang diinduksi oleh NP ZnO yang diubah (berumur) dan mekanisme yang mendasarinya tetap tidak jelas. Di sini, untuk mengungkap mekanisme sitotoksisitas beragam antara NP ZnO segar dan tua, analisis sekuensing RNA dan uji RT-PCR dilakukan. Juga, Western blotting diterapkan untuk memeriksa tingkat protein Caspase 3, pelaksana kunci dalam apoptosis sel.
Data kami menunjukkan bahwa NP ZnO tua menginduksi sitotoksisitas jauh lebih sedikit daripada NP ZnO segar di AL sel. LC100 dari kedua NP ZnO segar (90–200 nm dan 20 nm) dalam penelitian kami saat ini lebih rendah dari 15 μg/mL (Gbr. 3), yang konsisten dengan temuan sebelumnya bahwa LC100 NP ZnO dengan sel 19–36 nm hingga NIH-3T3 atau MSTO adalah sekitar 15 μg/mL [29]. Kami mengkonfirmasi bahwa transformasi lingkungan dari sifat fisikokimia di NP dapat secara dramatis mengubah toksisitasnya. Telah dilaporkan bahwa proses sulfidasi NP ZnO mengubah muatan, hidrofobisitas, dan keadaan agregasinya, menghasilkan adsorpsi NP keadaan sulfida dalam air liur manusia, keringat, dan cairan lavage bronkoalveolar. Dan protein yang diadsorpsi oleh ZnO NPs membentuk mahkota protein khusus, yang mempengaruhi efek biologisnya [19]. Fosfat yang banyak terdapat dalam larutan fisiologis (seperti air liur) dapat mengubah ZnO NP menjadi ZnHPO yang metastabil4 dan Zn3 (PO4 )2 dalam waktu sekitar 5-10 jam dan menunjukkan sitotoksisitas pada sel epitel saluran pencernaan [20]. Ivask dkk. membuktikan terjadinya transformasi lengkap NP ZnO (≤ 3 μg/mL) dalam sistem paparan in vitro pada limfosit T manusia (37 °C, media kultur sel RPMI1640 yang mengandung 10% FBS selama 24 jam) menggunakan radiasi sinkrotron penyerapan sinar-X spektroskopi struktur dekat-tepi (XANES). Spektrum dan sitotoksisitas produk transformasi konsisten dengan ZnSO4 [21]. Hasil kami mengungkapkan toksisitas ZnCl yang bergantung pada dosis dan waktu2 untuk AL sel, di mana sitotoksisitasnya jauh lebih rendah daripada NP ZnO segar dan tua (Gbr. 3). Pengamatan lebih lanjut menjelaskan temuan bahwa sitotoksisitas NP ZnO segar tidak sepenuhnya dikaitkan dengan Zn yang dilepaskan
2+
[30].
Penelitian kami sebelumnya juga menunjukkan bahwa NP ZnO tua menunjukkan potensi yang lebih tinggi dalam memunculkan ROS (spesies oksigen reaktif), serta kemampuan yang dilemahkan dalam membunuh sel dibandingkan dengan NP ZnO segar [23]. Kami beralasan bahwa sitotoksisitas yang lebih rendah yang diinduksi oleh NP ZnO yang sudah tua dapat lebih dapat ditoleransi dalam sel mamalia. Studi saat ini tentang data sekuensing RNA menggambarkan bahwa gen apoptosis telah diatur ke atas dalam sel yang diobati dengan ZnO NP, di mana mereka jauh lebih sedikit terpengaruh pada kelompok yang diobati dengan NP yang sudah tua. IL1α dan IL1β adalah anggota dari keluarga sitokin interleukin 1. Pelepasan IL1α dan IL1β mengaktifkan Caspase 8 sebagian tergantung apoptosis [31]. CD69 mengkodekan anggota superfamili lektin yang bergantung pada kalsium dari reseptor transmembran tipe II. Peningkatan ekspresi CD69 dikaitkan dengan peningkatan ekspresi penanda apoptosis annexin V dan CD95 (Fas) [32]. JUN adalah subunit faktor transkripsi AP-1. Peningkatan aktivitas JUN secara proteolitik membelah alfa-fodrin, substrat interleukin 1beta-converting enzyme (ICE), dan keluarga CED-3 dari protease sistein, yang selanjutnya menyebabkan kematian sel terprogram [33]. Peningkatan ekspresi gen apoptosis ini mengungkapkan bahwa NP segar memicu apoptosis dalam beberapa cara berbeda. Setelah peningkatan ekspresi gen apoptosis ini, proses apoptosis akhirnya dijalankan oleh protein apoptosis (Gbr. 7). Caspase 3 adalah protease inti untuk berbagai skenario apoptosis; cleavage of this protein is necessary to activate both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways [34, 35]. Therefore, detection of cleaved caspase 3 is a common method for identifying apoptosis induced by a wide variety of apoptotic signals [36]. Our Western blotting data revealed that, for both 20 nm and 90–200 nm ZnO NPs, sublethal exposure did not alter the level of Pro caspase 3 in all treatment groups. In contrast, cleaved Caspase 3 was significantly elevated by fresh NPs treatment, where aged NPs showed few (if any) effects on the level of cleaved caspase 3 (Fig. 6). Combined with RNA expression analysis, our results clearly elucidated the higher potency of fresh ZnO NPs in inducing cell apoptosis.
Model for Fresh ZnO NPs but not aged ZnO NPs induces Caspase 8- and Caspase 3-dependent apoptosis. The increased expression of apoptotic gene CD69 activates Fas and apoptosis annexin V expression in fresh ZnO NP-exposed mammalian cells. The increased expression of apoptotic gene IL1α and IL1β partially activates Caspase 8-dependent apoptosis. It further causes activation of Caspase 3 and induces apoptosis. All these changes in mRNA and protein level were not detectable in aged ZnO NPs-exposed mammalian cells
Kesimpulan
In the present study, the natural physicochemical transformation of ZnO NPs in ultrapure water was confirmed, and variations in cytotoxicity induced by fresh &aged NPs were investigated. We focused on RNA sequencing data from our aged ZnO NP-treated AL cells and that of fresh NPs from database. We compared those signaling pathway specifically enriched in aged NP-treated group, which are different from that of fresh NP- or ZnCl2 -treated groups. Our data indicated that the lower cytotoxicity of aged ZnO NPs is closely related to its attenuated ability in inducing apoptosis, while the transcriptional regulation of the multiple pathways activated by NPs promotes the establishment of cellular homeostasis in mammalian cells.
