Jalur Apoptosis Menggerakkan Toksisitas Nanopartikel Zink Oksida Segar versus Tua

Abstrak

Nanopartikel oksida zink (ZnO NPs) digunakan dalam berbagai aplikasi termasuk industri, produk komersial dan bidang medis. Banyak studi mekanisme untuk toksisitas ZnO NPs dilakukan pada nanopartikel murni (segat). Namun, toksisitas yang diinduksi oleh nanopartikel ZnO yang tertransformasi (tua) dan mekanisme yang mendasarinya masih belum jelas. Di sini, kami mengamati transformasi fisikokimia ZnO NPs seiring waktu, diikuti dengan evaluasi toksisitas nanopartikel segat dan tua. Kami menemukan bahwa nanopartikel ZnO segat menginduksi tingkat apoptosis yang lebih tinggi dibandingkan dengan sejenisnya yang tua. Akibatnya, data RNA sequencing dari sel hibrid manusia–hamster (A_L) yang dirawat nanopartikel ZnO tua menunjukkan bahwa jalur sinyal p53, PI3k–Akt, FoXO, Glutathione, ErbB, HIF-1, Oxytocin dan Jak-STAT terkaya tetapi tidak ada jalur apoptosis. Hasil PCR kuantitatif mengungkapkan tingkat mRNA IL1B dan CD69 yang secara signifikan lebih tinggi dalam kelompok yang dirawat nanopartikel segat dibandingkan dengan kelompok yang dirawat nanopartikel ZnO tua dan klorida zink. Hasil di atas menunjukkan bahwa toksisitas yang lebih rendah nanopartikel ZnO tua sebagian disebabkan oleh kemampuan mereka yang berkurang dalam menginduksi apoptosis. Regulasi transkriptional dari berbagai jalur sinyal yang diaktifkan oleh nanopartikel tua mungkin membantu membangun homeostasis sel. Secara keseluruhan, temuan kami menyoroti pengaruh proses penuaan (transformasi lingkungan) nanopartikel ZnO terhadap toksisitas dan konsekuensi biologisnya.

Pendahuluan

Dengan perkembangan cepat nanoteknologi dalam beberapa dekade terakhir, nanopartikel (NPs) telah diterapkan dalam berbagai bidang, termasuk industri, kehidupan sehari-hari manusia dan nanomedisin [1, 2]. Inventori Produk Konsumen Nanoteknologi (CPI) menunjukkan peningkatan 30 kali lipat antara 2005 dan 2015 dalam jumlah produk nano, termasuk 762 produk kesehatan (kebugaran), 72 produk makanan (minuman) dan 23 produk bayi [2]. Peningkatan aplikasi NPs dalam produk konsumen dan berbagai bidang meningkatkan kemungkinan NPs masuk ke lingkungan, yang mengangkat keamanan mengenai dampak buruk potensial mereka. Nanopartikel oksida zink (ZnO) adalah antara NPs yang paling banyak digunakan, dan output tahunan globalnya telah mencapai hampir 3400 ton [3, 4]. Beberapa zat yang sebelumnya dianggap sebagai biologis inert bisa menjadi toksis dalam keadaan nanopartikel. Sebanyak banyak studi menjelaskan bahwa nanopartikel ZnO mungkin menimbulkan risiko signifikan pada sel dan hewan mamalia dengan menginduksi toksisitas yang signifikan [5,6,7].

Berbagai strategi termasuk pelapisan, fungsionalisasi permukaan dan modifikasi status oksidasi telah digunakan untuk mengurangi potensi toksisitas NPs dengan memodifikasi properti fisik dan kimia mereka (seperti pelarutan, aglomerasi dan gangguan sel sel) [8,9,10,11]. Meskipun modifikasi ini memlemahkan efek toksis mereka dalam tingkat tertentu, penggunaan NPs tidak selalu aman, terutama dalam kondisi paparan dan lingkungan tertentu [12,13,14]. Faktanya, banyak jenis NPs tidak stabil dan cenderung mengalami “penuaan” atau “transformasi lingkungan” setelah dirilis sengaja atau tidak sengaja ke dalam lingkungan alami [14,15,16,17]. Dalam beberapa tahun terakhir, banyak pekerjaan dilakukan untuk mengeksplorasi proses transformasi lingkungan NPs; namun, penelitian tentang efek toksis “NPs yang tertransformasi (tua)” masih sangat terbuka, tidak heran tentang mekanisme toksis mereka.

Sebagai perwakilan tipikal NPs non-persisten, nanopartikel ZnO memiliki reaktivitas yang sangat tinggi, dan cenderung mengalami transformasi dalam properti fisik dan kimia serta keadaan kejadian setelah dirilis ke lingkungan atau dikonsumsi oleh hewan, yang dapat secara signifikan mempengaruhi efek toksikologis mereka [17, 18]. Misalnya, studi telah menunjukkan bahwa proses sulfidasi nanopartikel ZnO mengubah muatan, hidrofobisitas dan keadaan aglomerasi, yang mengakibatkan adsorpsi nanopartikel status sulfida dalam ludah manusia, keringat dan cairan lavase bronkoalveolar. Selain itu, protein yang terserap oleh nanopartikel ZnO membentuk mahkota protein khusus yang biasanya mempengaruhi efek biologisnya [19]. Fosfat dalam larutan fisiologis dapat mengonversi nanopartikel ZnO menjadi ZnHPO₄ dan Zn₃(PO₄)₂ yang metastabil dalam waktu sekitar 5–10 jam [20]. Proses transformasi lengkap nanopartikel ZnO (≤ 3 μg/mL) dalam sistem paparan in vitro ke sel limfosit T manusia (37 °C, medium kultur sel RPMI1640 yang mengandung 10% FBS selama 24 jam) telah diselidiki menggunakan spektroskopi struktur serapan X-ray tepi dekat radiasi sinkrotron (XANES) [21]. Studi di atas menunjukkan bahwa risiko lingkungan dan kesehatan nanopartikel ZnO underestimated dengan hanya mengevaluasi efek biologis nanopartikel ZnO murni (segat). Dalam rangka masalah ini, ada kebutuhan mendesak untuk secara menyeluruh memahami proses penuaan dan transformasi lingkungan NPs [22].

Studi kami sebelumnya mengungkapkan bahwa nanopartikel ZnO yang tua selama 40–120 hari dalam air ultra murni mengalami transformasi fisikokimia dan berubah menjadi Zn₅(CO₃)₂(OH)₆, Zn (OH)₂, dan Zn²⁺ [23]. Menariknya, nanopartikel ZnO tua menunjukkan toksisitas yang lebih rendah dibandingkan dengan sejenis segat [23], namun mekanisme toksis dari variasi semacam ini belum jelas. Dalam studi ini, kami bertujuan untuk menjelaskan alasan di balik perbedaan toksisitas antara nanopartikel ZnO segat dan tua. Nanopartikel ZnO dengan dua ukuran partikel yang berbeda (20 nm dan 90–200 nm) diterapkan secara sistematis. Assay toksisitas menunjukkan bahwa nanopartikel ZnO tua menginduksi kelainan morfologis yang kurang mencolok dan kelayakan sel yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan sejenis segat. Data RNA sequencing mengungkapkan bahwa gen apoptosis terkaya dalam sel yang dirawat nanopartikel ZnO segat, sedangkan gen-gen ini jauh lebih sedikit terpengaruh oleh perawatan nanopartikel ZnO tua. Selain itu, sel yang terpapar nanopartikel ZnO tua menunjukkan tingkat protein Caspase-3 yang terbelah yang lebih rendah, yang lebih lanjut menunjukkan potensi lebih tinggi nanopartikel ZnO segat dalam memicu apoptosis pada sel yang dikultur. Digabungkan dengan temuan kami sebelumnya, studi ini mengusulkan bahwa penurunan toksisitas nanopartikel ZnO tua disebabkan oleh kemampuan yang melemah mereka dalam memicu apoptosis sel.

Bahan dan Metode

Nanopartikel dan Reagen

Nanopowder oksida zink (ZnO NPs) yang tersedia secara komersial, dengan ukuran rata-rata yang dilaporkan produsen 20 nm (kemurnian 99,5%, hampir bola) dan 90–200 nm (kemurnian 99,9%, morfologi tidak teratur), dibeli dari Nanostructured & Amorphous Materials (Houston, TX). Kecuali jika disebut lain, semua reagen dan kimia yang digunakan dalam studi ini dibeli dari Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Dispersi, Penuaan dan Karakterisasi Nanopartikel

Suspensi stok nanopartikel ZnO (1 mg/mL) disiapkan dengan menyuspendi nanopowder kering dalam Milli-Q H₂O (Millipore, 18 MΩ cm) dan sterilisasi dengan autoklaving (120 °C, 30 menit) dan kemudian disimpan pada 25 °C untuk periode penuaan alami yang berkisar dari 0 hingga 60 hari. Nanopartikel ZnO yang secara alami tertransformasi pada hari 0 dan 60 ditetapkan sebagai nanopartikel segat dan tua, masing-masing. Untuk memastikan dispersi yang tepat, suspensi segat dan tua di-sonikasi (100 W) selama 30 menit dalam kolam ultrasonik sebelum karakterisasi atau inkubasi dengan sel. Morfologi, ukuran partikel dan aglomerasi nanopartikel ZnO segat dan tua dikarakterisasi menggunakan mikroskop transmisi elektron (TEM, JEOL JEM-2010, Tokyo, Jepang). Struktur kristal nanopartikel ZnO segat dan tua ditentukan menggunakan difraksi X-ray bubuk (XRD, PANalytical B. V., Shanghai, China) dengan membandingkan dengan standar autentik. Detail proses penuaan alami dan karakterisasi nanopartikel ZnO telah dijelaskan sebelumnya [23].

Kultur Sel dan Perawatan dengan Nanopartikel ZnO

Baris sel A_L, jenis sel hibrid manusia–hamster yang dibentuk oleh fusi mutant gly2A dari ovarium hamster China (CHO) dan fibroblas manusia digunakan dalam studi ini. Sel hibrid ini berisi serangkaian kromosom CHO-K1 standar dan satu salinan kromosom manusia 11 dan dikultur dalam medium Ham’s F12 (Hyclone, Grand Island, NY) yang dilengkapi dengan serum sapi fetal (8%, Hyclone, Grand Island, NY), gentamicin (25 g/mL) dan glisin (2 × 10^–4 M) pada 37 °C dalam inkubator 5% CO₂ yang kelembaban [24]. Suspensi stok nanopartikel ZnO segat dan tua di-disperse oleh 30 menit sonikasi (100 W) untuk mencegah aglomerasi, kemudian dicairkan ke konsentasi yang sesuai dengan media kultur sel untuk paparan sel. Sel yang dirawat dalam media kultur sel tanpa NPs digunakan sebagai kontrol dalam setiap eksperimen.

Assay untuk Mendeteksi Toksisitas Sel

Sel A_L pada fase pertumbuhan logaritmik dikultur pada slide kaca dalam piring Petri 35-mm (6 × 10⁴ sel/piring) selama 24 jam sebelum stimulasi, kemudian dirawat dengan 2 mL media kultur yang mengandung 1, 5, 10, 12, 15 dan 20 µg/mL nanopartikel ZnO segat atau tua selama 72 jam. Setelah waktu perawatan selesai, citra morfologi sel diperoleh menggunakan mikroskop Leica DM4B (Leica, Jerman). ZnCl₂ disertakan sebagai referensi ion zink untuk membandingkan toksisitas dengan nanopartikel ZnO.

Kit penghitungan sel (CCK-8) (APExBIO, Shanghai, China) digunakan untuk mendeteksi kelayakan sel. Secara rinci, sel A_L ditanam dalam plate 96-lubang (4 × 10³ sel/lubang) dengan media kultur sel selama 24 jam dan dirawat dengan media yang mengandung berbagai konsentrasi ZnCl₂, nanopartikel ZnO segat dan tua selama 24, 48 dan 72 jam, masing-masing. Untuk larutan kerja, volume penambahan NPs dari suspensi stok kurang dari 5% dari total volume media kultur di setiap lubang. Setelah waktu perawatan selesai, media kultur dihisap, dan sel diinkubasi dengan 100 µL larutan kerja CCK-8 selama 2 jam pada 37 °C sesuai petunjuk produsen. Kemudian, absorbansi dicatat pada 450 nm menggunakan pembaca fluoresensi Spectra Max M2 (Molecular Devices, Wokingham, Berks, Inggris). Kelayakan sel dihitung sebagai persentase absorbansi di lubang, dengan setiap konsentrasi NPs dinormalisasi terhadap absorbansi sel kontrol (100%).

Ekstraksi RNA, Transkripsi Balik dan PCR Kuantitatif

Sel A_L pada fase pertumbuhan logaritmik ditanam dalam piring Petri berdiameter 35-mm (6 × 10⁴ sel/piring) dengan media kultur sel selama 24 jam. Kemudian, medium diganti dengan 2 mL media kultur yang mengandung 12 µg/mL ZnCl₂, nanopartikel ZnO segat dan tua selama 72 jam. Setelah waktu perawatan selesai, media kultur dihisap, dan sel dicuci 3 kali dengan PBS. Selanjutnya, 1 mL reagen Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ditambahkan ke setiap piring untuk mengekstrak total RNA sesuai petunjuk produsen. Konsentrasi dan keurnian total RNA yang diperoleh setelah ekstraksi diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis Q5000UV (Quawell, USA). Setelah pengukuran, transkripsi balik dilakukan menggunakan kit RT-PCR TransGene (TransGene Biotech, Beijing, China) untuk mendapatkan cDNA dari templat RNA sesuai protokol produsen. Sampel cDNA yang dihasilkan diukur menggunakan spektrofotometer UV–Vis Q5000 dan kemudian dianalisis menggunakan SYBR-Green sebagai warna fluoresensi (TransGene Biotech, Beijing, China) pada sistem RT-PCR Roche (Applied Biosystems) [25].

Gen rumah tangga yang mengkodekan Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (Gapdh) digunakan sebagai kontrol internal untuk mengevaluasi ekspresi mRNA Il-1α, Il-1β, Caspase 3, CD69, Jun dan MT1. Hasil dinyatakan sebagai rasio ekspresi relatif antara gen target dan Gapdh. Urutan primer yang digunakan dalam studi ini disediakan dalam Tabel 1.

Analisis Data RNA Sequencing

Sampel total RNA sel A_L dari kelompok kontrol, kelompok yang dirawat nanopartikel ZnO tua dan kelompok yang dirawat ZnCl₂ disequens oleh BangFei Bioscience (Beijing, China). Singkatnya, total RNA sel A_L diekstrak mengikuti protokol TRIZOL, hingga presipitasi isopropanol. Kemudian, sampel RNA disuspendi dalam buffer ekstraksi sebelum disequens. Data RNA sequencing hitung mentah dianalisis menggunakan paket R Deseq2 [Eric1]. Diagram venn dihasilkan oleh paket R VennDiagram [Eric1.2]. Gen yang berubah secara signifikan digunakan untuk analisis enrichment jalur lebih lanjut. Eksperimen dilakukan tiga replik independen. Gen rRNA, gen mitokondria dan gen yang terdeteksi kurang dari 40 bp dikecualikan dari analisis.

Data RNA sequencing, seri referensi GSE97852, GSE60159 dan GSE39444, diperoleh dari Gene Expression Omnibus [Eric 2, 3, 4]. Plot Enrichment Analysis Gene Set dihasilkan oleh R (versi 3.6.2) menggunakan paket fgsea [Eric 5]. Gen apoptosis dengan perubahan signifikan 1,5 kali lipat & nilai p < 0,05 digunakan untuk analisis lebih lanjut. Heatmap dengan pohon gen dihasilkan oleh paket R “ComplexHeatmap” [Eric 6]. Average linkage digunakan sebagai metode klastering, dan Euclidean digunakan sebagai metode pengukuran jarak. Analisis enrichment jalur dilakukan menggunakan STRING2.0 [Eric 7].

Western Blotting

Sel A_L pada fase pertumbuhan logaritmik ditanam dalam piring Petri berdiameter 60-mm (1,5 × 10⁵ sel/piring) dengan media kultur sel selama 24 jam. Kemudian, medium diganti dengan 4 mL media kultur yang mengandung 12 µg/mL nanopartikel ZnO segat atau tua selama 24 jam. Pada akhir periode paparan, media kultur dihisap, dan kemudian sel dicuci 3 kali dengan PBS dan dilisis pada es dengan buffer lisis RIPA (Beyotime, China) untuk mengumpulkan protein sel. Jumlah protein sel yang sama dipisahkan pada gel SDS-PAGE 12% dan kemudian ditransfer ke membran polyvinylidene fluoride (PVDF) (Roche, Swiss). Singkatnya, setelah pemblokiran selama 2 jam dengan susu nonlemak 5% dalam TBST pada 25 °C, membran kemudian diinkubasi dengan antibodi primer pada pengenceran yang sesuai (sesuai protokol produsen) pada 4 °C selama malam, diikuti dengan diinkubasi dengan antibodi sekunder yang dikonjugasi HRP (1:5000, Promega, Madison, AS) selama 2 jam pada 25 °C. Akhirnya, imunolabeling terdeteksi menggunakan larutan kimiailuminesensi yang ditingkatkan (ECL) (BOSTER, China). Antibodi primer anti-pro/cleaved Caspase-3 dan anti-Actin dibeli dari Cell Signaling Technology dan ImmunoWay, masing-masing.

Statistika

Analisis statistik dikompilasi pada rata-rata hasil yang diperoleh dari setidaknya tiga eksperimen independen. Semua Data disajikan sebagai rata-rata ± deviasi standar (SD) dan dibandingkan secara statistik menggunakan analisis variansi satu arah (ANOVA). Dalam semua plot nilai p < 0,05 ditunjukkan sebagai * dan dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Karakterisasi Nanopartikel ZnO

Untuk menentukan perbedaan dalam karakteristik fisikokimia terperinci antara nanopartikel ZnO segat dan tua, kami pertama kali mengamati morfologi NPs menggunakan TEM (Gambar 1A). Hasil kami menunjukkan bahwa nanopartikel ZnO segat 20 nm adalah kristal hampir bola dan nanopartikel ZnO segat 90–200 nm adalah kristal batang/kubus yang tidak teratur. Ukuran tunggal partikel sesuai dengan ukuran yang diberikan oleh produsen. Jelas, baik nanopartikel ZnO 20 nm maupun 90–200 nm cenderung mengagregat dalam air ultra murni. Juga, terlepas dari bentuk dan ukuran NPs asli, mikrostruktur baik nanopartikel ZnO 20 nm maupun 90–200 nm secara dramatis berubah dari struktur kristal yang jelas menjadi keadaan amorfa atau seperi lembar/jarum setelah tua selama 60 hari. Selain itu, sifat kristal dan keurnian fase baik nanopartikel segat maupun tua ditentukan menggunakan difraksi X-ray (XRD) dengan radiasi Cu Kα (λ = 0,15418 nm) pada 25 °C, seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 1B. Pola XRD nanopartikel ZnO segat menunjukkan bahwa sampel terdiri dari struktur kristal wurtzite dan tidak ada puncak impurity yang teridentifikasi, yang menunjukkan kualitas tinggi nanopartikel segat. Untuk nanopartikel tua, pola XRD menunjukkan terbentuknya fase padat Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ (nomor kartu 00-011-0287) dan Zn (OH)₂ (nomor kartu 00-003-0888), yang menunjukkan transformasi kimia nanopartikel ZnO (20 dan 90–200 nm) selama proses penuaan.

Karakteristik fisikokimia nanopartikel ZnO segat dan tua. A Mikrograf representatif nanopartikel segat dan tua (100 μg/mL, 20 dan 90–200 nm) dalam air Milli-Q menggunakan TEM resolusi rendah, B pola XRD nanopartikel segat, nanopartikel tua, ZnO, Zn (OH)₂ dan Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ referensi dalam bentuk kering

Pengamatan Morfologi Sel A_L yang Diekspos Nanopartikel ZnO Segat dan Tua

Perawatan NPs mengakibatkan perubahan yang terlihat pada bentuk atau morfologi sel in vitro [26]. Oleh karena itu, sel A_L yang diekspos nanopartikel ZnO segat atau tua pada 10 & 15 µg/mL selama 72 jam diperiksa di bawah mikroskop stereoskopik. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2, morfologi sel dalam kelompok kontrol tetap normal. Sel menempel dengan baik, dengan sebagian besar menempel dalam 2 jam. Sebagian besar sel berbasis palang atau poligon, dengan beberapa sel yang baru terbagi menunjukkan sitoplasma yang lebih transparan dan dispersi yang lebih baik selama proses menempel. Perawatan dengan nanopartikel ZnO segat 12 μg/mL (20 nm & 90–200 nm) selama 72 jam secara signifikan mengubah morfologi sel. Meskipun sebagian besar sel menempel dalam 3–5 jam, mereka tidak dapat menyebar dengan baik, dan beberapa sel menjadi bulat dan kehilangan bentuk poligon. Ketika konsentrasi nanopartikel ZnO ditingkatkan menjadi 15 μg/mL, sel yang dirawat menyusut dan tidak dapat menempel, yang menunjukkan kelayakan sel yang jauh lebih rendah dibandingkan sel yang dirawat 10 μg/mL. Hasil ini menunjukkan bahwa LC100 untuk nanopartikel ZnO segat mungkin kurang dari 15 μg/mL dengan perawatan 72 jam. Sebaliknya, morfologi sel dalam kelompok yang dirawat nanopartikel tua 20 nm dan 90–200 nm (15 μg/mL) tidak terpengaruh secara signifikan, dan sebagian besar sel yang selamat hidup dapat menempel dan menyebar, dengan kurang dari setengah sel mati yang diamati, yang mengungkapkan bahwa nanopartikel ZnO tua jauh lebih rendah toksisitasnya dibandingkan nanopartikel ZnO segat.

Perubahan morfologi sel A_L setelah diekspos nanopartikel ZnO segat atau tua selama 72 jam dalam medium tambahan Ham’s F12, dan sel yang tidak diekspos digunakan sebagai kelompok kontrol. Morfologi sel A_L diamati dengan mikroskop optik pada pembesaran 10 ×

Nanopartikel ZnO Tua Menginduksi Toksisitas yang Lebih Rendah daripada Nanopartikel Segat

Untuk menyelidiki lebih lanjut perbedaan toksisitas antara nanopartikel ZnO segat dan tua, kami memeriksa kelayakan sel menggunakan kit CCK-8. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 3, inkubasi sel A_L dengan dosis gradasi nanopartikel ZnO segat dan tua (berkisar dari 0 hingga 20 μg/mL, 20 nm dan 90–200 nm) selama 24 jam, 48 jam atau 72 jam menunjukkan penurunan kelayakan sel yang bergantung pada dosis. Tidak ada toksisitas yang jelas diamati dengan perawatan sel dengan nanopartikel ZnO ≤ 10 μg/mL. Ketika dosis nanopartikel ZnO segat dan tua ditingkatkan menjadi 12 dan 15 μg/mL, kelayakan sel menunjukkan kecenderungan penurunan yang bergantung pada waktu. Jelas, kelayakan sel dalam kelompok yang dirawat nanopartikel tua secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok yang dirawat nanopartikel segat. Selain itu, perawatan ZnCl₂ juga mengurangi kelayakan sel dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu, sedangkan toksisitas ZnCl₂ jauh lebih rendah daripada baik nanopartikel ZnO segat maupun tua.

Kelayakan sel yang diinduksi nanopartikel ZnO segat dan tua pada sel A_L. Sel A_L diinkubasi dengan berbagai konsentrasi nanopartikel ZnO segat dan tua (20 dan 90–200 nm) selama 24 jam (A), 48 jam (B) dan 72 jam (C). D Sel A_L diekspos berbagai konsentrasi ZnCl₂ untuk waktu yang berbeda. Data didasari pada ≥ 3 eksperimen independen dan dinyatakan sebagai mean ± SD, *p < 0,05

Perawatan Nanopartikel ZnO Segat Mengaktifkan Jalur Apoptosis dan Mengurangi Ekspresi Gen Apoptosis

Untuk mengungkap mekanisme yang mendasari toksisitas yang lebih rendah nanopartikel tua, kami menganalisis data RNA sequencing dari baik nanopartikel ZnO segat maupun tua. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4A, B, setelah perawatan dengan nanopartikel ZnO segat, jalur apoptosis diaktifkan dalam sel Jurkat (p = 0,017) dan sel HMDM (p = 0,041). Gen apoptosis: ANXA1, CYLD, TNFSF10, IER3, CDKN1A, JUN, SAT1, PMAIP1, CD38 dan ISG20 secara signifikan terkaya dalam sel Jurkat yang dirawat nanopartikel ZnO segat. Gen apoptosis: CD38, TNFRSF12A, CCNA1, BMP2, PPP2R5B, EREG, IFNGR1, CD44, CD14, GNA15, GCH1, TIMP1, BTG2, IL1B, IL1A, BTG3, BCL2L11, SC5D dan SPTAN1 secara signifikan terkaya dalam sel HMDM yang dirawat nanopartikel ZnO segat (Gambar 4C, D). Karena sel Jurket (sel limfosit T darah perifer) dan sel HMDM (makrofag derivasi monosit manusia) adalah jenis sel yang berbeda, cara mereka memicu apoptosis mungkin berbeda. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa paparan nanopartikel ZnO segat dapat mengaktifkan berbagai jalur apoptosis pada berbagai jenis sel.

Jalur apoptosis terkaya dalam data RNA-seq dari sel Jurket dan HMDM yang dirawat nanopartikel ZnO segat. Skor enrichment dari gen yang diekspresikan secara signifikan dari jalur apoptosis sel Jurket yang dirawat nanopartikel ZnO segat (A) dan sel HMDM (B). Heatmap ekspresi gen apoptosis sel Jurket yang dirawat nanopartikel ZnO segat (C) dan sel HMDM (D) dan kelompok kontrol mereka

Nanopartikel ZnO Tua Tidak Mengurangi Ekspresi Gen Apoptosis seperti Nanopartikel ZnO Segat

Data RNA sequencing kami dari sel A_L yang dirawat nanopartikel ZnO tua menunjukkan bahwa jalur sinyal p53, PI3k–Akt, FoXO, Glutathione, ErbB, HIF-1, Oxytocin dan Jak-STAT terkaya (Gambar 5A). Gen apoptosis yang terkaya dalam sel Jurket dan HMDM tidak terpengaruh secara signifikan dalam sel yang dirawat nanopartikel ZnO tua (Gambar 5B). Untuk mengonfirmasi temuan ini lebih lanjut, kami menguji ekspresi gen terkait dengan PCR waktu nyata. Kami menemukan bahwa beberapa gen apoptosis: BMP2, PMAIP1, IL1α, CD69, CCNA1, CD38 dan IL1β tidak terdeteksi dalam sel A_L yang dirawat nanopartikel ZnO tua (data tidak ditunjukkan), mungkin karena sebagian besar gen ini diekspresikan pada sel sistem kekebalan. Gen apoptosis yang diurangi lainnya (IL1α, IL1β dan CD59) yang diamati dalam kelompok yang dirawat nanopartikel ZnO segat tidak berubah secara signifikan dalam tingkat ekspresi oleh perawatan nanopartikel ZnO tua. Sementara MT1 yang berfungsi sebagai kontrol positif secara signifikan meningkat dalam tingkat ekspresi, ekspresi Caspase 3 tidak berubah secara signifikan (Gambar 5C). Data ini menunjukkan bahwa nanopartikel ZnO tua, tidak seperti sejenis segatnya, kurang efektif dalam mengaktifkan gen jalur apoptosis pada sel A_L.

Jalur apoptosis tidak terkaya dalam data RNA-seq dari sel A_L yang dirawat nanopartikel ZnO tua. (A) Analisis ontologi gen dari jalur yang terkaya dari sel A_L yang dirawat nanopartikel ZnO tua. (B) Heatmap ekspresi gen apoptosis sel A_L yang dirawat nanopartikel ZnO tua dan kelompok kontrol. (C) Ekspresi gen apoptosis yang dipilih dan gen kontrol (MT1) dalam sel A_L yang dirawat nanopartikel ZnO segat dan tua

Nanopartikel ZnO Segat Namun Tidak Tua Meningkatkan Tingkat Ekspresi Protein Caspase 3 yang Diaktifkan

Deteksi ekspresi gen Caspase 3 sendirian tidak dapat langsung menunjukkan aktivasi jalur apoptosis. Untuk menganalisis lebih lanjut apakah perawatan nanopartikel ZnO dapat mengubah tingkat protein apoptosis, ekspresi protein Caspase 3 yang terbelah, biomarker yang umum digunakan untuk menunjukkan aktivasi apoptosis sel [27], diperiksa dengan analisis Western blotting. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 6, dibandingkan dengan kelompok kontrol, perawatan nanopartikel ZnO segat (20 nm) meningkatkan tingkat sel protein Caspase 3 yang terbelah sebesar 1,31 ± 0,023 kali lipat, yang secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok yang dirawat nanopartikel ZnO segat 20 nm (1,12 ± 0,039 kali lipat). Ketika ukuran partikel nanopartikel ZnO segat ditingkatkan menjadi 90–200 nm, ekspresi protein Caspase 3 yang terbelah yang diinduksi oleh nanopartikel segat meningkat sebesar 1,46 ± 0,078 kali lipat, secara signifikan lebih besar daripada nanopartikel tua (1,07 ± 0,075 kali lipat). Data ini lebih lanjut menggambarkan potensi yang lebih tinggi nanopartikel ZnO segat dalam menginduksi apoptosis sel, dibandingkan dengan sejenis tua mereka.

Tingkat apoptosis pada sel A_L yang diinkubasi dengan nanopartikel ZnO segat dan tua (20 dan 90–200 nm). Analisis Western Blotting (A) dan kuantifikasi (B) dari tingkat protein Caspase 3 yang terbelah ketika sel diinkubasi dengan nanopartikel ZnO segat dan tua 12 μg/mL (20 dan 90–200 nm) selama 72 jam. Data didasari pada ≥ 3 eksperimen independen dan dinyatakan sebagai mean ± SD, *p < 0,05

Diskusi

Nanopartikel ZnO dilaporkan mengalami transformasi fisikokimia menjadi Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ dengan pelepasan Zn²⁺ selama proses penuaan alami [23, 28]. Namun, toksisitas yang diinduksi oleh nanopartikel ZnO yang tertransformasi (tua) dan mekanisme yang mendasarinya masih belum jelas. Di sini, untuk mengungkap mekanisme di balik toksisitas yang berbeda antara nanopartikel ZnO segat dan tua, analisis RNA sequencing dan uji RT-PCR dilakukan. Juga, Western blotting diterapkan untuk memeriksa tingkat protein Caspase 3, eksekutor kunci dalam apoptosis sel.

Data kami menunjukkan bahwa nanopartikel ZnO tua menginduksi toksisitas yang jauh lebih rendah dibandingkan nanopartikel ZnO segat pada sel A_L. LC₁₀₀ baik nanopartikel ZnO segat (90–200 nm dan 20 nm) dalam studi kami saat ini kurang dari 15 μg/mL (Gambar 3), yang konsisten dengan temuan sebelumnya bahwa LC₁₀₀ nanopartikel ZnO dengan 19–36 nm untuk sel NIH-3T3 atau MSTO adalah sekitar 15 μg/mL [29]. Kami mengonfirmasi bahwa transformasi lingkungan dari properti fisikokimia dalam nanopartikel dapat secara dramatis mengubah toksisitas mereka. Telah dilaporkan bahwa proses sulfidasi nanopartikel ZnO mengubah muatan, hidrofobisitas dan keadaan aglomerasi mereka, yang mengakibatkan adsorpsi nanopartikel status sulfida dalam ludah manusia, keringat dan cairan lavase bronkoalveolar. Dan protein yang terserap oleh nanopartikel ZnO membentuk mahkota protein khusus, yang mempengaruhi efek biologisnya [19]. Fosfat yang banyak terdapat dalam larutan fisiologis (seperti ludah) dapat mengonversi nanopartikel ZnO menjadi ZnHPO₄ dan Zn₃(PO₄)₂ yang metastabil dalam waktu sekitar 5–10 jam dan menunjukkan toksisitas pada sel epitel saluran pencernaan [20]. Ivask et al. membuktikan terjadinya transformasi lengkap nanopartikel ZnO (≤ 3 μg/mL) dalam sistem paparan in vitro ke sel limfosit T manusia (37 °C, medium kultur sel RPMI1640 yang mengandung 10% FBS selama 24 jam) menggunakan spektroskopi struktur serapan X-ray tepi dekat radiasi sinkrotron (XANES). Spektrum dan toksisitas produk transformasi konsisten dengan yang dari ZnSO₄ [21]. Hasil kami mengungkapkan toksisitas ZnCl₂ yang bergantung pada dosis dan waktu terhadap sel A_L, di mana toksisitasnya jauh lebih rendah daripada baik nanopartikel ZnO segat maupun tua (Gambar 3). Pengamatan ini lebih lanjut menjelaskan temuan bahwa toksisitas nanopartikel ZnO segat tidak sepenuhnya disebabkan oleh pelepasan Zn²⁺ [30].

Studi kami sebelumnya juga menunjukkan bahwa nanopartikel ZnO tua menunjukkan potensi yang lebih tinggi dalam memicu ROS (spesies reaktif oksigen), serta kemampuan yang melemah dalam membunuh sel dibandingkan nanopartikel ZnO segat [23]. Kami beralasan bahwa toksisitas yang lebih rendah yang diinduksi oleh nanopartikel ZnO tua mungkin lebih dapat ditoleransi oleh sel mamalia. Studi saat ini tentang data RNA sequencing menunjukkan bahwa gen apoptosis telah diurangi dalam sel yang dirawat nanopartikel ZnO segat, sedangkan mereka jauh lebih sedikit terpengaruh dalam kelompok yang dirawat nanopartikel tua. IL1α dan IL1β adalah anggota keluarga sitokin interleukin 1. Pemelepasan IL1α dan IL1β mengaktifasi apoptosis yang bergantung sebagian pada Caspase 8 [31]. CD69 mengkode anggota dari keluarga reseptor transmembran tipe II kalium-dependen lectin. Peningkatan ekspresi CD69 terkait dengan peningkatan ekspresi penanda apoptosis annexin V dan CD95 (Fas) [32]. JUN adalah sub unit faktor transkripsi AP-1. Peningkatan aktivitas JUN secara proteolitik membelah alpha-fodrin, substrat dari enzim pengonversi interleukin 1beta (ICE), dan keluarga protease cysteine CED-3, yang lebih lanjut menyebabkan sel terprogram mati [33]. Peningkatan ekspresi gen apoptosis ini mengungkapkan bahwa nanopartikel segat memicu apoptosis dalam beberapa cara berbeda. Setelah kenaikan ekspresi gen apoptosis ini, proses apoptosis akhirnya dieksekusi oleh protein apoptosis (Gambar 7). Caspase 3 adalah protease inti untuk berbagai skenario apoptosis; pemotongan protein ini diperlukan untuk mengaktifasi baik jalur apoptosis ekstrinsik maupun intrinsik [34, 35]. Oleh karena itu, deteksi caspase 3 yang terbelah adalah metode umum untuk mengidentifikasi apoptosis yang diinduksi oleh berbagai sinyal apoptosis [36]. Data Western blotting kami mengungkapkan bahwa, baik nanopartikel ZnO 20 nm maupun 90–200 nm, paparan sublethal tidak mengubah tingkat Pro caspase 3 di semua kelompok perawatan. Sebaliknya, caspase 3 yang terbelah secara signifikant meningkat oleh perawatan nanopartikel segat, sedangkan nanopartikel tua menunjukkan sedikit (jika ada) efek pada tingkat caspase 3 yang terbelah (Gambar 6). Digabungkan dengan analisis ekspresi RNA, hasil kami dengan jelas menjelaskan potensi yang lebih tinggi nanopartikel ZnO segat dalam menginduksi apoptosis sel.

Model untuk Nanopartikel ZnO Segat namun tidak Nanopartikel ZnO Tua menginduksi apoptosis yang bergantung pada Caspase 8 dan Caspase 3. Peningkatan ekspresi gen apoptosis CD69 mengaktifasi ekspresi Fas dan apoptosis annexin V pada sel mamalia yang diekspos nanopartikel ZnO segat. Peningkatan ekspresi gen apoptosis IL1α dan IL1β secara sebagian mengaktifasi apoptosis yang bergantung pada Caspase 8. Ini lebih lanjut menyebabkan aktivasi Caspase 3 dan menginduksi apoptosis. Semua perubahan ini pada tingkat mRNA dan protein tidak dapat terdeteksi pada sel mamalia yang diekspos nanopartikel ZnO tua

Kesimpulan

Dalam studi ini, transformasi fisikokimia alami nanopartikel ZnO dalam air ultra murni dikonfirmasi, dan variasi toksisitas yang diinduksi oleh nanopartikel segat dan tua diteliti. Kami berfokus pada data RNA sequencing dari sel A_L yang dirawat nanopartikel ZnO tua kami dan nanopartikel segat dari database. Kami membandingkan jalur sinyal yang secara khusus terkaya dalam kelompok yang dirawat nanopartikel tua, yang berbeda dari kelompok yang dirawat nanopartikel segat atau ZnCl₂. Data kami menunjukkan bahwa toksisitas yang lebih rendah nanopartikel ZnO tua erat kaitan dengan kemampuan yang melemah mereka dalam menginduksi apoptosis, sementara regulasi transkriptional dari berbagai jalur sinyal yang diaktifkan oleh nanopartikel mempromosikan pendirian homeostasis sel dalam sel mamalia.