Thiakaliksena[4] Mengatasi Hambatan Aktivitas ATPase Miosin Uterin Akibat Zink

Latar Belakang

Paparan lingkungan terhadap logam berat, terutama zink, menimbulkan risiko kesehatan yang signifikan. Meskipun zink adalah kofaktor vital untuk lebih dari 300 metalienzim, asupan tinggi kronis dapat mengganggu proses fisiologis, termasuk kontraksi otot halus uterin, yang mengakibatkan komplikasi reproduksi seperti infertilitas dan persalinan prematur. Dampak zink terhadap ATPase miosin—penggerak utama kontraksi otot halus—telah didokumentasikan, namun upaya pengatasi yang efektif terbatas. Kaliksena, terutama thiakaliksena[4], telah muncul sebagai agen pengelat yang promising karena sitotoksikitas rendah dan kemampuan ikatan logam yang kuat. Pekerjaan sebelumnya menunjukkan bahwa C-798 melindungi miosin S1 dari inhibisi Pb²⁺, Cd²⁺, dan Ni²⁺. Penelitian ini memperluas wawasan tersebut kepada toksisitas zink pada miosin uterin.

Upaya kolaboratif ini antara Institut Biokimia Palladin dan Institut Kimia Organik, NAS Ukraina, mengeksplorasi interaksi antara ATPase miosin uterin dan thiakaliksena[4].

Hasil

Efek Zn²⁺ terhadap ATPase Miosin S1

Penambahan Zn²⁺ bertahap (0,5–5 mM) mengurangi aktivitas ATPase, dengan inhibisi maksimum (43 ± 8 %) yang terlihat pada 5 mM. Analisis kinetik selanjutnya (Lineweaver–Burk) mengonfirmasi penurunan signifikan 1,6 kali dalam V_max,ATP tanpa perubahan yang bermakna secara statistik dalam K_m,ATP.

Ketergantungan Konsentrasi ATP di bawah 5 mM Zn²⁺

Aktivitas ATPase mencapai puncak pada 3 mM ATP baik pada sampel kontrol maupun yang diobati zink. Di bawah zink, aktivitas puncak 30 % lebih rendah, mengonfirmasi efek inhibisi pada turnover katalitik.

Ketergantungan Mg²⁺ dalam Kehadiran 5 mM Zn²⁺

Berbeda dengan kontrol, variasi Mg²⁺ (0,5–5 mM) tidak mengubah aktivitas ATPase ketika 5 mM Zn²⁺ hadir, menunjukkan bahwa zink menempati situs ikatan Mg²⁺ dan membuat enzim tidak sensitif terhadap konsentrasi Mg²⁺.

Situs Ikatan Zink pada Miosin S1

Studi pengikatan mengidentifikasi beberapa lokus ikatan Zn di dalam domain ATPase—terutama di dekat P-loop dan wilayah switch 1/2—yang distabilkan oleh residue Glu, Asp, dan Arg. Situs-situs ini integral untuk ikatan dan hidrolisis ATP.

Thiakaliksena[4] Memulihkan Aktivitas ATPase

Penambahan 100 µM C-798 atau C-800 pada medium 5 mM Zn sepenuhnya memulihkan aktivitas ATPase ke tingkat kontrol. C-798 menunjukkan inhibisi yang modest dan dapat dibalik (kemungkinan karena penyekatan Mg²⁺), sedangkan C-800 tidak memiliki efek pada enzim dalam tidak adanya zink.

Wawasan Mekanisme dari Pengikatan

Simulasi mengungkapkan bahwa C-798 dan C-800 ikat Zn²⁺ melalui atom oksigen dan sulfur di sisinya bawah, memindahkan logam dari residue katalitik kunci. Pengelatan ini mengurangi interaksi Zn–miosin, sehingga meredakan efek inhibisi. Minimisasi energi menunjukkan interaksi tamu-tuan yang menguntungkan (energi total: 64,5 kcal/mol untuk C-798, 83 kcal/mol untuk kompleks C-798–Zn).

Pembahasan

Konsentrasi zink 5 mM yang digunakan meniru paparan patologis dan menunjukkan presion yang kuat serta dapat dibalik terhadap ATPase miosin uterin. Ketidakresponsifan Mg²⁺ pada sampel yang diobati zink mendukung hipotesis bahwa Zn²⁺ secara kompetitif menempati situs Mg²⁺ di dalam domain ATPase. Hasil pengikatan selaras dengan ini, menunjuk koordinasi Zn pada residue yang kritis untuk ikatan dan hidrolisis nukleotida.

Thiakaliksena[4], dengan grup sulfonat atau fosfonat anioniknya, memberikan pengelatan Zn²⁺ yang kuat tanpa mengganggu homeostasis Mg²⁺ pada tingkat fisiologis. Kemampuannya untuk memulihkan aktivitas ATPase menunjukkan strategi terapi yang viable untuk disfungsi uterin yang disebabkan oleh zink dan potensialmente untuk toksisitas zink lainnya.

Kesimpulan

Zink berlevel tinggi (5 mM) mengganggu ATPase miosin S1 uterin dengan mengurangi V_max tanpa mengubah K_m. Thiakaliksena[4] yang larut dalam air C-798 dan C-800 secara efektif menetralisasi inhibisi ini dengan mengelat zink di situs aktif ATPase, memulihkan aktivitas enzim ke dasar. Temuan ini memerlukan penelitian lebih lanjut tentang C-798 dan C-800 sebagai penangkal toksisitas zink.

Metode

Reagen

Semua reagen kelas analitik (Sigma, Merck, Acros, atau pemasok dalam negeri). Larutan disiapkan dengan air ultrapure (konduktivitas < 0,1 µS). Konsentrasi ion logam diverifikasi dengan metode titrasi Mohr.

Isolasi Aktomiosin dan Miosin S1

Aktomiosin diekstraksi dari otot halus uterin babi melalui protokol Barany yang dimodifikasi, dan miosin S1 dipurnikan menggunakan metode Suzuki. Kebenaran protein dikonfirmasi oleh elektroforesis PAAG-SDS.

Uji Aktivitas ATPase

Aktivitas ATPase diukur pada plates 96-lubang pada 37 °C dalam medium 0,1 mL (20 mM Tris-HCl pH 7,2, 100 mM KCl, 0,01 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 3 mM ATP). Konsentrasi miosin S1 adalah 20 µg mL⁻¹. Setelah 5 menit, pelepasan fosfat anorganik diukur dengan metode Chen (absorbansi 820 nm). Aktivitas dinyatakan sebagai nmol Pi menit⁻¹ mg⁻¹ protein. Efek zink dan thiakaliksena dievaluasi dengan menambahkan konsentrasi yang sesuai ke medium inkubasi; aktivitas kontrol (tanpa Zn atau ligand) diatur ke 100 %.

Analisis Kinetik dan Statistik

Parameter Michaelis–Menten diperoleh dari plot Lineweaver–Burk. Signifikansi statistik dievaluasi menggunakan ANOVA dua arah (p < 0,05). Analisis data menggunakan Microsoft Excel dan Statistica 4.5.

Sintesis dan Karakterisasi Thiakaliksena[4]

Senyawa C-798 dan C-800 disintesis di Departemen Kimia Fosforana (Institut Kimia Organik, NAS Ukraina) dan dikonfirmasi oleh spektroskopi NMR dan IR.

Modelling Komputer

Pengikatan ligand-protein menggunakan AutoDock 4.2 dengan struktur PDB 1b7t. 100 pelari algoritma genetika Lamarckian (populasi = 100, 10⁶ evaluasi energi) mengidentifikasi pose energi terendah. Visualisasi menggunakan Chimera dan Yassara. Energi ikatan mencakup kontribusi van der Waals, elektrostatik, dan ikatan hidrogen.

Singkatan

C-798:

Tetrahydroksithiakaliksena[4]etrasulfonat

C-800:

Tetrahydroksithiakaliksena[4]etrafosfonat

CNDO:

Complete Neglect of Differential Overlap (metode)

K_m:

Konstanta Michaelis

L50:

Domain 50-kDa bawah miosin

LD₅₀:

Dosis letal untuk 50 % kematian

MM2:

Kelas medan paksa

Miosin S1:

Subfragmen-1 miosin

NASU:

Akademi Ilmu Pengetahuan Nasional Ukraina

PDB:

Bank Data Protein

P-loop:

Loop ikatan fosfat miosin

RCSB:

Kolaborasi Penelitian untuk Bioinformatika Struktural

U50:

Domain 50-kDa atas miosin

V_max:

Kecepatan maksimum enzim

V_max,ATP:

Kecepatan maksimum untuk hidrolisis ATP