Menumbuhkan struktur nano emas untuk penyerapan seluler selektif bentuk

Hasil dan diskusi

Sintesis dan karakterisasi NS Au anisotropik

Au NSs anisotropik disintesis melalui pendekatan pertumbuhan yang dimediasi benih menggunakan campuran surfaktan biner. Ketika CTAB capped Au seed (~ 5 nm) ditambahkan ke larutan pertumbuhan campuran surfaktan biner (rasio molar OA CTAB ~ 20:1), rasio aspek rendah Au NRs terbentuk (Gbr. 2a, dan Tabel 2). Gambar HRTEM mengungkapkan morfologi kristal tunggal dan tulang anjing dari NR (inset pada Gambar. 2a). OA, asam lemak yang juga bertindak sebagai reduktor lemah memfasilitasi reduksi Au ³⁺ ke Au ⁺ . Perubahan warna larutan pertumbuhan dari kuning menjadi transparan (~ 15 menit) mengkonfirmasi pengamatan kami. Penambahan asam askorbat lebih lanjut ke larutan pertumbuhan meningkatkan laju reduksi Au ⁺ . Akibatnya, atom Au berdifusi dengan cepat pada sisi {111} [16] NR karena pengemasan struktur misel campuran kurang padat dibandingkan dengan sisi {110} dan ujung {100} NR [25]. Oleh karena itu, pertumbuhan berlebih dari NR pada sisi {111} akhir daripada sisi {110} dan sisi {100} mengarah pada pembentukan NR morfologi tulang anjing. Hasil kami juga menunjukkan bahwa {110} faset tidak mungkin dilapisi dengan Au karena interaksi yang kuat dari faset ini dengan molekul surfaktan dibandingkan dengan faset lainnya. Kami juga mengkonfirmasi peran OA dan asam askorbat dalam pembentukan Au NRs dari morfologi tulang anjing. Ketika konsentrasi OA atau asam askorbat diturunkan dalam larutan pertumbuhan, hanya Au NR yang diperoleh. Hasil ini menunjukkan penurunan laju reduksi dan laju difusi atom emas, yang mengarah pada pembentukan Au NR (File tambahan 1:Gambar S1, ESI†).

Gambar STEM dan spektrum UV-Vis Au NS s dari berbagai bentuk. a Gambar BF-STEM dari Au NR dari morfologi tulang anjing dan gambar HRTEM di sisipan menunjukkan sifat kristal tunggal NR. b Gambar BF-STEM dari Au NSs tetraheksahedral memanjang (inset adalah gambar SEM). c Gambar SEM dari Au BPs (inset adalah gambar SEM dari BP tunggal). d Gambar TEM dari partikel Au spherical (gambar HRTEM di sisipan menunjukkan sifat polikristalin dari partikel Au). e Gambar BF-STEM dari Au NMS. f Spektrum UV-vis Au NS dari berbagai bentuk

Ketika konsentrasi OA relatif terhadap CTAB meningkat dalam larutan pertumbuhan (Tabel 1), Au NS bentuk THH memanjang diperoleh (Gbr. 2b dan Tabel 2). Perubahan bentuk Au NSs dapat dijelaskan berdasarkan modifikasi struktur misel campuran oleh OA. Struktur misel campuran seperti batang terbentuk pada konsentrasi OA yang rendah. Peningkatan jumlah OA dalam struktur misel campuran memodifikasi strukturnya menjadi cembung dan memfasilitasi pembentukan THH Au NSs yang memanjang. Penelitian kami sebelumnya juga mengungkapkan bahwa peningkatan konsentrasi ko-surfaktan membuat struktur misel campuran lebih cembung [25]. Bentuk Au NSs juga dapat diubah dengan mengganti OA dengan DDAB. Kami memperoleh Au NSs bentuk bipyramid (BP) dengan menggunakan CTAB dan DDAB (Gbr. 2c dan Tabel 2) seperti yang dilaporkan dalam pekerjaan kami sebelumnya [25]. Selanjutnya, partikel Au berbentuk bola disintesis dengan metode Turkevich yang dimodifikasi (Gbr. 2d).

Kami juga menyelidiki pengaruh larutan benih pada bentuk Au NSs. Larutan benih diambil dari larutan pertumbuhan CTAB dan OA (OA:CTAB ~ 20:1) setelah 1 menit reaksi dan ditambahkan ke larutan pertumbuhan segar yang mengandung OA:CTAB ~ 20:1. Au NS dari nanomakura (NM) morfologi diperoleh setelah selesainya reaksi pertumbuhan (Gbr. 2e). Morfologi NM tampak mirip dengan tulang anjing. Namun, karena NS tumbuh ke segala arah seperti yang ditunjukkan pada gambar TEM yang diambil pada sudut yang berbeda (Gbr. 3a dan Tabel 2), oleh karena itu, kami menyebut NS ini sebagai NM. Untuk mengilustrasikan mekanisme pertumbuhan Au NM, volume kecil diambil dari larutan pertumbuhan pada interval waktu yang berbeda dan reaksi antara dianalisis menggunakan pencitraan STEM (Gbr. 3b). Ketika partikel benih berlapis CTAB ditambahkan ke larutan pertumbuhan pertama, warna larutan pertumbuhan berubah dengan cepat menjadi ungu tua yang menunjukkan pembentukan Au NSs anisotropik. 300 μL larutan dari larutan penumbuh pertama ditambahkan ke larutan penumbuh kedua, dan setelah itu, beberapa tetes larutan segera ditambahkan ke kisi TEM.

Morfologi dan pertumbuhan Au NM (nanomakura ). a Gambar TEM dari NM diambil pada sudut yang berbeda. b Gambar BF-STEM menunjukkan langkah-langkah pertumbuhan dalam pembentukan NM tipe Au NSs. Solusi yang diambil dari larutan pertumbuhan pada titik waktu yang berbeda ditambahkan langsung ke grid TEM tanpa pemurnian

Gambar STEM representatif menunjukkan pertumbuhan Au NM yang relatif lebih cepat dalam arah memanjang daripada melintang (0 s). Setelah 30 detik, NS yang menyerupai konfigurasi dasi kupu-kupu terlihat. NM yang memiliki ukuran akhir telah diamati sekitar 3 menit reaksi. Kami tidak melihat perubahan lebih lanjut dalam bentuk dan ukuran NS setelah 30 menit dan 8 jam. Berdasarkan analisis kami, pertumbuhan keseluruhan Au NM dapat dihipotesiskan mengikuti mekanisme pertumbuhan autokatalitik seperti "popcorn", di mana benih individu tertidur selama beberapa waktu sebelum tiba-tiba dan cepat tumbuh menjadi bentuk akhir, seperti yang telah telah diamati untuk NRs oleh Cortie et al. [47]. NM memiliki struktur tiga dimensi, yang ditunjukkan oleh gambar HRTEM dari NM yang diperoleh pada sudut rotasi yang berbeda (Gbr. 3a) tidak seperti NS berbentuk tulang anjing yang dilaporkan sebelumnya [48, 49].

Sifat optik Au NS dari berbagai bentuk diukur, dan hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 2f. Au NSs menampilkan karakteristik LSPR yang dapat disetel pada rentang UV-Vis––terlihat––dekat-inframerah (IR). Pita plasmon terpecah menjadi beberapa untuk struktur anisotropik––pita longitudinal dan transversal, karena osilasi resonansi di sepanjang sumbu yang berbeda. NR menunjukkan setidaknya tiga pita berbeda––516 nm, 679 nm, dan 796 nm, yang terkuat adalah yang di tengah. Munculnya pita ketiga dapat dikaitkan dengan polidispersitas NR yang disebabkan karena efek etsa asam oleat. Ini mengarah pada pembentukan nanorods dengan tepi kasar. Baik puncak resonansi melintang dan longitudinal (masing-masing 557 dan 760 nm) diamati untuk NM, yang memiliki permukaan lebih bergerigi daripada nanorod. Namun, untuk struktur yang lebih besar (THH dan BPs), puncak LSPR tunggal dan luas diamati masing-masing pada 568 nm dan 593 nm. Sementara spektrum UV-vis untuk THH menunjukkan kemiripan yang mirip dengan penelitian sebelumnya [50], dua mode untuk BPs tampaknya menyatu menjadi puncak yang luas tidak seperti yang diamati [51]. Hal ini dapat dikaitkan dengan hasil yang rendah dari bentuk BP atau sentrifugasi non-bentuk-selektif yang diterapkan pada Au NS atau lapisan yang tidak rata yang mengarah ke bentuk anisotropi dalam larutan.

Fungsionalisasi permukaan Au NSs

Au NS dari berbagai bentuk difungsikan menggunakan metode dua langkah––mengganti CTAB bilayer dengan O-[2-(3-mercaptopropionylamino) ethyl]-O-methylpolyethylene glycol (PEG-SH) dan selanjutnya dengan MUA. Gambar 4a menunjukkan diameter hidrodinamik NS pada setiap tahap fungsi. Peningkatan berurutan dalam ukuran diperoleh jika dibandingkan dengan NS berlapis CTAB, untuk setiap NS (kecuali untuk BP) yang menunjukkan keberhasilan fungsionalisasi. Karena pengukuran DLS didasarkan pada asumsi partikel sferis, analisis penentuan ukuran untuk NS anisotropik harus didekati dengan NS sferis yang memiliki koefisien difusi yang sama dengan NS anisotropik.

Ukuran dan potensi zeta Au NSs. a Variasi ukuran DLS dari Au NS setelah setiap tahap fungsionalisasi. b Variasi potensi zeta Au NSs dengan setiap tahap fungsionalisasi. X -sumbu mewakili struktur nano Au dari berbagai bentuk (NR nanorods, THH tetrahexahedra, NM nanomakura , BP bipyramid, SP spherical)

Ini menjelaskan sedikit penurunan ukuran untuk BP berlapis PEG-SH dan juga mendukung data UV-vis di atas. Sebagai hasil dari fungsionalisasi, muatan permukaan NS berkurang secara besar-besaran seperti yang ditampilkan pada Gambar 4b. Surfaktan kationik mudah digantikan dengan PEG-SH, yang selanjutnya digantikan oleh MUA karena afinitas yang lebih tinggi terhadap permukaan Au. Karena ukuran MUA yang kecil, ia memiliki fleksibilitas yang lebih tinggi untuk menggantikan CTAB yang tetap berada di NS, bahkan setelah PEGylation. Nilai potensial zeta akhir dari NS berlapis MUA mencerminkan permukaan bermuatan negatif untuk semua NS kecuali untuk NR. Perbedaan ini dapat dikaitkan dengan lapisan yang tidak rata dari NR kecil atau polidispersitasnya, dan prinsip pengukuran diterapkan. Untuk NS sferis, muatan permukaan negatif awal disebabkan oleh pelapisan sitrat. Namun, besarnya potensi zeta yang tinggi untuk semua NS memastikan stabilitas NS dalam larutan berair. Pengukuran XPS yang dilakukan pada Au NSs setelah setiap tahap fungsionalisasi, yaitu, dengan PEG-SH diikuti oleh MUA menunjukkan kandungan bromin yang sangat rendah di permukaan, mengkonfirmasikan penghilangan CTAB terikat dalam jumlah besar dari permukaan NSs. (Tabel 1, ESI).

Selanjutnya, pelapisan NS dengan PEG-SH dan MUA tidak mengubah karakteristik optiknya secara dramatis. Namun, pelebaran puncak sekuensial diperoleh setelah fungsionalisasi untuk NS anisotropik (File tambahan 1:Gambar S3, ESI†). Hal ini dapat terjadi karena sumbu rotasi NS yang berbeda karena anisotropi, pelapisan tidak seragam, pembesaran ukuran (data DLS), polidispersitas sampel, atau kombinasi di atas. Karena sifat optik Au NS bergantung pada bentuk, permukaan, ukuran, dan keadaan agregasi, demikian juga interaksinya dengan sel. Studi interaksi sel dapat mengungkapkan sejauh mana Au NS diambil, efek sitotoksiknya, dan dapat menunjukkan aplikasi terapeutik dan diagnostik di masa depan.

Interaksi seluler Au NS dalam berbagai bentuk

Umumnya, Au NSs memasuki sel melalui endositosis, yang dapat dimediasi reseptor atau reseptor-independen, melalui fagositosis yang bergantung pada aktin, atau melalui rute endositik lain yang saat ini tidak diketahui [52]. Menggambarkan rute mana yang diambil NS sangat penting, karena pada akhirnya menentukan nasib intraseluler NS [53]. Studi telah menunjukkan bahwa mekanisme serapan intraseluler tergantung pada sifat fisikokimia, AR, dan karakteristik permukaan NS, serta jenis sel [54,55,56,57,58]. Muatan molekul penstabil permukaan akan secara efektif menjadi muatan NS [59]. NSs bermuatan positif memiliki adsorpsi protein yang kuat dalam media biologis dan dapat sangat merusak membran sel. Karena itu, muatan netral atau negatif lebih disukai untuk menghindari adsorpsi yang kuat pada membran sel dan/atau adsorpsi protein [26, 60]. Selanjutnya, bentuk NSs akan menentukan sejauh mana cakupan permukaan molekul stabilisasi seragam atau tidak [61].

Di sini, semua Au NS, kecuali NS bulat, disintesis dengan zat aktif permukaan CTAB. Au NS difungsikan dengan MUA untuk mendapatkan permukaan bermuatan negatif sebelum studi interaksi sel. Au NS yang dilapisi MUA yang stabil selanjutnya diinkubasi bersama dengan sel glioblastoma-astrocytoma manusia selama 24 jam, dan efek bentuk dan konsentrasi pada sitotoksisitas dinilai dengan uji LIVE/DEAD®, dilengkapi dengan pewarnaan nuklir untuk menyoroti Au NS intraseluler .

Kematian sel tertinggi diamati dengan NM pada konsentrasi tinggi (Gbr. 5a), dengan kematian sel mendekati 20% setelah koreksi kosong. NS lain tidak menunjukkan tren yang sama dalam sitotoksisitas, yang mungkin menunjukkan bahwa NM diambil pada tingkat/volume yang lebih tinggi daripada bentuk lainnya [62]. Penghitungan sel untuk bentuk ini menunjukkan sitotoksisitas di bawah 5% setelah koreksi kosong (untuk gambar dari semua bentuk, lihat File tambahan 1:Gambar S4, ESI†).

Effect of Au NSs on glioblastoma-astrocytoma cells. a Percentage cell death of glioblastoma-astrocytoma cells as a function of concentration of AuNSs. Incubation time was 24 h. Images b –m are acquired after incubation of makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. b TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. e Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). g Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. h TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.