Nanopartikel PEG-PCCL: Pengiriman Paklitaksel Toksikitas Rendah dan Berkelanjutan serta Efektivitas Anti-Tumor yang Ditingkatkan dalam Model Hepatokarsinoma

Abstrak

Kimoterapi konvensional sering gagal mencapai konsentrasi terapeutik di situs tumor karena halangan fisiologis, yang mengarah pada efektivitas yang suboptimal dan toksisitas sistemik. Nanokarrier yang mengenkapsulasi obat hidrofobik dapat mengatasi hambatan ini dengan meningkatkan kelarutan obat, memperpanjang waktu sirkulasi, dan meningkatkan akumulasi tumor melalui efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR). Dalam studi ini kami mengevaluasi keamanan sistemik dari kopolimer diblok amfifil baru, polietilena glikol karboksi-poli(kaprolakton) (PEG-PCCL), dan kemampuannya untuk mengirimkan paklitaksel (PTX). Nanobola PEG-PCCL dikarakterisasi oleh dispersi cahaya dinamis dan mikroskop transmisi elektron, yang mengungkapkan diameter rata-rata 97 ± 2,6 nm dan potensi zeta negatif –18,4 mV. Uji sitotoksisitas in vitro (MTT dan kebocoran LDH) menunjukkan toksisitas yang tidak signifikan pada sel HEK293T dan Hep-G2 bahkan pada 1 mg/mL, sementara uji hemolisis dan flebitis pada tikus dan kelinci mengonfirmasi hemokompatibilitas yang baik dan iritasi vaskular minimal. Efisiensi enkapsulasi PTX dalam PEG-PCCL adalah 55,98 %. Analisis farmakokinetika pada tikus yang menderita H22 menunjukkan bahwa PEG-PCCL/PTX mempertahankan konsentrasi plasma yang lebih tinggi (Cmax = 283 ± 2,79 µg/mL) dan waktu tinggal rata-rata yang signifikan lebih lama (Tmax = 4 ± 1,22 jam) dibandingkan PTX bebas (Cmax = 312 ± 2,59 µg/mL, Tmax = 0,54 ± 0,20 jam). In vivo, PEG-PCCL/PTX mengurangi volume asites dan memperpanjang masa hidup tikus yang menderita tumor lebih efektif daripada PTX bebas. Secara kolektif, nanobola PEG-PCCL menunjukkan biokompatibilitas yang baik dan merupakan kendaraan yang menjanjikan untuk agen anticancer hidrofobik.

Pengantar

Seiring dengan kenaikan insiden kanker di seluruh dunia dan populasi yang meminut, jendela terapeutik dari kimoterapi konvensional tetap sempit karena penyerapan tumor yang terbatas dan toksisitas off-target yang parah, seperti neutropenia dan kardiomiopati. Pengiriman obat yang dimediasi nanopartikel menawarkan solusi rasional: dengan merancang ukuran, kimia permukaan, dan hidrofilisitas, karrier ini dapat secara selektif mengakumulasi di tumor sambil menghindari sistem retikuloendotelial. Di antara polimer yang disetujui FDA, PEG dan poli(kaprolakton) (PCL) membentuk struktur inti-kulit yang menggabungkan inti beban obat hidrofobik dengan kulit hidrofilik yang halus. Namun, banyak polimer ini masih menghadapi tantangan—tingkat klarifikasi yang tinggi, kebocoran obat prematur, dan toksisitas yang tersisa. PEG-PCCL adalah kopolimer diblok yang baru yang mengintegrasikan grup karboksi ke dalam rangka PCL, meningkatkan hidrofilisitas dan stabilitas melalui ikatan hidrogen intramolekuler. Meskipun profil fisikokimia telah didokumentasi, evaluasi toksisitas yang sistematik dan kinerja terapeutik masih kurang dieksplorasi. Studi ini mengatasi kesenjangan itu dengan mengevaluasi toksisitas akut in vitro dan in vivo PEG-PCCL dan dengan mengevaluasi kemampuannya untuk meningkatkan farmakokinetika paklitaksel dan efektivitas anti-tumor dalam model hepatokarsinoma H22.

Metode

Bahan, Sel, dan Hewan

Semua reagen adalah grade analitis. Tikus Balb/C jantan (7–8 minggu, 20–25 g) dan kelinci New Zealand (2,5–3,0 kg) dirawat dalam kondisi SPF dan digunakan sesuai dengan pedoman etika institusi. Sel Hep-G2, HEK293T, dan H22 hepatokarsinoma dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 % FCS dan antibiotik pada 37 °C, 5 % CO₂.

Persiapan PEG-PCCL dan Nanopartikel Terbebani PTX

PEG-PCCL disintesis melalui polimerisasi pembukaan cincin kaprolakton (ε-CL) kehadiran PEG (Mn = 1000) dan katalis paladium, seperti yang diilustrasikan dalam Gambar 1. Setelah pemurnian, polimer dikeringkan beku dan disimpan dalam kantong kedap udara. Penguatan PTX dicapai melalui metode dispersi padat bebas pelarut: PTX dipenguapkan bersama PEG-PCCL, kemudian didisperse kembali dalam air pada 65 °C untuk membentuk suspensi nanopartikel homogen, yang difilter (0,22 µm) dan dikeringkan beku. Efisiensi enkapsulasi (EE) dihitung oleh HPLC menggunakan metode sentrifugasi minikolom.

Karakterisasi

Dispersi cahaya dinamis (Malvern Nano-ZS 90) mengukur ukuran dan potensi zeta. Mikroskop transmisi elektron (TEM, Hitachi H-6009IV) memvisualisasikan morfologi setelah pewarnaan asam fosfotungstik.

Uji Sitotoksisitas

Uji MTT dan kebocoran LDH dilakukan pada sel Hep-G2 dan HEK293T yang diekspos pada 0–1 mg/mL PEG-PCCL selama 24 jam. Keberadaan diekspresikan sebagai persentase relatif terhadap kontrol tidak diobati. Pewarnaan Annexin V/PI dan mikroskopi fluoresens menilai apoptosis.

Uji Hemokompatibilitas

Hemolisis sel darah merah diukur in vitro setelah menginkubasi suspensi sel darah merah 2 % dengan PEG-PCCL (0,5 mg/mL) selama 1–3 jam pada 37 °C. Hemolisis in vivo dikuantifikasi dengan menghitung sel darah merah yang beredar setelah 3 jam infus intravena (20 mg/kg).

Flebitis Kelinci

Infus intravena PEG-PCCL (0,5 mg/mL) ke vena telinga kelinci diikuti oleh evaluasi histologis dinding vena 24 jam setelah infus.

Uji Fungsi Hati dan Ginjal

Serum AST, ALT, ALP, bilirubin, kreatinin, asam urat, dan albumin diukur 7 hari setelah infus (20 mg/kg) untuk menilai fungsi hati dan ginjal.

Histopatologi

Pewarnaan H&E pada jaringan paru-paru, hati, dan ginjal yang dikumpulkan 3 hari setelah infus intravena diperiksa untuk perubahan inflamasi.

Konsentrasi Darah

Tingkat plasma PTX diukur oleh spektrofotometri UV pada 760 nm dari sampel darah berurutan (0,08–24 jam) setelah administrasi intravena PTX bebas (10 mg/kg) atau PEG-PCCL/PTX (20 mg/kg).

Model Tumor dan Pengobatan

Sel H22 (4 × 10⁶) disuntik intraperitonealis ke tikus Balb/C. Setelah asites terbentuk (hari 3–5), tikus menerima salin, PTX bebas (10 mg/kg), atau PEG-PCCL/PTX (20 mg/kg) pada hari 3 dan 10. Perut lingkar (AP), volume asites, dan kelangsungan hidup dipantau hingga hari 20.

Analisis Statistik

Data diekspresikan sebagai rata-rata ± deviasi standar. Signifikansi statistik ditentukan oleh ANOVA dengan uji pasca Dunnett; p < 0,05 dianggap signifik.

Hasil

Morfologi, Diameter, dan Potensi Zeta PEG-PCCL

Dispersi cahaya dinamis mengungkapkan diameter rata-rata 97 ± 2,6 nm. Gambar TEM (Gambar 2) mengonfirmasi morfologi sferik yang seragam. Potensi zeta yang diukur adalah –18,4 mV, yang menunjukkan permukaan stabil dan bermuatan negatif. Efisiensi enkapsulasi PTX adalah 55,98 %.

Sitotoksisitas

Kedua sel HEK293T dan Hep-G2 menunjukkan penurunan keberadaan yang bergantung pada konsentrasi saat diekspos pada PEG-PCCL, namun penurunan tersebut jauh lebih ringan dibandingkan dengan PEI, terutama pada 0,75 dan 1 mg/mL (p = 0,023). Kebocoran LDH mencerminkan temuan ini, dengan 19 % dan 42 % kematian sel pada 24 dan 48 jam, masing-masing, pada 0,5 mg/mL PEG-PCCL—secara signifikan lebih rendah daripada PEI (p = 0,037). Pewarnaan Annexin V/PI mengonfirmasi apoptosis awal pada kedua baris sel, namun PEI menginduksi proporsi sel apoptosis yang lebih tinggi dibandingkan PEG-PCCL (Gambar 5).

Biokompatibilitas

Hemolisis

Uji hemolisis in vitro mengungkapkan peningkatan hemolisis yang bergantung pada waktu untuk semua sampel, namun PEG-PCCL secara konsisten menampilkan hemolisis yang lebih rendah daripada salin dan jauh lebih rendah daripada PEI (Gambar 6a). In vivo, jumlah sel darah merah setelah 3 jam infus intravena mencerminkan hasil ini, mengonfirmasi hemokompatibilitas yang baik (Gambar 6b).

Flebitis Kelinci

Pemeriksaan histologis vena telinga setelah infus 24 jam menunjukkan kerusakan endotel yang minimal dan infiltras inflamasi dalam grup PEG-PCCL dibandingkan salin (Gambar 7). Tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik dalam skor flebitis (p > 0,05).

Toksisitas Organ

Pewarnaan H&E pada jaringan paru-paru, hati, dan ginjal yang dikumpulkan 3 hari setelah infus intravena tidak menunjukkan lesi histopatologis yang jelas dalam grup PEG-PCCL, berlawanan dengan inflamasi ringan yang diamati dengan PEI (Gambar 8). Kimia serum mengonfirmasi tidak ada perbedaan yang signifikan dalam AST, ALT, ALP, bilirubin, kreatinin, asam urat, atau albumin antara grup PEG-PCCL dan salin (Tabel 2).

Studi Farmakokinetika

Setelah administrasi intravena PTX bebas (10 mg/kg) atau PEG-PCCL/PTX (20 mg/kg), profil konsentrasi plasma-waktu PEG-PCCL/PTX menampilkan Tmax yang signifikan lebih lama (4 ± 1,22 jam) dibandingkan PTX bebas (0,54 ± 0,20 jam). Luas di bawah kurva (AUC₀–∞) untuk PEG-PCCL/PTX adalah 282,21 ± 21,08 µg jam/mL, sekitar 5,4 kali lebih tinggi daripada PTX bebas (52,00 ± 4,30 µg jam/mL), yang menunjukkan paparan sistemik yang ditingkatkan (Gambar 9).

Efek PEG-PCCL/PTX pada Tikus yang Menderita Tumor

Pengukuran harian lingkar perut (AP) menunjukkan bahwa PEG-PCCL/PTX dan PTX bebas keduanya memperlambat akumulasi asites relatif terhadap salin (Gambar 10a). Pada hari 10, volume asites secara signifikan lebih rendah dalam grup PEG-PCCL/PTX (p = 0,0052) daripada dalam grup PTX bebas (p = 0,0005), dengan grup PEG-PCCL/PTX menunjukkan volume terkecil (p = 0,0138). Analisis kelangsungan hidup mengungkapkan bahwa tikus yang menerima PEG-PCCL/PTX hidup lebih lama dan menunjukkan tingkat kelangsungan hidup yang lebih tinggi dibandingkan keduanya PTX bebas dan kontrol salin (Gambar 10c).

Pembahasan

Data yang disajikan menunjukkan bahwa nanobola PEG-PCCL adalah platform yang aman dan efisien untuk mengirimkan obat anticancer hidrofobik. Muatan permukaan negatif dan ukuran di bawah 100 nm memberikan stabilitas dalam sirkulasi dan interaksi yang dikurangi dengan sistem retikuloendotelial, sementara inti PCL yang dikarboksi memastikan enkapsulasi obat yang kuat tanpa mengorbankan biokompatibilitas. Uji in vitro mengonfirmasi sitotoksisitas minimal dan aktivitas hemolitik yang tidak signifikan, memosisikan PEG-PCCL di atas polimer kationik seperti PEI, yang terkenal akan iritasi endotel dan toksisitas sistemik.

In vivo, profil farmakokinetika yang diperpanjang PEG-PCCL/PTX diterjemahkan menjadi kontrol tumor yang lebih baik dalam model H22: pembentukan asites secara signifikan ditekan dan kelangsungan keseluruhan ditingkatkan dibandingkan PTX bebas. Temuan ini konsisten dengan efek EPR dan paparan sistemik yang diperpanjang yang dicapai oleh nanokarrier. Meskipun efisiensi enkapsulasi sekitar 56 % memuaskan, pekerjaan masa depan dapat mengoptimalkan rasio PEG:PCL atau memperkenalkan ligan target (misalnya folat) untuk meningkatkan penyerapan tumor dan mengurangi rilis off-target.

Penting, panel toksisitas komprehensif—yang terdiri dari hemolisis, flebitis, histologi organ, dan kimia serum—menunjukkan tidak ada efek samping yang relevan secara klinis, yang menekankan kesesuaian PEG-PCCL untuk translasi klinis. Studi masa depan sebaiknya mengeksplorasi distribusi bio, keamanan jangka panjang, dan strategi kombinatorial (misalnya, bimbingan magnetik atau pengiriman gabungan imunoterapi) untuk sepenuhnya memanfaatkan potensi terapeutik platform ini.

Kesimpulan

Nanobola PEG-PCCL menunjukkan profil keamanan yang menguntungkan, dengan sitotoksisitas, hemolisis, dan toksisitas organ yang tidak signifikan, sambil memungkinkan rilis berkelanjutan dan aktivitas anti-tumor paklitaksel yang ditingkatkan dalam model tikus hepatokarsinoma. Hasil ini memosisikan PEG-PCCL sebagai pembawa yang kompatibel secara bio yang menjanjikan untuk agen anticancer hidrofobik.