Serapan Terbentuk Bentuk Nanostruktur Emas dalam Sel Glioblastoma: Dari Sintesis hingga Interaksi Seluler

Abstrak

Nanostruktur emas (Au NS) dengan ukuran dan bentuk yang terkontrol muncul sebagai alat serbaguna untuk nanomedisin. Namun, nasib seluler dari berbagai geometri masih tidak dipahami dengan baik, terutama dalam kanker agresif seperti glioblastoma. Di sini kami sintesis lima Au NS berbeda—nanorods (NRs), tetrahexahedra (THH), bipyramids (BPs), partikel sferik (SPs), dan bentuk baru yang disebut nano-makura (NM)—dengan pertumbuhan berbasis benih dengan surfaktan biner dan rute Turkevich yang dimodifikasi. Semua partikel difungsionalkan permukaannya dengan PEG-SH dan asam 11-merkapto-undesanoat (MUA) untuk memberikan muatan negatif dan stabilitas sterik. Uji sitotoksisitas (LIVE/DEAD) pada sel glioblastoma U-87 MG mengungkapkan efek yang bergantung pada bentuk: NM menunjukkan kematian sel tertinggi (~20 % pada 2 mg mL⁻¹) sementara SPs dan BPs sebagian besar tidak toksik. Mikroskopi transmisi elektron menunjukkan bahwa NM masuk ke sel melalui endositosi yang diinduksi reseptor dalam 2 jam dan kemudian memicu makropinositosis, yang mengarah pada akuumulasi vesikuler dan akhirnya lepasnya sel dari substrat. Temuan ini menunjukkan bahwa morfologi partikel, bukan ukuran saja, mengatur jalur pengambilan seluler dan hasil sitotoksis, memosisikan NM sebagai kandidat yang menjanjikan untuk terapi fototermal target dan pengiriman obat dalam glioblastoma.

Latar Belakang

Nanostruktur emas dihargai karena properti optik dan elektronik yang bergantung pada bentuk dan ukuran, memungkinkan aplikasi dari biosensor hingga terapi fototermal. Resonansi plasmon permukaan terlokalisasi (LSPR) dalam wilayah tampak-dekat inframerah (NIR) membuat partikel anisotropik, terutama nanorods dengan aspek rasio tinggi, menjadi agen kontras yang unggul untuk tomografi komputasi dan imaging fotoakustik. Nanostruktur yang lebih kecil menunjukkan penyerapan yang lebih baik, meningkatkan efisiensi fototermal. Selain itu, bentuk anisotropik dapat merakit diri menjadi superstruktur yang menghasilkan medan elektromagnetik intens, menguntungkan untuk pemantulan Raman yang ditingkatkan permukaan dan pengiriman obat yang target.

Pertumbuhan berbasis benih, sering dikompleksikan dengan ion perak dan campuran surfaktan (misalnya CTAB dengan asam oleat atau DDAB), telah menjadi metode pilihan untuk menyesuaikan Au NS, karena memungkinkan kontrol yang tepat atas aspek rasio dan pertumbuhan faset. Meskipun kemajuan dalam sintesis, studi sistematis tentang bagaimana berbagai geometri berinteraksi dengan sel—terutama glioblastoma, tumor otak yang sangat proliferatif dan invasif—terbatas. Memahami interaksi ini sangat penting untuk merancang nanomedisin yang secara selektif menargetkan sel kanker sambil meminimalkan efek off-target.

Glioblastoma multiforme (GBM) tetap menjadi tumor otak primer yang paling mematikan, dengan rata-rata过leben kurang dari 15 bulan meski terapi agresif. Sel glioblastoma-astrositoma U-87 MG proliferasi cepat (waktu ganda ~32 jam) dan dengan mudah internalisasi partikel asing, menjadikannya ideal untuk studi penyerapan. Di sini, kami menyajikan perbandingan komprehensif dari lima bentuk Au NS, fokus pada sintesis, difungsionalisasi permukaan, sitotoksisitas, dan mekanisme pengambilan dalam sel U-87 MG.

Eksperimen

Bahan

Semua reagen (asam oleat, nitrat perak, CTAB, HAuCl₄·3H₂O, asam askorbat, NaBH₄, PEG-SH, MUA, dll.) dibeli dari Sigma-Aldrich atau Merck dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Larutan disiapkan dengan air ultrapure (18,2 MΩ cm).

Sintesis Au NS Anisotropik

Benih partikel (~5 nm) disiapkan dengan mengurangi HAuCl₄ dengan NaBH₄ dalam CTAB. Untuk nanorods, tetrahexahedra, dan bipyramids, larutan pertumbuhan yang berisi CTAB, surfaktan pendamping (asam oleat atau DDAB), AgNO₃, dan asam askorbat dipanaskan hingga 80 °C. Setelah pendingin, larutan benih dan HAuCl₄ ditambahkan, dan larutan diaduk pada 35 °C selama 24 jam. Menyesuaikan rasio asam oleat/CTAB menghasilkan morfologi yang diinginkan: rasio rendah menghasilkan nanorods dog-bone, rasio lebih tinggi menghasilkan tetrahexahedra yang panjang, dan kombinasi CTAB/DDAB menghasilkan bipyramids. Untuk bentuk nano-makura yang baru, pertumbuhan dua tahap digunakan: reaksi berbasis benih awal diikuti oleh tahap pertumbuhan kedua menggunakan larutan menengah, menghasilkan partikel tiga dimensi yang tidak teratur yang mirip dengan bantal (bantal = makura dalam bahasa Jepang).

Sintesis Au NS Sferik

SPs dibuat oleh metode Turkevich yang dimodifikasi: larutan sitrat natrium 10 mM (10 mL) dipanaskan hingga 70 °C, diikuti oleh penambahan titik-titik HAuCl₄ 1,5 mM (10 mL). Larutan berubah menjadi ungu-merah setelah ~8 menit dan didinginkan ke suhu ruang sebelum sentrifugasi (14.500 rpm, 10 menit).

Difungsionalisasi Permukaan

Partikel pertama diinkubasi dengan PEG-SH (1 mg mL⁻¹) selama 2 jam untuk menggantikan CTAB dan memberikan stabilitas sterik. Setelah sentrifugasi, NS yang di-PEGylate diperlakukan dengan MUA (250 µL 10 mM dalam EtOH/H₂O) selama 1 jam pada 55 °C, mencapai pengeliminasi CTAB yang lengkap dan memberikan muatan permukaan negatif. Ukuran dan potensi zeta dipantau oleh DLS; XPS mengonfirmasi pengeliminasi brom dari permukaan.

Kultur Sel dan Uji Keberadaan

Sel U-87 MG dipertahankan dalam EMEM yang dilengkapi dengan 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, 1 % NEAA, 1 mM natrium pyruvate, dan 1,25 % gentamisin. Untuk sitotoksisitas, sel pada 70 % konfluensi diinkubasi dengan Au NS pada 100, 200, 500 µg mL⁻¹, dan 2 mg mL⁻¹ selama 24 jam. Kematian sel dikuantifikasi oleh uji LIVE/DEAD (calcein AM dan etidium homodimer-1) dan pewarnaan inti Hoechst, diimaging pada mikroskop Zeiss Axiovert 200 M. Tiga lubang independen per konsentrasi dianalisis.

Studi Pengambilan Bergantung Waktu (NM)

Sel diekspos pada 2 mg mL⁻¹ NM selama 2, 6, 12, dan 24 jam. Setelah inkubasi, sel dikonstapkan dengan 2 % paraformaldehida dan 2,5 % gluteraldehida, post-konstapkan dengan tetrokida osmium (± kalium ferosianida), dihidrasi, dan ditanam untuk bagian TEM ultratipis (70 nm). Gambar TEM digunakan untuk melacak lokasi dan morfologi NM dalam kompartemen seluler.

Karakterisasi

STEM lapangan terang dan HRTEM (JEOL 2100, 200 kV) menilai morfologi dan kristalinitas. Spektra UV-Vis (200–800 nm) direkam pada Shimadzu UV-2401PC. Dispersi cahaya dinamis dan potensi zeta diukur pada Malvern Zetasizer Nano-ZS. XPS dilakukan dengan spektrometer Kratos Axis Ultra DLD (Al Kα, 1486,6 eV).

Hasil dan Pembahasan

Sintesis dan Karakterisasi Au NS Anisotropik

Pertumbuhan berbasis benih dengan surfaktan biner menghasilkan nanorods (~20 nm × 50 nm) dengan hasil tinggi, tetrahexahedra (~50 nm panjang tepi), dan bipyramids (~200 nm). Partikel nano-makura menampilkan morfologi tiga dimensi yang tidak teratur dan unik, dikonfirmasi oleh TEM pada berbagai orientasi. HRTEM mengungkapkan inti kristal tunggal dengan faset halus untuk NRs, sementara NM menunjukkan permukaan yang bergerigi dan pita LSPR yang lebih lebar, yang mencerminkan polidispersitas. Spektra UV-Vis menunjukkan puncak plasmon longitudinal dan transversal yang berbeda: NRs (516, 679, 796 nm), THH (≈568 nm), BPs (≈593 nm), NM (≈557 dan 760 nm). SPs menunjukkan satu puncak pada 520 nm.

Hasil Difungsionalisasi Permukaan

Pengukuran DLS menunjukkan peningkatan ukuran bertahap setelah lapisan PEG-SH dan MUA, kecuali untuk BPs di mana penurunan kecil terlihat karena kemasan yang lebih erat. Potensi zeta bergeser dari positif (terlapisi CTAB) menjadi negatif (terlapisi MUA), mengonfirmasi pertukaran ligan yang berhasil. Spektra XPS menunjukkan brom yang tidak signifikan, yang menunjukkan pengeliminasi CTAB yang hampir lengkap. Spektra optik tetap sebagian besar tidak berubah, dengan hanya perlebaran puncak kecil untuk bentuk anisotropik, yang dapat disebabkan oleh pembesaran ukuran dan kekasaran permukaan.

Sitotoksisitas yang Bergantung pada Bentuk

Uji LIVE/DEAD mengungkapkan bahwa NM menyebabkan kematian sel tertinggi (~20 % pada 2 mg mL⁻¹), sedangkan SPs dan BPs <5 % sitotoksik di seluruh konsentrasi. NRs, meski memiliki aspek rasio tinggi dan muatan permukaan positif, tidak meningkatkan kematian sel relatif terhadap bentuk lain, yang menunjukkan bahwa pengukuran muatan permukaan oleh potensi zeta mungkin tidak secara akurat mencerminkan muatan lokal yang sebenarnya pada partikel anisotropik. Secara keseluruhan, ukuran memainkan peran kecil; baik SPs 15 nm maupun BPs 650 nm menunjukkan penyerapan dan toksisitas yang serupa.

Mekanisme Pengambilan Nano-makura

Studi TEM bergantung waktu menunjukkan NM mengasosiasikan dengan membran plasma setelah 2 jam, diikuti oleh internalisasi melalui endositosi yang diinduksi reseptor. Pada 12 jam, vesikel yang berisi NM menunjukkan pergantian ke makropinositosis, mungkin karena agregasi dan adsorpsi protein. NM secara preferensial berlokasi di tepi endosom, selaras dengan membran vesikel, dan menyalurkan ke wilayah perinukleus. Pada 24 jam, akuumulasi vesikel yang ekstensif berkaitan dengan perubahan morfologi: sel kehilangan filopodia, menjadi bulat, dan lepas dari substrat, yang menunjukkan gangguan sitoskeleton dan apoptosis.

Pembahasan

Hasil ini menyoroti pengaruh krusial morfologi partikel terhadap jalur pengambilan seluler. Sementara bentuk anisotropik dapat meningkatkan properti optik dan fototermal, geometri yang tidak teratur mereka mungkin juga meningkatkan formasi korona protein, yang mempromosikan makropinositosis dan sitotoksis. Partikel nano-makura, dengan struktur mirip bantal mereka, mencapai internalisasi yang efisien dan kematian sel yang signifikan, menjadikannya kandidat yang menarik untuk terapi glioblastoma. Studi masa depan sebaiknya mengeksplorasi distribusi biodi in vivo dan efikasi terapeutik, serta difungsionalisasi dengan ligan target untuk meningkatkan selektivitas.

Kesimpulan

Kami sintesis lima nanostruktur emas dengan bentuk dan ukuran yang berbeda, secara seragam difungsionalkan dengan PEG-SH dan MUA untuk menghasilkan partikel yang stabil dan bermuatan negatif. Bentuk, bukan ukuran saja, menentukan pengambilan dan sitotoksisitas selular dalam sel glioblastoma U-87 MG. Bentuk nano-makura yang baru menunjukkan internalisasi yang unggul, yang mengarah pada kematian sel yang signifikan melalui endositosi yang diinduksi reseptor dan makropinositosis berikutnya. Temuan ini memosisikan nano-makura sebagai platform yang menjanjikan untuk terapi fototermal gabungan dan pengiriman obat dalam tumor otak agresif.

Singkatan

AgNO₃:

Nitrat perak

Au:

Emas

BF:

Lapangan terang

BPs:

Bipyramids

CTAB:

Bromida setiltrimetilamoni

DDAB:

Bromida didesil-dimetilamoni

DLS:

Dispersi cahaya dinamis

EMEM:

Medium Esensial Minimal Eagle

EthD-1:

Etidium homodimer-1

GBM:

Glioblastoma multiforme

HAuCl₄:

Asem kloroaurik

HRTEM:

Mikroskop transmisi elektron resolusi tinggi

IR:

Inframerah

LSPR:

Resonansi plasmon permukaan terlokalisasi

MUA:

Asam 11-merkapto-undesanoat

Na-citrate:

Sitrat natrium dihidrat

NM:

nano-makura

NRs:

Nanorods

Ns:

Nanostruktur

OA:

Asam oleat

PEG-SH:

O-[2-(3-merkapto propionilamino) etil]-O-etil polietilena glikol

STEM:

Mikroskop transmisi elektron pemindaian

TEM:

Mikroskop transmisi elektron

THH:

Tetrahexahedra

UV-Vis:

Spektroskopi ultraviolet-tampak

XPS:

Spektroskopi fotoelektron sinar X