Liophilized Hybrid Nanostructured Lipid Carriers untuk Meningkatkan Serapan Seluler Verapamil:Optimalisasi Statistik dan Evaluasi In Vitro
Abstrak
Verapamil adalah penghambat saluran kalsium dan sangat efektif dalam pengobatan hipertensi, angina pektoris, dan penyakit lainnya. Namun, obat tersebut memiliki bioavailabilitas rendah 20 hingga 35% karena efek lintas pertama. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan pembawa lipid berstruktur nano verapamil-dekstran hibrida (HVD-NLCs) dalam upaya untuk meningkatkan serapan seluler verapamil. Formulasi berhasil disiapkan dengan metode homogenisasi geser tinggi dan dioptimalkan secara statistik menggunakan 2
4
desain faktorial penuh. Formulasi HVD-NLCs dibekukan-kering menggunakan trehalosa sebagai krioprotektan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa formula optimasi (VER-9) memiliki ukuran partikel (PS), indeks polidispersitas (PDI), dan persentase efisiensi penjerapan (%EE) sebesar 192,29 ± 2,98, 0,553 ± 0,075, dan 93,26 ± 2,66%. , masing-masing. Penggabungan dekstran sulfat dalam formulasi telah memperpanjang pelepasan verapamil (~ 85% dalam 48 jam) dalam simulasi cairan lambung (pH 1,2) dan simulasi cairan usus (pH 6,8). Analisis kalorimetri pemindaian diferensial menunjukkan tidak ada interaksi kimia antara verapamil dan eksipien dalam formulasi. Sementara studi hamburan sinar-X sudut lebar menunjukkan obat dalam bentuk amorf setelah penggabungan dalam NLC. Gambar mikroskop elektron transmisi dan pemindaian mikroskop elektron mengungkapkan bahwa nanopartikel memiliki bentuk bulat. Studi serapan seluler menggunakan garis sel Caco-2 menunjukkan serapan verapamil yang lebih tinggi dari HVD-NLCs dibandingkan dengan larutan verapamil dan kompleks verapamil-dekstran. Formulasi yang dioptimalkan (VER-9) yang disimpan dalam kondisi berpendingin (5 °C ± 3 °C) stabil selama 6 bulan. Kesimpulannya, HVD-NLC adalah pembawa potensial untuk verapamil karena mereka secara signifikan meningkatkan serapan seluler obat.
Latar Belakang
Verapamil adalah agen penghambat saluran kalsium tipe-L dari kelas fenilalkilamin dan antagonis reseptor -adrenergik. Ini banyak digunakan untuk pengobatan hipertensi, takiaritmia supraventrikular, angina pektoris, dan sakit kepala cluster. Menurut sistem klasifikasi biofarmasi, verapamil diklasifikasikan sebagai obat kelas I. Obat-obatan di bawah kelas ini diketahui memiliki penyerapan yang baik melalui membran usus (≤ 90%) setelah pemberian oral. Namun, hanya 20 hingga 35% dari dosis oral verapamil yang dialirkan ke sirkulasi darah karena metabolisme lintas pertama yang cepat melalui sirkulasi portal [1]. Oleh karena itu, penting untuk mengembangkan pembawa yang sesuai yang dapat meningkatkan serapan seluler verapamil dan mungkin meningkatkan bioavailabilitasnya.
Generasi kedua, formulasi nano berbasis lipid seperti pembawa lipid berstruktur nano (NLCs) menunjukkan potensi besar untuk digunakan dalam pengiriman agen terapeutik [2, 3]. NLC memiliki stabilitas kimia dan fisik yang lebih tinggi dibandingkan dengan nanopartikel lipid padat (SLN), dan juga memiliki sifat pelepasan yang terkontrol. Selain itu, NLC menunjukkan kapasitas pemuatan yang tinggi untuk molekul obat dengan membentuk kisi kristal yang lebih sedikit dari matriks lipid, yang dapat meminimalkan pengusiran obat selama penyimpanan. NLC dibuat dari lipid, yang mempercepat pembentukan kilomikron di dalam usus dan memfasilitasi penyerapan NLC yang dapat meningkatkan bioavailabilitas obat [4]. Oleh karena itu, penelitian ini mengembangkan hybrid verapamil-dextran nanostructured lipid carriers (HVD-NLCs) untuk meningkatkan serapan seluler obat yang dapat meningkatkan bioavailabilitasnya.
Sebagian besar obat lipofilik dapat dengan mudah dimasukkan ke dalam NLC, tetapi cukup sulit untuk menjebak obat hidrofilik seperti verapamil dalam formulasi nano berbasis lipid. Jadi, dalam penelitian ini, NLC hibrida menggunakan natrium dekstran sulfat counterion disiapkan untuk meningkatkan enkapsulasi verapamil dan memperpanjang pelepasannya dari NLC (Gbr. 1). Formulasi HVD-NLC dibuat dengan metode homogenisasi panas dan geser tinggi dan dioptimalkan secara statistik menggunakan 2
4
desain faktorial penuh. Dua jenis lipid digunakan dalam penelitian ini, lipid padat, Compritol 888 ATO® dan asam oleat lipid cair. HVD-NLC yang disiapkan dikarakterisasi untuk ukuran partikel (PS), potensi zeta (ZP), indeks polidispersitas (PDI), dan persentase efisiensi penjebakan obat (% EE). HVD-NLC yang dioptimalkan diliofilisasi menggunakan trehalosa sebagai krioprotektan. Profil pelepasan in vitro dilakukan di lingkungan basa dan asam. Studi serapan seluler in vitro verapamil dari HVD-NLC yang dipilih dilakukan menggunakan garis sel Caco-2. Studi stabilitas formulasi yang dioptimalkan dilakukan selama 6 bulan pada tiga kondisi berbeda (5 °C ± 3 °C, 25 °C ± 2 °C/60% RH ± 5% RH, dan 40 °C ± 2 °C/ 75% RH ± 5% RH).
Pembentukan kompleks elektrostatik obat kationik yang larut dalam air verapamil hidroklorida dan polimer kontra dekstran sulfat natrium
Metode
Materi
Verapamil HCl dibeli dari pabrik farmasi Wenzhou (Wenzhou, Cina). Compritol 888 ATO® (Gliserol dibehenat EP–Gliseril behenat NF) diperoleh dari Gattefosse (Saint-Priest, Prancis). Asam oleat diperoleh dari bahan kimia R &M (Essex, UK). Tween 80® (Polysorbate 80) dibeli dari Euro chemo-pharma Sdn. Bhd. (Penang, Malaysia). Poloxamer 188 (Pluronic® F-68) diperoleh dari Molekula (Dorset, Inggris). Trehalose, Sephadex® G-25, dan serum janin sapi (FBS) diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Garis sel Caco-2 diperoleh dari ATCC (Virginia, USA). Larutan penisilin-Streptomisin 100 X diperoleh dari Biowest (Nuaillé, Prancis). Trypsin 0,25% dan medium Eagles yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) diperoleh dari ilmu kehidupan perawatan kesehatan GE, laboratorium Hyclone (Utah, AS). Penyangga Lisis Pasif, 5X dibeli dari Promega (Wisconsin, USA).
Metode
Persiapan HVD-NLC
HVD-NLC dibuat dengan metode homogenisasi geser tinggi panas. Fasa lipid terdiri dari Compritol ATO 888® dan asam oleat dilebur dengan pemanasan pada suhu 85 °C (10 °C di atas titik leleh lipid padat). Jumlah verapamil yang diperlukan ditimbang dan dilarutkan dalam fase air yang mengandung campuran Tween 80® dan poloxamer 188 dengan perbandingan 1:1 w /dengan . Fase air dipanaskan sampai suhu yang sama dengan fase lipid. Fase berair dituangkan ke dalam fase lipid dan dihomogenkan menggunakan homogenizer digital T25 Ultra-Turrax®, IKA® (Staufen, Jerman) pada 24.000 rpm, 85 °C. Selanjutnya, larutan berair dekstran sulfat (perbandingan 1:1 terhadap verapamil) ditambahkan secara perlahan ke dalam campuran selama proses homogenisasi. HVD-NLC yang telah disiapkan dibiarkan dingin pada suhu kamar (25 ± 2 °C).
Optimasi Statistik Parameter Formulasi Menggunakan 2
4
Desain Faktorial Penuh dan Pendekatan Fungsi Desirability
Sebuah desain faktorial penuh dengan dua tingkat dan empat variabel dilakukan untuk mengoptimalkan dan mengevaluasi pengaruh formulasi variabel independen (faktor) pada karakteristik (variabel dependen atau tanggapan) (Tabel 1). Tingkat tinggi dan rendah sebenarnya untuk setiap variabel independen dipilih berdasarkan studi pendahuluan.
Respon eksperimental yang diperoleh dari variabel dependen adalah hasil individu dan efek gabungan dari empat variabel independen. Desain eksperimental dua tingkat ini menyediakan data yang cukup untuk memenuhi persamaan polinomial berikut.
Dimana X merupakan variabel terikat; 0 adalah intersep; 1 , 2 , 3 , dan 4 adalah koefisien dari variabel independen A , B , C , dan D masing-masing. Sementara 12 , 13 , 14 , 23 , 24 , dan 34 adalah interaksi masing-masing (yaitu, AB, AC, AD, BC, BD, dan CD). Hasil eksperimen dianalisis dengan perangkat lunak Design-Expert® versi 6.0.10 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA) diikuti dengan analisis varians (ANOVA) untuk menentukan signifikansi faktor dan interaksinya. Analisis statistik dianggap signifikan ketika p nilainya adalah < 0,05.
Formulasi akhir dipilih berdasarkan pendekatan fungsi keinginan. Fungsi keinginan menggabungkan semua tanggapan menjadi satu variabel untuk memprediksi tingkat optimal dari faktor yang dipelajari. Oleh karena itu, keinginan ditentukan untuk memilih formulasi yang dioptimalkan dengan ukuran partikel (PS) dan indeks polidispersitas (PDI) terendah dan nilai potensial zeta (ZP) dan persen efisiensi jebakan (%EE) tertinggi. Fungsi keinginan mengubah semua respons menjadi skala umum (0, 1) dan menggabungkannya dengan rata-rata geometrik untuk optimalisasi metrik keseluruhan. Nilai keinginan 1 menunjukkan nilai yang dapat diterima (nilai yang paling diinginkan) untuk tanggapan, sedangkan nilai keinginan 0 menunjukkan nilai yang tidak dapat diterima.
Pengukuran Ukuran Partikel, Indeks Polidispersitas, dan Potensi Zeta
PS dan PDI dari nanopartikel yang disiapkan diukur menggunakan spektrometer korelasi foton (Zetasizer 1000HS/3000HS, Malvern Instrument, Malvern, UK). ZP ditentukan menggunakan penganalisis potensi zeta (seri nano Zetasizer, lencana Nano Z-merah, Instrumen Malvern, Malvern, Inggris). Semua sampel diencerkan menggunakan air suling yang disaring (filter Nylon 0,45 μm) dan pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga.
Penentuan Persentase Efisiensi Jebakan
Sampel yang disiapkan yang mengandung kompleks verapamil-dekstran bebas dan HVD-NLC dipisahkan dengan metode sentrifugasi kolom mini menggunakan Sephadex® G25. Sampel sebanyak 1 mL ditempatkan di bagian atas kolom, kemudian disentrifugasi selama 2 menit pada 2000 rpm. Eluen yang mengandung HVD-NLC dikumpulkan dan diliofilisasi menggunakan pengering beku (Labconco, Free Zone Freeze Dry Systems, Kansas City, USA).
HVD-NLC yang diliofilisasi (10 mg) dilarutkan dalam kloroform dan diuapkan di bawah gas nitrogen pada 40 °C. Sampel kering kemudian dilarutkan dalam 1 mL air suling, divorteks selama 2 menit, dan disentrifugasi (Eppendorf, Jerman) pada 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dikumpulkan dan jumlah verapamil ditentukan dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang divalidasi. %EE dihitung menggunakan persamaan berikut:
Analisis HPLC untuk kuantifikasi verapamil dilakukan menggunakan sistem kromatografi Shimadzu yang dilengkapi dengan pompa pengiriman LC 20AD (Kyoto, Jepang) dan kolom Phenomenex C18 (250 × 4.6 mm). Fase gerak terdiri dari 20 mM amonium asetat dan asetonitril dengan perbandingan 40:60 (v /v ). PH fase gerak diatur ke pH 6,5 dengan asam asetat glasial. Volume injeksi adalah 20 μL dan panjang gelombang deteksi untuk verapamil ditetapkan pada 278 nm dan laju aliran ditetapkan pada 1,5 mL/menit.
Studi Liofilisasi
Liofilisasi dilakukan pada 40 °C selama 24 jam menggunakan Labconco, FreeZone Freeze Dry Systems (Kansas City, USA). Lima jenis gula yang umum digunakan, termasuk manitol, fruktosa, sukrosa, laktosa, dan trehalosa pada rasio lipid:krioprotektan 1:1 disaring, untuk memilih krioprotektan yang cocok untuk pengeringan beku HVD-NLC. Krioprotektan yang menghasilkan rata-rata PS dan PDI terendah dari formulasi terliofilisasi setelah rekonstitusi dalam air suling dipilih untuk studi lebih lanjut.
Pada penelitian selanjutnya, formulasi HVD-NLCs dicampur dengan krioprotektan terpilih dengan menggunakan dua metode. Pada metode pertama, krioprotektan ditambahkan setelah persiapan formulasi HVD-NLCs, dan dinamakan sebagai “setelah proses homogenisasi.” Sedangkan pada metode kedua, krioprotektan ditambahkan pada saat pembuatan formulasi HVD-NLCs, dan diberi nama “selama proses homogenisasi”. Pada metode pertama, beberapa lipid dan rasio krioprotektan 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, dan 1:8 disiapkan dan diliofilisasi. Formulasi HVD-NLC yang diliofilisasi didispersikan kembali dalam air suling yang disaring (filter Nylon 0,45 m), dan sampel dievaluasi untuk PS rata-rata, PDI, dan %EE. Rasio lipid:krioprotektan yang menghasilkan PS dan PDI terendah dan %EE tertinggi dipilih untuk studi lebih lanjut dalam metode pencampuran kedua.
Studi Rilis In Vitro
Studi pelepasan verapamil secara in vitro dari NLC dilakukan dengan menggunakan kantong dialisis yang ditempatkan dalam media simulasi cairan usus (pH 6,8) atau cairan lambung simulasi (pH 1,2). Dalam penelitian ini, 2 mL dispersi HVD-NLCs diisikan ke dalam kantong dialisis (cutoff 12.000 Da MW). Kantong ditutup rapat dan kemudian direndam dalam 150 mL media pelepas yang telah dipanaskan sebelumnya. Studi pelepasan dilakukan pada pengaduk magnet pelat panas yang diatur pada kecepatan pengadukan 100 rpm dan suhu 37 °C. Pada interval waktu yang dijadwalkan 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, dan 72 jam, 1 mL sampel diambil dan diganti dengan volume media segar yang sama. Konsentrasi verapamil yang dilepaskan ditentukan oleh HPLC.
Kalorimetri Pemindaian Diferensial
Analisis kalorimetri pemindaian diferensial (DSC) dilakukan dengan menggunakan Perkin-Elmer Pyris 6 DSC (Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK). Sampel ditimbang (5–7 mg) ke dalam panci aluminium dan disegel menggunakan sampel pan crimper press standar (Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK). Kurva DSC direkam pada kecepatan 10 °C/menit dari 0 hingga 260 °C.
Hamburan Sinar-X Sudut Lebar
Analisis hamburan sinar-X sudut lebar (WAXS) /2θ dilakukan pada suhu kamar menggunakan PANalytical X'Pert PRO MRD PW3040 (Almelo, Belanda) yang menerapkan radiasi Cu Kα. Sampel dijalankan pada kisaran suhu 2–60 °C dengan kecepatan pemindaian 5 °C/menit.
Mikroskop Transmisi Elektron dan Mikroskop Elektron Pemindai
Morfologi (yaitu, bentuk dan ukuran) HVD-NLC diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) menggunakan (Philips CM12, Eindhoven, Belanda). Setetes dispersi HVD-NLCs encer ditempatkan pada grid tembaga 400 mesh diikuti dengan pewarnaan negatif dengan asam fosfotungstat 2%. Sampel yang telah disiapkan dikeringkan dengan udara sebelum pemeriksaan TEM.
Morfologi HVD-NLC yang diliofilisasi diamati menggunakan mikroskop elektron pemindaian (SEM) (Leo Supra 50 VP bidang Emisi SEM, Oberkochen, Jerman). Sampel HVD-NLC yang diliofilisasi difiksasi pada rintisan aluminium kemudian dilapisi dengan emas (ketebalan 10 nm) dalam perangkat sputtering pada 15 mA selama 15 mnt. Sampel divisualisasikan menggunakan sistem mikroanalisis x-ray dispersif energi Oxford INCA dengan tegangan percepatan 10 kV.
Serapan Seluler HVD-NLC
Studi serapan seluler in vitro verapamil dari formulasi HVD-NLC diselidiki menggunakan garis sel Caco-2. Sel-sel dikultur dalam media pertumbuhan DMEM yang dilengkapi dengan larutan penisilin-streptomisin 1% dan FBS 10% dalam labu kultur jaringan T-25. Kemudian, sel-sel Caco-2 dikumpulkan dan diunggulkan dalam pelat 48-sumur, pada kepadatan sel 60.000 per sumur dengan media lengkap DMEM sampai sel-sel menjadi konfluen dan membentuk monolayer di bagian bawah pelat sumur. Beberapa larutan yang mengandung konsentrasi verapamil yang sama dibuat dengan mengencerkan HVD-NLCs, larutan verapamil, dan kompleks verapamil-dekstran dengan media DMEM saja. Larutan verapamil dan kompleks verapamil-dekstran digunakan sebagai kontrol. Selanjutnya, media lengkap DMEM dari monolayer sel Caco-2 dalam pelat 48-sumur ditukar dengan pengenceran yang berbeda dari HVD-NLC, larutan verapamil, dan kompleks verapamil-dekstran dan diinkubasi pada 37 ° C selama 6 jam. Setelah menyelesaikan masa inkubasi, sampel HVD-NLC, larutan verapamil, dan kompleks verapamil-dekstran dikeluarkan dari sumur. Residu sampel uji dan sel-sel mati dihilangkan dari lapisan tunggal dengan mencuci tiga kali dengan fosfat-buffered saline (PBS). Sel-sel monolayer dilisiskan dengan menambahkan buffer lisis pasif (200 L) ke setiap sumur sampel. Sampel dipipet keluar dan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit untuk mengekstrak verapamil dari sel. Supernatan dikumpulkan dan konsentrasi verapamil diukur menggunakan HPLC.
Studi Stabilitas Jangka Pendek
Studi stabilitas jangka pendek dari formulasi HVD-NLCs yang dioptimalkan dilakukan sesuai dengan pedoman dewan internasional untuk harmonisasi persyaratan teknis untuk farmasi untuk manusia (ICH) Q1A (R2). Formulasi HVD-NLC yang baru disiapkan (VER-9) ditempatkan pada tiga kondisi berbeda (5 ± 3 °C, 25 ± 2 °C/60 ± 5% kelembaban relatif (RH), dan 40 ± 2 °C/75 ± 5%RH) selama 6 bulan. Stabilitas formulasi HVD-NLC yang dioptimalkan diperiksa dengan mengukur PS, PDI, ZP, dan kandungan obat total pada 0, 1, 3, dan 6 bulan.
Analisis Statistik
Hasil dianalisis menggunakan one-way analysis of variance (ANOVA) dan dilanjutkan dengan post-hoc Tukey-HSD. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak IBM® SPSS® Statistical (Versi 22, NY, USA). Semua nilai dinyatakan sebagai mean dan standar deviasi (mean ± SD). Perbedaannya signifikan secara statistik ketika p < 0,05.
Hasil dan Diskusi
Analisis Menggunakan 2
4
Desain Faktorial Penuh
Nilai variabel bebas terpilih yaitu waktu homogenisasi (A), konsentrasi lipid padat (B), konsentrasi lipid cair (C), dan konsentrasi surfaktan (D) dan diperoleh hasil respon terpilih yaitu PS, PDI , ZP, dan %EE ditunjukkan pada Tabel 2. Setiap variabel independen dan interaksinya dievaluasi secara statistik menggunakan ANOVA. Koefisien polinomial untuk setiap variabel dependen dihasilkan oleh perangkat lunak Design-Expert® untuk mengukur efek dari setiap variabel independen, seperti yang ditunjukkan pada Persamaan. 3, 4, 5, dan 6. Persamaan hanya mewakili faktor signifikan dan interaksinya.
dimana A adalah waktu homogenisasi (min), B adalah konsentrasi lipid padat (mg), C adalah konsentrasi lipid cair (mg), dan D adalah konsentrasi surfaktan (mg). Tanda positif dan negatif sebelum setiap faktor atau faktor interaksi dalam persamaan masing-masing mewakili efek sinergis atau antagonis. Plot permukaan respons dibuat untuk mengamati efek bersamaan dari setiap faktor atau interaksi faktor pada parameter respons.
Pengaruh Variabel terhadap Ukuran Partikel Rata-rata
Seperti yang ditunjukkan pada Persamaan. 3, faktor A , C , dan D memiliki efek antagonis pada ukuran partikel (PS). Dapat disimpulkan bahwa peningkatan waktu homogenisasi (faktor A ) secara bersamaan dikaitkan dengan penurunan signifikan pada PS NLC (p < 0,05). Hal ini mungkin disebabkan oleh gaya geser homogenisasi yang tinggi yang secara efisien memecah butiran lipid menjadi partikel yang lebih kecil. Demikian pula, meningkatkan konsentrasi lipid cair (C ) ditemukan secara bersamaan menurunkan PS NLC. Hal ini mungkin disebabkan kemampuan asam oleat untuk menurunkan viskositas sistem serta tegangan permukaan bila dikombinasikan dengan Compritol 888 ATO®, sehingga menghasilkan ukuran partikel NLC yang lebih kecil. Kemampuan lipid cair untuk menurunkan viskositas sistem ketika dikombinasikan dengan lipid padat juga dilaporkan oleh Jenning et al. ketika mereka menyiapkan dispersi SLN [5]. Penulis mengamati bahwa peningkatan konsentrasi lipid cair dari 0 hingga 38% dalam komposisi matriks lipid akan mengurangi ukuran partikel. Selanjutnya, meningkatkan konsentrasi surfaktan (D ) akan menurunkan PS, karena jumlah surfaktan yang lebih tinggi dalam sistem akan dengan mudah mengemulsi kandungan lipid total dalam formulasi, sehingga membentuk nanopartikel yang lebih kecil.
Gambar 2 menunjukkan signifikan (p < 0,05) efek interaksi faktor (AC, BD, dan CD) pada PS dari NLC. Pengaruh positif faktor (BD), dan pengaruh negatif faktor (interaksi AC dan CD) menunjukkan pengaruh yang signifikan terhadap ukuran partikel NLC. Pengaruh negatif faktor (AC) menunjukkan bahwa pada waktu homogenisasi yang lebih lama dan konsentrasi lipid cair yang lebih tinggi menyebabkan penurunan PS. Interaksi antara konsentrasi yang lebih tinggi dari lipid padat dan surfaktan dalam formulasi NLC (interaksi BD) menunjukkan dampak positif yang signifikan pada ukuran partikel, yang menghasilkan ukuran partikel yang lebih besar. Sebaliknya, interaksi antara konsentrasi yang lebih tinggi dari lipid cair dan surfaktan (interaksi CD) menunjukkan dampak negatif yang signifikan pada ukuran partikel di mana ukuran yang lebih kecil dihasilkan.
Plot permukaan respons yang menggambarkan signifikansi (p < 0.05) pengaruh waktu homogenisasi, konsentrasi lipid cair, konsentrasi surfaktan, dan interaksi antara a AC, b BD, dan c CD di PS HVD-NLC. A waktu homogenisasi, B lipid padat, C lipid cair, D surfaktan
Pengaruh Variabel pada PDI
Seperti yang diilustrasikan dalam Persamaan. 4, asam oleat terbukti memiliki dampak negatif pada PDI, yang berarti bahwa peningkatan konsentrasi asam oleat akan menurunkan nilai PDI dan menyebabkan distribusi partikel NLC yang lebih baik. Efek serupa asam oleat pada NLC juga diamati oleh beberapa penelitian [6]. Gambar 3 menggambarkan interaksi antara waktu homogenisasi dan konsentrasi lipid cair (interaksi AC). Interaksi ini menunjukkan pengaruh negatif yang signifikan terhadap PDI. Hal ini berarti bahwa waktu homogenisasi yang lebih lama dan konsentrasi lipid cair yang lebih tinggi akan menyebabkan penurunan nilai PDI. Selain itu, interaksi antara lipid cair dan konsentrasi surfaktan (interaksi CD) menunjukkan efek sinergis pada nilai PDI. Dengan demikian, secara bersamaan meningkatkan lipid cair dan konsentrasi surfaktan akan meningkatkan nilai PDI dan menghasilkan partikel HVD-NLC yang kurang homogen. Ini mungkin karena peningkatan lebih lanjut dalam konsentrasi surfaktan di luar nilai yang dioptimalkan dapat menyebabkan akumulasi surfaktan pada permukaan luar nanopartikel, yang pada gilirannya meningkatkan nilai PDI. Pola yang sama juga diamati oleh Shamma et al., dimana peningkatan konsentrasi surfaktan menyebabkan peningkatan nilai PDI NLCs [7].
Plot permukaan respons yang menggambarkan signifikan (p < 0.05) pengaruh konsentrasi lipid cair dan interaksi antara a AC dan b CD pada PDI dari HVD-NLCs. A waktu homogenisasi, C lipid cair, D surfaktan
Efek Variabel pada ZP
Formulasi HVD-NLC memiliki muatan negatif karena ionisasi gliseril behenat (asam lemak dalam Compritol 888 ATO®), asam oleat, dan residu dekstran sulfat. Berdasarkan Persamaan. 5, peningkatan jumlah asam oleat memiliki dampak negatif pada nanopartikel, dan mengakibatkan peningkatan muatan negatif nanopartikel, sehingga meningkatkan ZP HVD-NLCs. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh ionisasi berlebihan dari gugus karboksilat yang melimpah dalam asam oleat (lipid cair) [8]. Selain itu, gliseril behenat (lipid padat) juga menunjukkan efek negatif pada nilai ZP, di mana peningkatan konsentrasinya meningkatkan ZP nanopartikel. Ini karena ionisasi karboksilat yang lebih tinggi dalam gliseril behenat yang menyebabkan muatan negatif yang lebih tinggi di permukaan luar nanopartikel.
Interaksi BD memiliki efek positif yang signifikan pada ZP NLC, sedangkan interaksi CD menunjukkan efek negatif (Gbr. 4). Peningkatan konsentrasi lipid padat dan penurunan konsentrasi surfaktan mengurangi muatan negatif nanopartikel dan menurunkan nilai ZP. Kemungkinan, pada tahap ini, konsentrasi surfaktan yang lebih rendah tidak akan mampu mengionisasi jumlah total lipid padat, yang mengarah pada pengurangan muatan negatif pada permukaan nanopartikel, sehingga mengurangi ZP HVD-NLCs. Selanjutnya, secara bersamaan meningkatkan konsentrasi lipid cair dan surfaktan (interaksi CD) akan secara signifikan meningkatkan nilai ZP HVD-NLCs. Ini karena lebih banyak asam karboksilat akan terionisasi dengan adanya konsentrasi surfaktan yang lebih tinggi dalam formulasi.
Plot permukaan respons yang menggambarkan signifikan (p < 0.05) pengaruh konsentrasi lipid cair, konsentrasi surfaktan, dan interaksi antara a BD dan b CD pada ZP HVD-NLC. B lipid padat, C lipid cair, D surfaktan
Pengaruh Variabel pada %EE
Persamaan 6 menunjukkan bahwa peningkatan waktu homogenisasi akan signifikan (p < 0.05) menurunkan %EE obat. Waktu homogenisasi yang lebih lama dapat melucuti atau mengelupas molekul obat yang menempel pada permukaan luar nanopartikel, yang menghasilkan %EE obat yang lebih rendah di HVD-NLC. Sebaliknya, peningkatan konsentrasi surfaktan menghasilkan %EE obat yang lebih tinggi dalam HVD-NLCs. Hal ini dapat terjadi karena konsentrasi surfaktan yang lebih tinggi akan meningkatkan lapisan permukaan luar NLC, di mana sebagian obat akan terperangkap di dalamnya. Zhuang dkk. dan Das dkk. menyarankan bahwa konsentrasi surfaktan yang memadai sangat penting untuk pelarutan molekul obat di dalam kisi lipid dan di permukaan luar nanopartikel [9, 10].
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, interaksi AD memiliki pengaruh yang signifikan (p < 0,05) dampak negatif, dimana meningkatkan waktu homogenisasi dan penurunan jumlah surfaktan menurunkan %EE obat dalam HVD-NLCs. Sebaliknya, interaksi antara lipid padat dan konsentrasi surfaktan (interaksi BD) menunjukkan efek positif pada %EE obat. Oleh karena itu, peningkatan konsentrasi lipid padat dan surfaktan akan meningkatkan %EE obat dalam HVD-NLCs. Hal ini mungkin disebabkan oleh konsentrasi surfaktan yang lebih tinggi yang akan melarutkan kelebihan molekul obat, dan pada saat yang sama jumlah lipid padat yang lebih tinggi dalam sistem telah menampung kelebihan molekul obat, sehingga meningkatkan %EE obat dalam HVD- NLC.
Plot permukaan respons yang menggambarkan signifikan (p < 0.05) pengaruh waktu homogenisasi, konsentrasi lipid cair, konsentrasi surfaktan, dan interaksi antar a AD dan b BD pada EE dari verapamil di HVD-NLC. A waktu homogenisasi, B lipid padat, D surfaktan
Pemilihan HVD-NLC yang Dioptimalkan Menggunakan Fungsi Desirability
Formulasi HVD-NLC dengan kode no.VER-9, VER-11, VER-13, dan VER-15 memiliki nilai desirability yang lebih tinggi masing-masing sebesar 0.863, 0.852, 0.811, dan 0.840. Formulasi ini dipilih untuk studi lebih lanjut karena nilai keinginan lebih dekat ke 1. Fungsi keinginan individu dan gabungan dari semua tanggapan untuk formulasi yang dipilih digambarkan pada Gambar. 6. Rata-rata PS, PDI, ZP, dan %EE dari ini formulasi berada di kisaran 173.46 ± 0.757 sampai 190.3 ± 8.22, 0.451 ± 0.033 sampai 0.501 ± 0.019, − 46.73 ± 1.13 sampai − 49.16 ± 1.55, dan 93.95 ± 4.10 sampai 98.81 ± 1.01, masing-masing.
Bar graph displaying the individual and combined desirability of several responses on selected HVD-NLCs formulations. a VER-9, b VER-11, c VER-13, and d VER-15
Lyophilization Study
Lyophilization is one of the commonly used methods in the pharmaceutical field to change aqueous formulation into the dried form to prolong the physical and chemical stability of the nanoparticle during storage [11, 12]. However, the lyophilization step produces various stresses to the sample during the process. So, the need of cryoprotectant is essential to avoid the stress condition and protect the sample. Among the screened cryoprotectants, trehalose was found to be the most suitable one for protecting the HVD-NLCs formulations from aggregation after the lyophilization process. The HVD-NLCs formulations protected with trehalose had the smallest particle size and lowest PDI (Table 3). Trehalose offers many advantages over other cryoprotectants including less chemical interactions and exhibit higher glass transition temperature which may help to prolong the stability of nanoparticles. Furthermore, trehalose has been demonstrated as an efficient cryoprotectant for freeze drying of Compritol 888 ATO® (Glyceryl behenate) in the lipid-based nanoparticles [13, 14]. Thus, in the present study, trehalose was selected as cryoprotectant for the HVD-NLCs formulations.
In the next study, different ratios of trehalose were used in the HVD-NLCs formulations after or during the homogenization process. Table 4 shows the effects of different ratios of trehalose added into the formulations after homogenization on PS, PDI, and %EE.
The mean PS was found in the nano size range, while PDI was < 1 in all ratios of lipids to trehalose used in the study. However, the %EE of verapamil was decreased significantly with increasing the ratio of trehalose to lipids. The %EE of lipid:trehalose at the ratio of 1:1 was significantly higher than the lipid:trehalose ratio of> 1:1. Increasing the amount of trehalose beyond the lipid trehalose ratio of 1:1 enhanced the removal of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex. This is possibly due to the interaction between trehalose and dextran at the outer surface of nanoparticles, which promotes the displacement of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex and hence, lowers the %EE of drug in the HVD-NLCs. The interaction between trehalose and dextran takes place due to the formation of sugar-salt complex (trehalose-dextran complex), in that the trehalose (sugar) competes with cationic verapamil and forms complex with polyanionic dextran [15]. Miller et al. measured the viscosity and glass transition temperature of trehalose with boric acid and proposed the formation of chemical complex between trehalose and borate ion (B(OH)4
−
) [15]. Therefore, based on the obtained results, the lipid to trehalose ratios of 1:1 and 1:2 were selected for the next study of trehalose addition during homogenization. Table 5 shows that the results of PS, PDI, and %EE were significantly better when trehalose were added during homogenization. This could be due to better mixing of trehalose in the HVD-NLCs formulation by the homogenization process. It is evident from the data that there was no significant difference in the %EE of lipid:trehalose ratios of 1:1 and 1:2. Therefore, formulation VER-9 and VER-11 at lipid:trehalose ratio of 1:1 was selected for further studies.
In Vitro Release of HVD-NLCs
The release profile of verapamil solution from the selected HVD-NLCs formulations (VER-9 and VER-11) in SGF and SIF are shown in Fig. 7. The release profile of verapamil from the VER-9 and VER-11 formulations was significantly longer than verapamil solution in both SGF and SIF media. Verapamil was loaded as an ionic complex with dextran sulfate in the HVD-NLCs formulation. This could be the reason for the sustained release of verapamil from the HVD-NLCS. The formulations released about ~ 85% of verapamil after 48 h and the drug had a prolonged release profile up to 72 h. On the other hand, the verapamil solution released approximately 99% of verapamil within 4 h. The release profiles of the selected formulations VER-9 and VER-11 were found almost similar in SGF and SIF release media. However, the release of verapamil from VER-9 was found slightly better as compared to VER-11 in the SGF release medium. The percentage cumulative release of verapamil at 72 h from VER-9 (95.91 ± 1.40) was found significantly higher as compared to VER-11 (90.67 ± 1.16) in the SGF medium. Therefore, VER-9 was selected as a final formulation and proceeded for further investigations.
Cumulative percentage of verapamil released in a SIF (pH 6.8) and b SGF (pH 1.2) release media for 72 h
DSC Study
The DSC analysis of verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, physical mixture (including Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), lyophilized blank formulation (Placebo), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 8. Verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, and trehalose had the melting peak at 144.96 °C, 220.41 °C, 72.46 °C, 50.80 °C, and 100.13 °C, respectively. The thermograms showed that there was no significant shift in the peaks of physical mixture, lyophilized blank formulation, and HVD-NLCs formulation (VER-9) when compared to the individual peak components such as Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate. This indicated the physical compatibility between the components. The endothermic peak of verapamil at 144.96 °C was no longer seen in the thermogram of HVD-NLCs formulation (VER-9) (Fig. 8f), which could be due to verapamil that had changed to amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs matrix [16].
DSC thermograms of a Compritol 888 ATO, b Polomxamer 188, c verapamil HCl, d dextran sulfate, e trehalose, f verapamil HCl and dextran sulfate physical mixture, g physical mixture (including Compritol 888 ATO, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), h placebo, and i HVD-NLCs formulation (VER-9)
WAXS Study
The WAXS/2θ scans of pure verapamil, dextran sulfate, bulk Compritol 888 ATO®, trehalose, lyophilized blank formulation (containing Compritol 888 ATO®, oleic acid, poloxamer 188, Tween 80®, trehalose, and dextran sulfate), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 9. The diffraction peaks of pure verapamil showed specific crystalline nature of the drug at 2θ scattered angles 14.42°, 16.67°, 17.07°, 18.07°, 18.82°, 20.22°, 23.77°, and 26.27° [17]. However, the WAXS/2θ scans of HVD-NLCs formulation (VER-9) showed that the peaks of verapamil diminished indicating a decrease in the crystallinity of the drug when incorporated in the lipids of HVD-NLCs. The scan also showed the predominant peaks at 2θ scattered angles 12.47°, 15.17°, 16.87°, 21.07°, and 23.82° which possibly attributed to the crystalline structure of Compritol 888 ATO® and trehalose because none of these peaks showed similarity with any of the pure verapamil peaks [10]. The results suggested that verapamil was in the amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs formulation. The Compritol 888 ATO® revealed polymorphic crystalline transformation upon heating, whereby it changed to a more stable form, and showed reduced intensity peaks at 21.1° and 23.3° in the HVD-NLCs and blank formulations. The WAXS pattern of pure dextran sulfate indicated its amorphous form.
X-ray patterns of a lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9), b lyophilized blank formulation, c trehalose, d dextran sulfate, e verapamil HCl, and f Compritol 888 ATO
Electron Microscopic Examinations
The particle shape and size of the HVD-NLCs formulation (VER-9) were examined using the electron microscope. The liquid preparation of HVD-NLCs formulation (VER-9) observed under transmission electron microscope (TEM) showed that the particles had a spherical shape with the size less than 200 nm (Fig. 10). In contrast, observation under scanning electron microscope (SEM) revealed that the nanoparticles no longer had a spherical shape following lyophilization of the formulation without trehalose. However, the cryoprotective effect of trehalose could be seen when it was incorporated in the HVD-NLCs formulation (VER-9). The SEM image indicated that the trehalose helped to protect the structure of the nanoparticle to such extent when compared to the lyophilized formulation without the cryoprotectant (Fig. 11).
TEM image of VER-9 before lyophilization
SEM images of VER-9 formulation a without trehalose; b with trehalose
Cellular Uptake Study of HVD-NLCs
Caco-2 cells have been extensively used to study drugs intestinal cellular uptake [18]. The Caco-2 cells lines is spontaneously differentiating to form monolayer which has significant morphological and biological resemblance to the intestinal epithelium [19]. Several researchers have reported the in vitro cytotoxicity studies of Compritol ATO 888® [20], oleic acid [21, 22], Tween 80® [23, 24], and poloxamer 188 [25]. These substances were used as excipients in the optimized formulation of HVD-NLCs (VER-9). Based on their finding, these excipients were safe within the concentration used, the cell line type, and cell density that have been employed in the present study. The concentration of verapamil in the samples of VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex used in the cellular uptake study was in the range of 10.03 μg/200 μL to 30.1 μg/200 μL. It was found that the verapamil cellular uptake was increased with increasing the verapamil concentration in the samples. The cellular uptake values of verapamil from VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex were increased from 6.45 ± 2.62 to 15.92 ± 4.78 μg, 0.89 ± 0.28 to 1.46 ± 0.65 μg, and 0.064 ± 0.019 to 0.118 ± 0.003 μg, respectively (Fig. 12). The verapamil cellular uptake from the VER-9 formulation was 10.90- and 134.91-fold higher than the verapamil solution and verapamil-dextran complex, respectively. The results indicated that verapamil was passively transported from HVD-NLCs, verapamil solution, and verapamil-dextran complex in the caco2-cells. A similar finding of higher cellular uptake of drugs from a lipid-based nanoformulation was reported [26].
In vitro model of Caco-2 cell line showing cellular uptake of HVD-NLCs (VER-9), verapamil solution, and verapamil-dextran complex (mean ± SD, n = 3)
Caco-2 cells act similarly as cell in animals when stimulated by fatty acid. van Greevenbroek et al. suggested that the incorporation of long-chain unsaturated fatty acids (e.g., oleic acid and linoleic acid) into the Caco-2 cells stimulate the secretion of very low-density lipoproteins (VLDL) and chylomicrons. In contrast, administration of saturated fatty acids primarily secretes intermediate- and low-density lipoproteins (IDL and LDL) [27]. Similar findings of increasing chylomicron secretion by the long-chain fatty acids were also reported by Caliph et al. in animal model [28]. In the present investigation, the long-chain fatty acids (Compritol 888 ATO® and oleic acid) used in the preparation of the HVD-NLCs may also stimulate the secretion of chylomicron, and hence increase the cellular uptake of the model drug.
Stability Study
The lyophilized VER-9 formulation was found stable for 6 months at refrigerated condition (5 ± 3 °C) (Table 6). There were no significant differences in the PS, PDI, ZP, and %EE after 6 months of stability study at storage temperature of 5 ± 3 °C. However, the VER-9 formulation was not stable after 1-month storage at the temperatures of 25 ± 2 °C/60 ± 5%RH and 40 ± 2 °C/75 ± 5% RH. The PS and PDI were increased significantly, while the total drug content decreased significantly. After 1 month of stability study, the samples were not measurable due to aggregation and sticky behavior of the nanoparticles.
Conclusion
The lyophilized HVD-NLCs formulation was successfully developed and optimized. The lipid carriers had prolonged the release of verapamil from the HVD-NLCs formulation. The formulation was in the nano size range and stable for 6 months at 5 ± 3 °C. The cellular uptake of verapamil lipid formulation (NLCs) was found higher than the non-lipid formulations. This suggested that the NLCs as a lipid carrier for verapamil may play an important role in improving the absorption of the drug.
