Perangkat Mikrofluida yang Dibuat Langsung pada Elektroda yang Dicetak di Layar untuk Penginderaan Elektrokimia Ultrasensitif dari PSA
Abstrak
Cara membuat perangkat mikofluida skala rendah untuk deteksi biomarker memiliki persyaratan besar. Di sini, untuk pertama kalinya dilaporkan bahwa perangkat mikofluida baru berdasarkan ikatan saluran mikrofluida polidimetilsiloksan ke substrat elektroda tercetak layar dengan larutan kaca pelapis dibuat untuk penginderaan elektrokimia dari antigen spesifik prostat (PSA). Dibandingkan dengan proses mikrofabrikasi tradisional, metode ini sederhana, cepat, biaya rendah, dan juga cocok untuk produksi massal. Perangkat mikrofluida berbasis elektroda yang dicetak di layar (CASPE-MFD) digunakan untuk mendeteksi PSA dalam serum manusia. CASPE-MFD yang disiapkan memiliki batas deteksi 0,84 pg/mL (25,8 fM) dan linieritas yang baik dengan konsentrasi PSA berkisar antara 0,001 hingga 10 ng/mL, yang menunjukkan platform yang menjanjikan untuk pengembangan miniatur, elektrokimia berbiaya rendah perangkat mikofluida untuk digunakan dalam kesehatan manusia, pemantauan lingkungan, dan aplikasi lainnya.
Latar Belakang
Sistem mikofluida adalah proses manipulasi cairan volume kecil (10
−9
sampai 10
−18
L) dalam saluran dengan dimensi puluhan hingga ratusan mikrometer [1]. Teknologi ini telah menunjukkan potensi besar dalam biomedis, pemantauan lingkungan, dan analisis keamanan pangan. Secara khusus, perangkat mikofluida (MFD) biasanya menunjukkan keuntungan berikut, termasuk footprint kecil, pengurangan konsumsi reagen, deteksi beberapa sampel secara paralel, peningkatan keandalan, sensitivitas, dan integrasi skala tinggi dan besar [2,3,4].
Sensor elektrokimia telah banyak diintegrasikan dan ditulis dengan tanda penghubung dengan pengambilan sampel, penanganan fluida, pemisahan, dan skenario deteksi teknik lainnya [5]. Penerapan sensor elektrokimia untuk deteksi biomolekul cukup menjanjikan karena sensor elektrokimia menunjukkan banyak keuntungan seperti sensitivitas dan selektivitas yang tinggi, reproduktifitas yang andal, penggunaan sederhana untuk analisis di tempat yang berkelanjutan, preparasi sampel minimal, biaya yang relatif rendah, dan respons waktu yang singkat. Sistem elektrokimia dapat dengan mudah diintegrasikan dalam sistem mikofluida [6, 7], dan ini menawarkan keunggulan dibandingkan platform analitik konvensional [8,9,10], seperti kemudahan dalam preparasi sampel, sensitivitas dan keserbagunaan yang sangat baik, dan penghilangan gumpalan besar. komponen optik [11, 12].
Dalam penelitian ini, strategi sederhana, murah, dan serbaguna digunakan untuk pembuatan MFD penginderaan elektrokimia menggunakan elektroda sablon yang tersedia secara komersial untuk diagnosis titik perawatan. Perangkat yang dikembangkan didefinisikan sebagai CASPE-MFDs (perangkat mikofluida berbasis elektroda yang tersedia secara komersial). Saluran mikrofluida polidimetilsiloksan (PDMS) pertama-tama dipola menggunakan fotolitografi standar, dan CASPE-MFD dibuat dengan mengikat saluran mikofluida PDMS secara langsung pada elektroda sablon yang tersedia secara komersial (Gbr. 1). Elektroda sablon langsung digunakan dan dilapisi dengan lapisan tipis kaca menggunakan pendekatan sol-gel [13]. Selanjutnya, saluran mikrofluida PDMS diikat ke elektroda setelah perawatan plasma pada permukaannya. CASPE-MFDs mampu mengukur konsentrasi berbagai analit dalam cairan biologis seperti larutan buffer fosfat (PBS) dan sampel serum. CASPE-MFD digunakan untuk mendemonstrasikan deteksi dan kuantifikasi biomarker antigen spesifik prostat (PSA) dalam larutan buffer PBS dan sampel serum manusia menggunakan kronoamperometri (CA) dan voltametri gelombang persegi (SWV). Deteksi PSA di perangkat ini menunjukkan sensitivitas yang tinggi, dan batas deteksi (LOD) untuk PSA adalah 0,84 pg/mL (25,8 fM). LOD lebih dari 100 kali lebih sensitif daripada batas deteksi klinis 0,1 ng/mL untuk uji komersial [14] dan lebih baik daripada perangkat lain [3, 15, 16]. CASPE-MFD portabel, mudah digunakan, dan memiliki potensi untuk mengintegrasikan komponen lain seperti preparasi sampel dan sistem pemisahan.
a Proses fabrikasi untuk saluran mikrofluida PDMS yang dipolakan oleh fotolitografi SU-8. b Proses fabrikasi untuk perangkat mikrofluida berbasis elektroda sablon yang tersedia secara komersial. CASPE-MFD terdiri dari saluran mikrofluida PDMS, dua elektroda emas tercetak sebagai elektroda kerja dan lawan, dan elektroda perak tercetak sebagai elektroda referensi semu. c Perangkat mikofluida berbasis elektroda sablon yang tersedia secara komersial
Bahan dan Metode
Reagen dan Bahan Kimia
Antigen spesifik prostat (PSA) dan antibodi anti-PSA multiklonal horseradish peroxidase (HRP) dibeli dari Petsec Energy Ltd. Antibodi anti-PSA terbiotinilasi, manik-manik magnetik streptavidin, albumin serum sapi, dan hidrokuinon berasal dari Fisher Scientific. Tween-20, hidrogen peroksida (H2 O2; 30%), dan asam ferrocenecarboxylic berasal dari Sigma-Aldrich. SU-8 2075 berasal dari MicroChem Corp. Polidimetilsiloksan (PDMS) pra-polimer dan bahan pengawet dibeli dari Dow Corning. Semua imunoreagen dilarutkan dalam larutan buffer 1x pH 7.4 PBS dari KD Medical Solutions. Semua reagen kimia disiapkan dengan air ultra murni dari sistem pemurnian air Millipore Milli-Q.
Instrumentasi
Mikroskop fluoresensi dilakukan pada Olympus U-CMAD3 (Olympus, Jepang). Perangkat CSPE dibuat oleh pembersih Plasma PDC-32G (Harrick Plasma, USA). Semua pengukuran elektrokimia dilakukan oleh CHI 760B (CHI, China) dengan sistem tiga elektroda konvensional, yang masing-masing terdiri dari dua elektroda emas cetak sebagai elektroda kerja dan elektroda lawan, dan elektroda perak tercetak sebagai elektroda referensi semu (Gbr. 1 ).
Fabrikasi Chip Mikrofluida
Saluran mikrofluida PDMS dipola menggunakan fotolitografi standar. Secara singkat, wafer silikon, dibilas dengan larutan campuran (H2 JADI4 /H2 O2 = 7/3) dilanjutkan dengan ultrapure water clean, dilapisi dengan SU-8 2075 photoresist. Wafer kemudian dipanggang pada suhu 65 °C selama 7 menit diikuti dengan 95 °C selama 40 menit untuk menghilangkan pelarut dan dipapar foto dengan sinar UV selama 15s melalui photomask. Seluruh sistem dipanggang pada 65 °C selama 5 min diikuti oleh 95 °C selama 15 min untuk menstabilkan polimerisasi. Fotoresist yang tidak terpolimerisasi dihilangkan dengan merendam wafer silikon dalam pengembang SU-8 dan dicuci dengan isopropanol dan air deionisasi. Campuran larutan pra-polimer PDMS dan bahan pengawet (10,1) dicetak di atas wafer silikon yang telah dijelaskan sebelumnya, dikeringkan pada 65 °C selama 2 jam, dan dikupas [17].
Elektroda cetak yang tersedia secara komersial dilapisi dengan lapisan kaca menggunakan pendekatan sol-gel. Secara singkat, tetra etoksi silan (TEOS), MTE, etanol, dan air dicampur sepenuhnya pada proporsi 1:1:1:1 dan disonikasi selama 5 min. Campuran ditempatkan dalam oven pada suhu 65 C semalaman. Elektroda diletakkan di atas hot plate selama 5 menit pada suhu 80°C sebelum pelapisan kaca dan kemudian diolesi dengan campuran prekursor menggunakan sikat untuk menghindari campuran masuk ke permukaan elektroda. Elektroda dikeringkan pada suhu kamar setelah pengolesan. Chip PDMS dan elektroda berlapis kaca kemudian diproses dengan O2 plasma selama 30 detik dan saling menempel.
Eksperimen Chronoamperozmetric
Eksperimen kronoamperometrik dilakukan dalam 1× pH 7,4 PBS yang mengandung 4,5 mM hidrokuinon dan 0,1 mM larutan hidrogen peroksida pada potensial langkah 2,0 mV (vs elektroda referensi semu perak) dan menghasilkan kurva kalibrasi untuk konsentrasi PSA dari 0 hingga 10 ng mL
−1
. Secara singkat, kami menyuntikkan 50 μL 0,2 mg mL
−1
antibodi anti-PSA terkonjugasi manik magnetik ke perangkat CSPE dengan kecepatan 50 μL min
−1
, dan dicuci bersih menggunakan 100 μL pH 7.4 PBS dengan kecepatan 50 μL min
−1
. Selain itu, 50 μL buffer pemblokiran (0,05% (v /v ) Tween-20 dan 2% (w /v ) bovine serum albumin (BSA) di PBS) disuntikkan dengan kecepatan 10 μL min
−1
dan diinkubasi selama 30 menit pada kondisi 37 °C, dicuci bersih menggunakan 100 μL pH 7.4 PBS pada kecepatan 50 μL min
−1
. Kemudian, 50 μL konsentrasi PSA yang berbeda disuntikkan dengan kecepatan 10 μL min
−1
dengan inkubasi selama 30 min pada 37 °C dan dicuci bersih menggunakan 100 μL pH 7.4 PBS pada kecepatan 50 μL min
−1
. Selanjutnya, 50 μL antibodi anti-PSA terkonjugasi HRP (pengenceran 1:1000) disuntikkan dengan kecepatan 10 μL min
−1
, diinkubasi selama 30 menit pada 37 °C, dan dicuci bersih menggunakan 100 μL pH 7.4 PBS pada kecepatan 50 μL menit
−1
. Terakhir, kami menyuntikkan 50 μL 1× pH 7,4 PBS yang mengandung 4,5 mM hidrokuinon dan 0,1 mM larutan hidrogen peroksida dengan kecepatan 50 μL min
−1
. Setelah arus puncak stabil, kami membuat rata-rata ketiga pengukuran arus dan menghitung simpangan baku yang sesuai. Akhirnya, kronoamperometri diimplementasikan pada potensial konstan 4 mV, dalam delapan pengulangan untuk setiap kelompok. Untuk memastikan CASPE-MFD selalu dalam kondisi terbaik selama eksperimen elektrokimia, elektroda CASPE-MFD diaktifkan terlebih dahulu dengan memindai dalam kisaran potensial 0,5 hingga 1,5 V selama 10 siklus dalam 0,5 MH2 JADI4 larutan menggunakan voltametri siklik. Karakteristik voltamogram khas dari emas polikristalin bersih disajikan. Kemudian, CASPE-MFD dicuci dengan air ultra murni dan larutan PBS.
Hasil dan Diskusi
Persiapan CASPE-MFD
Distribusi homogen digunakan untuk menyelidiki kegunaan CASPE-MFD. Larutan microbeads fluoresen disuntikkan ke dalam saluran CASPE-MFD pada laju aliran 5-μL/menit, dan jelas bahwa setiap sudut CASPE-MFD diisi dengan larutan microbeads fluoresen dan tidak ada gelembung yang terbentuk. di perangkat (Gbr. 2). Laju aliran ditingkatkan menjadi 100 μL/menit untuk membuktikan kekokohan CASPE-MFD, yang menunjukkan bahwa perangkat ini cocok untuk deteksi analit.
a Fotoelektroda yang dicetak dengan layar digunakan untuk mengambil gambar fluoresensi. b Gambar fluoresensi CASPE-MFD. Kami menggunakan fotoelektroda sebagai gambar model fluoresensi untuk menunjukkan bahwa area kerja penuh dengan pewarna dan tidak memiliki gelembung di CASPE-MFD. c Gambar sebagian diperbesar dari gambar fluoresensi
Proses fabrikasi juga diselidiki dengan voltamogram siklik seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3. Asam ferrosen karboksilat digunakan sebagai model senyawa aktif redoks, dan Gambar 3a menunjukkan hubungan arus puncak redoks dengan laju pemindaian potensial yang berbeda. Puncak redoks kurva CV menunjukkan reaksi elektrokimia reversibel yang khas di mana laju reaksi diatur oleh difusi spesies elektroaktif ke permukaan elektroda. Pemisahan potensial antara potensial katodik puncak (Epc ) dan potensi puncak anodik (Epa ) adalah 62 mV, yang mendekati nilai teoritis 59 mV untuk pasangan redoks ferrosen. Selain itu, posisi potensial puncak tidak berubah sebagai fungsi dari laju pemindaian potensial, dan arus puncak anodik (ipa ) kira-kira sama dengan arus puncak katodik (ipc ) dalam kisaran 10 hingga 350 mV/s. Perilaku reversibel sesuai dengan sinyal dalam larutan massal (File tambahan 1:Gbr. S1A), yang menunjukkan bahwa tidak ada reaksi samping yang terjadi dan, seperti yang diharapkan, kinetika transfer elektron cukup cepat untuk mempertahankan konsentrasi permukaan redoks spesies -aktif pada nilai yang dibutuhkan oleh persamaan Nernst. Gambar 3b menunjukkan bahwa kedua arus puncak anodik (ipa ) dan arus puncak katodik (ipc ) sebanding dengan akar kuadrat dari tingkat pemindaian, menyiratkan proses difusi-dikendalikan yang khas [18]. Lebih lanjut, arus yang diukur dalam CASPE-MFD cukup dekat dengan nilai arus dalam larutan massal (File tambahan 1:Gbr. S1B), yang menunjukkan bahwa analisis dalam perangkat tidak mengorbankan sensitivitasnya.
a Voltammogram siklik dari asam karboksilat ferrosen 0,5 mM dalam larutan berair KCl 0,1 M (pH 7.0) dalam CASPE-MFD pada kecepatan pemindaian yang berbeda (naik sepanjang y -sumbu):10, 25, 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300, dan 350 mV/s. b Plot kalibrasi anodik (ipa ) dan arus puncak katodik (ipc ) vs kecepatan pemindaian persegi. Kedua garis tersebut masing-masing mewakili kurva linier dengan persamaan regresi:Y (ipa ) = 0.9932X 0,2563 (R
2
= 0,9996, n = 8); Y (ipc ) = − 0.9384X 0.1774 (R
2
= 0,9996, n = 8)
Kinerja CASPE-MFD pada Deteksi PSA
Laporan terbaru menunjukkan bahwa konsentrasi antigen spesifik prostat (PSA) dalam kisaran 4-10 ng/mL umumnya menunjukkan kemungkinan tinggi adanya karsinoma prostat [19]. Oleh karena itu, PSA dipilih sebagai target untuk mengevaluasi kinerja CASPE-MFD yang disiapkan (Gbr. 4). Gambar 4a menunjukkan CASPE-MFD yang disiapkan dapat langsung dihubungkan ke stasiun kerja elektrokimia portabel. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4c, antibodi anti-PSA terkonjugasi manik magnetik diimobilisasi pada permukaan elektroda emas (elektroda kerja) menggunakan magnet. Antigen PSA kemudian disuntikkan ke dalam saluran mikrofluida dari CASPE-MFD yang telah disiapkan dan dikonjugasikan dengan antibodi anti-PSA yang diimobilisasi pada elektroda kerja. Selanjutnya, antibodi anti-PSA yang dimodifikasi HRP dikonjugasikan dengan antigen PSA. Kronoamperometri digunakan untuk mendeteksi sinyal elektrokimia yang dihasilkan hidrokuinon dan hidrogen peroksida.
a Seluruh perangkat deteksi. Pompa jarum suntik digunakan untuk menyuntikkan larutan ke dalam CASPE-MFD, dan stasiun kerja elektrokimia digunakan untuk mendeteksi sinyal elektrokimia. b CASPE-MFD digunakan untuk mendeteksi PSA. Antibodi anti-PSA terkonjugasi manik-manik imunomagnetik disuntikkan dengan larutan melalui saluran masuk, dan magnet digunakan untuk menangkap manik-manik magnetik. c Skema CASPE-MFD dalam mendeteksi antigen PSA. Antibodi anti-PSA terkonjugasi manik-manik imunomagnetik diimobilisasi pada elektroda kerja menggunakan magnet. Antigen PSA disuntikkan ke dalam CASPE-MFD dan dikonjugasikan dengan antibodi anti-PSA. Antibodi anti-PSA yang dimodifikasi HRP kemudian dikonjugasikan dengan antigen PSA. Kronoamperometri digunakan untuk mendeteksi sinyal elektrokimia yang dihasilkan hidrokuinon dan hidrogen peroksida
Kronoamperometri memberikan rasio signal-to-noise yang lebih baik dibandingkan dengan teknik amperometrik lainnya [20,21,22,23,24], dan penggunaan slab tipis cairan yang dijepit secara mekanis ke elektroda lebih tahan terhadap getaran daripada analisis dalam volume larutan yang lebih besar. Untuk arus terbatas difusi faradaik, respons arus-waktu dijelaskan oleh persamaan Cottrell.
dimana n adalah jumlah elektron, F adalah konstanta Faraday (96.485 C/mol), A adalah luas elektroda (cm
2
), D adalah koefisien difusi (cm
2
/s), dan C adalah konsentrasi (mol/cm
3
).
CASPE-MFD yang disiapkan digunakan untuk mendeteksi PSA dalam serangkaian larutan analit, konsentrasi dari 0 hingga 10 ng mL
−1
. Respons kronoamperometrik dari deteksi PSA di CASPE-MFD ditunjukkan pada Gambar 5a. Arus puncak meningkat dengan meningkatnya konsentrasi PSA pada pH 7,4 PBS yang mengandung 4,5 mM hidrokuinon dan 0,1 mM hidrogen peroksida. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b (garis biru), arus puncak sebanding dengan nilai logaritmik konsentrasi PSA pada kisaran 0,001 hingga 10 ng/mL dan persamaan regresi liniernya adalah I (μA) = 14.87 + 3.927 × log CPSA (ng/mL) (R
2
= 0,9985, n = 8). Batas deteksi yang rendah (0,84 pg/mL) dan hubungan linier yang baik menunjukkan bahwa CASPE-MFD yang disiapkan dapat digunakan untuk mendeteksi PSA dalam penggunaan praktis. Selain itu, kami juga mendeteksi konsentrasi PSA yang berbeda dalam CASPE-MFD menggunakan voltametri gelombang persegi (SWV) pada Gambar 5c. Respons SWV juga konsisten dengan hasil kronoamperometrik.
a Kurva kronoamperometrik untuk berbagai konsentrasi antigen PSA (naik sepanjang y -sumbu):0, 0,001, 0,01, 0,1, 1, dan 10 ng/mL dalam buffer pH 7,4 PBS yang mengandung 4,5 mM hidrokuinon dan 0,1 mM H2 O2 larutan dalam CASPE-MFD pada 2.0 mV vs elektroda referensi semu perak. b Hubungan linier antara arus puncak dan konsentrasi antigen PSA dalam CASPE-MFD dalam buffer PBS pH 7.4 (garis biru) dan dalam serum manusia (garis merah). Persamaan regresi linier garis biru adalah Y = 14.87 + 3.927 × X (R
2
= 0,9985, n = 8), dan persamaan regresi linier garis merah adalah Y = 14.15 + 3.622 × X (R
2
= 0.9986, n = 8). c Voltammogram gelombang persegi untuk berbagai konsentrasi antigen PSA dalam buffer PBS pH 7,4 yang mengandung 4,5 mM hidrokuinon dan 0,1 mM H2 O2 solusi dalam CASPE-MFD (naik sepanjang y -sumbu):masing-masing 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1, dan 10 ng/mL. d Hubungan linier yang sesuai dari konsentrasi yang berbeda dari antigen PSA. Persamaan regresi linier adalah Y = 34.53 + 9.246 × X (R
2
= 0.9884, n = 8)
Deteksi Selektif PSA dengan CASPE-MFD
Untuk memverifikasi kemungkinan penerapan di perangkat kami untuk sampel nyata, kami menganalisis berbagai konsentrasi PSA dalam sampel serum manusia menggunakan kronoamperometri. Hasil yang diperoleh dalam file tambahan 1:Gambar. S2 menunjukkan bahwa arus puncak PSA juga meningkat dengan meningkatnya konsentrasi PSA dalam serum manusia yang mengandung 4,5 mM hidrokuinon dan 0,1 mM hidrogen peroksida. Selain itu, kurva kalibrasi yang sesuai ditunjukkan pada Gambar. 5b (garis merah), dan persamaan regresi liniernya adalah I (μA) = 14.15 + 3.622 × log CPSA (ng/mL) (R
2
= 0.9986, n = 8). Jelas bahwa hampir tidak ada perbedaan statistik antara kedua kelompok, yang menunjukkan bahwa CASPE-MFD yang disiapkan dapat bekerja dalam sampel nyata. Lebih lanjut, CASPE-MFD menunjukkan bahwa ia memiliki selektivitas yang tinggi untuk menargetkan PSA dan dapat digunakan dalam aplikasi klinis untuk mendiagnosis karsinoma prostat.
Kesimpulan
Kami telah mengembangkan penginderaan elektrokimia mikrofluida berbasis elektroda komersial yang sederhana, murah, dan portabel. Selain itu, kami telah mendemonstrasikan penerapan CASPE-MFD kami untuk analisis kuantitatif PSA dalam buffer PBS dan dalam sampel serum manusia. Pengukuran menunjukkan sensitivitas dan reproduktifitas yang baik karena perangkat dibuat langsung pada elektroda sablon komersial. CASPE-MFD memiliki lima keunggulan:(i) ringan, portabel, multi guna; (ii) distandarisasi; (iii) memiliki reproduktifitas yang sangat baik dengan sensitivitas dan akurasi yang tinggi; (iv) mudah digunakan dan tidak memerlukan tenaga medis profesional atau instrumen yang rumit; dan (v) memungkinkan integrasi sistem deteksi kepadatan tinggi ke dalam perangkat kecil. Selain itu, penggunaan potensiostat mini dapat membuat CASPE-MFDs mampu melakukan diagnosis lapangan atau rumah. Selain itu, elektroda komersial dan fabrikasi yang mudah dapat mencapai standarisasi dan industrialisasi CASPE-MFD. Oleh karena itu, kami percaya bahwa platform ini dapat digunakan secara luas untuk diagnosis di tempat perawatan seperti molekul kecil (natrium, kalium, klorida, glukosa), penanda kanker (peptida natriuretik tipe-B atau BNP, troponin I), sel (CD4 ), dan asam nukleat (DNA, RNA).
Singkatan
MFD:
Perangkat mikofluida
CASPE-MFD:
Perangkat mikrofluida berbasis elektroda yang dicetak di layar
