Mekanisme Baru yang Mendasari Pembentukan Akar Lateral Tomat Berdinding Karbon yang Dipicu Nanotube Multi-dinding:Keterlibatan Oksida Nitrat
Abstrak
Banyak penelitian mengungkapkan bahwa nanotube karbon berdinding banyak (MWCNTs) beracun bagi tanaman. Namun, apakah atau bagaimana MWCNT memengaruhi pembentukan akar lateral (LR), yang merupakan komponen penting dari kemampuan beradaptasi sistem akar terhadap berbagai isyarat lingkungan, masih kontroversial. Dalam laporan ini, kami menemukan bahwa MWCNT dapat masuk ke dalam akar bibit tomat. Administrasi dengan MWCNT mempromosikan pembentukan LR tomat dengan cara yang kira-kira bergantung pada dosis. Produksi oksida nitrat (NO) endogen dipicu oleh MWCNT, dikonfirmasi oleh metode reagen Greiss, resonansi paramagnetik elektron (EPR), dan pemindaian laser confocal microscopy (LSCM), bersama dengan pemulung NO. Ada hubungan sebab-akibat antara MWCNT dan NO dalam induksi pengembangan LR, karena sintesis NO yang dipicu MWCNT dan pembentukan LR jelas diblokir oleh penghilangan NO endogen dengan pemulungnya. Aktivitas enzim penghasil NO nitrat reduktase (NR) meningkat dalam menanggapi MWCNTs. Penghambatan tungstat NR tidak hanya mengganggu produksi NO, tetapi juga menghilangkan pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT. Penambahan N
G
-nitro-l-arginine methyl ester (l-NAME), penghambat enzim mirip nitric oxide synthase (NOS), gagal mempengaruhi pembentukan LR. Secara kolektif, kami mengusulkan bahwa NO dapat bertindak sebagai molekul pensinyalan hilir dalam kontrol MWCNT pengembangan LR, setidaknya sebagian melalui NR.
Pengantar
Ada banyak aplikasi biologis dan biomedis dari karbon nanotube [1, 2]. Karena kemampuan unik untuk dengan mudah menembus membran sel, biosafety karbon nanotube selalu menjadi topik perdebatan [3, 4]. Sementara itu, karena produksi dan penggunaan karbon nanotube tumbuh pesat, menjadi penting untuk mengkarakterisasi mekanisme rinci sitotoksisitas pada manusia dan mamalia, dan baru-baru ini pada tanaman [3,4,5,6,7,8,9]. Tanaman dan komunitasnya diketahui sangat penting bagi manusia dan lingkungan, dan mereka juga berisiko terpapar karbon nanotube, karena menumpuk di tanah melalui aplikasi pupuk biosolid [6, 10, 11]. Sebagai anggota penting dari karbon nanotube, toksisitas nanotube karbon berdinding banyak (MWCNTs), yang terdiri dari beberapa lapisan graphene yang digulung, telah diselidiki secara luas. Studi pada mamalia mengungkapkan bahwa paparan dengan MWCNT dan karbon nanotube berdinding tunggal menginduksi kerusakan oksidatif dan aktivasi NF-kB pada keratinosit manusia dan sel A549 [9, 12]. MWCNTs dan karbon nanotube berdinding tunggal dapat menyatu dengan membran plasma, sehingga menyebabkan kerusakan sel melalui peroksidasi lipid dan stres oksidatif [9, 11, 13, 14]. Sitotoksisitas dan stres oksidatif yang dipicu oleh MWCNT, serta respons inflamasi sederhana, diamati pada sel endotel vena umbilikalis manusia [15]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa toksisitas utama MWCNTs dalam bayam merah terutama berasal dari kelebihan produksi spesies oksigen reaktif (ROS), dan efek toksiknya dapat dibalikkan dengan suplemen asam askorbat [7]. Dalam pengertian ini, MWCNT dianggap sebagai faktor stres baru bagi organisme, baik pada hewan maupun tumbuhan.
Pembentukan akar lateral (LR), penentu penting arsitektur akar, telah dianggap sebagai indikator respon adaptif terhadap berbagai tekanan [16]. Pada tumbuhan tingkat tinggi, pembentukan LR dipengaruhi oleh fitohormon dan berbagai isyarat lingkungan, termasuk ketersediaan air, nutrisi, dan cekaman abiotik, seperti hipoksia dan cekaman logam berat [17,18,19]. Sementara itu, banyak bukti menegaskan bahwa pembentukan LR tidak hanya bertindak sebagai pendukung fisik, tetapi juga berkontribusi pada penyerapan air dan nutrisi untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman [19,20,21]. Petunjuk lingkungan yang berbeda dapat memicu beberapa fenotipe respon morfogenik yang diinduksi stres (SIMR) spesifik, termasuk promosi pembentukan LR dan penghambatan pemanjangan akar [17].. Regulasi pembentukan LR juga dikontrol ketat oleh fitohormon, seperti auksin, dan aktivasi gen pengatur siklus sel dalam menanggapi auksin disarankan [19, 22]. Sementara itu, keterlibatan beberapa molekul kecil dalam organogenesis akar yang dipicu auksin dikonfirmasi pada tanaman mentimun, tomat, kedelai, dan lobak [23,24,25,26,27]. Molekul kecil ini termasuk hidrogen peroksida (H2 O2 ), oksida nitrat (NO), karbon monoksida (CO), dan gas hidrogen (H2 ).
Di antaranya, NO, gas radikal bebas, telah terbukti memiliki beberapa fungsi fisiologis pada tanaman [28, 29]. Selain peningkatan adaptasi tanaman terhadap cekaman, fungsi NO termasuk mempromosikan perkembangan rambut akar, rooting adventif, dan pembentukan akar lateral [30,31,32,33], meskipun sumber daya enzimatik dari biosintesis NO pada tanaman tersebut proses tersebut di atas tetap sulit dipahami. Pada hewan, sintesis NO dari l-arginin dikatalisis oleh enzim yang mengandung heme nitric oxide synthase (NOS) [34]. Meskipun gen yang mengkode enzim NOS belum diidentifikasi pada tanaman, aktivitas mirip NOS mamalia terdeteksi secara luas [35, 36], dan penghambat NOS mamalia, seperti N
G
-nitro-l-arginine methyl ester hydrochloride (l-NAME), dapat menghambat pembentukan NO pada tanaman [25, 33, 36,37,38,39]. Yang penting, banyak bukti genetik mengungkapkan bahwa NO dapat diproduksi oleh nitrat reduktase (NR), enzim terkenal yang bertanggung jawab untuk metabolisme nitrogen pada tanaman [28]. Keterlibatan produksi NO yang dimediasi NR dalam penutupan stomata dan aklimatisasi dingin telah ditunjukkan secara genetik [37, 38]. Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa sintesis NO yang bergantung pada NR terlibat dalam pembentukan akar lateral yang dimediasi oleh gas hidrogen yang diinduksi auksin [39].
Sampai saat ini, respon yang berbeda dalam pembentukan LR, promosi atau penghambatan, masing-masing dilaporkan di berbagai spesies tanaman ketika dilengkapi dengan bahan nano, termasuk MWCNTs [40,41,42,43], nanopartikel emas (Au NP, [44]), seng oksida nanopartikel (ZnO NP [45, 46];), nanopartikel titanium dioksida (TiO2 NP [46];), dan graphene oxide (GO [47,48,49];) (Tabel 1), dan belum ada penelitian yang memberikan bukti definitif peran NO dalam tanggapan di atas. Dalam penelitian ini, deteksi NO endogen dengan metode reagen Greiss, laser scanning confocal microscopy (LSCM), dan analisis resonansi paramagnetik elektron (EPR) mengungkapkan bahwa kadar NO meningkat pada bibit tomat yang diberi perlakuan MWCNT. Setelah itu, pembentukan LR diamati. Kami selanjutnya mempelajari keterlibatan NO dalam pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT, dengan memanipulasi level NO endogen menggunakan pemulung NO dan antagonis yang menghambat NR dan aktivitas NOS seperti mamalia. Eksperimen lebih lanjut mengungkapkan bahwa NO yang bergantung pada NR mungkin, setidaknya sebagian, penting untuk pembentukan LR sebagai respons terhadap MWCNT. Dengan demikian, pekerjaan ini membuka jendela baru untuk memahami efek biologis bahan nano pada tanaman.
Bahan dan Metode
Bahan kimia
Kecuali dinyatakan lain, semua bahan kimia lainnya diperoleh dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). MWCNTs, dibeli dari Sigma-Aldrich, dicirikan seperti yang dijelaskan sebelumnya [50]. Diameter luar, diameter antar, dan panjang MWCNT masing-masing adalah 6–12 nm, 2,5–5 nm, dan 1–9 μm. Setelah perlakuan sonikasi, suspensi koloid homogenat yang diperoleh disterilisasi dan digunakan.
Nanopartikel karbon lainnya diperoleh dari Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd., termasuk nanotube karbon berdinding tunggal (SWCNTs, XFS22; kemurnian> 95%, diameter 1–2 nm, panjang 5–30 μm, luas permukaan khusus> 1075 m
2
/g), graphene (XF001W; kemurnian ~ 99%, diameter 0,5–5 μm, ketebalan ~ 0,8 nm, rasio lapisan tunggal ~ 80%, luas permukaan BET 500~1000 m
2
/G; resistivitas listrik 0.30 Ω.cm), dan karbon aktif (AC, XFP06; kemurnian> 95%, ukuran partikel 5 ± 1 μm, volume pori 1-1,2 cm
3
/g, bukaan 2,0–2,2 nm, luas permukaan khusus ~ 1500–1700 m
2
/g).
Selain itu, natrium nitroprusside (SNP) digunakan sebagai senyawa pelepas NO [30,31,32,33]. 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt (cPTIO) dianggap sebagai pemulung NO [51,52,53,54]. Tungstate (Tg; penghambat NR [28, 33, 37, 55,56,57];) dan N
G
-nitro-L-arginin metil ester hidroklorida (NAMA; penghambat enzim mirip NOS mamalia [25, 33, 36,37,38,39];) juga diterapkan. Dalam studi ini, konsentrasi bahan kimia di atas ditentukan dalam percobaan percontohan, dari mana respons signifikan diamati.
Bahan Tanaman dan Kondisi Pertumbuhan serta Penentuan Formasi LR
Tomat (Solanum lycopersicum L.) benih “Jiangshu 14” dipasok dengan baik oleh Institut Pertanian Jiangsu, Nanjing, Provinsi Jiangsu, Cina. Benih terpilih dengan ukuran yang sama dikecambahkan dalam air suling pada 25 ± 1 °C dalam gelap selama 3 hari. Bibit identik yang dipilih dengan radikula 2-3 mm kemudian dipindahkan ke larutan perawatan 6 mL yang mengandung konsentrasi MWCNT yang ditunjukkan, 200 nM 1-naphthylacetic acid (NAA; auksin terkenal), 0.1 mM SNP, 0.2 mM cPTIO, 20 M tungstate (Tg), 0.2 mM NAME, dan nanopartikel karbon lainnya, termasuk 5 mg/mL karbon nanotube berdinding tunggal (SWCNTs), graphene, dan karbon aktif (AC), sendiri atau dalam kombinasi untuk titik waktu yang ditunjukkan. Bibit ditanam dalam inkubator yang menyala (25 ± 1 °C) dengan intensitas cahaya 200 μmol m
−2
s
−1
pada 14/10 h (terang/gelap) fotoperiode.
Setelah perlakuan, pengambilan gambar, dan jumlah serta panjang akar lateral yang muncul (> 1 mm) per bibit kemudian ditentukan dengan menggunakan perangkat lunak Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/) [39 , 58]. Seperti yang dijelaskan sebelumnya, hanya segmen lateral yang dapat diinduksi akar yang digunakan untuk analisis selanjutnya.
Pencitraan Distribusi MWCNT dengan Mikroskop Elektron Transmisi
Distribusi MWCNTs di akar bibit tomat dikarakterisasi menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM; JEOL, JEM-200CX, Tokyo, Jepang). Persiapan sampel untuk analisis TEM sesuai dengan protokol sebelumnya [59].
Pencitraan NO Endogen dengan Mikroskop Confocal Pemindaian Laser
Pencitraan NO dilakukan dengan menggunakan probe fluoresen NO yang cukup spesifik 4-amino-5-methylamino-2′,7′-difluorofluorescein diacetate (DAF-FM DA). Setelah probe dicuci bersih, gambar diperoleh menggunakan mikroskop confocal Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman, eksitasi pada 488 nm, emisi pada 500–530 nm untuk analisis NO). Dalam percobaan kami, 20 sampel individu dipilih secara acak dan diukur per perlakuan. Foto mewakili hasil yang identik.
TIDAK ADA Konten yang Ditentukan oleh Uji Reagen Griess
Menurut metode yang dijelaskan sebelumnya [50], konten NO ditentukan dengan uji reagen Griess. Yang penting, untuk menghindari gangguan yang disebabkan oleh kandungan nitrat dan nitrit pekat dalam tanaman, sampel identik yang diinkubasi dalam 200 μM cPTIO (pemulung NO) selama 30 menit dianggap sebagai sampel kosong. Setelah penambahan reagen Griess selama 30 min, absorbansi dicatat pada 540 nm, dan kandungan NO ditentukan dengan membandingkan kurva standar NaNO2 .
Penentuan NO dengan Resonansi Paramagnetik Elektron (EPR)
Menurut metode kami sebelumnya [39, 55, 60], penentuan tingkat NO menggunakan resonansi paramagnetik elektron (EPR) dilakukan. Lapisan pelarut organik digunakan untuk menentukan NO pada spektrometer Bruker A300 (Bruker Instrument, Karlsruhe, Jerman) pada kondisi berikut:suhu kamar; frekuensi gelombang mikro, 9,85 GHz; daya gelombang mikro, 63,49 mW; dan frekuensi modulasi, 100.00 kHz.
Penentuan Aktivitas Nitrat Reduktase (NR)
Aktivitas NR dideteksi secara spektrofotometri pada 540 nm menurut metode sebelumnya [57]. Nitrit yang dihasilkan ditentukan secara spektrofotometri pada 540 nm dengan penambahan 1 mL 1% (b/v) sulfenilamida dalam 3 M HCl bersama dengan 1 mL 0,02% (v/v) n-(1-naftil)-etilendiamin.
Analisis Statistik
Jika diindikasikan, hasil dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± SE dari tiga percobaan independen dengan tiga ulangan biologis untuk masing-masing. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan software SPSS Statistics 17.0. Untuk analisis statistik, uji berganda Duncan (p < 0.05) dipilih yang sesuai.
Hasil
MWCNTs tidak hanya Masuk ke Sel Akar, tetapi juga Mempromosikan Pembentukan LR
Pembentukan LR merupakan penentu utama arsitektur sistem root. Untuk menyelidiki pengaruh MWCNT pada pembentukan LR, bibit tomat berumur 3 hari diinkubasi dengan kisaran konsentrasi MWCNT (0,05, 0,5, 5, dan 50 mg/mL) selama 3 hari. Aplikasi asam 1-naftilasetat (NAA) dianggap sebagai kontrol positif. Dalam percobaan kami, baik jumlah dan panjang LR ditentukan sebagai dua parameter pembentukan LR. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1, dibandingkan dengan sampel kontrol, MWCNT eksogen secara signifikan menginduksi pembentukan LR dengan cara yang bergantung pada dosis, dengan efek maksimal dalam 5 dan 50 mg/mL. Respons serupa yang dapat diinduksi diamati ketika 200 nM NAA diberikan. Mempertimbangkan biaya MWCNT dan respons yang dapat diinduksi dalam pembentukan LR, MWCNT 5 mg/mL diterapkan dalam eksperimen berikut.
Pembentukan LR tomat yang diinduksi MWCNT kira-kira bergantung pada dosis. Bibit tomat berumur tiga hari diperlakukan dengan 200 nM NAA dan konsentrasi MWCNT yang ditunjukkan, masing-masing. Jumlah dan panjang akar lateral yang muncul (> 1 mm) per bibit kemudian ditentukan setelah 3 hari perawatan. Terdapat 30 (10 × 3) tanaman dalam tiga ulangan biologis, dan percobaan dilakukan sebanyak 3 kali. Data adalah sarana ± SE. Dalam setiap rangkaian percobaan, batang yang dilambangkan dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada p < 0,05 menurut uji berganda Duncan
Untuk memvalidasi fungsi spesifik MWCNT dalam induksi pembentukan LR, kami menyelidiki lebih lanjut apakah alotropi MWCNT lainnya juga memiliki efek yang dapat diinduksi seperti itu. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, semua nanomaterial karbon ini menunjukkan efek toksik pada pertumbuhan tunas (data tidak ditampilkan). Menariknya, penerapan MWCNT, nanotube karbon berdinding tunggal (SWCNTs), graphene, dan karbon aktif dengan konsentrasi yang sama (5 mg/mL) dapat secara berbeda menghasilkan peningkatan jumlah dan panjang LR, dibandingkan dengan tanaman kontrol bebas bahan kimia. (Gbr. 2b). Di antara bahan kimia ini, respons maksimal yang dapat diinduksi ditemukan pada bibit tomat yang diinkubasi MWCNT.
Perubahan dalam pembentukan akar lateral sebagai respons terhadap nanopartikel karbon yang berbeda. Bibit tomat berumur tiga hari diperlakukan dengan air suling (Con), 5 mg/mL MWCNT, nanotube karbon berdinding tunggal (SWCNTs), graphene, dan karbon aktif (AC), masing-masing, selama 3 hari lagi. a Foto perwakilan kemudian diambil. b Jumlah dan panjang akar lateral yang muncul (> 1 mm) per semai juga ditentukan. Bilah skala = 50 mm. Terdapat 30 (10 × 3) tanaman dalam tiga ulangan biologis, dan percobaan dilakukan sebanyak 3 kali. Data adalah sarana ± SE. Dalam setiap rangkaian percobaan, batang yang dilambangkan dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada p < 0,05 menurut uji berganda Duncan
Dengan bantuan mikroskop elektron transmisi (TEM), distribusi MWCNT dapat dievaluasi dengan mudah. Hasil yang ditunjukkan pada Gambar 3 mengungkapkan bahwa MWCNT, ketika diterapkan secara eksogen, dapat diserap oleh bibit tomat, dan distribusi MWCNT ditemukan di sel akar. Hasil ini dapat dipahami, karena akar bibit dibiakkan secara langsung dalam larutan cair yang mengandung MWCNT.
Distribusi MWCNTs di akar tomat. Gambar TEM dari bibit tomat berumur 3 hari yang diolah dengan air suling (Con; a ) atau 5 mg/mL MWCNT (b ) selama 1 hari diambil. Panah merah menunjukkan dinding sel, sedangkan panah putih menunjukkan MWCNTs
Sintesis NO yang Diinduksi MWCNT dan Setelahnya Pembentukan LR Peka terhadap cPTIO, Pemulung NO
Untuk menyelidiki apakah NO juga terlibat dalam pembentukan LR yang diinduksi MWCNT, fungsi NO dalam pembentukan LR yang ditimbulkan oleh MWCNT dinilai dengan memanipulasi level NO endogen menggunakan senyawa pelepas NO dan pemulung. Mirip dengan hasil sebelumnya [31], pemberian natrium nitroprusside (SNP) dapat mengakibatkan induksi pembentukan LR, dan respon aditif diamati ketika SNP dan MWCNT diterapkan bersama-sama (Gbr. 4). Ketika 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt (cPTIO; pemulung NO) ditambahkan, respons promosi dalam pembentukan LR yang disebabkan oleh MWCNT secara signifikan terganggu. Sendiri, cPTIO dapat menghambat perkembangan LR, dibandingkan dengan kontrol bebas bahan kimia, yang menunjukkan peran penting NO endogen dalam organogenesis akar.
Pembentukan LR yang diinduksi MWCNT sensitif terhadap penghilangan NO endogen dengan cPTIO, pemulungnya. Bibit tomat berumur tiga hari diperlakukan dengan air suling, 5 mg/mL MWCNT, 0.1 mM SNP, 0.2 mM cPTIO, sendiri atau dalam kombinasi selama 3 hari. Setelah itu, jumlah dan panjang akar lateral yang muncul (> 1 mm) per semai kemudian ditentukan. Terdapat 30 (10 × 3) tanaman dalam tiga ulangan biologis, dan percobaan dilakukan sebanyak 3 kali. Data adalah sarana ± SE. Dalam setiap rangkaian percobaan, batang yang dilambangkan dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada p < 0,05 menurut uji berganda Duncan
Untuk mengevaluasi lebih lanjut peran penting NO endogen dalam respons MWCNT, perjalanan waktu produksi NO in vivo pertama kali dideteksi dengan metode reagen Greiss. Selama penentuan di atas, filtrat identik yang diolah dengan cPTIO dianggap sebagai blanko untuk hasil yang akurat. Diamati bahwa produksi NO pada akar bibit tomat meningkat secara dramatis sampai 24 jam setelah perlakuan MWCNT dan kemudian pulih ke tingkat awal (48 jam; Gambar 5a). Di atas tingkat maksimal NO endogen yang dipicu oleh MWCNT selama 24 jam jelas dihilangkan oleh cPTIO, pemulung NO, menunjukkan peran spesifik NO.
Produksi NO yang diinduksi MWCNT diblokir oleh cPTIO, pemulung NO. Bibit tomat berumur tiga hari diperlakukan dengan air suling dan 5 mg/mL MWCNTs dengan atau tanpa 0,2 mM cPTIO, masing-masing. a Perubahan aktivitas NR (kiri), dan produksi NO (kanan) ditentukan dengan metode pereaksi Greiss. b Setelah perawatan selama 24 jam, sinyal NO dianalisis dengan LSCM (kiri) dan EPR (kanan). Bilah skala = 0.1 mm. Data adalah sarana ± SE. Batang yang dilambangkan dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata pada p < 0,05 menurut uji ganda Ducan
Untuk mengkonfirmasi hasil di atas, baik LSCM dan ESR diadopsi. Pertama, perubahan kadar NO endogen dalam akar bibit tomat dipantau dengan memberi label NO menggunakan probe fluoresen DAF-FM DA yang permeabel dan cukup spesifik NO dan pencitraan dengan LSCM. Mirip dengan hasil sebelumnya (Gbr. 5a), dengan adanya cPTIO, peningkatan intensitas fluoresensi yang bergantung pada DAF-FM yang dipicu oleh MWCNT sangat dihilangkan (Gbr. 5b). Hasil ini menyiratkan bahwa fluoresensi yang dipicu DAF-FM terkait dengan tingkat NO endogen dalam akar bibit tomat.
Produksi NO yang diinduksi MWCNT dikonfirmasi oleh spektroskopi EPR. Seperti yang diharapkan, akar bibit yang dirawat selama 24 jam dengan MWCNT menghadirkan triplet struktur hyperfine khas dari kompleks NO. Namun, penambahan cPTIO menghilangkan sinyal di atas, menunjukkan bahwa paparan MWCNT menghasilkan produksi NO yang kuat (Gbr. 5b). Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwa sintesis NO mungkin diperlukan untuk pembentukan LR yang dipicu MWCNT pada bibit tomat.
NR Mungkin Bertanggung Jawab atas Produksi NO yang Diinduksi MWCNT dan Setelahnya Pembentukan LR
Karena NR dan NOS mirip mamalia adalah dua enzim utama yang terkait dengan sintesis NO pada tanaman, baik tungstat (penghambat NR) dan NAMA (penghambat NOS mamalia) diterapkan dalam percobaan berikutnya. Di sini, perlakuan tungstat secara substansial menekan promosi pembentukan LR pada akar bibit tomat yang diberi perlakuan MWCNT (Gbr. 6). Secara komparatif, induksi pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNTs tidak dihambat secara kuat oleh penambahan NAME, yang menunjukkan bahwa NOS seperti mamalia mungkin bukan target enzim sintetik NO yang bertanggung jawab atas produksi NO yang ditimbulkan oleh MWCNTs. Juga diamati bahwa sedikit tetapi tidak ada penurunan signifikan dalam pembentukan LR yang diamati pada bibit tomat ketika tungstate atau NAME diterapkan secara terpisah.
Perubahan dalam pembentukan LR sebagai respons terhadap MWCNT dan dua penghambat sintesis NO. Bibit tomat berumur tiga hari diperlakukan dengan 5 mg/mL MWCNT, 20 μM tungstate (Tg), 0.2 mM NAMA, sendiri atau dalam kombinasi selama 3 hari. Setelah itu, jumlah dan panjang akar lateral yang muncul (> 1 mm) per semai kemudian ditentukan. Terdapat 30 (10 × 3) tanaman dalam tiga ulangan biologis, dan percobaan dilakukan sebanyak 3 kali. Data adalah sarana ± SE. Dalam setiap rangkaian percobaan, batang yang dilambangkan dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada p < 0,05 menurut uji berganda Duncan
Peran NR dalam pembentukan LR yang dipicu MWCNT diperiksa lebih lanjut dengan memantau produksi NO sebagai respons terhadap MWCNT yang diterapkan dengan atau tanpa tungstat. Dibandingkan dengan perubahan produksi NO endogen (Gbr. 5a), analisis perjalanan waktu dalam aktivitas NR menunjukkan kecenderungan yang sama (Gbr. 7a), juga memuncak pada 24 jam setelah perawatan dengan MWCNT. Hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan produksi NO yang diinduksi MWCNT mungkin terutama disebabkan oleh peningkatan aktivitas NR. Secara konsisten, penghambatan produksi NO yang bergantung pada NR oleh tungstat dikonfirmasi dengan menggunakan metode reagen Greiss (Gbr. 7b), LSCM, dan EPR (File tambahan 1:Gambar S1).
Produksi NO yang diinduksi MWCNT diblokir oleh tungstat, penghambat NR. Bibit tomat berumur tiga hari diperlakukan dengan air suling dan MWCNTs 5 mg/mL dengan atau tanpa 20 μM tungstat (Tg). Perubahan aktivitas NR (a ) dan TANPA produksi (b ) ditentukan dengan menggunakan metode reagen Greiss. Data adalah sarana ± SE. Batang yang dilambangkan dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata pada p < 0,05 menurut uji ganda Ducan
Diskusi
Fitotoksisitas merupakan pertimbangan penting dalam memahami potensi dampak lingkungan dari nanopartikel [4, 7, 61,62,63]. Bukti berlimpah mengungkapkan bahwa MWCNT beracun bagi tanaman, termasuk menginduksi kerusakan oksidatif, menghambat perkecambahan biji, pertumbuhan akar, dan perkembangan [11, 63, 64]. Namun, sebagai fenotipe SIMR, percabangan akar melalui pembentukan akar lateral merupakan komponen penting dari adaptasi sistem akar untuk berbagai isyarat lingkungan [17]. Dalam karya ini, kami mengintegrasikan analisis biologis, farmakologis, dan biokimia untuk menunjukkan keterlibatan produksi NO yang dimediasi NR dalam pembentukan LR yang diinduksi MWCNT, setidaknya sebagian dalam kondisi eksperimental kami. Juga, fungsi NO dalam organogenesis akar yang dirangsang oleh MWCNTs menekankan peran sentral dari pembawa pesan kedua ini yang terlibat dalam proses perkembangan tanaman dan adaptasi terhadap stres [29,30,31,32,33, 37, 38].
Pertama, kami mengkonfirmasi bahwa 5 mg/mL MWCNTs (OD 6-12 nm) dapat masuk ke dalam jaringan akar (Gbr. 3). Setelah itu, induksi pembentukan LR tomat diamati (Gbr. 1), meniru peran induksi NAA dan SNP (Gbr. 4), senyawa pelepas NO yang terkenal [30, 31]. Respons induksi serupa ditemukan di pohon resin [41], selada [42], dan Arabidopsis [43] ketika ditantang dengan MWCNT (OD 6-13 nm, sekitar 9,5 nm, dan 30-40 nm, masing-masing). Misalnya, aplikasi dengan MWCNT murni (p-MWCNT) atau MWCNT yang difungsikan dengan karboksil (c-MWCNT) (diameter rata-rata 9,5 nm) dapat mendorong pengembangan LR pada bibit selada [42]. Sebaliknya, penghambatan akar primer dan bahkan pembentukan LR secara bersamaan ditemukan pada tanaman kedelai ketika dikenai MWCNT (OD 20-70 nm [40];). Dengan membandingkan dengan data dalam diameter luar MWCNTs (Tabel 1), kami menduga bahwa efek yang dipamerkan MWCNT pada pembentukan LR bervariasi dengan diameternya, menunjukkan promosi dengan diameter lebih rendah dan penghambatan dengan diameter lebih tinggi. Tentu saja, mekanisme terkait harus diselidiki dengan cermat. Fenomena serupa dikonfirmasi dalam toleransi salinitas tanaman [50]. Dikombinasikan dengan hasil di atas, selanjutnya disimpulkan bahwa fungsi nanomaterial dapat bervariasi dari spesies, dan sebaliknya, berbagai jenis nanomaterial dapat menyebabkan berbagai efek biologis. Namun, faktor lain yang mempengaruhi, seperti dosis MWCNT yang berbeda [48] dan bahkan kondisi pertumbuhan tanaman, tidak dapat dengan mudah dikesampingkan.
Dibandingkan dengan bahan nano lainnya, termasuk SWCNT, graphene, dan AC dengan konsentrasi yang sama, induksi maksimal dalam pembentukan LR dan bahkan efek toksik pada pertumbuhan tunas diamati pada MWCNT (Gbr. 2). Ini mungkin terkait dengan karakteristik fisik khusus MWCNT, salah satu jenis nanomaterial yang memiliki konduktivitas listrik tinggi, luas permukaan spesifik yang besar, rasio aspek yang tinggi, dan stabilitas termal yang luar biasa [65]. Efek racun dari bahan nano telah banyak dilaporkan pada mentimun, kubis, wortel, bawang, dll. [66, 67].
Banyak bukti menunjukkan bahwa NO, bertindak sebagai molekul sinyal, dapat mengatur berbagai proses tanaman dari adaptasi lingkungan untuk pengembangan dan yang terakhir termasuk perkecambahan biji dan organogenesis akar [29, 68,69,70,71,72,73] ]. Eksperimen kami selanjutnya mengungkapkan bahwa NO mungkin terlibat dalam pembentukan LR yang diinduksi MWCNT. Meskipun beberapa metode untuk pencitraan produksi NO dalam sel tumbuhan telah diterapkan, kerugiannya, termasuk kurangnya sensitivitas dan interferensi oleh molekul NO-independen, mungkin ada di setiap metode [74]. Dengan demikian, tiga metode yang bertanggung jawab untuk pencitraan dan penentuan NO, termasuk metode reagen Greiss, LSCM, dan EPR, bersama dengan penerapan cPTIO, pemulung NO, diterapkan dalam kondisi eksperimental kami. Dengan menggunakan tiga metode, kami mengamati bahwa peningkatan produksi NO endogen yang diinduksi oleh MWCNT pada bibit tomat dihilangkan oleh cPTIO (Gbr. 5), pemulung NO [30,31,32]. Yang penting, proses ini berkorelasi dengan respons biologis pengembangan LR yang diinduksi MWCNT, yang sangat terhambat ketika cPTIO diterapkan secara bersamaan (Gbr. 4).
Evaluasi lebih lanjut dari respons ini dan sumber potensial NO yang diinduksi oleh MWCNT yang diterapkan secara eksogen mengungkapkan bahwa produksi NO dan setelahnya pembentukan LR dapat dikaitkan dengan aktivitas NR. Pada tumbuhan, produksi NO terutama dihasilkan dari NR dan protein mirip NOS mamalia [28]. Namun, gen NOS tanaman masih belum diidentifikasi [35, 75, 76], meskipun beberapa percobaan menggunakan inhibitor enzim NOS mamalia memberikan beberapa bukti jalur yang bergantung pada l-arginin dalam produksi NO [36, 76]. NR dikonfirmasi menjadi sumber NO yang paling penting dalam tanaman [28]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa produksi NO yang bergantung pada NR berfungsi sebagai sinyal terkait nitrat yang terlibat dalam regulasi arsitektur akar [32, 33]. Selain itu, produksi NO yang bergantung pada NR terkait erat dengan aklimatisasi dingin [38], toleransi salinitas [50], dan penutupan stomata yang diinduksi asam absisat [77]. Hasil kami selanjutnya mengungkapkan bahwa tungstat (penghambat NR) jelas mengganggu pembentukan LR yang diinduksi MWCNT, terutama pada panjang LR (Gbr. 6). Sebaliknya, hanya ada sedikit penurunan panjang LR, dan tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada jumlah LR ketika l-NAME (penghambat NOS mamalia) digunakan. Secara konsisten, uji biokimia menunjukkan bahwa aktivitas NR jelas meningkat oleh MWCNTs (Gbr. 7a), sejajar dengan perubahan produksi NO (Gbr. 5a). Tanggapan di atas dapat sepenuhnya diblokir oleh tungstate (Gbr. 7a, File tambahan 1:Gambar S1). Dengan demikian kami menyimpulkan bahwa peningkatan produksi NO endogen yang disebabkan oleh MWCNT terutama dikaitkan dengan jalur NR. Certainly, further genetic evidence should be investigated.
Conclusion
In summary, we provide evidence to show that MWCNT-induced NO production via NR might be required for tomato lateral root formation and this was summarized in Fig. 8. Importantly, above findings provide insights into the intricate molecular mechanism of MWCNTs functions in plants.
Schematic representation of the proposed MWCNT-induced tomato lateral root formation mainly via NR-dependent NO production. The role of mammalian NOS-like enzyme was preliminarily ruled out
Ketersediaan Data dan Materi
All data are fully available without restriction.
Singkatan
CO:
Carbon monoxide
cPTIO:
2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt
