Bagaimana Nanotubus Karbon Multi-Dinding Mempromosikan Perkembangan Akar Samping Tomat melalui Sinyal Nitrik Oksida
Abstrak
Studi yang melimpah mengungkapkan bahwa nanotubus karbon multi-dinding (MWCNT) beracun bagi tanaman. Namun, apakah dan bagaimana MWCNT mempengaruhi pembentukan akar samping (LR), yang merupakan komponen penting dari adaptabilitas sistem akar terhadap berbagai petunjuk lingkungan, masih kontroversial. Dalam laporan ini, kami menemukan bahwa MWCNT dapat masuk ke dalam akar bibit tomat. Pemberian MWCNT mempromosikan pembentukan LR tomat dengan cara yang bergantung pada dosis secara aproksimat. Produksi endogen oksida nitrik (NO) dipicu oleh MWCNT, dikonfirmasi oleh metode reagen Greiss, resonansi paramagnetik elektron (EPR), dan mikroskop konfokal pindai laser (LSCM), bersama dengan penangkap NO. Ada hubungan sebab-akibat antara MWCNT dan NO dalam induksi perkembangan LR, karena sintesis NO yang dipicu oleh MWCNT dan pembentukan LR secara jelas terblokir oleh penghapusan NO endogen dengan penangkapnya. Aktivitas enzim pembangkit NO reduktase nitrat (NR) meningkat sebagai respons terhadap MWCNT. Inhibisi NR oleh natrium tungstat tidak hanya mengganggu produksi NO, tetapi juga membatalkan pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT. Penambahan NG-nitro-l-arginine methyl ester (l-NAME), inhibitor enzim NOS seperti mamalia, gagal mempengaruhi pembentukan LR. Secara kolektif, kami mengusulkan bahwa NO mungkin berfungsi sebagai molekul sinyal downstream dalam kontrol MWCNT atas perkembangan LR, setidaknya sebagian melalui NR.
Pendahuluan
Ada banyak aplikasi biologis dan biomedis dari nanotubus karbon [1, 2]. Karena kemampuan unik untuk dengan mudah menembus sel membran, biosafety nanotubus karbon selalu menjadi topik perdebatan [3, 4]. Sementara itu, karena produksi dan penggunaan nanotubus karbon tumbuh dengan cepat, menjadi penting untuk mengkarakterisasi mekanisme detail sitotoksisitasnya pada manusia dan mamalia, dan baru-baru ini pada tanaman [3,4,5,6,7,8,9]. Hal yang diketahui bahwa tanaman dan komunitas mereka sangat penting bagi manusia dan lingkungan, dan mereka berisiko terhadap paparan nanotubus karbon baik karena penumpukan di tanah melalui aplikasi pupuk biosolid [6, 10, 11]. Sebagai anggota penting dari nanotubus karbon, toksisitas nanotubus karbon multi-dinding (MWCNT), yang terdiri dari banyak lapisan grafine yang digulung, telah diteliti secara luas. Studi pada mamalia mengungkapkan bahwa paparan baik MWCNT maupun nanotubus karbon tunggal dinding (SWCNT) mengakibatkan kerusakan oksidatif dan aktivasi NF-κB dalam sel keratinosit manusia dan sel A549 [9, 12]. MWCNT dan SWCNT dapat menyatu dengan membran plasma, sehingga menyebabkan kerusakan sel melalui peroksidasi lipid dan stres oksidatif [9, 11, 13, 14]. Sitotoksisitas dan stres oksidatif yang dipicu oleh MWCNT, serta respons inflamasi yang modest, diamati pada sel endotelis vena tali tali manusia [15]. Penelitian sebelumnya mengusulkan bahwa toksisitas primer MWCNT pada bayam merah terutama berasal dari produksi ROS berlebihan, dan efek toksis dapat dibalik oleh asam asbatik yang disuplai [7]. Dalam arti ini, MWCNT dianggap sebagai faktor stres baru bagi organisme, baik pada hewan maupun tanaman.
Pembentukan akar samping (LR), determinan penting dari arsitektur akar, telah dianggap sebagai indikator respons adaptif terhadap berbagai stres [16]. Pada tanaman tinggi, pembentukan LR dipengaruhi oleh fitohormon dan berbagai petunjuk lingkungan, termasuk ketersediaan air, nutrisi, dan stres abiotik, seperti hipoksia dan stres logam berat [17,18,19]. Sementara itu, bukti yang melimpah mengonfirmasi bahwa pembentukan LR tidak hanya bertindak sebagai dukungan fisik, tetapi juga berkontribusi pada penyerapan air dan nutrisi untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman [19,20,21]. Petunjuk lingkungan yang berbeda dapat memicu beberapa fenotip respons morfogenik yang diinduksi stres (SIMR) tertentu, termasuk promosi pembentukan LR dan inhibisi pertumbuhan akar utama [17].. Regulasi pembentukan LR juga dikontrol erat oleh fitohormon, seperti auxin, dan aktivasi gen regulasi siklus sel sebagai respons terhadap auxin disarankan [19, 22]. Sementara itu, keterlibatan beberapa molekul kecil dalam organogenesis akar yang dipicu auxin dikonfirmasi pada tanaman timun, tomat, kedelai, dan kolza [23,24,25,26,27]. Molekul kecil ini termasuk peroksida hidrogen (H2O2), oksida nitrik (NO), karbon monoksida (CO), dan gas hidrogen (H2).
Di antara ini, NO, radikal bebas gas, telah menunjukkan memiliki banyak fungsi fisiologis pada tanaman [28, 29]. Selain peningkatan adaptasi tanaman terhadap stres, fungsi NO termasuk promosi perkembangan rambut akar, pembentukan akar adventisius, dan pembentukan akar samping [30,31,32,33], meskipun sumber enzim biosintesis NO dalam proses tersebut masih misterius. Pada hewan, sintesis NO dari l-arginin dikatalisis oleh enzim yang mengandung heme nitric oxide synthase (NOS) [34]. Meskipun gen yang mengkode enzim NOS belum teridentifikasi pada tanaman, aktivitas NOS seperti mamalia terdeteksi secara luas [35, 36], dan inhibitor NOS mamalia, seperti NG-nitro-l-arginine methyl ester hidroklorida (l-NAME), dapat menghambat generasi NO pada tanaman [25, 33, 36,37,38,39]. Pentingnya, bukti genetika yang melimpah mengungkapkan bahwa NO dapat dihasilkan oleh reduktase nitrat (NR), enzim yang dikenal yang bertanggung jawab atas metabolisme nitrogen pada tanaman [28]. Keterlibatan produksi NO yang dimediasi NR dalam penutupan stomata dan aklimatisasi dingin telah ditunjukkan secara genetik [37, 38]. Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa sintesis NO yang bergantung NR terlibat dalam pembentukan akar samping yang diinduksi auxin melalui gas hidrogen [39].
Hingga saat ini, respons yang berbeda dalam pembentukan LR, promosi atau inhibi, masing-masing dilaporkan pada berbagai spesies tanaman saat disuplai dengan nanomaterial, termasuk MWCNT [40,41,42,43], nanoparticle emas (Au NP, [44]), nanoparticle oksida seng (ZnO NP [45, 46];), nanoparticle titanium dioksida (TiO2 NP [46];), dan oksida grafen (GO [47,48,49];) (Tabel 1), dan tidak ada studi yang telah memberikan bukti definitif tentang peran NO dalam respons di atas. Dalam studi ini, deteksi NO endogen dengan metode reagen Greiss, mikroskop konfokal pindai laser (LSCM), dan analisis resonansi paramagnetik elektron (EPR) mengungkapkan bahwa tingkat NO meningkat pada bibit tomat yang diobati MWCNT. Setelah itu, pembentukan LR diamati. Kami lebih jauh mempelajari keterlibatan NO dalam pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT, dengan memanipulasi tingkat NO endogen menggunakan penangkap NO dan antagonis yang menghambat NR dan aktivitas NOS seperti mamalia. Eksperimen lebih lanjut mengungkapkan bahwa NO yang bergantung NR mungkin, setidaknya sebagian, esensial untuk pembentukan LR sebagai respons terhadap MWCNT. Kerja ini membuka jendela baru untuk memahami efek biologis nanomaterial pada tanaman.
Bahan dan Metode
Kimia
Selain dinyatakan lain, semua kimia lainnya diperoleh dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO, AS). MWCNT, dibeli dari Sigma-Aldrich, dikarakterisasi seperti yang telah dijelaskan sebelumnya [50]. Diameter luar, diameter dalam, dan panjang MWCNT adalah 6–12 nm, 2,5–5 nm, dan 1–9 μm, masing-masing. Setelah perlakuan ultrasonikasi, suspensi koloid homogen yang diperoleh diesterilkan dan digunakan.
Nanopartikel karbon lainnya diperoleh dari Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd., termasuk nanotubus karbon tunggal dinding (SWCNT, XFS22; keutuhan > 95%, diameter 1–2 nm, panjang 5–30 μm, luas permukaan spesifik > 1075 m2/g), grafen (XF001W; keutuhan ~ 99%, diameter 0,5–5 μm, tebal ~ 0,8 nm, rasio lapisan tunggal ~ 80%, luas permukaan BET 500~1000 m2/g; resistansi listrik ≦ 0,30 Ω.cm), dan karbon aktif (AC, XFP06; keutuhan > 95%, ukuran partikel 5 ± 1 μm, volume pori 1–1,2 cm3/g, lubang pori 2,0–2,2 nm, luas permukaan spesifik ~ 1500–1700 m2/g).
Selain itu, natrium nitroprusida (SNP) digunakan sebagai senyawa pelolos NO [30,31,32,33]. 2-(4-Karboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolin-1-oksil-3-oksida garam kalium (cPTIO) dianggap sebagai penangkap NO [51,52,53,54]. Tungstat (Tg; inhibitor NR [28, 33, 37, 55,56,57];) dan NG-nitro-L-arginine methyl ester hidroklorida (NAME; inhibitor enzim NOS seperti mamalia [25, 33, 36,37,38,39];) juga diterapkan. Dalam studi ini, konsentrasi kimia di atas ditentukan dalam eksperimen pilot, dari mana respons signifikan diamati.
Bahan Tanaman dan Kondisi Pertumbuhan serta Penentuan Pembentukan LR
Biji tomat (Solanum lycopersicum L.) “Jiangshu 14” disediakan ramah oleh Lembaga Pertanian Jiangsu, Nanjing, Provinsi Jiangsu, China. Biji yang dipilih dengan ukuran identik diurai dalam air destilasi pada 25 ± 1 °C dalam kegelapan selama 3 hari. Bibit yang dipilih identik dengan radikel 2–3 mm kemudian dipindahkan ke dalam larutan perlakuan 6 mL yang mengandung konsentrasi yang ditunjukkan MWCNT, 200 nM 1-nafilenasetat asam (NAA; auxin yang dikenal), 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, 20 μM tungstat (Tg), 0,2 mM NAME, dan nanoparticle karbon lain, termasuk 5 mg/mL nanotubus karbon tunggal dinding (SWCNTs), grafen, dan karbon aktif (AC), sendirian atau dalam kombinasi untuk titik waktu yang ditunjukkan. Bibit ditumbuhkan dalam inkubator terang (25 ± 1 °C) dengan intensitas cahaya 200 μmol m−2 s−1 pada siklus cahaya/gelap 14/10 jam.
Setelah perlakuan, foto diambil, dan jumlah serta panjang akar samping yang muncul (> 1 mm) per bibit kemudian ditentukan menggunakan perangkat lunak Image J (https://rsb.info.nih.gov/ij/) [39, 58]. Seperti yang dijelaskan sebelumnya, hanya segmen akar yang dapat diinduksi LR yang digunakan untuk analisis berikutnya.
Pengcitraan Distribusi MWCNT dengan Mikroskop Elektron Transmisi
Distribusi MWCNT dalam akar bibit tomat dikarakterisasi menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM; JEOL, JEM-200CX, Tokyo, Jepang). Persiapan sampel untuk analisis TEM sesuai dengan protokol sebelumnya [59].
Pengcitraan NO Endogen dengan Mikroskop Konfokal Pindai Laser
Pengcitraan NO dilakukan dengan menggunakan sond fluoresen NO yang cukup spesifik 4-amino-5-metilamino-2′,7′-difluorofluoresin diasetat (DAF-FM DA). Setelah sond dicuci bersih, citra diperoleh menggunakan mikroskop konfokal Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman, excitasi pada 488 nm, emisi pada 500–530 nm untuk analisis NO). Dalam eksperimen kami, 20 sampel individu dipilih secara acak dan diukur per perlakuan. Foto adalah representatif dari hasil yang identik.
Penentuan Kandungan NO dengan Uji Reagen Griess
Menurut metode yang telah dijelaskan sebelumnya [50], kandungan NO ditentukan dengan uji reagen Griess. Pentingnya, untuk menghindari gangguan yang disebabkan oleh kandungan nitrat dan nitrit yang terkonsentrasi dalam tanaman, sampel identik yang prainkubasi dalam 200 μM cPTIO (penangkap NO) selama 30 menit dianggap sebagai sampel kosong. Setelah penambahan reagen Griess selama 30 menit, absorbansi dicatat pada 540 nm, dan kandungan NO ditentukan dengan membandingkan dengan kurva standar NaNO2.
Penentuan NO dengan Resonansi Paramagnetik Elektron (EPR)
Menurut metode kami sebelumnya [39, 55, 60], penentuan tingkat NO menggunakan resonansi paramagnetik elektron (EPR) dilakukan. Lapisan pelarut organik digunakan untuk menentukan NO pada spektrometer Bruker A300 (Bruker Instrument, Karlsruhe, Jerman) dalam kondisi berikut: suhu ruangan; frekuensi mikrogelombang, 9,85 GHz; daya mikrogelombang, 63,49 mW; dan frekuensi modulasi, 100,00 kHz.
Penentuan Aktivitas Reduktase Nitrat (NR)
Aktivitas NR terdeteksi spektrofotometrik pada 540 nm sesuai dengan metode sebelumnya [57]. Nitrit yang dihasilkan ditentukan spektrofotometrik pada 540 nm dengan penambahan 1 mL sulfanilamida 1% (b/v) dalam 3 M HCl bersama dengan 1 mL n-(1-nafil)-etilenediamin 0,02% (v/v).
Analisis Statistik
Di mana ditunjukkan, hasil dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± SE dari tiga eksperimen independen dengan tiga replikasi biologis untuk masing-masing. Analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak SPSS Statistics 17.0. Untuk analisis statistik, uji Duncan’s multiple test (p < 0,05) dipilih sebagai yang sesuai.
Hasil
MWCNT tidak hanya Masuk ke Sel Akar, tetapi juga Mempromosikan Pembentukan LR
Pembentukan LR adalah determinan utama arsitektur sistem akar. Untuk menyelidiki efek MWCNT terhadap pembentukan LR, bibit tomat berusia 3 hari diinkubasi dengan berbagai konsentrasi MWCNT (0,05, 0,5, 5, dan 50 mg/mL) selama 3 hari. Penerapan 1-nafilenasetat asam (NAA) dianggap sebagai kontrol positif. Dalam eksperimen kami, baik jumlah maupun panjang LR ditentukan sebagai dua parameter pembentukan LR. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1, dibandingkan dengan sampel kontrol, MWCNT eksogen secara signifikan menginduksi pembentukan LR dengan cara yang bergantung pada dosis secara aproksimat, dengan efek maksimal pada 5 dan 50 mg/mL. Respons indusibel yang serupa diamati saat 200 nM NAA diberikan. Mempertimbangkan biaya MWCNT dan respons indusibel dalam pembentukan LR, 5 mg/mL MWCNT diterapkan dalam eksperimen berikutnya.
Pembentukan LR tomat yang dipicu oleh MWCNT dengan cara yang bergantung pada dosis secara aproksimat. Bibit tomat berusia 3 hari diobati dengan 200 nM NAA dan konsentrasi MWCNT yang ditunjukkan, masing-masing. Jumlah dan panjang akar samping yang muncul (> 1 mm) per bibit kemudian ditentukan setelah 3 hari perlakuan. Terdapat 30 (10 × 3) tanaman dalam tiga replikasi biologis, dan eksperimen dilakukan sebanyak 3 kali. Data adalah rata-rata ± SE. Dalam setiap set eksperimen, bar yang ditandai dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada tingkat p < 0,05 menurut uji Duncan’s multiple test
Untuk memvalidasi fungsi spesifik MWCNT dalam induksi pembentukan LR, kami lebih lanjut menyelidiki apakah alotropi lain dari MWCNT juga memiliki efek indusibel tersebut. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a, semua bahan karbon nano ini menunjukkan efek toksis pada pertumbuhan batang (data tidak ditampilkan). Menariknya, penerapan MWCNT, nanotubus karbon tunggal dinding (SWCNTs), grafen, dan karbon aktif dengan konsentrasi yang sama (5 mg/mL) dapat secara berbeda menghasilkan peningkatan jumlah dan panjang LR, dibandingkan tanaman kontrol tanpa kimia (Gambar 2b). Di antara bahan kimia ini, respons indusibel maksimal ditemukan pada bibit tomat yang diobati MWCNT.
Perubahan dalam pembentukan LR sebagai respons terhadap berbagai nanoparticle karbon. Bibit tomat berusia 3 hari diobati dengan air destilasi (Con), 5 mg/mL MWCNT, nanotubus karbon tunggal dinding (SWCNTs), grafen, dan karbon aktif (AC), masing-masing, selama 3 hari lagi. a Foto representatif kemudian diambil. b Jumlah dan panjang akar samping yang muncul (> 1 mm) per bibit kemudian ditentukan juga. Skala bar = 50 mm. Terdapat 30 (10 × 3) tanaman dalam tiga replikasi biologis, dan eksperimen dilakukan sebanyak 3 kali. Data adalah rata-rata ± SE. Dalam setiap set eksperimen, bar yang ditandai dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada tingkat p < 0,05 menurut uji Duncan’s multiple test
Dengan bantuan mikroskop elektron transmisi (TEM), distribusi MWCNT dapat dievaluasi dengan mudah. Hasil yang ditampilkan pada Gambar 3 mengungkapkan bahwa MWCNT, ketika diterapkan secara eksogen, dapat diserap oleh bibit tomat, dan distribusi MWCNT ditemukan di dalam sel akar. Hasil ini dapat dipahami, karena akar bibit secara langsung dibudidayakan dalam larutan cair yang mengandung MWCNT.
Distribusi MWCNT dalam akar tomat. Citra TEM dari bibit tomat berusia 3 hari yang diobati dengan air destilasi (Con; a) atau 5 mg/mL MWCNTs (b) selama 1 hari diambil. Panah merah menunjukkan dinding sel, sementara panah putih menunjukkan MWCNTs
Sintesis NO yang Dipicu oleh MWCNT dan Pembentukan LR Setelahnya Sensitif terhadap cPTIO, Penangkap NO
Untuk menyelidiki apakah NO juga terlibat dalam pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT, fungsi NO dalam pembentukan LR yang diaktifkan oleh MWCNT dievaluasi dengan memanipulasi tingkat NO endogen menggunakan senyawa pelolos NO dan penangkap. Serupa dengan hasil sebelumnya [31], pemberian natrium nitroprusida (SNP) dapat mengakibatkan induksi pembentukan LR, dan respons aditif diamati saat SNP dan MWCNT diterapkan bersama (Gambar 4). Ketika 2-(4-karboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolin-1-oksil-3-oksida garam kalium (cPTIO; penangkap NO) ditambahkan, respons promosi dalam pembentukan LR yang disebabkan oleh MWCNT secara signifikan terganggu. Sendirian, cPTIO dapat menghambat perkembangan LR, dibandingkan kontrol tanpa kimia, yang menunjukkan peran penting NO endogen dalam organogenesis akar.
Pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT sensitif terhadap penghapusan NO endogen dengan cPTIO, penangkapnya. Bibit tomat berusia 3 hari diobati dengan air destilasi, 5 mg/mL MWCNT, 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, sendirian atau dalam kombinasi selama 3 hari. Setelah itu, jumlah dan panjang akar samping yang muncul (> 1 mm) per bibit kemudian ditentukan. Terdapat 30 (10 × 3) tanaman dalam tiga replikasi biologis, dan eksperimen dilakukan sebanyak 3 kali. Data adalah rata-rata ± SE. Dalam setiap set eksperimen, bar yang ditandai dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada tingkat p < 0,05 menurut uji Duncan’s multiple test
Untuk mengevaluasi lebih lanjut peran penting NO endogen dalam respons MWCNT, deret waktu produksi NO in vivo pertama kali dideteksi dengan metode reagen Griess. Selama penentuan di atas, filtrat identik yang diobati cPTIO dianggap sebagai kosong untuk hasil yang akurat. Teramati bahwa produksi NO di akar bibit tomat meningkat secara dramatis hingga 24 jam setelah perlakuan MWCNT dan kemudian pulih ke tingkat awal (48 jam; Gambar 5a). Tingkat endogen NO maksimal yang dipicu oleh MWCNT selama 24 jam secara jelas dibatalkan oleh cPTIO, penangkap NO, yang menunjukkan peran spesifik NO.
Produksi NO yang dipicu oleh MWCNT diblokir oleh cPTIO, penangkap NO. Bibit tomat berusia 3 hari diobati dengan air destilasi dan 5 mg/mL MWCNTs dengan atau tanpa 0,2 mM cPTIO, masing-masing. a Perubahan dalam aktivitas NR (kiri), dan produksi NO (kanan) yang ditentukan menggunakan metode reagen Griess. b Setelah perlakuan selama 24 jam, sinyal NO dianalisis dengan LSCM (kiri) dan EPR (kanan). Skala bar = 0,1 mm. Data adalah rata-rata ± SE. Bar yang ditandai dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada tingkat p < 0,05 menurut uji Ducan’s multiple test
Untuk mengonfirmasi hasil di atas, baik LSCM maupun ESR diadopsi. Pertama, perubahan dalam tingkat NO endogen di akar bibit tomat dipantau dengan melabeli NO menggunakan sond fluoresen NO yang cukup spesifik dan dapat menembus sel DAF-FM DA dan diimajing dengan LSCM. Serupa dengan hasil sebelumnya (Gambar 5a), dalam kehadiran cPTIO, intensitas fluoresensi tergantung DAF-FM yang meningkat yang dipicu oleh MWCNT sangat terhapus (Gambar 5b). Hasil ini mengimplikasikan bahwa fluoresensi yang dipicu oleh DAF-FM terkait dengan tingkat NO endogen di akar bibit tomat.
Produksi NO yang dipicu oleh MWCNT dikonfirmasi oleh spektroskopi EPR. Seperti yang diharapkan, akar bibit yang diobati selama 24 jam dengan MWCNT menunjukkan struktur hiperfine triplet tipis dari kompleks NO. Namun, penambahan cPTIO membatalkan sinyal di atas, mengindikasikan bahwa paparan MWCNT memang menghasilkan produksi NO yang kuat (Gambar 5b). Secara kolektif, data ini mengusulkan bahwa sintesis NO mungkin diperlukan untuk pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT pada bibit tomat.
NR Mungkin Bertanggung Jawab atas Produksi NO yang Dipicu oleh MWCNT dan Pembentukan LR Setelahnya
Karena NR dan NOS seperti mamalia adalah dua enzim utama yang terkait dengan sintesis NO pada tanaman, baik tungstat (inhibitor NR) maupun NAME (inhibitor NOS mamalia) diterapkan dalam eksperimen berikutnya. Di sini, perlakuan tungstat secara substansial menekan promosi pembentukan LR di akar bibit tomat yang diobati MWCNT (Gambar 6). Secara komparatif, induksi pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT tidak terhambat kuat dengan penambahan NAME, yang menunjukkan bahwa NOS seperti mamalia mungkin bukan enzim sintesis NO target yang bertanggung jawab atas produksi NO yang diaktifkan oleh MWCNT. Juga diamati bahwa penurunan ringan tetapi tidak signifikan dalam pembentukan LR diamati pada bibit tomat saat baik tungstat maupun NAME diterapkan secara terpisah.
Perubahan dalam pembentukan LR sebagai respons terhadap MWCNT dan dua inhibitor sintesis NO. Bibit tomat berusia 3 hari diobati dengan 5 mg/mL MWCNT, 20 μM tungstat (Tg), 0,2 mM NAME, sendirian atau dalam kombinasi selama 3 hari. Setelah itu, jumlah dan panjang akar samping yang muncul (> 1 mm) per bibit kemudian ditentukan. Terdapat 30 (10 × 3) tanaman dalam tiga replikasi biologis, dan eksperimen dilakukan sebanyak 3 kali. Data adalah rata-rata ± SE. Dalam setiap set eksperimen, bar yang ditandai dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada tingkat p < 0,05 menurut uji Duncan’s multiple test
Peran NR dalam pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT lebih lanjut diperiksa dengan memantau produksi NO sebagai respons terhadap MWCNT yang diterapkan dengan atau tanpa tungstat. Dibandingkan dengan perubahan dalam produksi NO endogen (Gambar 5a), analisis deret waktu aktivitas NR menunjukkan kecenderungan yang serupa (Gambar 7a), juga mencapai puncak pada 24 jam setelah perlakuan dengan MWCNT. Hasil ini mengusulkan bahwa peningkatan produksi NO yang dipicu oleh MWCNT mungkin terutama berasal dari aktivitas NR yang ditingkatkan. Secara konsisten, inhibisi produksi NO yang bergantung NR oleh tungstat dikonfirmasi dengan menggunakan metode reagen Griess (Gambar 7b), LSCM, dan EPR (berkas tambahan 1: Gambar S1).
Produksi NO yang dipicu oleh MWCNT diblokir oleh tungstat, inhibitor NR. Bibit tomat berusia 3 hari diobati dengan air destilasi dan 5 mg/mL MWCNTs dengan atau tanpa 20 μM tungstat (Tg). Perubahan dalam aktivitas NR (a) dan produksi NO (b) ditentukan menggunakan metode reagen Griess. Data adalah rata-rata ± SE. Bar yang ditandai dengan huruf yang sama tidak berbeda secara signifikan pada tingkat p < 0,05 menurut uji Ducan’s multiple test
Pembahasan
Fitotoksisitas adalah pertimbangan signifikan dalam memahami dampak lingkungan potensial nanopartikel [4, 7, 61,62,63]. Bukti yang melimpah mengungkapkan bahwa MWCNT beracun bagi tanaman, termasuk menginduksi kerusakan oksidatif, menghambat penguraian biji, pertumbuhan akar, dan perkembangan [11, 63, 64]. Namun, sebagai fenotipe SIMR, cabang akar melalui pembentukan akar samping adalah komponen penting dari adaptabilitas sistem akar terhadap berbagai petunjuk lingkungan [17]. Dalam pekerjaan ini, kami mengintegrasikan analisis biologis, farmakologis, dan biokimiawi untuk menunjukkan keterlibatan produksi NO yang dimediasi NR dalam pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT, setidaknya sebagian dalam kondisi eksperimen kami. Juga, fungsi NO dalam organogenesis akar yang dituntun oleh MWCNT menekankan peran pusat dari pesan kedua ini yang terlibat dalam proses perkembangan tanaman dan adaptasi terhadap stres [29,30,31,32,33, 37, 38].
Pertama, kami mengonfirmasi bahwa 5 mg/mL MWCNT (OD 6–12 nm) dapat masuk ke dalam jaringan akar (Gambar 3). Setelah itu, induksi pembentukan LR tomat diamati (Gambar 1), meniru peran indusi NAA dan SNP (Gambar 4), senyawa pelolos NO yang dikenal [30, 31]. Respons indusibel yang serupa ditemukan pada pohon resinus [41], selada [42], dan Arabidopsis [43] saat ditantang dengan MWCNT (OD 6–13 nm, sekitar 9,5 nm, dan 30–40 nm, masing-masing). Misalnya, penerapan baik MWCNT asli (p-MWCNT) maupun MWCNT yang difungsionalkan karboksil (c-MWCNT) (diameter rata-rata 9,5 nm) dapat mempromosikan perkembangan LR pada bibit selada [42]. Sebaliknya, inhibisi akar utama dan bahkan pembentukan LR ditemukan secara bersamaan pada tanaman kedelai saat ditetapkan MWCNT (OD 20–70 nm [40];). Dengan membandingkan dengan data di diameter luar MWCNT (Tabel 1), kami mengasumsikan bahwa efek MWCNT terhadap pembentukan LR bervariasi dengan diameter mereka, menunjukkan promosi dengan diameter lebih rendah dan inhibi dengan diameter yang lebih tinggi. Tentu saja, mekanisme terkait harus diteliti dengan hati-hati. Fenomena yang serupa dikonfirmasi pada toleransi kekeringan tanaman [50]. Digabungkan dengan hasil di atas, disimpulkan lebih lanjut bahwa fungsi nanomaterial dapat bervariasi dari spesies, dan sebaliknya, berbagai jenis nanomaterial dapat menyebabkan efek biologis yang berbeda. Namun, faktor pengaruh lain, seperti berbagai dosis MWCNT [48] dan bahkan kondisi pertumbuhan tanaman, tidak dapat dengan mudah diabaikan.
Dibandingkan dengan nanomaterial lain, termasuk SWCNT, grafen, dan AC dengan konsentrasi yang sama, induksi maksimal dalam pembentukan LR dan bahkan efek toksis pada pertumbuhan batang diamati pada MWCNT (Gambar 2). Ini mungkin terkait dengan karakteristik fisik khusus dari MWCNT, salah satu jenis nanomaterial yang memiliki konduktivitas listrik tinggi, luas permukaan spesifik yang besar, rasio aspek tinggi, dan stabilitas termal yang luar biasa [65]. Efek toksis nanomaterial telah banyak dilaporkan pada timun, kol, wortel, bawang, dll. [66, 67].
Bukti yang melimpah menunjukkan bahwa NO, berfungsi sebagai molekul sinyal, dapat mengatur berbagai proses tanaman dari adaptasi lingkungan hingga perkembangan yang terakhir meliputi penguraian biji dan organogenesis akar [29, 68,69,70,71,72,73]. Eksperimen selanjutnya kami mengungkapkan bahwa NO mungkin terlibat dalam pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT. Meskipun beberapa metode untuk pengcitraan produksi NO pada sel tanaman telah diterapkan, kelemahan, termasuk kurangnya sensitivitas dan gangguan oleh molekul yang tidak bergantung NO, mungkin ada dalam setiap metode [74]. Dengan demikian, tiga metode yang bertanggung jawab untuk pengcitraan dan penentuan NO, termasuk metode reagen Griess, LSCM, dan EPR, bersama dengan penerapan cPTIO, penangkap NO, diterapkan dalam kondisi eksperimen kami. Dengan menggunakan tiga metode, kami mengamati bahwa produksi NO endogen yang meningkat yang dipicu oleh MWCNT pada bibit tomat diblokir oleh cPTIO (Gambar 5), penangkap NO [30,31,32]. Pentingnya, proses ini berkaitan dengan respons biologis pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT, yang terhalang parah saat cPTIO diterapkan secara bersamaan (Gambar 4).
Evaluasi lebih lanjut terhadap respons ini dan sumber potensial NO yang diinduksi oleh MWCNT yang diterapkan secara eksogen mengungkapkan bahwa produksi NO dan pembentukan LR setelahnya dapat dikaitkan dengan aktivitas NR. Pada tanaman, produksi NO terutama dihasilkan dari NR dan protein NOS seperti mamalia [28]. Namun, gen NOS tanaman masih belum teridentifikasi [35, 75, 76], meskipun beberapa eksperimen menggunakan inhibitor enzim NOS mamalia memberikan beberapa bukti tentang jalur bergantung l-arginin dalam produksi NO [36, 76]. NR dikonfirmasi sebagai sumber NO yang paling penting pada tanaman [28]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa produksi NO yang bergantung NR berfungsi sebagai sinyal terkait nitrat yang terlibat dalam regulasi arsitektur akar [32, 33]. Selain itu, produksi NO yang bergantung NR berkaitan erat dengan aklimatisasi dingin [38], toleransi kekeringan [50], dan penutupan stomata yang diinduksi asam absisik [77]. Hasil kami lebih lanjut mengungkapkan bahwa tungstat (inhibitor NR) secara jelas mengganggu pembentukan LR yang dipicu oleh MWCNT, terutama pada panjang LR (Gambar 6). Sebaliknya, hanya ada penurunan ringan dalam panjang LR, dan tidak ada perbedaan yang diamati dalam jumlah LR saat l-NAME (inhibitor NOS mamalia) digunakan. Secara konsisten, uji biokimia menunjukkan bahwa aktivitas NR meningkat secara jelas oleh MWCNT (Gambar 7a), sejalan dengan perubahan dalam produksi NO (Gambar 5a). Respons di atas dapat sepenuhnya diblokir oleh tungstat (Gambar 7a, berkas tambahan 1: Gambar S1). Kami berdeduksi bahwa produksi NO endogen yang meningkat yang dipicu oleh MWCNT terutama dikaitkan dengan jalur NR. Tentu, bukti genetika lebih lanjut harus diteliti.
Kesimpulan
Secara ringkas, kami memberikan bukti untuk menunjukkan bahwa produksi NO yang dipicu oleh MWCNT melalui NR mungkin diperlukan untuk pembentukan akar samping tomat dan ini diringkas pada Gambar 8. Pentingnya, temuan di atas memberikan wawasan tentang mekanisme molekuler yang rumit dari fungsi MWCNT pada tanaman.
Representasi skematis pembentukan akar samping tomat yang dipicu oleh MWCNT yang diusulkan terutama melalui produksi NO yang bergantung NR. Peran enzim NOS seperti mamalia awalnya telah diabaikan
