Graphene Oxide Hybridized nHAC/PLGA Scaffolds Memfasilitasi Proliferasi Sel MC3T3-E1
Abstrak
Perancah biomaterial berpori yang dapat terurai secara hayati memainkan peran penting dalam regenerasi tulang. Dalam penelitian ini, perancah komposit nano-hidroksiapatit/kolagen/poli(asam laktat-co-glikolat)/grafena oksida (nHAC/PLGA/GO) berpori yang mengandung jumlah GO yang berbeda dibuat dengan metode pengeringan beku. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perancah yang disintesis memiliki struktur berpori tiga dimensi. GO sedikit meningkatkan hidrofilisitas perancah dan memperkuat kekuatan mekaniknya. Modulus Young dari perancah yang tergabung dengan GO 1,5 berat% sangat meningkat dibandingkan dengan sampel kontrol. Eksperimen in vitro menunjukkan bahwa perancah nHAC/PLGA/GO (1,5 berat) secara signifikan meningkatkan adhesi sel dan proliferasi sel osteoblas (MC3T3-E1). Penelitian ini menunjukkan bahwa scaffold nHAC/PLGA/GO memiliki kemampuan sitokompatibilitas dan regenerasi tulang yang sangat baik, sehingga berpotensi tinggi untuk digunakan sebagai scaffold di bidang rekayasa jaringan tulang.
Latar Belakang
Rekayasa jaringan tulang yang menggabungkan perancah berpori tiga dimensi dan sel tulang telah dipelajari secara luas sebagai pendekatan yang menarik dalam pengobatan jaringan yang tidak berfungsi atau hilang [1]. Scaffolds biodegradable, yang meniru sifat tulang, memainkan peran penting untuk menampung sel, mengendalikan adhesi dan proliferasi sel, dan memfasilitasi regenerasi tulang [2]. Sampai saat ini, berbagai metode termasuk electrospinning, integrasi desain topologi komputasi (CTD) dan fabrikasi bentuk bebas padat (SFF), dan pengeringan beku telah diterapkan untuk membuat struktur berpori tiga dimensi (3D) yang berbeda [3,4,5 ,6,7]. Electrospinning mampu membuat scaffolds nanofibrous atau microfibrous dengan struktur dan komposisi yang kompleks (aligned, spring-like fiber) [7]. Namun, efisiensi produksinya agak rendah. Integrasi CTD dan SFF memungkinkan desain perancah anatomis 3D dengan arsitektur berpori dan sifat mekanik yang lebih baik. Tetapi metode ini membutuhkan pengetahuan profesional yang kuat [4]. Dibandingkan dengan kedua metode tersebut, metode pengeringan beku memungkinkan fabrikasi struktur berpori dengan proses yang jauh lebih sederhana dengan sublimasi fase cair beku di bawah vakum untuk membuat struktur berpori [8].
Tulang alami memiliki arsitektur hierarki yang kompleks dengan dua komponen utama, kolagen dan hidroksiapatit [9,10,11]. Dalam rekayasa jaringan tulang, pembuatan biomimikri ideal dari matriks ekstraseluler tulang yang mengakomodasi adhesi sel dan proliferasi untuk pengobatan malfungsi masih merupakan tantangan [12]. Scaffolds biodegradable berbasis nano-hidroksiapatit/kolagen (nHAC) yang meniru tulang alami dapat memberikan biokompatibilitas, afinitas sel, dan bioresorbabilitas yang lebih baik [13]. Namun, kelemahan kolagen, termasuk sifat mekanik yang buruk dan degradasi yang cepat, tetap menjadi kendala untuk penerapannya dalam rekayasa jaringan tulang [14]. Polimer alifatik yang dapat terurai secara hayati, seperti asam poli(laktat-ko-glikolat) (PLGA), dengan kekuatan mekanik yang tinggi, biokompatibilitas yang luar biasa, kemampuan terurai secara hayati, dan kelarutan yang baik dalam pelarut organik, merupakan bahan kompensasi yang ideal untuk membangun perancah berpori 3D untuk rekayasa jaringan tulang [15 , 16]. Scaffold berpori hibrida yang mengandung kolagen dan polimer sintetik menggabungkan keunggulan kolagen dan polimer dan mengatasi kelemahannya, yang banyak digunakan untuk perbaikan dan regenerasi tulang [17,18,19]. Misalnya, Liao et al. telah mengembangkan perancah tulang yang disiapkan oleh nHAC dan poli(asam laktat) (PLA) untuk mendorong regenerasi tulang [17]. Niu dkk. telah membuat scaffold komposit mikrosfer nHAC/poly(L-lactic acid)/chitosan untuk meningkatkan proliferasi osteoblas [19].
Baru-baru ini, graphene oxide (GO), lembaran karbon baru dengan ketebalan satu atom [20, 21], telah menarik minat besar dalam bidang biologi karena memiliki biokompatibilitas yang baik. Perancah hibridisasi GO mampu memperkaya sifat mekanik perancah dan perilaku seluler, seperti penyebaran dan proliferasi sel [22, 23]. Luo dkk. melaporkan bahwa penggabungan GO ke dalam PLGA nanofibrous meningkatkan proliferasi dan diferensiasi osteogenik sel punca mesenkim (MSC) [20]. Jing dkk. melaporkan bahwa penambahan 1,0% berat GO ke dalam poliuretan termoplastik dapat memfasilitasi proliferasi sel fibroblas tikus Swiss [24]. Dibandingkan dengan menambahkan bahan kimia pengikat silang (genipin, glutaraldehid, karbodiimida, dll. ) [25, 26], yang memiliki sitotoksisitas tertentu, untuk meningkatkan sifat mekanik perancah komposit, sejumlah kecil perancah hibridisasi GO menunjukkan biokompatibilitas yang baik. Oleh karena itu, hibridisasi GO dan nHAC/PLGA bisa menjadi perancah buatan baru untuk jaringan tulang.
Dalam penelitian ini, perancah nano-hidroksiapatit/kolagen/poli(asam laktat-co-glikolat) /grafena oksida (nHAC/PLGA/GO) berpori, yang mengandung rasio berat GO yang berbeda (0,0, 0,5, 1,0, dan 1,5 berat). %) telah dibuat dan dikarakterisasi. Perancah hibridisasi menunjukkan struktur berpori. Penambahan GO memodifikasi sifat hidrofilik dan sifat mekanik perancah hibridisasi. Untuk menyelidiki efek perancah nHAC/PLGA/GO pada rekayasa jaringan tulang, sel-sel MC3T3-E1 dikultur pada perancah hibridisasi berpori. Hasilnya menunjukkan bahwa perancah hibridisasi yang didoping GO 1,5 berat% memfasilitasi adhesi, pertumbuhan, dan proliferasi sel, yang selanjutnya menunjukkan perancah nHAC/PLGA/GO dapat dianggap sebagai kandidat yang menjanjikan dalam rekayasa jaringan tulang.
Hasil dan Diskusi
Struktur Scaffolds Komposit nHAC/PLGA/GO
Gambar 1 mengilustrasikan proses fabrikasi perancah nHAC/PLGA/GO. Rincian proses fabrikasi ditampilkan di bagian eksperimental. nHAC disintesis sebelum membuat perancah komposit nHAC/PLGA/GO. Gambar mikroskop elektron pemindaian (SEM) dari bubuk nHAC menunjukkan struktur nanonya. Spektroskopi sinar-X (EDS) dispersif energi yang sesuai dari nHAC juga ditampilkan (File tambahan 1:Gambar S1), yang mengungkapkan keberadaan Ca, Cu, P, C, dan O. Sinyal tembaga seharusnya merupakan kontribusi dari sampel pendukung. Dengan demikian, nHAC terdiri dari Ca, P, C, O, dan rasio molar Ca:P bubuk nHAC adalah 1,41, lebih rendah dari hidroksiapatit (HA) (1,66). Hal ini menunjukkan bahwa HA yang disintesis adalah tipe defisiensi kalsium [27], yang akan menyebabkan penurunan kekerasan, modulus elastisitas, dan ketangguhan pada nHAC. Untuk meningkatkan sifat mekanik perancah komposit, PLGA dan GO ditambahkan ke dalam bubuk nHAC. Ikhtisar optik dari perancah nHAC/PLGA/GO fabrikasi dengan jumlah GO yang berbeda ditunjukkan pada Gambar. 2a. Sampel berupa silinder dengan diameter 14 mm. Terlihat jelas bahwa perancah komposit tanpa GO berwarna putih. Dengan meningkatnya GO, perancah komposit menjadi semakin gelap. Morfologi rinci perancah nHAC/PLGA/GO yang berbeda diungkapkan oleh SEM (Gbr. 2b-e). Ini secara signifikan menunjukkan bahwa semua perancah membentuk struktur berpori dan permukaan empat perancah yang berbeda cukup kasar. Untuk mengkarakterisasi informasi lubang ini, kami menggunakan area permukaan otomatis dan penguji porositas untuk mengevaluasi. Hasil distribusi lubang ditunjukkan pada Gambar 2f. Ukuran empat lubang perancah adalah antara 0 dan 200 nm. Dan jumlah lubang yang puluhan nanometer lebih banyak daripada yang beberapa ratus nanometer di empat perancah. Telah dilaporkan bahwa porositas perancah biomaterial tidak sepele untuk pembentukan tulang in vitro dan in vivo [28]. Untuk mengoptimalkan integrasi ke jaringan sekitarnya, perancah untuk osteogenesis harus meniru morfologi tulang, struktur, dan fungsi [4]. Dengan demikian, struktur berpori 3D dari perancah komposit nHAC/PLGA/GO sangat penting untuk regenerasi tulang. Gambar SEM skala besar dari empat perancah komposit juga ditampilkan (File tambahan 1:Gambar S2), yang menggambarkan struktur ikhtisar permukaan yang berbeda.
Diagram skema proses fabrikasi untuk perancah nHAC/PLGA/GO
a Gambar optik perancah nHAC/PLGA/GO yang disintesis dengan jumlah GO yang berbeda. b –e Gambar SEM dari b nHAC/PLGA, c nHAC/PLGA/GO (0,5 berat%), d nHAC/PLGA/GO (1,0 berat%), dan e perancah nHAC/PLGA/GO (1,5 berat). f Distribusi lubang nHAC/PLGA/GO(0, 0.5, 1.0, dan 1.5 wt%)
Karakterisasi Fisikokimia dan Mekanik Perancah Komposit nHAC/PLGA/GO
Mekanisme proses sintesis dapat diungkap melalui spektrum difraksi sinar-X (XRD) dan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR) dari berbagai zat tunggal dan komposit (Gbr. 3). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, fase anorganik ditentukan sebagai HA menurut file difraksi serbuk (kartu PDF no. 09-0432) karena tidak ada puncak dari bahan Ca-P lain yang ada dalam pola XRD. Dibandingkan dengan nHA, puncak difraksi yang melebar dari nHAC menyiratkan ukuran butir yang kecil dan kristalinitas yang rendah. Mirip dengan nHAC, pola nHAC/PLGA/GO dengan jumlah GO yang berbeda juga memiliki kristalinitas yang rendah. Namun, puncak GO tidak muncul pada komposit nHAC/PLGA/GO, yang mungkin karena jumlah GO yang sedikit dibandingkan dengan bulk. Gambar 3b menunjukkan spektrum FT-IR dari berbagai bahan tunggal dan komposit. Dari Gbr. 3b, pita khas untuk kolagen dapat diamati, seperti N–H yang meregang pada 3336 cm
−1
untuk amida A; Peregangan C–H pada 3079 cm
−1
untuk amida B; Peregangan C=O pada 1656 cm
−1
untuk amida I; Deformasi N–H pada 1548 cm
−1
untuk amida II dan puncak serapan pada 1238 cm
−1
untuk amida III. Saat pembentukan nHAC, amida A bergerak dari 3336 cm
−1
hingga sekitar 3411 cm
−1
, amida B melemah, amida I, amida II, amida III bergerak dari 1656, 1548, dan 1238 cm
−1
hingga 1654, 1542, dan 1240 cm
−1
, masing-masing. Dengan demikian, ini menegaskan reaksi kimia antara kolagen dan HA. Selain itu, puncak pada 1033, 601, dan 563 cm
−1
adalah puncak khas untuk (PO4)
3−
kelompok, yang menunjukkan pembentukan baru HA pada kolagen karena HA yang diperdagangkan hanya memiliki puncak karakteristik (PO4)
3−
pada 1033, 603, dan 565 cm
−1
. Puncak PLGA yang dikarakterisasi sekitar 2996 dan 2944 cm
−1
ditugaskan ke CH2 , 1752 cm
−1
ditugaskan ke C=O, 1183 dan 1093 cm
−1
ditugaskan untuk C-O, terlihat jelas. Dibandingkan dengan perancah PLGA, puncak perancah nHAC/PLGA bergerak dari 1752 dan 1183 cm
−1
hingga 1760 dan 1187 cm
−1
, masing-masing, yang menunjukkan reaksi kimia antara PLGA dan daya nHAC. Dibandingkan dengan perancah nHAC/PLGA, puncak perancah nHAC/PLGA yang didoping GO berpindah dari 1760 ke 1762 cm
−1
; terjadi pergeseran merah yang menunjukkan reaksi kimia antara GO dan nHAC/PLGA.
a XRD dan b Spektrum FT-IR dari komponen yang berbeda
Struktur nano dan sifat mekanik scaffold nHAC/PLGA/GO dengan jumlah GO yang berbeda dikarakterisasi dengan mikroskop gaya atom nano mekanis kuantitatif (QNM-AFM) [29,30,31,32,33,34], yang mampu memberikan morfologi dan kekakuan secara spontan dan banyak digunakan untuk mendeteksi sifat mekanik berbagai bahan, termasuk tulang [30], gigi [35], kornea [36], dll. Gambar 4a–d menunjukkan tomografi empat jenis komposit perancah. Karena keterbatasan area pemindaian, gambar AFM hanya menunjukkan struktur permukaan lokal. Dengan demikian, struktur keropos tidak terlihat jelas. Namun, gambar AFM juga menunjukkan morfologi permukaan kasar yang mirip dengan gambar SEM. Kekasaran memiliki efek penting pada proliferasi dan diferensiasi sel. Permukaan dengan permukaan kasar bermanfaat untuk proliferasi dan diferensiasi sel [37,38,39]. Profil garis (Gbr. 4e–h) yang diturunkan dari morfologi (Gbr. 4a–d) menunjukkan perbedaan ketinggian maksimum saja dengan arah garis yang berbeda. Terlihat jelas bahwa perbedaan ketinggian maksimum berkisar dari ~ 200 hingga ~ 600 nm. Distribusi kekakuan yang sesuai (Gbr. 4i) menunjukkan modulus Young dari empat perancah yang berbeda adalah 7,53 ± 1,25, 8,34 ± 1,00, 9,15 ± 0,85, dan 10,20 ± 1,28 GPa, masing-masing. Untuk menunjukkan dengan jelas perbedaan kekakuan, diagram batang yang sesuai juga diberikan (Gbr. 4j). Meskipun modulus Young scaffold nHAC/PLGA/GO dengan sedikit perbedaan jumlah GO tidak berbeda nyata, misalnya nHAC/PLGA/GO dengan jumlah GO 0,0 dan 0,5 berat (7,53 ± 1,25 dan 8,34 ± 1,00 GPa), dari 0,5 dan 1,0 berat% (8,34 ± 1,00 dan 9,15 ± 0,85 GPa), dari 1,0 dan 1,5 %berat (9,15 ± 0,85 dan 10,20 ± 1,28 GPa), modulus Young dari perancah nHAC/PLGA/GO dengan a perbedaan jumlah GO sedikit besar (0,0 wt% dan 1,5 wt%) berbeda secara signifikan (7,53 ± 1,25 dan 10,20 ± 1,28 GPa). Hal ini menunjukkan bahwa sifat mekanik perancah nHAC/PLGA/GO meningkat dengan meningkatnya jumlah GO.
Gambar AFM dari a nHAC/PLGA, b nHAC/PLGA/GO (0,5 berat%), c nHAC/PLGA/GO (1,0 berat%), dan d perancah nHAC/PLGA/GO (1,5 berat). e –h Profil garis berasal dari citra morfologi. saya Distribusi kekakuan dari empat perancah yang berbeda diukur dengan QNM-AFM. j Bagan batang modulus Young versus jumlah GO. k Sudut kontak yang sesuai dari empat jenis perancah yang diukur dengan metode penurunan sessile
Hidrofilisitas perancah memainkan peran kunci dalam berinteraksi dengan sel. Penambahan GO tidak hanya meningkatkan sifat mekanik scaffolds komposit, tetapi juga mengubah hidrofobisitas empat jenis scaffolds. Gambar 4f menunjukkan sudut kontak perancah nHAC/PLGA/GO yang berbeda. Sudut kontak scaffold nHAC/PLGA adalah ~ 125.1° sedangkan untuk nHAC/PLGA/GO dengan jumlah GO yang berbeda (0.5.1.0, dan 1.5 wt%) masing-masing adalah ~ 113.4°, ~ 103.4°, dan ~ 101.4°. Dengan meningkatnya jumlah GO, sudut kontak perancah komposit sedikit berkurang karena gugus hidroksil dan gugus bermuatan negatif, seperti gugus asam karboksilat pada permukaan GO [40]. Dengan demikian, GO dapat memberikan bioaktivitas yang luar biasa pada scaffolds nHAC/PLGA 3D.
Secara umum, scaffolds untuk rekayasa jaringan tidak hanya membutuhkan tampilan morfologi dan sifat biokompatibel, tetapi juga struktur berpori dan kekuatan fisik [41]. Scaffold 3D nHAC/PLGA/GO beku-kering memiliki struktur berpori karena sublimasi pelarut. Gugus fungsi, termasuk spesies hidroksil (OH), epoksi (C-O-C), dan karboksil (COOH) pada permukaan perancah [40] menginduksi hidrofilisitas yang baik. Penambahan PLGA dan GO memberikan kekuatan fisik yang cukup. Dengan demikian, perancah 3D nHAC/PLGA/GO bisa menjadi kandidat yang menjanjikan untuk rekayasa jaringan.
Budaya Sel
Telah diketahui dengan baik bahwa perancah yang digunakan untuk jaringan tulang harus biokompatibel, proliferasi sel, dan eksklusif dari respon imun [21]. nHAC/PLGA/GO, yang mengandung komponen tulang alami (kolagen dan HA) dan memiliki sifat mekanik dan hidrofilisitas yang sesuai, harus menjadi kandidat ideal untuk rekayasa jaringan tulang. Untuk menyelidiki proliferasi sel perancah ini, sel-sel osteoblas MC3T3-E1 dikultur dalam karya ini. Gambar 5 menunjukkan viabilitas sel versus waktu kultur yang dievaluasi dengan uji penghitungan sel kit-8 (CCK-8). Proliferasi sel secara konsisten meningkat selama periode kultur keseluruhan untuk semua kelompok. Lebih khusus lagi, proliferasi sel MC3T3-E1 pada scaffold nHAC/PLGA/GO (0,5 dan 1,0 wt%) menurun secara signifikan pada hari ke-1, sedangkan pada scaffold nHAC/PLGA/GO (1,5 wt%) serupa dengan pada perancah nHAC/PLGA. Seiring waktu, proliferasi sel MC3T3-E1 pada scaffold nHAC/PLGA/GO (1,5 wt%) meningkat secara signifikan pada hari ke 3, 5, dan 7. Namun, proliferasi sel MC3T3-E1 pada nHAC/PLGA/GO (0,5 dan 1,0 wt%) perancah tidak berbeda secara signifikan dibandingkan dengan perancah nHAC/PLGA.
Perbandingan sel MC3T3-E1 pada permukaan perancah yang berbeda; tanda bintang ganda menunjukkan p < 0.01, jumlah sampel N = 4
Bukti pertumbuhan sel, proliferasi pada perancah yang berbeda juga ditangkap oleh SEM. Gambar 6 menunjukkan morfologi permukaan sel osteoblas pada empat scaffold yang berbeda setelah dikultur masing-masing selama 1, 3, 5, 7 hari. Pada hari ke-1, semua sel terdistribusi secara merata dan terisolasi pada empat scaffold yang berbeda. Seiring berjalannya waktu (hari ke 3, 5, dan 7), semua kelompok sel tumbuh, berkembang biak, dan mulai berintegrasi pada perancah yang berbeda, membentuk lapisan sel yang besar. Dibandingkan dengan morfologi sel pada perancah yang berbeda, sel-sel pada permukaan perancah nHAC/PLGA/GO jauh lebih besar dan meregang daripada pada permukaan perancah nHAC/PLGA. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam situasi penyebaran sel, adhesi antar sel pada nHAC/PLGA/GO dengan jumlah yang berbeda (0,5, 1,0, dan 1,5 wt%) sesuai dengan gambar SEM.
a –p Gambar SEM sel MC3T3-E1 dikultur pada empat perancah berbeda selama 1, 3, 5, dan 7 hari. Bilah skala berukuran 50 μm di semua gambar. Tanda bintang putih mewakili sel osteoblas MC3T3-E1
Uji Sitotoksisitas
Sitotoksisitas GO merupakan perhatian penting, untuk aplikasinya di bidang biologi. Jadi kami mengevaluasi sitotoksisitas dari empat perancah dalam waktu 24 jam. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 7. Vitalitas sel sel fibroblas (NIH-3T3) pada nHAC/PLGA mengandung 0,5,1, dan GO 1,5% adalah 99,101,11, dan 97,86% berhubungan dengan nHAC/PLGA, yang tidak berbeda nyata daripada nHAC/PLGA, menunjukkan bahwa peningkatan graphene oxide aman pada 0-1,5%.
Aktivitas relatif sel HIH-373 dalam nHAC/PLGA(0.5, 1, 1.5 wt%) berhubungan dengan nHAC/PLGA
Tabel 1 merangkum sifat mekanik dan sifat kultur sel dari empat jenis perancah komposit. Dengan meningkatnya GO, modulus Young dari perancah meningkat sesuai. Namun, hanya sifat mekanik nHAC/PLGA dan nHAC/PLGA/GO (1,5 wt%) yang jelas berbeda. Viabilitas sel dari empat jenis perancah menunjukkan tren yang sama dengan sifat mekanik, yaitu nilai OD dari semua kelompok meningkat dengan meningkatnya waktu kultur sel, tetapi hanya nHAC/PLGA dan nHAC/PLGA/GO (1,5 wt %) kelompok menunjukkan perbedaan yang signifikan. Ini menunjukkan bahwa sifat mekanik perancah terkait erat dengan sifat kultur sel. Hasilnya mungkin karena sel-sel jaringan dapat merasakan dan merespon kekakuan substratnya [42,43,44,45]. Tuning sifat mekanik substrat dapat mempromosikan respon seluler yang mempengaruhi interaksi permukaan sel bersama dengan pertumbuhan sel dan kelangsungan hidup [46,47,48,49]. Haugh dkk. menemukan bahwa kekakuan perancah meningkatkan aktivitas sel MC3T3-E1 (proliferasi dan migrasi sel) [50]. Engler dkk. menunjukkan bahwa faktor fisik penting dalam respon dari banyak jenis sel adalah kekakuan substrat [51]. Mereka menemukan bahwa sel-sel otot polos berasal dari aorta tikus (garis A7R5), seperti sel-sel yang bergantung pada penjangkaran lainnya, menyebar lebih banyak dan mengatur sitoskeleton dan adhesi fokalnya lebih banyak pada substrat 'kaku' daripada pada substrat 'lunak'. Sifat mekanik tidak hanya mempengaruhi perilaku sel tetapi juga aktivitas jaringan. Duncan dkk. mempelajari mekanotransduksi dan regangan mekanis dari respons fungsional pada tulang. Mereka menemukan bahwa beban mekanis dapat menghambat resorpsi tulang dan meningkatkan pembentukan tulang in vivo [52]. Oleh karena itu, perancah nHAC/PLGA/GO (1,5 wt%) yang paling kaku dapat mendorong proliferasi sel MC3T3-E1.
Sitotoksisitas GO merupakan perhatian penting untuk penerapannya di bidang biologi. Hingga saat ini, ada dua argumen yang muncul. Satu klaim GO akan menginduksi sitotoksisitas dan efeknya tergantung konsentrasi. Misalnya, Chatterjee, dkk. melaporkan respon toksik dengan ketergantungan dosis diferensial untuk GO [53]. Pinto, dkk. melaporkan bahwa hanya konsentrasi GO yang rendah yang dapat dimasukkan keamanan di PLA untuk memfasilitasi adhesi dan proliferasi sel [6]. Yang lain menyatakan bahwa jumlah GO yang lebih tinggi akan memiliki biokompatibilitas yang baik dan meningkatkan sifat mekanik substrat dan perilaku seluler. Shin, dkk. mempelajari bahwa myoblast kerangka C2C12 ditingkatkan pada matriks hibrida PLGA-GO-kolagen daripada matriks PLGA, PLGA-kolagen [54]. Dan Luo, dkk. melaporkan perancah nanofiber PLGA yang didoping GO dapat meningkatkan diferensiasi osteogenik MSC [22]. Dalam penelitian ini, GO dipilih berdasarkan argumen pertama. Jumlah terbatas ditambahkan ke dalam perancah komposit untuk non-sitotoksisitas dan meningkatkan sifat mekanik. Konjugasi GO ke perancah nHAC / PLGA secara signifikan meningkatkan pertumbuhan sel, proliferasi. Meskipun jumlah sel pada nHAC/PLGA dan nHAC/PLGA dengan jumlah GO yang sedikit, misalnya nHAC/PLGA/GO (0,5 wt%), kurang lebih sama, jumlah sel pada nHAC/PLGA/GO (1,5 wt%) scaffold lebih tinggi daripada scaffold nHAC/PLGA. Hasil ini menunjukkan perancah nHAC/PLGA/GO bersifat biofungsional dengan kemampuan meningkatkan pertumbuhan dan proliferasi sel MC3T3-E1. Oleh karena itu, biokompatibilitas dan biofungsi yang sangat baik memungkinkan nHAC/PLGA/GO digunakan sebagai perancah yang efektif untuk regenerasi tulang.
Sifat biomaterial dan proses fabrikasi sangat penting untuk sifat scaffold [28]. Sejauh ini, biomaterial telah dipelajari secara ekstensif, termasuk logam [55], keramik [56], kaca [57], polimer yang disintesis secara kimia [58], polimer alam [59], dan kombinasi bahan-bahan tersebut untuk membentuk komposit [60] . Mengubah komponen perancah komposit akan menginduksi properti perancah. Misalnya, untuk membuat perancah biomimik dari tulang alami, kolagen tipe I digunakan dalam penelitian ini. Saat ini, keluarga kolagen mencakup lebih dari 20 jenis kolagen berbeda yang ada di kulit, tulang, tulang rawan, dll. Mengganti kolagen tipe I dengan jenis lain, dimungkinkan untuk membuat perancah komposit yang berbeda untuk tujuan yang berbeda. Sebagai contoh, kolagen tipe II adalah salah satu kolagen pembentuk fibril dan jenis kolagen yang dominan pada tulang rawan. Koordinasi kolagen tipe II ke dalam perancah mungkin dapat memfasilitasi regenerasi tulang rawan [61]. Selain itu, kolagen dengan anil yang tepat dapat lebih memperkuat perancah, yang dapat menginduksi material komposit baru dengan struktur fungsional. Selain sifat biomaterial, pemrosesan juga menentukan fungsi scaffold, seperti metode pemrosesan yang berbeda. Kimia material dan pemrosesan menentukan sifat fungsional maksimum serta bagaimana sel berinteraksi dengan perancah. Perancah sifat dan persyaratan dalam rekayasa jaringan tulang telah diselidiki secara ekstensif, termasuk degradasi [62], sifat mekanik [63], pengiriman sitokin [64], dan kombinasi perancah dan sel [65].
Kesimpulan
Singkatnya, perancah nHAC/PLGA/GO dengan jumlah GO yang berbeda (0,0, 0,5, 1,0, dan 1,5 berat) dibuat dengan metode pengeringan beku. Perancah nHAC/PLGA/GO yang dibuat menunjukkan struktur berpori. Selanjutnya, sifat mekanik dan hidrofilisitas perancah ditingkatkan karena penambahan PLGA dan GO. Studi in vitro menunjukkan perancah berpori memfasilitasi adsorpsi, pertumbuhan, dan proliferasi sel. Scaffold nHAC/PLGA/GO ini bisa menjadi kandidat yang menjanjikan untuk aplikasi jaringan tulang.
Metode
Materi
Kolagen tipe 1 terliofilisasi yang dimurnikan diperoleh dari Tianjin Saining Biological Engineering Technology Co., Ltd. PLGA dengan rasio laktida:glikolida 75:25 dan Mw 95.000 g/mol dibeli dari Pabrik Peralatan Medis Shandong (Cina). GO dibeli dari Shanghai Aladdin biokimia Polytron Technologies Inc. Sel osteoblas MC3T3-E1 disediakan oleh bank sel Shanghai Chinese Academy of Sciences. Fetal bovine serum (FBS), antibiotik-antimikotik, CCK-8, dan media Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) diakses dari Tianjin Nobuo Letter Technology Co., Ltd. 1,4-dioxane, phosphate buffered saline (PBS, 0,1 M, PH 7.4), dan semua bahan kimia lainnya adalah kelas analitis dan digunakan saat diterima tanpa pemurnian lebih lanjut.
Persiapan nHAC Power dan Scaffolds Komposit nHAC/PLGA/GO
Metode pengomposisian bubuk nHAC telah dilaporkan sebelumnya [66,67,68]. Secara singkat kolagen dilarutkan dalam asam asetat (0,5 mol/L) membentuk larutan dengan konsentrasi 4 g/L. CaCl2 dan H3 PO4 (Ca/P = 1,66) solusi kemudian ditambahkan secara terpisah dengan tetes. Tingkat penurunan adalah 100 tetes per menit. Larutan diaduk perlahan dan dititrasi pada suhu 37 °C dengan larutan amonia hingga pH 9. Setelah 24 jam, endapan nHAC dipanen dengan sentrifugasi dan pengeringan beku. Untuk persiapan perancah komposit nHAC/PLGA/GO, GO didispersikan secara merata dalam dioksan dengan menggunakan penghancur sel ultrasonik, membentuk konsentrasi akhir masing-masing 0,0, 0,5, 1,0, dan 1,5 g/L. PLGA kemudian ditambahkan ke dalam larutan GO, membentuk konsentrasi akhir 10% (m/v). Larutan GO/PLGA kemudian diaduk perlahan pada suhu kamar selama 12 jam. Solusi akhir dibentuk dengan menambahkan daya nHAC ke dalam larutan GO/PLGA pada rasio berat 1:1 nHAC:PLGA. Larutan nHAC/PLGA/GO yang terbentuk kemudian diaduk dan diultrasonik selama 4 jam. Setelah dibekukan pada 20 °C semalaman, perancah komposit nHAC/PLGA/GO diperoleh dengan liofilisasi untuk menghilangkan dioksan.
Karakterisasi
Perancah komposit dilapisi dengan emas dan diamati di bawah SEM (JSM-7100F). Kami menyemprot emas selama 20 detik untuk persiapan sampel mikroskop elektron. Topografi dan sifat mekanik matriks dikarakterisasi dengan mikroskop gaya atom (AFM, Multimode VIII, Bruker, Jerman) di udara. Analisis citra dilakukan dengan menggunakan Perangkat Lunak Analisis Gwyddion dan Nanoscope. Analisis komposisi perancah komposit nHAC/PLGA/GO dilakukan oleh spektrofotometer FT-IR (VECTOR22, Bruker, Jerman). Semua spektrum direkam dalam mode absorpsi dalam rentang panjang gelombang 1000–2200 cm
−1
dengan resolusi 4,0 cm
−1
dan pemindaian 16 kali. Sudut kontak sampel diukur menggunakan sistem pengukuran sudut kontak dengan metode penurunan sesi (EasyDrop, model DAS30, kruss, Jerman). Pola XRD diukur menggunakan difraktometer sinar-X (D8 DISCOVER). Radiasi Cu-Kα (λ = 0.154 nm) adalah 40 kV dan 30 mA. Kecepatan pemindaian pengukuran adalah 8°min
−1
selama 2θ kisaran 5–80 ° di RT. Porositas perancah diukur dengan area permukaan otomatis dan penganalisis porositas (ASAP 2460, Micromeritics, GA, USA).
Budaya Sel
Sel-sel osteoblas MC3T3-E1 diinkubasi dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS dan larutan antibiotik-antimikotik 3% pada 37 °C dan 5% CO2 dalam inkubator sel. Perlekatan awal dan proliferasi diuji dengan menggunakan CCK-8 sesuai dengan instruksi pabrik, di mana jumlah sel yang hidup berbanding lurus dengan produk reaksi metabolik yang diperoleh dalam uji CCK-8 [69]. Secara singkat, sel-sel osteoblas MC3T3-E1 diunggulkan pada kepadatan 2,5 × 10
4
sel per sumur pada matriks nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0,5 berat%), nHAC/PLGA/GO (1,0 berat%), dan nHAC/PLGA/GO (1,5 berat) yang disematkan dalam kultur sel 48-sumur piring. Sel-sel diinkubasi dengan larutan CCK-8 dalam 2 jam terakhir periode kultur (1, 3, 5, dan 7 hari) untuk proliferasi pada 37°C dalam gelap. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 450 nm menggunakan pembaca ELISA (DNM-9602).
Sampel sel untuk pengukuran SEM difiksasi dengan formaldehida, dan spesimen kemudian didehidrasi melalui rangkaian bertingkat etanol (30, 50, 75, 95, dan 100%) selama 15 menit pada setiap konsentrasi. Then, the samples were drying by critical point drying was allowed to occur with a carbon dioxide analyzer (Hitachi, HCP-2). Finally, the samples with gold coating were observed by SEM.
Cytotoxicity Test
The fibroblasts cells concentration was adjusted to 1 × 10
4
/ml and was inoculated into 96-well plates at 200 ul per well. Then, the well plates were incubated at 37 °C in a 5% CO2 incubator for 24 h. The samples (nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%), nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) and nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)) were powdered to make a 100 mg/ml suspension. The experiment group with 100 ul suspension and control group with equal volume of DMEM complete medium were incubated for 24 h and were further incubated for 4 h after the CCK-8 was added to the incubator. The cell viability was obtained by measuring the absorbance at the wavelength of 450 nm using an ELISA reader. The cell viability was calculated by using the following formula,
Where A (experiment) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution and power samples solution; A (blank) represents absorbance of wells with medium and CCK-8 solution without cells and A (control) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution without power samples solution.
Analisis Statistik
Quantitative results were expressed as the mean value from at least triplicate samples ± standard deviation (SD). Student’s t test was used to the statistical analysis. A value of p < 0.05 was considered statistically significant. Data are marked ** to indicate p < <0.01.
Singkatan
3D:
Tiga dimensi
AFM:
Mikroskop kekuatan atom
CCK-8:
Cell counting kit-8
CTD:
Computational topology design
DMEM:
Dulbecco’s modified Eagle media
EDS:
X-ray spectroscopy
FBS:
Fetal bovine serum
FT-IR:
Spektroskopi inframerah transformasi Fourier
GO:
Graphene oxide
HA:
Hydroxyapatite
MC3T3-E1:
Osteoblast cells
MSCs:
Mesenchymal stem cells
nHAC:
Nano-hydroxyapatite/collagen
NIH-3T3:
Fibroblast cells
PBS:
Phosphate-buffered saline
PLA:
Poly(lactic acid)
PLGA:
poly(lactic-co-glycolic acid)
QNM-AFM:
Quantitative nano-mechanical atomic force microscope
