Rangka nHAC/PLGA Terintegrasi Grafit Oksida Meningkatkan Proliferasi Osteoblast dan Regenerasi Tulang

Abstrak

Rangka porus terbiodegradasi adalah pusat rekayasa jaringan tulang. Dalam studi ini, nano-hidroksiapatit/kolagen (nHAC) yang dicampur dengan asam laktat-kolat glikolida (PLGA) dan berbagai jumlah grafit oksida (GO) difabrikasi melalui freeze-drying. Komposit yang dihasilkan menunjukkan jaringan pori tiga dimensi yang berkelanjutan. GO sedikit meningkatkan hidrofilisitas dan secara signifikan meningkatkan modulus Young, dengan sampel GO 1,5 wt% mencapai 10,20 ± 1,28 GPa dibandingkan 7,53 ± 1,25 GPa untuk rangka bebas GO. In vitro, osteoblast MC3T3-E1 menunjukkan adhesi dan proliferasi yang jauh lebih tinggi pada rangka GO 1,5 wt%, seperti yang dikonfirmasi oleh ensai CCK-8 dan citra SEM. Temuan ini menunjukkan bahwa rangka nHAC/PLGA/GO menggabungkan sitokompatibilitas yang baik dengan performa mekanis yang unggul, memosisikannya sebagai kandidat yang menjanjikan untuk aplikasi regenerasi tulang.

Latar Belakang

Rangka porus tiga dimensi yang meniru matriks ekstraselular tulang sangat penting untuk perbaikan tulang yang sukses. Teknik pembuatan konvensional—electrospinning, desain topologi komputasi (CTD) yang digabungkan dengan pembuatan bentuk bebas padat (SFF), dan freeze-drying—menawarkan tingkat kontrol struktural dan skalabilitas yang bervariasi. Freeze-drying, khususnya, menyediakan jalur sederhana untuk menghasilkan pori yang sangat terhubung dengan sublimasi pelarut beku di bawah vakum.

Tulang asli terdiri dari susunan hierarkis kolagen dan hidroksiapatit (HA). Komposit nHAC meniru arsitektur alami ini, yang menyediakan biokompatibilitas dan bioresorpsi yang baik. Namun, kelelehitan intrinsik kolagen dan degradasi yang cepat membatasi penggunaannya. PLGA memperkenalkan ketangguhan mekanis dan laju degradasi yang dapat diatur, sementara GO menawarkan properti fisikokimia unik—luas permukaan tinggi, penguat mekanis, dan grup fungsional yang dapat memodulasi perilaku sel.

Karya sebelumnya telah menunjukkan bahwa rangka yang ditingkatkan GO meningkatkan differensiasi osteogenik dan proliferasi sel. Di sini, kami secara sistematis mengevaluasi bagaimana muatan GO bertambah (0,0, 0,5, 1,0, dan 1,5 wt%) mempengaruhi performa struktural, mekanis, hidrofilik, dan biologis komposit nHAC/PLGA.

Hasil dan Pembahasan

Struktur Rangka Komposit nHAC/PLGA/GO

Proses pembuatan melibatkan pelarutan kolagen tipe I dalam asam asetat, co-precipitasi ion Ca dan P untuk membentuk nHAC, pencampuran dengan PLGA dan GO yang dispersi, diikuti oleh freeze-drying. Mikroskop elektron pemindai (SEM) mengungkapkan arsitektur yang sangat porus dengan pori yang terhubung yang berkisar dari 0 hingga 200 nm. Distribusi pori diukur dengan analyzer luas permukaan otomatis (Gambar 2f), mengonfirmasi dominansi pori di bawah 100 nm, ukuran yang cocok untuk infiltrasi osteoblast.

Skema pembuatan rangka melalui freeze-drying.

Karakterisasi Sifat Fisikokimia dan Mekanis

Difraksi sinar-X (XRD) bubuk mengonfirmasi keberadaan HA heksagonal; sinyal GO tidak terlihat karena muatannya rendah. Spektra FT-IR menunjukkan pita amida kolagen karakteristik dan pita fosfat, dengan pergeseran halus yang menunjukkan interaksi kimia antara kolagen, HA, PLGA, dan GO.

Pengukuran mekanis nano AFM (QNM-AFM) mengungkapkan peningkatan monoton modulus Young seiring meningkatnya kandungan GO: 7,53 ± 1,25 GPa (0 wt%), 8,34 ± 1,00 GPa (0,5 wt%), 9,15 ± 0,85 GPa (1,0 wt%), dan 10,20 ± 1,28 GPa (1,5 wt%). Rangka GO 1,5 wt% menunjukkan keunggulan kekakuan yang signifikan dibandingkan rangka bebas GO, yang mencerminkan efek penguatan GO.

Pengukuran sudut kontak menunjukkan penurunan bertahap dari 125,1° (bebas GO) hingga 101,4° (1,5 wt%), yang menunjukkan peningkatan basahan permukaan karena grup hidrofilik GO (Gambar 4f).

Citra AFM (a–d) dan peta kekakuan (i) dari empat varian rangka; sudut kontak (k) diukur dengan metode titik jatuh.

Kultur Sel dan Sitotoksisitas

Osteoblast MC3T3-E1 yang ditanam pada rangka menunjukkan aktivitas metabolisme yang meningkat selama 7 hari (ensai CCK-8). Meskipun proliferasi awal pada rangka GO 0,5 wt% dan 1,0 wt% sedikit lebih rendah dari kontrol bebas GO, rangka GO 1,5 wt% cocok dan melebihi kontrol pada hari 3, 5, dan 7 (Gambar 5). Citra SEM mengonfirmasi penyebaran sel yang luas dan pembentukan jaringan, dengan sel pada rangka yang dipenuhi GO menunjukkan morfologi yang lebih besar dan lebih datar (Gambar 6).

Fibroblast NIH-3T3 yang diekspos pada suspensi rangka selama 24 jam tidak menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan; vitalitas tetap di atas 97% pada semua muatan GO, yang mengonfirmasi biokompatibilitas komposit (Gambar 7).

Vitalitas sel MC3T3-E1 pada empat varian rangka (*** p < 0,01).

Citra SEM sel MC3T3-E1 pada hari 1, 3, 5, dan 7 pada keempat jenis rangka.

Vitalitas relatif sel NIH-3T3 setelah 24 jam paparan suspensi rangka.

Kesimpulan

Freeze-drying memungkinkan pembuatan rangka nHAC/PLGA/GO dengan porositas yang terhubung, kekakuan mekanis yang ditingkatkan, dan hidrofilisitas yang ditingkatkan. Rangka GO 1,5 wt% menunjukkan adhesi dan proliferasi osteoblast yang unggul sambil mempertahankan sitokompatibilitas yang baik, yang menekankan potensinya sebagai rangka rekayasa jaringan tulang.

Metode

Bahan

Kolagen tipe I, PLGA (75:25, Mw = 95 kDa), GO, dan reagen kultur sel diperoleh dari pemasok terkemuka. Osteoblast MC3T3-E1 dan fibroblast NIH-3T3 diperoleh dari bank sel terkemuka.

Persiapan Rangka

Kolagen dilarutkan dalam asam asetat 0,5 M (4 g L⁻¹). Larutan kalsium dan fosfat (Ca/P = 1,66) ditambahkan secara titik-titik pada 100 titik min⁻¹, diaduk, dan dititrasi ke pH 9 dengan ammonia pada 37 °C. Setelah 24 jam, endapan dikumpulkan, dikeringkan dengan freeze-drying, dan digiling untuk menghasilkan bubuk nHAC.

GO dispersi dalam dioksan (0,0, 0,5, 1,0, 1,5 g L⁻¹) melalui ultrasonikasi, kemudian dicampur dengan PLGA (10 % m/v) dan diaduk selama 12 jam. nHAC ditambahkan pada rasio berat 1:1 terhadap PLGA, diikuti oleh ultrasonikasi 4 jam. Campuran dibeku pada –20 °C selama satu malam dan liofilisasi untuk menghasilkan rangka akhir.

Karakterisasi

SEM, AFM (mode QNM), FT-IR, XRD, sudut kontak, dan pengukuran porositas dilakukan menggunakan protokol standar. Semua data dikumpulkan secara triplik.

Kultur Sel dan Ensai

Sel MC3T3-E1 ditanam pada 2,5 × 10⁴ sel mL⁻¹ pada cakram rangka dan dikultur dalam DMEM +10 % FBS +3 % antibiotik pada 37 °C, 5 % CO₂. Proliferasi dievaluasi oleh CCK-8 pada hari 1, 3, 5, dan 7. Untuk SEM, sel difiksikan dengan paraformaldehida 4 %, dikeringkan, dikeringkan titik kritis, dan dilapisi emas.

Uji Sitotoksisitas

Sel NIH-3T3 diekspos pada suspensi rangka 100 mg mL⁻¹ selama 24 jam, diikuti oleh ensai CCK-8. Vitalitas sel dihitung relatif terhadap kultur kontrol.

Analisis Statistik

Data dinyatakan sebagai mean ± SD. Uji t Student diterapkan; p < 0,05 dianggap signifikansi.