Down-regulation of microRNA-342-5p atau Up-regulation of Wnt3a Menghambat Angiogenesis dan Mempertahankan Stabilitas Plak Aterosklerotik pada Tikus Aterosklerosis

Bahan dan Metode

Pernyataan Etika

Hewan diperlakukan secara manusiawi menggunakan prosedur yang disetujui sesuai dengan rekomendasi dalam Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari National Institutes of Health. Protokol ini disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Rumah Sakit Rakyat Provinsi Qinghai (nomor etik:201870726).

Hewan Eksperimen

ApoE Pria ^−/− tikus dan tikus C57BL/6J (kelas bebas patogen spesifik) berusia 8 minggu tersedia dari Teknologi Hewan Laboratorium Vital Beijing (Beijing, Cina). Tikus (5–6 tikus dalam sangkar) dikandangkan dengan siklus 12 j/12 h siang/malam dengan akses ad libitum ke makanan dan air.

Pembentukan Model AS dari Tikus

ApoE ^−/− tikus diberi makan dengan pakan tinggi lemak selama 16 w untuk membangun model plak AS yang rentan. Tikus C57BL/6 J digunakan sebagai kelompok normal dengan makanan dan minuman alami. ApoE ^−/− tikus memiliki rambut tipis mengkilap dan rambut rontok di punggung setelah 12 w. Lengkungan aorta dan arteri brakiosefalika dari 3 tikus model dibedah untuk dilakukan pewarnaan hematoxylin-eosin (HE), dan tidak ada deposit plak yang signifikan pada intima. 3 tikus model lainnya diidentifikasi lagi setelah 4 w, dan pewarnaan HE menunjukkan bahwa ada deposit plak yang jelas pada intima lengkung aorta, yang menunjukkan keberhasilan pembentukan model.

Pengelompokan dan Perawatan Tikus

ApoE ^−/− mencit dengan plak rentan AS dibagi menjadi 6 kelompok dengan 12 mencit pada masing-masing kelompok:kelompok AS, kelompok kontrol negatif (NC) (disuntik dengan normal saline dalam ApoE ^−/− tikus), miR-342-5p agomir group (disuntik dengan miR-342-5p agomir untuk mengekspresikan ekspresi miR-342-5p secara berlebihan di ApoE ^−/− tikus), kelompok antagomir miR-342-5p (disuntikkan dengan antagomir miR-342-5p untuk mengurangi ekspresi miR-342-5p di ApoE ^−/− mouse), grup ekspresi berlebih (oe)-Wnt3a (disuntikkan dengan vektor oe-Wnt3a untuk meningkatkan regulasi ekspresi Wnt3a di ApoE ^−/− tikus) dan grup miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (disuntikkan dengan vektor miR-342-5p agomir dan oe-Wnt3a untuk mengatur ekspresi miR-342-5p dan Wnt3a di ApoE ^−/− tikus). Tikus C57BL/6 J sebagai kelompok normal diberi diet normal. Pakan tinggi lemak mengandung 20% ​​lemak dan 0,25% kolesterol. miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir dan vektor oe-Wnt3a dibeli dari Sangon (Shanghai, China). Vektor oe-Wnt3a, miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir semuanya dilarutkan dalam 0,2 mL saline normal dan disuntikkan ke tikus dengan dosis 40 mg/kg melalui vena ekor setiap dua minggu. Setelah 8 minggu, sampel darah diambil dari bola mata, lalu tikus di-eutanasia untuk mengumpulkan jaringan arteri [19].

Dalam percobaan pendahuluan, ApoE ^−/− tikus dengan AS disuntik dengan 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir atau vektor oe-Wnt3a (setiap dua minggu sekali; total 4 kali). Kemudian, level ekspresi -catenin dideteksi dengan reverse transcription kuantitatif polymerase chain reaction (RT-qPCR).

Pengumpulan dan Perawatan Sampel

Sebelum pengambilan sampel, tikus dipuasakan selama 12 jam dan dibius dengan inhalasi eter dan sampel darah dikumpulkan dari bola mata. Dada tikus dibuka, aorta toraks dipisahkan ke ujung aorta perut dan seluruh pembuluh diangkat. Setelah dibersihkan dengan RNA-free phosphate-buffered saline (PBS), jaringan disematkan untuk pewarnaan HE, oil red O, pewarnaan Sirius red dan pewarnaan imunohistokimia. Beberapa jaringan pembuluh darah diawetkan pada suhu 80 °C untuk RT-qPCR dan Western blot.

Deteksi Kadar Lipid Darah

Penganalisis biokimia otomatis (Roche, Basel, Swiss) diadopsi untuk mendeteksi kolesterol total (TC), trigliserida (TG), kolesterol lipoprotein densitas rendah (LDL-C) dan kolesterol lipoprotein densitas tinggi (HDL-C) dalam serum. Deteksi diimplementasikan mengikuti spesifikasi kit (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Penentuan kandungan sitokin serum:interleukin komersial (IL)-5, IL-12p70, tumor necrosis factor alpha (TNF-α) dan kit ELISA interferon (IFN)-γ digunakan. Terakhir, nilai densitas optik (OD) setiap sumur diuji oleh pembaca pelat mikro pada 450 nm.

Penentuan cedera stres oksidatif:kandungan malondialdeyde (MDA) dan aktivitas superoksida dismutase (SOD) dalam serum diuji dengan kit MDA (nilai OD diuji dengan spektrofotometer pada 532 nm) dan kit SOD (nilai OD ditentukan oleh pembaca lempeng mikro pada 450 nm). Kit IL-5, IL-12p70, TNF-α, IFN-γ, MDA, dan SOD ELISA dibeli dari MultiSciences (Lianke) Biotechnology Corporate Limited (Hangzhou, Zhejiang, China).

Pewarnaan HE, Pewarnaan Oil Red O dan Pewarnaan Sirius Red

Setelah fiksasi dan embedding, spesimen diiris menjadi bagian berurutan dengan ketebalan 4 mikrom. Irisan di-dewax dan dihidrasi, diwarnai dengan hematoxylin dan eosin, dibedakan, didehidrasi, dibersihkan dengan xilena, dikeringkan dan disegel dengan gom netral. Nukleus berwarna biru, dan jaringan lain seperti sitoplasma dan jaringan ikat berwarna merah dalam berbagai warna. Pembentukan plak diamati dengan mikroskop fluoresensi. Dinding arteri bagian yang diwarnai HE dipilih di bawah mikroskop, dan hasil eksperimen dikumpulkan oleh kamera digital. Modul perangkat lunak analisis gambar Image Pro Plus6.0 (IPP6.0) digunakan untuk menghitung luas plak pada penampang setiap irisan dan luas dinding serta rasionya.

Irisan dengan 4-5 m dipilih untuk pewarnaan O merah minyak. Irisan dikeringkan dengan suhu berlebih selama 20 menit dan diinkubasi dengan isopropanol 100% selama 5 menit. Kemudian irisan diinkubasi dengan larutan pewarna O merah minyak 0,5% dalam oven 60 °C selama 8 menit, dicuci dalam 85% isopropanol selama 3 menit, diwarnai dengan hematoxylin selama 1 menit, dibersihkan dan disegel. Hasil pewarnaan O merah minyak menunjukkan bahwa lipid berwarna merah atau oranye dan nukleus berwarna biru muda. Perangkat lunak IPP6.0 digunakan untuk menghitung area lemak dan area plak pada plak irisan jaringan. Kandungan lipid = area pewarnaan/plak merah minyak O positif × 100%.

Pewarnaan Sirius red:irisan di-dewax dan dihidrasi, dicelup selama 10 menit dengan larutan pewarnaan celestine blue, dengan larutan pewarnaan Sirius red selama 20 menit dan counterstained selama 10 menit dengan hematoxylin. Akhirnya, irisan didehidrasi dengan etanol gradien, dibersihkan dengan xilena dan disegel dengan gom netral. Area kolagen pada plak irisan jaringan dihitung dengan perangkat lunak IPP6.0. Area kolagen = Area pewarnaan positif merah Sirius/area plak× 100%. Persentase lipid dan kolagen di area plak dihitung.

Hematoxylin, eosin dan pewarna Sirius tersedia dari China Pharmaceutical Group Shanghai Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Bubuk O merah minyak dibeli dari Sigma-Aldrich Chemical Company (St Louis, MO, USA).

Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

Jaringan aorta ditambahkan ke reagen ekstraksi RNA total Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) dan kemudian dihomogenisasi untuk mengekstrak RNA total dan menyusun DNA komplementer. Semua primer direferensikan ke urutan yang disediakan oleh Genbank, dirancang oleh Primer 5.0 dan disintesis oleh Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. MiR-342-5p:maju:5′-CGGAGGGGTGCTATCTGTGATTGAG-3′, primer terbalik adalah kit universal primer (Qiagen perusahaan, Hilden, Jerman); Wnt3a:maju:5′-AGGTAAGCTACTCCCTCAACTA-3′, mundur:5′-CTGAAGCACCCTCTCATGTATC-3′; -aktin:maju:5′-GCACCCACCTTCTACAATGAGC -3′, mundur:5′-TCGTTGCCAATAGTGATGACC-3′; -catenin:maju:5′-TCAAGAGAGCAAGCTCATCATTCT-3′, mundur:5′-CACCTTCAGCACTCTGCTTGTG-3′. Setelah reaksi, siklus ambang (Ct) dianalisis dengan komputer. Rasio relatif miR-342-5p terhadap U6 digunakan sebagai ekspresinya, rasio relatif Wnt3a terhadap -aktin digunakan sebagai ekspresinya, dan rasio relatif dihitung dengan 2 ^−ΔΔCt metode.

Analisis Western Blot

Protein total diambil dari jaringan aorta. Konsentrasi protein diukur dengan metode asam bicinchoninic. Elektroforesis gel poliakrilamida dilakukan. Kemudian protein dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida dan pita target diperoleh. Membran disegel dalam susu skim 5% selama 1 jam, ditambahkan dengan antibodi primer Wnt3a (1:500), -catenin (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), CD34 (1 :2500, Abcam, MA, USA) dan -aktin (1:2000, Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China) pada 4 °C semalaman. Membran dicuci dengan Tris-buffered saline dengan Tween 20 (pH = 7,5, 10 mmol/L Tris–HCl, 100 mmol/L NaCl dan 0,2% Tween-20) selama 10 mmol/L Tris–HCl, 100 mmol/L NaCl dan 0,2% Tween-20) selama 10 mnt × 3 kali, lalu ditambahkan antibodi sekunder (1:1000, ZSGB-Bio, Beijing, China) selama 2 jam. Perangkat lunak ImageJ diadopsi untuk menilai nilai abu-abu pita dan mengukur ekspresi protein.

Pewarnaan imunohistokimia

Irisan 4-5 m ditempatkan pada slide yang dilapisi dengan 100 mg/L polilisin dan difiksasi dengan aseton. Peroksidase endogen diblokir oleh albumin serum sapi. Jaringan ditetesi antibodi MOMA-2 (1:200), -SMA (1:200) dan CD34 (1:200, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) serta ditambahkan larutan kerja antibodi sekunder ( 1:1000). Jaringan dikembangkan dengan diaminobenzidine, counterstained dengan hematoxylin (1 menit), dehidrasi, dibersihkan, disegel dan diamati di bawah mikroskop. Tiga bidang visual yang berbeda dipilih untuk setiap bagian imunohistokimia. Perangkat lunak IPP6.0 dilakukan untuk analisis kuantitatif. Pewarnaan imunohistokimia positif dari MOMA-2 dan -SMA, masing-masing, menunjukkan bahwa makrofag dan sel otot polos terutama terletak di sitoplasma, yang berwarna kuning hingga coklat. Persentase makrofag dan sel otot polos dihitung secara terpisah, yang digabungkan dengan persentase lipid dan kolagen dalam plak untuk menghitung indeks kerentanan plak. Indeks kerentanan plak = (persentase positif makrofag + persentase positif lipid)/(persentase positif kolagen + persentase positif sel otot polos) [20]. Kepadatan pembuluh mikro (MVD) dinilai dengan pengukuran ekspresi CD34 dan dihitung sebagai jumlah pembuluh mikro/mm ² .

Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda

Gen target miR-342-5p dianalisis oleh situs web prediksi biologis (http://www.microRNA.org). Uji gen reporter luciferase ganda digunakan untuk memverifikasi apakah Wnt3a adalah gen target miR-342-5p. Urutan tipe liar atau mutan dari wilayah yang tidak diterjemahkan Wnt3a 3' (3'-UTR) dikloning ke dalam vektor GP-miRGLO (GenePharma, Shanghai, Cina). Reporter (0,5 μg) dan 1, 10 atau 100 pM miR-342-5p agomir ditransfusikan ke dalam sel endotel aorta tikus (No. 506, MingzhouBio, Ningbo, China) selama 48 jam untuk menguji aktivitas luciferase menggunakan sistem uji luciferase ganda (Promega, WI, AS).

Analisis Statistik

Semua data diinterpretasikan oleh perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Data pengukuran ditunjukkan sebagai mean ± standar deviasi. Perbedaan antara dua kelompok dirumuskan oleh t -tes, sedangkan yang di antara beberapa kelompok dengan analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti dengan uji perbandingan ganda Tukey. Signifikansi statistik ditetapkan oleh P nilai < 0,05.

Hasil

miR-342-5p Meningkat dan Wnt3a Menurun di Jaringan Aorta ApoE ^−/− mouse dan miR-342-5p Langsung Menargetkan Wnt3a

Gen target MicroRNA (miRNA) dikaitkan dengan fungsi terkait aterosklerosis. miR-342-5p, Wnt3a dan -catenin diuji dalam jaringan aorta tikus model AS dengan RT-qPCR dan uji Western blot. Terungkap bahwa dalam kaitannya dengan kelompok normal, miR-342-5p meningkat sementara Wnt3a dan -catenin menurun pada kelompok AS (keduanya P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok NC, miR-342-5p ditingkatkan serta Wnt3a dan -catenin menurun pada kelompok agomir miR-342-5p (keduanya P < 0,05), sementara miR-342-5p menurun, Wnt3a dan -catenin meningkat pada kelompok antagomir miR-342-5p (keduanya P < 0,05). Ekspresi Wnt3a dan -catenin meningkat pada kelompok oe-Wnt3a relatif terhadap kelompok NC (keduanya P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok miR-342-5p agomir, ekspresi Wnt3a dan -catenin dimunculkan pada kelompok miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (P < 0,05) (Gbr. 1A–D). Selain itu, dalam percobaan pendahuluan, ekspresi -catenin di bawah perlakuan konsentrasi yang berbeda dari miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir dan oe-Wnt3a diuji dan hasilnya menunjukkan (File tambahan 1:Gambar. S1 ) semakin tinggi konsentrasi agomir miR-342-5p, semakin rendah ekspresi -catenin; semakin tinggi konsentrasi antagomir miR-342-5p, semakin tinggi ekspresi -catenin; dan semakin tinggi konsentrasi oe-Wnt3a, semakin tinggi ekspresi -catenin.

miR-342-5p meningkat dan Wnt3a menurun pada jaringan aorta ApoE ^−/− mouse dan miR-342-5p secara langsung menargetkan Wnt3a. A Ekspresi miR-342-5p dalam jaringan aorta tikus yang dideteksi oleh RT-qPCR. B Ekspresi mRNA Wnt3a dalam jaringan aorta tikus yang dideteksi oleh RT-qPCR (n = 12). C , D Ekspresi protein Wnt3a dan -catenin dalam jaringan aorta tikus yang diuji dengan analisis Western blot (n = 12). E Situs pengikatan miR-342-5p dalam Wnt3a 3′-UTR. B miR-342-5p agomir yang bergantung pada dosis menurunkan aktivitas relatif dalam sel yang ditransfeksi dengan Wnt3a 3′-UTR (N = 3). G Aktivitas relatif luciferase dalam sel dengan tipe liar dan mutan Wnt3a 3′-UTR setelah ditransfeksi dengan miR-342-5p agomir atau perebutan (N = 3). *P < 0.05 vs. kelompok normal, ^# P < 0,05 vs. kelompok NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir miR-342-5p. Data pengukuran ditunjukkan sebagai mean ± standar deviasi. Perbandingan antara dua kelompok dirumuskan oleh t -test, sedangkan perbandingan di antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan ganda Tukey. AS, aterosklerosis; NC, kontrol negatif

miRNA dapat menghambat translasi gen tertentu dengan mengikat messenger RNA 3′UTR mereka. Situs web bioinformatika memperkirakan bahwa ada hubungan target antara miR-342-5p dan Wnt3a (Gbr. 1E). Uji gen reporter luciferase ganda melaporkan bahwa dalam sel endotel aorta tikus yang ditransfeksi vektor Wnt3a 3′UTR, nilai renilla/kunang-kunang dari luciferase diturunkan secara tergantung dosis dengan transfeksi dengan miR-342-5p agomir, dengan penurunan yang signifikan dari 10 menjadi 100 pM miR-342-5p agomir dan penurunan 64% terjadi pada kelompok agomir 100 pM miR-342-5p bila dibandingkan dengan kelompok NC. Ini menunjukkan adanya situs target miR-342-5p di Wnt3a 3′UTR. Namun, nilai renilla/kunang-kunang dari aktivitas luciferase tidak terpengaruh pada kelompok mutasi Wnt3a (Gbr. 1F, G). Dengan demikian, dapat dipastikan bahwa Wnt3a adalah gen target langsung miR-342-5p, dan miR-342-5p/Wnt3a dapat mengatur perkembangan AS.

Efek Wnt3a Up-Regulated atau Down-Regulated miR-342-5p pada Level Lipid di ApoE ^−/− Tikus

Selanjutnya, untuk menyelidiki apakah penargetan miR-342-5p dan pengaturan jalur pensinyalan Wnt3a akan memengaruhi kadar lipid tikus AS, penganalisis biokimia otomatis digunakan untuk mengamati perubahan kadar lipid. Hasilnya menunjukkan bahwa (Gbr. 2A–D) berbeda dengan kelompok normal, konten TC, TG, dan LDL-C meningkat dan konten HDL-C menurun pada grup AS (semua P < 0,05). Dibandingkan grup NC, konten TC, TG dan LDL-C meningkat dan konten HDL-C menurun pada grup agomir miR-342-5p (semua P < 0.05), sementara kandungan TC, TG dan LDL-C diturunkan dan kandungan HDL-C ditambah pada kelompok antagomir miR-342-5p dan kelompok oe-Wnt3a (semua P < 0,05). Sehubungan dengan kelompok agomir miR-342-5p, kandungan TC, TG dan LDL-C berkurang dan kandungan HDL-C meningkat pada kelompok miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (semua P < 0,05). Hasil ini menunjukkan bahwa miR-342-5p dan Wnt3a mengatur tingkat lipid darah tikus AS, dan selanjutnya menggambarkan hubungan regulasi yang ditargetkan antara miR-342-5p dan Wnt3a. Ekspresi berlebih dari Wnt3a akan membalikkan efek yang diinduksi miR-342-5p yang diekspresikan secara berlebihan pada tikus AS.

Efek dari Wnt3a yang diatur ke atas atau miR-342-5p yang diatur ke bawah pada tingkat lipid di ApoE ^−/− tikus. A Perbandingan kadar HDL-C serum kelompok mencit. B Perbandingan kadar LDL-C serum kelompok mencit. C Perbandingan kandungan TG dalam serum kelompok mencit. D Perbandingan kandungan TC dalam serum kelompok mencit. n = 12. *P < 0.05 vs. kelompok normal, ^# P < 0,05 vs. kelompok NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir miR-342-5p. Data pengukuran ditunjukkan sebagai mean ± standar deviasi. Perbandingan di antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan ganda Tukey. AS, aterosklerosis; NC, kontrol negatif

Efek Overexpression Wnt3a atau Rendahnya Ekspresi miR-342-5p pada Inflammatory and Oxidative Stress-Related Sitokin dalam Serum ApoE ^−/− Tikus

Kemudian, kandungan sitokin dalam serum tikus AS diuji dengan ELISA, dan hasilnya melaporkan bahwa (Gbr. 3A–D) dibandingkan kelompok normal, IL-5, IL-12p70, IFN-γ dan TNF-α ditingkatkan di grup AS (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan grup NC, konten IL-5, IL-12p70, IFN-γ dan TNF-α dinaikkan pada grup agomir miR-342-5p (semua P < 0.05), sedangkan kandungan IL-5, IL-12p70, IFN-γ dan TNF-α terdegradasi pada kelompok antagomir miR-342-5p dan kelompok oe-Wnt3a (semua P < 0,05). Berbeda dengan kelompok miR-342-5p agomir, kandungan IL-5, IL-12p70, IFN-γ dan TNF-α menurun pada kelompok miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (semua P < 0,05). Diisyaratkan bahwa regulasi target miR-342-5p dari jalur pensinyalan Wnt3a selanjutnya mengatur tingkat sitokin terkait dalam serum tikus AS.

Efek overekspresi Wnt3a atau ekspresi rendah miR-342-5p pada sitokin inflamasi dan stres oksidatif terkait dalam serum ApoE ^−/− tikus. A Perbandingan kandungan IL-5 serum kelompok mencit. B Perbandingan kandungan IL-12p70 dalam serum kelompok mencit. C Perbandingan kandungan IFN-γ dalam serum kelompok mencit. D Perbandingan kandungan TNF-α dalam serum kelompok mencit. E, Perbandingan kandungan MDA dalam serum kelompok mencit. B Perbandingan aktivitas SOD pada serum kelompok mencit. n = 12. *P < 0.05 vs. kelompok normal, ^# P < 0,05 vs. kelompok NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir miR-342-5p. Data pengukuran ditunjukkan sebagai mean ± standar deviasi. Perbandingan di antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan ganda Tukey. AS, aterosklerosis; NC, kontrol negatif

Selanjutnya, konten MDA dan aktivitas SOD dalam serum tikus diuji, dan terungkap bahwa (Gbr. 3E, F) dibandingkan dengan kelompok normal, konten MDA meningkat dan aktivitas SOD tertekan pada kelompok AS (keduanya P < 0,05). Dibandingkan kelompok NC, konten MDA ditingkatkan dan aktivitas SOD menurun pada kelompok agomir miR-342-5p (keduanya P < 0,05), sedangkan kandungan MDA menurun dan aktivitas SOD meningkat pada kelompok antagomir miR-342-5p dan kelompok oe-Wnt3a (semua P < 0,05). Dibandingkan kelompok agomir miR-342-5p, konten MDA tertekan dan aktivitas SOD ditingkatkan pada kelompok miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (keduanya P < 0,05). Oleh karena itu, diperoleh ringkasan bahwa penipisan miR-342-5p dan pemulihan Wnt3a menghambat stres oksidatif pada tikus AS.

Pengaruh Deplesi miR-342-5p atau Restorasi Wnt3a pada Kandungan Lipid dan Kolagen pada Plak Aorta ApoE ^−/− Tikus

Untuk mengeksplorasi efek miR-342-5p menargetkan Wnt3a pada area plak di jaringan aorta tikus, pewarnaan HE dilakukan dan hasilnya menunjukkan bahwa (Gbr. 4A, B) kecuali untuk kelompok normal, plak AS terbentuk di semua bagian dari kelompok lain. Pada kelompok AS, area plak besar, tutup fibrosa lebih tipis, inti lipid membesar, lebih banyak sel busa dan presipitasi kristal kolesterol muncul di plak, dinding bagian dalam arteri dan lapisan otot menebal, dan plak tidak stabil. Situasi di grup NC mirip dengan grup AS. Pada antagomir miR-342-5p dan kelompok oe-Wnt3a, area plak kecil, intima arteri halus, dan fibrous caps jumlahnya sedikit dan menjadi lebih tipis. Tidak ada ruptur tetapi sel busa dalam berbagai ukuran di plak. Kristal kolesterol terdistribusi secara asimetris dan sebagian terkalsifikasi, jumlah sel otot polos dan serat kolagen meningkat, dan plak cenderung stabil. Dibandingkan dengan kelompok NC, area plak meningkat dan lesi AS diperburuk pada kelompok agomir miR-342-5p (P < 0,05) sedangkan area plak menurun pada kelompok antagomir miR-342-5p dan kelompok oe-Wnt3a dengan lesi AS yang berkurang (keduanya P < 0,05). Dibandingkan kelompok agomir miR-342-5p, area plak menurun pada kelompok miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (P < 0.05).

Efek penipisan miR-342-5p atau pemulihan Wnt3a pada kandungan lipid dan kolagen pada plak aorta ApoE ^−/− tikus. A Hasil pewarnaan HE aorta pada tikus (bilah skala:50 μm). B Perbandingan luas plak aorta pada masing-masing kelompok mencit. C Hasil pewarnaan Aortic Oil Red O pada semua kelompok mencit (skala bar:100 μm). D Perbandingan kandungan lipid dalam jaringan aorta tikus. E Hasil pewarnaan Aortic Sirius Red pada masing-masing kelompok mencit (skala bar:50 μm). B Perbandingan kandungan kolagen dalam jaringan aorta tikus. n = 12. ^# P < 0,05 vs. kelompok NC. &P < 0,05 vs. kelompok agomir miR-342-5p. Data pengukuran ditunjukkan sebagai mean ± standar deviasi. Perbandingan di antara beberapa kelompok dinilai dengan ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan ganda Tukey. AS, aterosklerosis; NC, kontrol negatif

Pewarnaan minyak merah O dan pewarnaan merah Sirius diadopsi untuk mendeteksi efek miR-342-5p yang ditargetkan Wnt3a pada kandungan lipid dan kandungan kolagen pada plak jaringan aorta tikus, dan hasilnya menunjukkan bahwa (Gbr. 4C–F) Minyak merah Pewarnaan O menunjukkan lemak merah dan nukleus biru sedangkan pewarnaan Sirius red menunjukkan serat kolagen merah dan nukleus biru. Dibandingkan kelompok NC, kandungan lipid meningkat dan kandungan kolagen berkurang pada kelompok agomir miR-342-5p serta kandungan lipid berkurang dan kandungan kolagen terakumulasi pada kelompok antagomir miR-342-5p dan oe-Wnt3a grup (semua P < 0,05). Sehubungan dengan kelompok agomir miR-342-5p, kandungan lipid menurun dan kandungan kolagen meningkat pada kelompok miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (keduanya P < 0,05). Hasil eksperimen sepenuhnya menggambarkan bahwa regulasi target miR-342-5p dari jalur pensinyalan Wnt3a memiliki efek regulasi pada kandungan lipid dan kolagen pada plak aorta tikus AS.

Efek Down-Regulated miR-342-5p atau Up-Regulated Wnt3a pada Makrofag dan Sel Otot Polos pada ApoE Plak Aorta ^−/− Tikus

Derajat AS berbanding lurus dengan kandungan makrofag mononuklear [21]. VSMC adalah sel utama di lapisan tengah arteri dan sangat penting untuk menjaga integritas dinding arteri. VSMC terlibat dalam rekonstruksi dinding arteri dan berperan penting dalam AS pada berbagai tahap [22]. -SMA adalah penanda spesifik sel otot polos [23]. Dalam penelitian ini, antibodi penanda makrofag (MOMA-2) digunakan untuk memberi label pada makrofag, dan imunohistokimia diterapkan untuk mendeteksi ekspresi MOMA-2 dan -SMA.

Under the microscope, positive immunohistochemical staining of MOMA-2 and α-SMA, respectively, indicates that macrophages and smooth muscle cells are mainly located in the cytoplasm, which is yellow to brown. MOMA-2 immune positive indicated that macrophages was mainly located in the cytoplasm with yellow to brown. Determined by immunohistochemistry, it was manifested that versus the NC group, percentage of plaque macrophages (MAMO-2) positive staining was raised and percentage of positive smooth muscle cells was decreased in the miR-342-5p agomir (both P  < 0.05). Percentage of plaque macrophages (MAMO-2) positive staining was reduced and percentage of positive smooth muscle cells was increased in the miR-342-5p antagomir group and the oe-Wnt3a group (all P  < 0.05). In comparison with the miR-342-5p agomir group, percentage of plaque macrophages (MAMO-2) positive staining was depressed and percentage of positive smooth muscle cells was raised in the miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a group (both P  < 0.05) (Fig. 5A–D). It was implied that miR-342-5p targeted regulation of Wnt3a signaling pathway could regulate aggregation of macrophages and smooth muscle cells in arterial tissue plaques of AS mice.

Effects of high expression of Wnt3a or poor expression of miR-342-5p on aortic plaque vulnerability of ApoE ^−/− mice. A Immunohistochemical staining of MOMA-2 in each group of mice (scale bar:50 μm). B Quantitative analysis of figure A. C Immunohistochemical staining of α-SMA in each group of mice (scale bar:50 μm). D Quantitative analysis of figure C . E Comparison of plaque vulnerability index in aortic tissues of AS mice. n  = 12. ^# P  < 0.05 vs. the NC group. &P  < 0.05 vs. the miR-342-5p agomir group. Measurement data were indicated as mean ± standard deviation. Comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test. AS, atherosclerosis; NC, negative control

Effects of High Expression of Wnt3a or Poor Expression of miR-342-5p on Aortic Plaque Vulnerability of ApoE ^−/− Mice

Plaque vulnerability index was calculated:(positive percentage of macrophages + positive percentage of lipids)/(positive percentage of smooth muscle cells + positive percentage of collagen). In relation to the NC group, the plaque vulnerability index was raised in the miR-342-5p agomir group (P  < 0.05) and decreased in the miR-342-5p antagomir group and the oe-Wnt3a group (both P  < 0.05). Versus the miR-342-5p agomir group, the plaque vulnerability index was decreased in the miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a group (P  < 0.05) (Fig. 5E). Briefly, miR-342-5p targeted regulation of Wnt3a signaling pathway-mediated vulnerability of plaques in arterial tissues of AS mice.

Effects of Low Expression of miR-342-5p or Overexpression of Wnt3a on Angiogenesis in Aortic Plaque of ApoE ^−/− Mice

Antibodies against endothelial cell marker CD34 can detect blood vessel density [24]. By immunohistochemistry and Western blot. Versus the NC group, MVD was heightened in the miR-342-5p agomir group and attenuated in the miR-342-5p antagomir group and the oe-Wnt3a group (all P  < 0.05). In comparison with the miR-342-5p agomir group, MVD was decreased in the miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a group (P  < 0.05) (Fig. 6A–C). Collectively, miR-342-5p targeting and regulating Wnt3a signaling pathway directly participated in regulating the density of neovascularization in plaques of AS mice.

Effects of low expression of miR-342-5p or overexpression of Wnt3a on MVD in aortic plaque of ApoE ^−/− mice. A Immunohistochemical staining of CD34 in each group of ApoE ^−/− mice (scale bar:50 μm). B Comparison of MVD in aortic plaque in ApoE ^−/− mice. C Comparison of CD34 protein expression in ApoE ^−/− mice. n  = 12. ^# P  < 0.05 vs. the NC group. &P  < 0.05 vs. the miR-342-5p agomir group. Measurement data were indicated as mean ± standard deviation. Comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test. AS, atherosclerosis; NC, negative control

Discussion

AS is an unpredictable disease involving forms of chronic inflammation and vascular remodeling, and is the major cause of mortality and morbidity globally [25]. A previous study has discussed that miR-342-5p is implicated in regulating the progression of AS [26]. Also, it was mirrored that Wnt pathway is involved in facilitating the occurrence and development of diabetic AS [27]. As the related mechanisms of miR-342-5p and Wnt3a in AS remain to be excavated, our study was to inquire the effect of miR-342-5p targeted Wnt3a on formation of vulnerable plaque and angiogenesis of AS.

Our study revealed that highly expressed miR-342-5p and lowly expressed Wnt3a were found in aortic tissues of AS mice. A study has presented that macrophage-derived miR-342-5p is dramatically raised in early atherosclerotic lesions in ApoE ^−/− mice [13]. Another study has presented that miR-342-5p is markedly elevated in atrial fibrillation patients [28]. It has been reported that Wnt3a deficiency irreversibly injures hematopoietic stem cell self-renewal and results in defects in progenitor cell differentiation [29]. A study has shown that depletion of Wnt3a leads to defective cardiac function [30]. It has been revealed that Wnt3a expression in hippocampus of Alzheimer’s disease mice is remarkably decreased [31]. Another result from our study is that Wnt3a was directly targeted by miR-342-5p in AS mice. It has been reported that miR-342-5p can target the 3'-UTR of Wnt3a and negatively regulate its expression [14].

In addition, our study has suggested that TC, TG, LDL-C, IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α and MDA contents were increased in serum, and HDL-C content and SOD activity were decreased. In addition, plaque area, lipid content, collagen content and MVD were enhanced as well as MOMA-2 expression was raised and α-SMA expression was decreased in AS mice. IFN-γ is a soluble cytokine with many functions, including anti-fibrosis, anti-proliferation, immunomodulation, apoptosis and anti-viral activities [32]. It has been revealed that glutamine treatment markedly raises SOD activity and reduces MDA content as well as increases Wnt3a protein levels in Alzheimer’s disease [31]. A study has revealed that the plasma levels of TC, TG and LDL-C are notably elevated and HDL-C is markedly reduced in AS [33]. A study has reported that TEMPOL supplementation, which has a value in suppressing metabolic disorders and raising atherosclerotic plaque stability, enhances plaque collagen content and reduces lipid content [34]. Zhou et al. noted that OPCRR treatments dramatically reduces the serum lipid profiles including TC, TG and LDL-C as well as and raises the HDL-C, also decreases MDA content as a product of lipid peroxidation and, moreover, declines serum levels of TNF-α in AS [35]. It has been presented that atherosclerotic samples have obviously reduced expression of α-SMA [36]. A study has presented that raised MVD is found in diseased aortas and especially in ruptured atherosclerotic plaque [37]. Furthermore, our study revealed that poor expression of miR-342-5p and overexpression of Wnt3a decreased he lipid levels, cytokine contents, oxidative stress response, plaque area and lipid content as well as increased collagen content, depleted MOMA-2 expression and restored α-SMA expression in aortic tissues in AS mice. It has been suggested previously that miR-342-5p is found to be positively linked to LDL-C and TNF-α serum levels and has an inverse correlation with HDL-C in coronary artery disease (CAD) patients [12]. Another study has verified that depletion of miR-342-5p inhibits AS [13]. Additionally, an experiment has presented that low serum level of Wnt1 is related to raised TG and LDL-C in premature CAD patient [38]. In addition, a study has showed that up-regulated Wnt3a, enhanced SOD content and decreased MDA content are found in the curcumin groups in Parkinson's disease rats [39].

Conclusion

In brief, our study for the first time discovered the mechanism of miR-342-5p/Wnt3 axis in AS and revealed that depleting miR-342-5p could reduce formation of vulnerable plaque and angiogenesis in AS mice via restoring Wnt3a, which may be a potential candidate for treatment of AS (Additional file 2:Fig. S2). miR-342-5p may have a synergistic effect with other miRNAs in atherosclerotic vascular disease, but due to time and funding constraints, we did not conduct further relevant discussions, which is also a limitation of this study.

Availability of data and materials

The original contributions presented in the study are included in the article/Supplementary Material, and further inquiries can be directed to the corresponding author.

Singkatan

miR-342-5p:

MicroRNA-342-5p

A:

Atherosclerosis

α-SMA:

α-Smooth muscle actin

MVD:

Microvessel density

miRNA:

MicroRNA

oe:

Overexpression

NC:

Negative control

PBS:

Phosphate-buffered saline

TC:

Total cholesterol

TG:

Triglyceride

LDL-C:

Low-density lipoprotein cholesterol

HDL-C:

High-density lipoprotein cholesterol

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

IL:

Interleukin

TNF-α:

Tumor necrosis factor alpha

IFN:

Interferon

MDA:

Malondialdeyde

SOD:

Superoxide dismutase

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

Kemajuan dan Tantangan Nanomaterial Fluorescent untuk Sintesis dan Aplikasi Biomedis Teknologi Deposisi Lapisan Atom Tingkat Lanjut untuk Micro-LED dan VCSEL