MicroRNA-326-5p yang Dipulihkan Menghambat Apoptosis Neuronal dan Melemahkan Kerusakan Mitokondria melalui Menekan STAT3 pada Iskemia/Cedera Reperfusi Serebral

Bahan dan Metode

Pernyataan Etika

Percobaan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan dari Rumah Sakit Afiliasi Universitas Yangzhou; Universitas Yangzhou, dan dilakukan dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Tikus Eksperimental dari Rumah Sakit Afiliasi Universitas Yangzhou; Universitas Yangzhou.

Hewan Eksperimen

Tikus jantan dewasa Sprague–Dawley (6–8 minggu, 250 ± 30 g) dari Pusat Pengobatan Perbandingan, Universitas Yangzhou (Yangzhou, Cina), dipelihara di lingkungan bebas patogen tertentu dengan akses gratis ke makanan dan air, (24 ± 1)°C, (50 ± 5)% kelembaban dan siklus terang/gelap 12 jam.

Isolasi dan Identifikasi Sel

Tikus di-eutanasia dengan cara dipenggal, dan otaknya dipotong menjadi 1 mm ³ untuk mengkonfigurasi suspensi sel, yang dicampur dengan larutan trypan blue 0,4% pada 9:1 (konsentrasi akhir trypan blue adalah 0,04%) dan kepadatan sel dan tingkat kelangsungan hidup dihitung dengan hemositometer. Sel (1 × 10 ⁶ sel/mL) diunggulkan dalam labu kultur sel yang telah dilapisi dengan L-polilisin (0,1 mg/mL) pada 5 × 10 ⁶ sel per labu. Ketika sel menempel pada dinding, mereka diinkubasi dengan media yang diperbarui (NeurobasalA + B27 + L-glutamine) dan terus dikultur selama 6–7 hari dengan media diganti setengahnya setiap 2-3 hari.

Identifikasi sel:Neuron kortikal tikus digunakan untuk menyiapkan slide neuron yang diinkubasi dengan antibodi poliklonal anti-tikus Nestin (NES) primer kelinci (1:200), serta imunoglobulin anti-kelinci kambing berlabel fluorescein isothiocyanate (FITC) G (1:50, keduanya dari Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Setelah itu, sel disegel dengan pemadam anti-fluoresen dan diamati dengan mikroskop fluoresensi.

Pembentukan Model OGD

Neuron dibiakkan dalam larutan Earle bebas glukosa dan terpapar gas campuran 95% N₂ dan 5% CO₂ . Setelah 30 menit ventilasi tekanan positif, lingkungan hipoksia terbentuk di mana sel-sel diinkubasi (simulasi iskemia oleh OGD in vitro). Setelah 90 menit inkubasi, sel-sel diinkubasi dengan media sel pemeliharaan setelah larutan Earle bebas glukosa dihilangkan. Sel-sel dikultur secara rutin untuk eksperimen selanjutnya (simulasi reperfusi dengan reperfusi oksigen-glukosa in vitro). Media normal di bawah normoksia berfungsi sebagai kontrol.

Neuron dibagi menjadi kelompok kontrol; kelompok OGD, kelompok kontrol negatif (NC) (neuron yang diobati dengan OGD yang ditransfeksi dengan oligonukleotida yang diacak), kelompok agomir miR-326-5p (neuron yang diobati dengan OGD yang ditransfeksi dengan agomir miR-326-5p), kelompok sh-STAT3 (neuron yang diobati dengan OGD ditransfeksi dengan STAT3 shRNA) dan kelompok miR-326-5p agomir + overexpression (oe)-STAT3 (neuron yang diobati dengan OGD ditransfeksi dengan miR-326-5p agomir dan vektor pcDNA-STAT3). Oligonukleotida dan vektor semuanya disediakan oleh GenePharma (Shanghai, China).

Menggunakan lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific), orak-arik oligonukleotida, miR-326-5p agomir, STAT3 shRNA atau miR-326-5p agomir dan pcDNA-STAT3 ditransfeksi ke dalam neuron tikus primer dan kemanjuran transfeksi diuji dengan transkripsi terbalik kuantitatif reaksi berantai polimerase (RT-qPCR) atau Western blot setelah 48 jam.

3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) Assay

Neuron dibuat suspensi pada 1 × 10 ⁶ sel / mL dan dikultur selama 0, 24 dan 48 jam, masing-masing. Dalam lingkungan yang steril, neuron diinkubasi selama 2-4 jam dalam larutan MTT 10% dan ditambahkan dengan 150 L larutan terlarut Formanzan (Dimetil Sulfoksida) sampai kristal cukup larut. Nilai densitas optik (OD) diukur pada pembaca pelat mikro pada 570 nm.

Pengujian Apoptosis Sitometri Aliran

Neuron dipisahkan dengan tripsin 0,25%, disentrifugasi pada 2000 rpm dan disuspensikan kembali dalam PBS. Kemudian, neuron disentrifugasi pada 2000 rpm, dan pelet disuspensikan kembali dengan buffer pengikat dan diinkubasi berturut-turut dengan 5 L Annexin V-FITC dan 5 L propidium iodide (PI). Flow cytometer diterapkan untuk mendeteksi tingkat apoptosis.

Deteksi Potensi Membran Mitokondria JC-1

Sel-sel dalam pelat 6-sumur dibilas dengan PBS, ditambahkan dengan 1 mL media kultur sel dan 1 mL larutan pewarna JC-1 (50 L JC-1, 8 mL air ultra murni dan 2 mL buffer pewarnaan JC-1) (SolarbioScience , Beijing, China) dan diinkubasi selama 15 menit. Buffer pewarnaan 1 × JC-1 dikonfigurasi dengan 4 mL air suling dan 1 mL buffer pewarnaan JC-1. Setelah inkubasi, sel-sel ditripsinisasi, disuspensikan kembali dalam buffer JC-1, dan diuji pada flow cytometer. Proporsi relatif fluoresensi hijau telah dihitung.

Deteksi Stres Oksidatif

Tingkat ROS intraseluler diukur dengan 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) Detection Kit (Abcam). Singkatnya, neuron dilepaskan dengan tripsin 0,25%, disuspensi ulang dan diinkubasi dengan 10 m DCF-DA selama 30 menit. Setelah itu, fluoresensi DCF dengan cahaya eksitasi/emisi pada 495 nm/529 nm diukur dengan spektroskopi fluoresensi (BD Biosciences).

Deteksi aktivitas intraseluler malondialchehyche (MDA), glutathione (GSH) dan superoksida dismutase (SOD) dideteksi dengan kolorimetri kimia menggunakan kit uji komersial (Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China). Nilai OD diukur dengan pembaca pelat mikro.

Pembentukan Model Tikus

Tikus dibius dengan injeksi natrium pentobarbital intraperitoneal (50 g/kg). Sebuah sayatan garis tengah dibuat di leher, karotis eksternal diikat, dan arteri karotis komunis diblokir dengan klip arteri. Jahitan nilon monofilamen berlapis silikon 3-0 dengan hati-hati dimasukkan ke dalam arteri karotis interna sampai resistensi ringan. Setelah 90 menit iskemia serebral transien, jahitan ditarik, dan reperfusi dilakukan selama 24 jam. Kelompok palsu menerima perlakuan yang sama, kecuali jahitannya tidak masuk ke arteri karotis interna. Selama operasi, tempat tidur termostatik digunakan untuk menjaga suhu rektal pada 37 ± 0,5 °C [19].

Tikus dialokasikan ke dalam 6 kelompok (n = 6) dan disuntik dengan plasmid atau miR ke serebroventrikular lateral sebelum pembentukan model MCAO, termasuk kelompok palsu, kelompok MCAO (tikus model), kelompok NC (tikus model dengan injeksi serebroventrikular lateral dari 5 L oligonukleotida orak [100 M]), kelompok agomir miR-326-5p (tikus model dengan injeksi serebroventrikular lateral 5 L miR-326-5p agomir [100 M]), kelompok sh-STAT3 (tikus model dengan injeksi serebroventrikular lateral 5 L vektor interferensi STAT3 [100 M]) dan kelompok miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (tikus model dengan injeksi serebroventrikular lateral 5 L miR-326-5p agomir [100 M] dan 5 L vektor ekspresi berlebih STAT3 [100 M]) [20, 21].

Koleksi Spesimen

Tikus di-eutanasia dengan anestesi, jantung diperfusi, dan seluruh otak diperoleh. Jaringan cedera otak dipotong menjadi 1 × 1 × 1 mm ³ massa jaringan untuk persiapan bagian parafin, RT-qPCR, analisis western blot dan deteksi potensial membran mitokondria.

Deteksi Potensi Membran Mitokondria di Korteks Serebral

Korteks serebral tikus SD dipisahkan dan dipotong menjadi 1 mm ³ . Blok jaringan ditempatkan pada jaring nilon 300 mesh dan ditambahkan dengan PBS. Kemudian suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan 1000 r/menit, ditambah dengan etanol 70% dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 1000 r/menit. Setelah itu, sampel disuspensikan kembali dalam 1 mL PBS, dan suspensi (1 × 10 ⁶ sel, 100 L) direaksikan dengan larutan pewarna Rhodamine123 (10 L, 5 g/mL) dan dianalisis pada flow cytometer pada 488 nm.

Pewarnaan HE

Jaringan otak tikus direndam dalam paraformaldehyde 4% selama 24 jam, dan bagian parafin disiapkan, dipotong menjadi 4 m, disebarkan dalam air 40 ° C dan dipanggang pada suhu 60 ° C. Secara rutin di-dewax dan dihidrasi, bagian parafin diwarnai dengan larutan pewarnaan HE. Setelah pewarnaan HE, neuron yang rusak menunjukkan kontraksi nukleus, edema seluler, vakuolisasi, dan nukleus yang gelap. Mikroskop cahaya (Nikon, Jepang) digunakan untuk mendapatkan gambar, dan jumlah neuron yang bertahan (mm ² ) dari korteks iskemik dihitung.

Pewarnaan TUNEL

Bagian parafin didewax dan didehidrasi dengan alkohol 100%, 95%, 80% dan 70%. Kemudian, potongan direndam dalam paraformaldehida 4% yang diikuti dengan inkubasi dengan buffer natrium sitrat Triton X-100 0,1% selama 20 menit dan campuran reaksi TUNEL selama 1-1,5 jam. Selanjutnya, bagian dikembangkan dengan larutan peroksidase dan diaminobenzidine (DAB), counterstained dengan hematoxylin, dehidrasi oleh alkohol gradien, permeabilisasi, dan disegel dalam gum netral. Bagian diamati di bawah mikroskop cahaya untuk menghitung sel TUNEL-positif. Partikel kuning kecoklatan dalam nukleus didefinisikan sebagai sel TUNEL-positif (sel apoptosis).

Imunohistokimia

Bagian-bagian tersebut di-dewax, dihidrasi dan diambil oleh antigen sitrat, dan katalase endogen diblokir oleh 3% H₂ O₂ . Setiap bagian ditambahkan serum kambing (50 L), diinkubasi dengan antibodi primer (50 L) dan direaksikan dengan antibodi sekunder (50 L) dan streptavidin berlabel lobak peroksidase (50 L). Bagian dikembangkan oleh DAB dan counterstained oleh hematoxylin, yang diikuti oleh dehidrasi alkohol gradien, permeabilisasi xilena dan penyegelan gusi netral. Potongan diamati dengan mikroskop (sitoplasma atau inti jaringan otak iskemik adalah partikel kuning atau kuning kecoklatan). Nilai OD diukur dan dirata-rata.

RT-qPCR

Ekstraksi RNA total dari jaringan dan sel dilakukan dengan Trizol (Invitrogen). Ekspresi mRNA dianalisis melalui qPCR menggunakan SYBR Green PCR Mix (Applied Biosystems, CA, USA) dan sistem PCR real-time QuantStudio TM 6Flex (Applied Biosystems). Primer transkripsi balik loop batang spesifik dan primer maju/mundur (BioTNT, Shanghai, China) dirancang untuk menganalisis level miRNA. Tabel 1 mencantumkan semua primer. 2 ^−△△CT metode diadopsi untuk menghitung tingkat miRNA atau mRNA.

Analisis Western Blot

Sampel protein dipisahkan dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida 10% dan disedot ke membran polivinilidena fluorida (PVDF). Setelah itu, membran PVDF diblokir dengan 5% susu bubuk skim dalam saline yang mengandung Tris, diperiksa dengan antibodi primer dan diperiksa ulang dengan antibodi sekunder selama 2 jam. Kemudian, pita protein dianalisis dengan buffer alkaline phosphatase yang mengandung Nitroblue tetrazolium chloride dan 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate dan diukur dengan perangkat lunak ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Antibodi utama adalah STAT3 (1:1000), Mfn2 (1:1000, Abcam, MA, USA) dan glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda

STAT3 3′UTR yang mengandung situs pengikatan tipe liar (WT) atau mutan (Mut) miR-326-5p diklon ke vektor pmirGLO (Promega, WI, USA), dinamai sebagai STAT3-WT dan STAT3-Mut. Sel diunggulkan dalam piring 24-sumur pada 2 × 10 ⁴ sel/sumur dan ditransfeksi bersama dengan 100 ng vektor luciferase STAT3-WT atau STAT3-Mut dan agomir miR-326-5p 50 nM atau agomir NC pada pertemuan 70%. Aktivitas luciferase diukur menggunakan Sistem Uji Reporter Dual-Luciferase (Promega Corporation, WI, USA).

Analisis Statistik

Perangkat lunak statistik SPSS 21.0 (IBM, NY, USA) digunakan untuk analisis data. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbedaan antara dua kelompok dianalisis dengan uji-t Student, sedangkan perbandingan ganda dianalisis dengan analisis varians satu arah (ANOVA), dilanjutkan dengan uji post hoc Tukey. P mewakili tes dua sisi, dan P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Up-regulation miR-326-5p atau Down-Regulation of STAT3 Melemahkan Apoptosis Neuron Kortikal yang Diobati OGD

Dikultur selama seminggu, neuron korteks tikus dibedakan dan dimatangkan. Secara mikroskopis, neuron menunjukkan badan neuron yang lebih besar, sitoplasma yang lebih transparan, nukleus yang besar dengan kepadatan rendah, dan indeks bias yang kuat. Badan neuron berbentuk kerucut atau bulat, dan dendritnya terhuyung-huyung dan menempel pada dinding (Gbr. 1a, b). NES adalah penanda kimia spesifik neuron serebral untuk menemukan neuron dengan spesifisitas tinggi melalui uji imunofluoresensi. Neuron ditemukan secara khusus mengikat NES dan menunjukkan fluoresensi hijau (Gbr. 1c).

Up-regulation miR-326-5p atau down-regulation STAT3 melemahkan apoptosis neuron kortikal yang diobati dengan OGD. a Neuron serebral dengan kultur penganut 2-d (bilah skala:100 m); b Neuron serebral dengan budaya patuh 7 hari (bilah skala:100 m); c Neuron serebral dengan kultur patuh 7 hari yang diwarnai dengan uji imunofluoresensi NES (bilah skala:50 m); d Viabilitas neuron kortikal yang diobati dengan OGD dengan uji MTT; e Apoptosis neuron kortikal yang diobati dengan OGD terdeteksi oleh flow cytometry; f Tingkat apoptosis neuron kortikal yang diobati dengan OGD; g Ekspresi mRNA Bcl-2 dan Bax dalam neuron kortikal yang diobati dengan OGD; *P <0,05 dibandingkan dengan kelompok kontrol; #P <0,05 dibandingkan dengan kelompok NC; &P < 0,05 dibandingkan dengan kelompok agomir miR-326-5p

Uji MTT diterapkan untuk mendeteksi viabilitas neuron kortikal (Gbr. 1d). Hasilnya menunjukkan bahwa viabilitas neuron korteks tikus terganggu pada kelompok OGD dan kelompok miR-326-5p agomir + oe-STAT3 versus kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, tetapi ditingkatkan pada miR-326-5p grup agomir dan grup sh-STAT3 versus grup NC (semua P < 0.05).

Apoptosis neuron korteks tikus ditentukan dengan flow cytometry, sedangkan ekspresi mRNA Bcl-2 dan Bax oleh RT-qPCR (Gbr. 1e-g). Hasilnya menjelaskan bahwa dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, kelompok OGD dan kelompok miR-326-5p agomir + oe-STAT3 menunjukkan peningkatan laju apoptosis, penurunan ekspresi Bcl-2 dan peningkatan ekspresi Bax. (semua P < 0,05). Dengan kelompok NC sebaliknya, tingkat apoptosis diturunkan, tingkat Bcl-2 meningkat dan tingkat Bax ditekan pada kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 (semua P < 0.05).

Up-regulation of miR-326-5p atau Down-Regulation of STAT3 Meningkatkan Mfn2 dan Tingkat Potensi Membran Mitokondria di Neuron Kortikal Setelah Cedera OGD

Ekspresi Mfn2 dalam neuron kortikal yang diobati dengan OGD dideteksi dengan analisis western blot (Gbr. 2a, b). Sehubungan dengan kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, ekspresi protein Mfn2 berkurang pada kelompok OGD dan kelompok miR-326-5p agomir + oe-STAT3, sementara meningkat pada kelompok agomir miR-326-5p dan sh -Grup STAT3 versus grup NC (semua P < 0.05).

Up-regulation miR-326-5p atau down-regulation STAT3 meningkatkan Mfn2 dan tingkat potensial membran mitokondria pada neuron kortikal yang diobati dengan OGD. a , b Ekspresi protein Mfn2 dalam neuron kortikal yang diobati dengan OGD; c JC-1 flow cytometry tingkat potensial membran mitokondria pada neuron kortikal yang diobati dengan OGD; d konten ROS dalam neuron kortikal yang dirawat dengan OGD setelah pengaturan miR-326-5p atau pengaturan bawah STAT3; e Aktivitas GSH dalam neuron kortikal yang diobati dengan OGD setelah pengaturan miR-326-5p atau pengaturan bawah STAT3; f Konten MDA dalam neuron kortikal yang dirawat dengan OGD setelah pengaturan miR-326-5p atau pengaturan bawah STAT3; g aktivitas SOD di neuron setelah pengaturan miR-326-5p atau pengaturan bawah STAT3; *P <0,05 dibandingkan dengan kelompok kontrol; #P <0,05 dibandingkan dengan kelompok NC; &P < 0,05 dibandingkan dengan kelompok agomir miR-326-5p

Potensi membran mitokondria yang dideteksi oleh JC-1 menemukan bahwa (Gbr. 2c, d) sehubungan dengan kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, tingkat potensi membran mitokondria menurun pada kelompok OGD dan agomir miR-326-5p + oe-STAT3 grup (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok NC, tingkat potensial membran mitokondria meningkat pada kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 (semua P < 0.05).

Kandungan ROS dan MDA, dan aktivitas GSH dan SOD dalam neuron kortikal yang diobati dengan OGD ditentukan dan hasilnya menunjukkan bahwa versus kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, kelompok OGD dan miR-326-5p agomir + oe Kelompok -STAT3 menunjukkan peningkatan konten ROS dan MDA dan gangguan aktivitas GSH dan SOD (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok NC, kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 menunjukkan penurunan kandungan ROS dan MDA dan memperkuat aktivitas GSH dan SOD (semua P < 0,05) (Gbr. 2e–g).

Up-regulation miR-326-5p atau Down-Regulation STAT3 Menghambat Kerusakan Patologis Neuron Kortikal dan Menghambat Apoptosis pada Tikus dengan CI/RI

Pewarnaan HE diadopsi untuk mengamati kerusakan patologis jaringan otak (Gbr. 3a, b), menunjukkan bahwa pada kelompok palsu, neuron normal dalam struktur dan tersusun rapi dengan sitoplasma merah pucat, nukleus biru dan nukleolus bening. Pada kelompok MCAO, kelompok NC dan kelompok miR-326-5p agomir + oe-STAT3, kecuali untuk nekrosis, diamati bahwa neuron tersusun tidak teratur dan diwarnai lebih gelap, dengan pecahnya membran inti, hilangnya struktur sel, kariopiknosis, dalam nukleus bernoda dan lisis dalam jumlah besar. Pada kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3, pembengkakan neuron berkurang dan neuron diatur secara teratur, dan sel-sel nekrotik berkurang, menunjukkan status yang lebih baik dalam kaitannya dengan kelompok MCAO dan kelompok NC.

Up-regulasi miR-326-5p atau down-regulasi STAT3 menghambat kerusakan patologis neuron kortikal dan menghambat apoptosis pada tikus dengan CI/RI. a Kerusakan patologis jaringan otak pada tikus MCAO diamati dengan pewarnaan HE (skala bar:50 m); b Jumlah neuron utuh dari jaringan otak tikus MCAO setelah pengaturan miR-326-5p atau pengaturan bawah STAT3; c Apoptosis neuron pada jaringan otak tikus MCAO yang dideteksi dengan pewarnaan TUNEL (bilah skala:50 m); d Tingkat TUNEL-positif dalam jaringan otak tikus MCAO setelah pengaturan miR-326-5p atau pengaturan bawah STAT3; e Ekspresi mRNA Bcl-2 dan Bax dalam jaringan otak tikus MCAO setelah pengaturan miR-326-5p atau pengaturan bawah STAT3; *P <0,05 dibandingkan dengan kelompok palsu; #P <0,05 dibandingkan dengan kelompok NC; &P < 0,05 dibandingkan dengan kelompok agomir miR-326-5p

Pewarnaan TUNEL digunakan untuk mendeteksi apoptosis neuron dan RT-qPCR untuk ekspresi mRNA Bcl-2 dan Bax di jaringan otak. Hasil menunjukkan bahwa (Gbr. 3c-e) dibandingkan dengan kelompok palsu dan kelompok agomir miR-326-5p, tingkat TUNEL-positif meningkat, ekspresi mRNA Bcl-2 menurun dan ekspresi mRNA Bax meningkat pada kelompok MCAO dan grup miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (semua P < 0,05). Tingkat TUNEL-positif dan ekspresi mRNA Bax yang lebih rendah, dan ekspresi mRNA Bcl-2 yang lebih tinggi ditunjukkan pada agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 daripada kelompok NC (semua P < 0.05).

Up-regulation of miR-326-5p atau Down-Regulation of STAT3 Meningkatkan Tingkat Potensi Membran Mitokondria di Jaringan Otak pada Tikus dengan CI/RI

Deteksi ekspresi protein Mfn2 dalam jaringan otak tikus dilakukan dengan imunohistokimia, dan hasilnya menunjukkan bahwa (Gbr. 4a, b) ekspresi protein Mfn2 yang lebih rendah diuji pada kelompok palsu dan kelompok agomir miR-326-5p versus kelompok MCAO dan kelompok miR-326-5p agomir + oe-STAT3 kelompok, sementara ekspresi protein Mfn2 yang lebih tinggi diukur pada kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 bukan kelompok NC (semua P < 0.05).

Up-regulation miR-326-5p atau down-regulation STAT3 meningkatkan tingkat potensial membran mitokondria dalam jaringan otak pada tikus dengan CI/RI. a Ekspresi Mfn2 terdeteksi oleh imunohistokimia dalam jaringan otak tikus (bilah skala:50 m); b Jumlah sel Mfn2-positif dalam jaringan otak tikus MCAO setelah pengaturan miR-326-5p atau pengaturan bawah STAT3; c Potensi transmembran mitokondria dalam neuron jaringan otak tikus MCAO setelah pengaturan miR-326-5p atau pengaturan bawah STAT3; *P <0,05 dibandingkan dengan kelompok palsu; #P <0,05 dibandingkan dengan kelompok NC; &P < 0,05 dibandingkan dengan kelompok agomir miR-326-5p

Deteksi tingkat potensial membran mitokondria menemukan bahwa (Gbr. 4c) dibandingkan dengan kelompok palsu dan kelompok agomir miR-326-5p, tingkat potensi membran mitokondria menurun pada kelompok MCAO dan miR-326-5p agomir + oe-STAT3 kelompok, sementara itu meningkat pada kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 berbeda dengan kelompok NC (semua P < 0.05).

miR-326-5p Menargetkan STAT3

Ekspresi miR-326-5p dan STAT3 dalam neuron kortikal dan jaringan otak dideteksi oleh RT-qPCR dan analisis western blot. Dalam neuron kortikal in vitro, penurunan yang disarankan dalam ekspresi miR-326-5p dan peningkatan ekspresi STAT3 pada kelompok OGD relatif terhadap kelompok kontrol (keduanya P < 0,05). Sehubungan dengan kelompok NC, ekspresi miR-326-5p meningkat dan ekspresi STAT3 berkurang pada kelompok agomir miR-326-5p (keduanya P < 0,05); Ekspresi STAT3 menurun (P <0,05) pada kelompok sh-STAT3. Berbeda dengan kelompok agomir miR-326-5p, ekspresi STAT3 meningkat pada kelompok miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (P < 0,05) (Gbr. 5a–c).

miR-326-5p menargetkan STAT3. a miR-326-5p dan ekspresi mRNA STAT3 dalam neuron kortikal yang diobati dengan OGD secara in vitro; b , c Ekspresi protein STAT3 dalam neuron kortikal yang diobati dengan OGD secara in vitro; d miR-326-5p dan ekspresi mRNA STAT3 dalam jaringan otak tikus MCAO; e , f Ekspresi protein STAT3 dalam jaringan otak tikus MCAO; g Prediksi situs pengikatan miR-326-5p dan STAT3 oleh perangkat lunak bioinformatika; h Hubungan penargetan antara miR-326-5p dan STAT3 divalidasi oleh uji gen reporter luciferase ganda; Pada Gambar a –c , *P <0,05 dibandingkan dengan kelompok kontrol; #P <0,05 dibandingkan dengan kelompok NC; &P < 0,05 dibandingkan dengan kelompok agomir miR-326-5p. Pada Gambar d –f , *P <0,05 dibandingkan dengan kelompok palsu; #P <0,05 dibandingkan dengan kelompok NC; &P < 0,05 dibandingkan dengan kelompok agomir miR-326-5p

Dalam jaringan otak in vivo, dalam kaitannya dengan kelompok palsu, miR-326-5p yang lebih rendah dan STAT3 yang lebih tinggi muncul pada kelompok MCAO (keduanya P < 0,05). Dibandingkan dengan grup NC, ekspresi miR-326-5p meningkat sementara ekspresi STAT3 menurun pada grup agomir miR-326-5p (keduanya P < 0,05). Ekspresi STAT3 menurun pada grup sh-STAT3 (P < 0,05). Dengan kelompok agomir miR-326-5p sebaliknya, ekspresi STAT3 meningkat pada kelompok miR-326-5p agomir + oe-STAT3 (P < 0,05) (Gbr. 5d–f).

Situs penargetan miR-326-5p potensial pada STAT3 3′UTR ditemukan oleh perangkat lunak DIANA dan miRDB (Gbr. 5g). STAT3 3′UTR yang berisi situs pengikatan WT miR-326-5p dan situs pengikatan Mut dibangun dan dimasukkan ke dalam plasmid pmirGLO. Pengikatan miR-326-5p ke STAT3 3′UTR selanjutnya divalidasi dengan uji reporter luciferase. Uji reporter Luciferase mengungkapkan bahwa miR-326-5p agomir mengurangi aktivitas luciferase relatif STAT3-WT, tetapi tidak STAT3-Mut (Gbr. 5h), menyiratkan bahwa STAT3 adalah gen target langsung miR-326-5p.

Diskusi

CI/RI adalah penyebab utama kematian serebrovaskular [22]. miRNA diindikasikan untuk terlibat dalam CI/RI [23]. Namun, pemahaman komprehensif tentang mekanisme terkait miR-326-5p masih belum mencukupi di CI/RI. Dengan demikian, penelitian ini ditargetkan untuk menggali peran konkrit miR-326-5p di CI/RI dengan penekanan pada kombinasi timbal balik miR-326-5p dan STAT3. Secara produktif, penelitian ini telah menyatakan bahwa up-regulation miR-326-5p melemahkan CI/RI dan meningkatkan ekspresi Mfn2 melalui inhibisi STAT3.

Pada awalnya, ekspresi miR-326-5p ditentukan untuk mengurangi di CI/RI in vivo dan in vitro. Subsequently, we arranged a series assays and found that up-regulating miR-326-5p enhanced neuron viability and mitochondrial function, elevated Mfn2 expression and restrained oxidative stress and apoptosis. Furthermore, in vivo experiments in rats further verified the functional roles of restored miR-326-5p in CI/RI. As a matter of fact, high miR-326 is proved to correlate with long overall survival of patients with glioblastoma, the common type of brain tumor [24]. Also, miR-326 expression has been further evidenced to reduce in Parkinson's disease and miR-326 could suppress apoptosis of dopaminergic neurons and reduce inflammatory response [25]. Except for that, the reduction in miR-326-5p is manifested in endothelial progenitor cells in the course of myocardial infarction, and introduction of endothelial progenitor cells overexpressing could promote cardiac function recovery [11]. There has been a study illustrating that up-regulation of miR-326 improves the behavioral function, enhances neuronal viability and depresses neuronal apoptosis in mice with Alzheimer's disease [26]. Furthermore, it is documented that up-regulation of miR-326 by miR-326 mimic could suppress inducible nitric oxide synthase in dopaminergic neurons in Parkinson's disease [27].

In this study, we found that STAT3 was a target gene of miR-326-5p. Supported by an advanced study, it is indicated that STAT3 expression is negatively regulated by miR-326 in human endometrial carcinoma stem cells [28]. In the present study, we measured that STAT3 expression was enhanced in CI/RI. Currently, it has been found that I/R injury and OGD would induce STAT3 expression to increase [29]. Intriguingly, STAT3 mRNA expression trends to an increment in I/R animals [30]. Additionally, STAT3 protein expression is reported to up-regulate in CI/RI [31]. Next, our study revealed that down-regulating STAT3 had the therapeutic effects on CI/RI rats and OGD-treated neurons. As supported by a study, it is concluded that miR-31 induction discourages oxidative stress by inactivation of JAK/STAT3 pathway in ischemic stroke [32]. Also, inhibition of JAK2/STAT3 pathway is beneficial to oxidative stress impairment in CI/RI [31]. Furthermore, knockdown of JAK/STAT3 pathway is identified to enhance cell viability, and reduce oxidative stress and neuron apoptosis in ischemic brain injury [33]. Lately, inhibited JAK/STAT3 signaling pathway is witnessed to relieve myocardial infarction in myocardial I/R injury [34]. As demonstrated, depleted STAT3 undermines neuronal apoptosis in rats with white matter injury [35]. Moreover, the suppression of neuronal apoptosis, and alleviation of cerebral infarct size are attributed to JAK2/STAT3 inhibition in rats with CI/RI [36].

Finally, we focused on the effects of miR-326-5p and STAT3 on Mfn2 expression and discovered that the reduced level Mfn2 in rats with CI/RI and OGD-treated neurons could be elevated by either restoring miR-326-5p or silencing STAT3. As implicated by a previous study, it is documented that Mfn2 is decreased in the lately phase of reperfusion and poorly expressed of Mfn2 exacerbates CI/RI via restrained autophagosome formation and autophagosome and lysosome fusion [18]. Additionally, Mfn2 is implied to reduce even disappear in I/R injury in old hepatocytes [37]. However, few researches have discussed the regulatory mechanism of miR-326-5p and STAT3 for Mfn2.

Conclusion

In general, this study has elucidated the mechanisms that elevated miR-326-5p inhibits neuronal apoptosis, attenuates pathological damage of neurons and increases the expression of Mfn2 via STAT3 downregulation in CI/RI. The study may update the potential mechanism of miR-326-5p and STAT3 in CI/RI. However, more studies are still needed for further development of the molecular mechanism in CI/RI.

Ketersediaan data dan materi

Tidak berlaku.

Singkatan

miRNAs:

MicroRNAs

STAT3:

Signal transducer and activator of transcription-3

OGD:

Oxygen and glucose deprivation

MCAO:

Middle cerebral artery occlusion

ROS:

Spesies oksigen reaktif

STAT:

Signal transducers and transcriptional activator

Mfn2:

Mitofusin-2

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

NES:

Nestin

NC:

Negative control

Oe:

Overexpression

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

OD:

Kerapatan optik

PI:

Propidium iodida

MDA:

Malondialchehyche

GSH:

Glutathione

SOD:

Superoxide dismutase

DAB:

Diaminobenzidine

PVDF:

Polivinilidena fluorida

WT:

Wild-type

Mut:

Mutant

SD:

Simpangan baku

ANOVA:

One-way analysis of variance

Pembentukan dan Evaluasi Substrat Silikon dengan Lapisan Si Berpori yang Didoping Tinggi yang Dibentuk dengan Etsa Kimia Berbantuan Logam Chondroitin Sulfate/Polycaprolactone/Gelatin Electrospun Nanofibers dengan Antitrombogenisitas dan Peningkatan Afinitas Sel Endotel sebagai Perancah Potensial untuk Rekayasa Jaringan Pembuluh Darah