MikroRNA-326-5p Melindungi Neuron dalam Stroke: Menekan STAT3 Mengurangi Apoptosis dan Kerusakan Mitokondria

Abstrak

Studi telah secara luas menjelajahi peran mikroRNA (miRNA) dalam cedera ischemia/reperfusio otak (CI/RI). Namun, mekanisme spesifik miR-326-5p dalam CI/RI masih tidak diketahui. Oleh karena itu, studi ini bertujuan untuk mengungkap mekanisme sumbu miR-326-5p/signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3) dalam CI/RI. Dua model (deprivasi oksigen dan glukosa [OGD] pada neuron kortikal tikus primer dan penutupan arteria cerebral tengah [MCAO] pada tikus Sprague–Dawley) dirancang untuk meniru CI/RI in vitro dan in vivo, masing-masing. Uji loss- dan gain-of function dilakukan pada neuron yang dirawat OGD dan tikus MCAO. Setelahnya, kelangsungan hidup, apoptosis, stres oksidatif, dan potensi membran mitokondria pada neuron yang dirawat OGD diuji, serta perubahan patologis, apoptosis, dan potensi membran mitokondria pada jaringan otak tikus MCAO. Ekspresi Mitofusin-2 (Mfn2), miR-326-5p, dan STAT3 pada neuron yang dirawat OGD dan jaringan otak tikus MCAO terdeteksi. Mfn2 dan miR-326-5p berkurang, dan STAT3 meningkat pada neuron yang dirawat OGD dan jaringan otak tikus MCAO. miR-326-5p menargetkan dan secara negatif mengatur ekspresi STAT3. Memulihkan miR-326-5p atau mengurangi STAT3 memperkuat kelangsungan hidup, menghambat apoptosis dan stres oksidatif, meningkatkan potensi membran mitokondria, dan meningkatkan ekspresi Mfn2 pada neuron yang dirawat OGD. Menaikkan miR-326-5p atau menurunkan STAT3 meredakan perubahan patologis, menghambat apoptosis, dan meningkatkan potensi membran mitokondria serta ekspresi Mfn2 pada jaringan otak tikus dengan MCAO. Studi ini menjelaskan bahwa miR-326-5p yang naik atau STAT3 yang turun melindungi terhadap CI/RI dengan meningkatkan ekspresi Mfn2.

Pendahuluan

Cedera ischemia/reperfusio otak (CI/RI) adalah jenis cedera otak yang diikuti oleh stroke ischemik [1]. Fitur karakteristik paling mencolok dari cedera I/R otak adalah ischemia otak sementara awal yang diikuti oleh reperfusio [2]. CI/RI mengaktifasi apoptosis neuron dan menyebabkan kerusakan hipokampus dan kortikal [3]. Saat ini, aplikasi klinis yang paling umum adalah trombolitik untuk CI/RI [4]. Namun, reperfusio akan meningkatkan produksi spesies reaktif oksigen (ROS), yang mengakibatkan kerusakan DNA seluler, kerusakan terkait stres oksidatif, oksidasi protein, dan peroksidasi lipid, sehingga lebih memburukkan barere darah-otak dan edema [5]. Dengan demikian, urgensi untuk mencari opsi target baru menjadi prioritas utama untuk CI/RI.

MikroRNA (miRNA) dianggap secara luas sebagai peran potensial dan prognostik dalam CI/RI [6, 7]. Sebagai contoh, sebuah artikel telah menunjukkan bahwa miR-202-5p mengurangi kerusakan neuron dan deficit neurologis, serta kerusakan sel yang diinduksikan oleh deprivasi oksigen dan glukosa (OGD) pada model tikus penutupan arteria cerebral tengah (MCAO) dalam cedera ischemik [8]. Selain itu, ditemukan bahwa peningkatan miR-98 meningkatkan hasil neurologis pada tikus dengan stroke I/R [9] dan overexpressed miR-451 mengurangi apoptosis serebral ischemik pada tikus dengan CI/RI [10]. Secara spesifik, miR-326-5p memiliki kemampuan pro-angiogenik untuk sel progenitor endotel dan dapat meningkatkan fungsi jantung setelah infark miokard akut [11]. Namun, studi yang berpusat pada miR-326-5p dalam CI/RI masih dalam tahap awal. Signal transducers and transcriptional activator (STAT) adalah keluarga protein unik yang diaktifkan oleh CI/RI [12]. STAT3 diprediksi sebagai target miR-326-5p pada situs bioinformatika; therefore, kami mempelajari peran STAT3 yang diinduksikan oleh miR-326-5p dalam CI/RI. STAT3 memburukkan proses neuro-inflamasi ischemik dan cedera otak sekunder dengan melepaskan perantara pro-inflamasi [13, 14]. Secara spesifik, jalur Janus-activated kinase 2 (JAK2)/STAT3 memainkan peran fungsional dalam mencegah apoptosis sel yang diinduksikan oleh CI/RI [15]. Mitofusin-2 (Mfn2) adalah faktor fusi mitokondria yang dapat melindungi terhadap cedera I/R cardio-serebrovaskular [16] dan memperbaiki apoptosis neuron yang diinduksikan oleh hipoksia pada kerusakan otak ischemik [17]. Telah juga dicatat bahwa Mfn2 menampilkan efek protektif pada CI/RI [18].

Singkatnya, penelitian yang lebih mendalam belum banyak menemukan peran gabungan miR-326-5p dan STAT3 dalam CI/RI. Berdasarkan itu, studi ini diluncurkan dengan hipotesis bahwa miR-326-5p mengurangi CI/RI melalui targeting STAT3.

Materi dan Metode

Pernyataan Etika

Eksperimen disetujui oleh Komite Pengawasan dan Penggunaan Hewan Rumah Sakit Affiliasi Universitas Yangzhou; Universitas Yangzhou, dan dilakukan sesuai dengan Pedoman Pengawasan dan Penggunaan Tikus Eksperimental Rumah Sakit Affiliasi Universitas Yangzhou; Universitas Yangzhou.

Hewan Eksperimental

Tikus Sprague–Dawley dewasa jantan (6–8 minggu usia, 250 ± 30 g) dari Pusat Kedokteran Perbandingan, Universitas Yangzhou (Yangzhou, Cina), dijaga dalam lingkungan bebas patogen spesifik dengan akses bebas ke pangan dan air, (24 ± 1)°C, (50 ± 5)% kelembaban, dan siklus cahaya/gelap 12 jam.

Isolasi dan Identifikasi Sel

Tikus diuthanasi dengan dekapitasi, dan otaknya dipotong menjadi 1 mm³ untuk mengkonfigurasi suspensi sel, yang dicampur dengan larutan trypan blue 0,4% pada rasio 9:1 (konsentrasi akhir trypan blue 0,04%) dan densitas sel serta tingkat kelangsungan hidup dihitung dengan hemositometer. Sel (1 × 10⁶ sel/mL) ditanamkan dalam botol kultur sel yang telah dilapisi L-polylysine (0,1 mg/mL) dengan 5 × 10⁶ sel per botol. Ketika sel telah menempel pada dinding, mereka diinkubasi dengan medium segar (NeurobasalA + B27 + L-glutamine) dan terus dikultur selama 6–7 hari dengan medium diubah setengahnya setiap 2–3 hari.

Identifikasi sel: Neuron kortikal tikus digunakan untuk mempersiapkan slide neuron yang diinkubasi dengan antibodi politikal rabbit anti-tikus Nestin (NES) primer (1:200), serta antibodi immunoglobulin G kambing yang dilabeli fluorescein isothiocyanate (FITC) (1:50, keduanya dari Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Setelahnya, sel ditutup dengan anti-penghilang fluoresensi dan diamati dengan mikroskop fluoresensi.

Pembentukan Model OGD

Neuron dikultur dalam larutan Earle's bebas glukosa dan diekspos pada campuran gas 95% N₂ dan 5% CO₂. Setelah ventilasi tekanan positif selama 30 menit, lingkungan hipoksia terbentuk di mana sel diinkubasi (simulasi ischemia dengan OGD in vitro). Setelah 90 menit inkubasi, sel diinkubasi dengan medium pemeliharaan sel setelah larutan Earle's bebas glukosa dihilangkan. Sel rutin dikultur untuk eksperimen selanjutnya (simulasi reperfusio oksigen-glukosa in vitro). Medium normal di bawah normoksia berfungsi sebagai kontrol.

Neuron dibagi menjadi kelompok kontrol; kelompok OGD, kelompok kontrol negatif (NC) (neuron yang dirawat OGD dan ditransfeksi dengan oligonucleotides scrambled), kelompok agomir miR-326-5p (neuron yang dirawat OGD dan ditransfeksi dengan miR-326-5p agomir), kelompok sh-STAT3 (neuron yang dirawat OGD dan ditransfeksi dengan STAT3 shRNA) dan kelompok agomir miR-326-5p + overexpressed (oe)-STAT3 (neuron yang dirawat OGD dan ditransfeksi dengan miR-326-5p agomir dan vektor pcDNA-STAT3). Oligonucleotides dan vektor semuanya disediakan oleh GenePharma (Shanghai, Cina).

Menggunakan lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific), oligonucleotides scrambled, miR-326-5p agomir, STAT3 shRNA atau miR-326-5p agomir dan pcDNA-STAT3 ditransfeksi ke dalam neuron tikus primer dan efektivitas transfeksi diuji dengan reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) atau Western blot setelah 48 jam.

Uji 3-(4, 5-Dimetiltiazol-2-il)-2, 5-Difeniltetrazolium Bromida (MTT)

Neuron dibuat menjadi suspensi pada 1 × 10⁶ sel/mL dan dikultur selama 0, 24, dan 48 jam, masing-masing. Dalam lingkungan steril, neuron diinkubasi selama 2–4 jam dalam larutan MTT 10% dan ditambahkan dengan 150 μL larutan Formazan (Dimethyl Sulfoxide) hingga kristal larut sepenuhnya. Nilai densitas optik (OD) diukur pada pembaca mikropapan pada 570 nm.

Uji Apoptosis dengan Citometri Alir

Neuron dilepas dengan tripsin 0,25%, difugenasi pada 2000 rpm, dan disuspendasi dalam PBS. Kemudian, neuron difugenasi pada 2000 rpm, dan pelet disuspendasi dengan buffer binding dan diinkubasi secara berturut-turut dengan 5 μL Annexin V-FITC dan 5 μL iodida propidium (PI). Sebuah citometer alir digunakan untuk mendeteksi tingkat apoptosis.

Deteksi Potensi Membran Mitokondria JC-1

Sel pada papan 6-lubang dicuci dengan PBS, ditambahkan dengan 1 mL medium kultur sel dan 1 mL larutan kerja pewarnaan JC-1 (50 μL JC-1, 8 mL air ultraputih dan 2 mL buffer pewarnaan JC-1) (SolarbioScience, Beijing, Cina) dan diinkubasi selama 15 menit. Buffer pewarnaan JC-1 1 × dikonfigurasi oleh 4 mL air tisu dan 1 mL buffer pewarnaan JC-1. Setelah inkubasi, sel dilepas dengan tripsin, disuspendasi dalam buffer JC-1, dan diuji pada citometer alir. Proporsi relatif fluoresensi hijau dihitung.

Deteksi Stres Oksidatif

Tingkat ROS seluler diukur dengan Kit Deteksi 2,7-diklorofluoresesin diasetat (DCF-DA) (Abcam). Singkatnya, neuron dilepas dengan tripsin 0,25%, disuspendasi dan diinkubasi dengan 10 μm DCF-DA selama 30 menit. Setelahnya, fluoresensi DCF dengan pencahayaan eksitasi/emisi pada 495 nm/529 nm diukur dengan spektroskopi fluoresensi (BD Biosciences).

Deteksi kandungan malondialdehida (MDA) seluler, glutation (GSH), dan aktivitas superoksida dismutase (SOD) dilakukan dengan kolorimetri kimia menggunakan kit assay komersial (Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, Cina). Nilai OD diukur dengan pembaca mikropapan.

Pembentukan Model Tikus

Tikus dianesteshi dengan injeksi intraperitonealis pentobarbital natrium (50 μg/kg). Insisi tengah dilakukan pada leher, arteria karotis eksternal diikati, dan arteria karotis umum diblokir dengan klip arteri. Sutur nylon monofilamen dilapisi silikon 3–0 dimasukkan dengan hati-hati ke dalam arteria karotis internal hingga ada resistansi ringan. Setelah 90 menit ischemi serebral sementara, sutur ditarik dan reperfusio dilakukan selama 24 jam lainnya. Kelompok sham menerima perlakuan yang sama, kecuali sutur tidak memasuki arteria karotis internal. Selama operasi, ranjang termostatis digunakan untuk mempertahankan suhu rektum pada 37 ± 0,5 °C [19].

Tikus dialokasikan ke dalam 6 kelompok (n = 6) dan diobati dengan plasmid atau miR ke ventrikel serebral lateral sebelum pembentukan model MCAO, termasuk kelompok sham, kelompok MCAO (tikus yang dimodelkan), kelompok NC (tikus yang dimodelkan dengan injeksi ventrikel serebral lateral 5 μL oligonucleotides scrambled [100 μM]), kelompok agomir miR-326-5p (tikus yang dimodelkan dengan injeksi ventrikel serebral lateral 5 μL agomir miR-326-5p [100 μM]), kelompok sh-STAT3 (tikus yang dimodelkan dengan injeksi ventrikel serebral lateral 5 μL vektor interferensi STAT3 [100 μM]) dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (tikus yang dimodelkan dengan injeksi ventrikel serebral lateral 5 μL agomir miR-326-5p [100 μM] dan 5 μL vektor overexpressed STAT3 [100 μM]) [20, 21].

Pengumpulan Spesimen

Tikus diuthanasi dengan anestesi, jantung diperfusi, dan seluruh otak diperoleh. Jaringan otak yang cedera dipotong menjadi massa jaringan 1 × 1 × 1 mm³ untuk persiapan bagian parafin, RT-qPCR, analisis western blot, dan deteksi potensi membran mitokondria.

Deteksi Potensi Membran Mitokondria dalam Korteks Serebrum

Korteks serebrum tikus SD dipisahkan dan dipotong menjadi 1 mm³. Blok jaringan ditempatkan pada jaring nylon 300 mesh dan ditambahkan PBS. Kemudian, suspensi sel difugenasi pada 1000 r/min, ditambahkan dengan etanol 70% dan difugenasi pada 1000 r/min lagi. Setelahnya, sampel disuspendasi dalam 1 mL PBS, dan suspensi (1 × 10⁶ sel, 100 μM) bereaksi dengan larutan pewarna Rhodamine123 (10 μL, 5 μg/mL) dan dianalisis pada citometer alir pada 488 nm.

Pewarnaan HE

Jaringan otak tikus direndam dalam paraformaldehida 4% selama 24 jam, dan bagian parafin disiapkan, dipotong 4 μm, disebarkan dalam air 40 °C dan dipanggang pada 60 °C. Setelah dewaxing dan hidrasi rutin, bagian parafin diwarnai dengan larutan pewarnaan HE. Setelah pewarnaan HE, neuron yang rusak menunjukkan kontraksi inti, edema sel, vakuloisasi, dan inti yang gelap. Mikroskop cahaya (Nikon, Jepang) digunakan untuk memperoleh gambar, dan jumlah neuron yang bertahan (mm²) pada korteks ischemik dihitung.

Pewarnaan TUNEL

Bagian parafin di-dewax dan dihidrasi dengan alkohol 100%, 95%, 80%, dan 70%. Kemudian, bagian direndam dalam paraformaldehida 4% yang diikuti oleh inkubasi dengan buffer sitrat Triton X-100 0,1% selama 20 menit dan campuran reaksi TUNEL selama 1–1,5 jam. Selanjutnya, bagian dikembangkan dengan larutan peroksidase dan diaminobenzidin (DAB), diperwarnai kembali dengan hematoksin, dihidrasi dengan alkohol gradasi, dipermeabilisasi, dan ditutup dengan gumi netral. Bagian diamati di bawah mikroskop cahaya untuk menghitung sel positif TUNEL. Partikel cokelat kehitangan dalam inti didefinisikan sebagai sel positif TUNEL (sel apoptosis).

Imunohistokimia

Bagian di-dewax, dihidrasi dan diambil kembali dengan antigen sitrat, dan katalase endogen diblokir dengan H₂O₂ 3%. Setiap bagian ditambahkan serum kambing (50 μL), diinkubasi dengan antibodi primer (50 μL) dan bereaksi dengan antibodi sekunder (50 μL) dan streptavidin yang dilabeli peroksidase horseradish (50 μL). Bagian dikembangkan dengan DAB dan diperwarnai kembali dengan hematoksin, yang diikuti oleh dehydrasi alkohol gradasi, permeabilisasi xylene dan penyegelan gumi netral. Bagian diamati oleh mikroskop (citoplasma atau inti jaringan otak ischemik adalah partikel kuning atau cokelat kehitangan). Nilai OD diukur dan dirata-ratakan.

RT-qPCR

Ekstraksi RNA total dari jaringan dan sel dilakukan dengan Trizol (Invitrogen). Ekspresi mRNA dianalisis melalui qPCR menggunakan SYBR Green PCR Mix (Applied Biosystems, CA, USA) dan sistem PCR real-time QuantStudio TM 6Flex (Applied Biosystems). Primer reverse transkripsi stem-loop spesifik dan primer forward/reverse (BioTNT, Shanghai, Cina) dirancang untuk menganalisis tingkat miRNA. Tabel 1 mencantumkan semua primer. Metode 2⁻△△CT digunakan untuk menghitung tingkat miRNA atau mRNA.

Analisis Western Blot

Sampel protein dipisahkan oleh elektroforesis gel akrilamida natrium dodeksil sulfat 10% dan dialokasi transfer elektro onto membran fluorida polivinilidenida (PVDF). Setelah itu, membran PVDF diblokir dengan 5% tepung susu skrim dalam Tris yang mengandung garam, diprobe dengan antibodi primer dan di-reprobe dengan antibodi sekunder selama 2 jam. Kemudian, pita protein dianalisis dengan buffer fosfatase alkaline yang mengandung Nitroblue tetrazolium klorida dan 5-Bromo-4-Kloro-3-Indosil Fosfat dan diukur dengan perangkat lunak ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Antibodi utama adalah STAT3 (1:1000), Mfn2 (1:1000, Abcam, MA, USA) dan gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Uji Gen Laporan Dual Luciferase

STAT3 3′UTR yang mengandung situs pengikatan tipe liar (WT) atau mutant (Mut) miR-326-5p dikloning ke dalam vektor pmirGLO (Promega, WI, USA), yang disebut STAT3-WT dan STAT3-Mut. Sel ditanam pada papan 24-lubang pada 2 × 10⁴ sel/lubang dan ditransfeksi bersama dengan 100 ng vektor pelapor STAT3-WT atau STAT3-Mut dan 50 nM miR-326-5p agomir atau agomir NC-nya pada kekeruhan 70%. Aktivitas luciferase diukur menggunakan Sistem Pelapor Dual-Luciferase (Promega Corporation, WI, USA).

Analisis Statistik

Perangkat lunak statistik SPSS 21.0 (IBM, NY, USA) digunakan untuk analisis data. Data diekspresikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbedaan antara dua kelompok dianalisis dengan uji t-Student, sementara perbandingan multipel dianalisis dengan analisis variansi satu arah (ANOVA), diikuti oleh uji post hoc Tukey. P mewakili uji dua sisi, dan P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Penaikan miR-326-5p atau Penurunan STAT3 Mengurangi Apoptosis Neuron Kortikal yang Dirawat OGD

Setelah dikultur selama satu minggu, neuron kortikal tikus diferensiasi dan matang. Secara mikroskopik, neuron menunjukkan tubuh neuron yang lebih besar, sitoplasma yang lebih transparan, inti besar dengan densitas rendah, dan indeks refraksi yang kuat. Tubuh neuron berbentuk kerucut atau bundar, dan denkrit berselisih serta menempel pada dinding (Gambar 1a, b). NES adalah penanda kimia spesifik dari neuron serebr untuk menemukan neuron dengan spesifisitas tinggi melalui uji imunofluoresensi. Neuron ditemukan secara spesifik terikat pada NES dan menunjukkan fluoresensi hijau (Gambar 1c).

Uji MTT diterapkan untuk mendeteksi kelangsungan hidup neuron kortikal (Gambar 1d). Hasilnya menunjukkan bahwa kelangsungan hidup neuron kortikal tikus terpengaruh dalam kelompok OGD dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3 dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, tetapi ditingkatkan dalam kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 dibandingkan dengan kelompok NC (semua P < 0,05).

Apoptosis neuron kortikal tikus ditentukan oleh citometri alir, sementara ekspresi mRNA Bcl-2 dan Bax oleh RT-qPCR (Gambar 1e–g). Hasilnya menjelaskan bahwa dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, kelompok OGD dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3 menunjukkan tingkat apoptosis yang meningkat, ekspresi Bcl-2 yang berkurang, dan ekspresi Bax yang meningkat (semua P < 0,05). Dengan kelompok NC sebagai kontras, tingkat apoptosis menurun, tingkat Bcl-2 meningkat, dan tingkat Bax tertekan dalam kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 (semua P < 0,05).

Penaikan miR-326-5p atau Penurunan STAT3 Meningkatkan Mfn2 dan Tingkat Potensi Membran Mitokondria pada Neuron Kortikal Setelah Cedera OGD

Ekspresi Mfn2 pada neuron kortikal yang dirawat OGD terdeteksi oleh analisis western blot (Gambar 2a, b). Terhadap kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, ekspresi protein Mfn2 berkurang dalam kelompok OGD dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3, sementara meningkat dalam kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 dibandingkan dengan kelompok NC (semua P < 0,05).

Potensi membran mitokondria yang terdeteksi oleh JC-1 menunjukkan bahwa (Gambar 2c, d) terhadap kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, tingkat potensi membran mitokondria menurun dalam kelompok OGD dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (semua P < 0,05). Terhadap kelompok NC, tingkat potensi membran mitokondria meningkat dalam kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 (semua P < 0,05).

Kandungan ROS dan MDA, serta aktivitas GSH dan SOD pada neuron kortikal yang dirawat OGD ditentukan dan hasilnya menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok kontrol dan kelompok agomir miR-326-5p, kelompok OGD dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3 menunjukkan kandungan ROS dan MDA yang meningkat serta aktivitas GSH dan SOD yang terpengaruh (semua P < 0,05). Dibandingkan dengan kelompok NC, kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 menunjukkan kandungan ROS dan MDA yang berkurang serta aktivitas GSH dan SOS yang diperkuat (semua P < 0,05) (Gambar 2e–g).

Penaikan miR-326-5p atau Penurunan STAT3 Mencegah Kerusakan Patologis Neuron Kortikal dan Menghambat Apoptosis pada Tikus dengan CI/RI

Pewarnaan HE digunakan untuk mengamati kerusakan patologis jaringan otak (Gambar 3a, b), menunjukkan bahwa dalam kelompok sham, neuron memiliki struktur yang normal dan tertata rapi dengan sitoplasma merah muda, inti biru, dan nukleolus yang jelas. Dalam kelompok MCAO, kelompok NC, dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3, kecuali nekrosis, diamati bahwa neuron tertata tidak teratur dan berwarna lebih gelap, dengan ruptur membran inti, hilangnya struktur sel, piknosis karyon, inti yang berwarna dalam, dan lisis dalam jumlah besar. Dalam kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3, pembengkakan neuron mereda dan neuron tertata rapi, dan sel nekrotik berkurang, menunjukkan status yang lebih baik terkait dengan kelompok MCAO dan kelompok NC.

Pewarnaan TUNEL digunakan untuk deteksi apoptosis neuron dan RT-qPCR untuk ekspresi mRNA Bcl-2 dan Bax pada jaringan otak. Hasilnya menunjukkan bahwa (Gambar 3c–e) dibandingkan dengan kelompok sham dan kelompok agomir miR-326-5p, tingkat TUNEL-positif meningkat, ekspresi mRNA Bcl-2 berkurang, dan ekspresi mRNA Bax meningkat dalam kelompok MCAO dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (semua P < 0,05). Tingkat TUNEL-positif yang lebih rendah dan ekspresi mRNA Bax, serta ekspresi mRNA Bcl-2 yang lebih tinggi ditunjukkan dalam kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 dibandingkan dengan kelompok NC (semua P < 0,05).

Penaikan miR-326-5p atau Penurunan STAT3 Meningkatkan Tingkat Potensi Membran Mitokondria pada Jaringan Otak pada Tikus dengan CI/RI

Deteksi ekspresi protein Mfn2 pada jaringan otak tikus dilakukan oleh imunohistokimia, dan hasilnya menunjukkan bahwa (Gambar 4a, b) ekspresi protein Mfn2 yang lebih rendah diuji dalam kelompok sham dan kelompok agomir miR-326-5p dibandingkan dengan kelompok MCAO dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3, sementara ekspresi protein Mfn2 yang lebih tinggi diukur dalam kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 sebagai pengganti kelompok NC (semua P < 0,05).

Deteksi tingkat potensi membran mitokondria menunjukkan bahwa (Gambar 4c) dibandingkan dengan kelompok sham dan kelompok agomir miR-326-5p, tingkat potensi membran mitokondria menurun dalam kelompok MCAO dan kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3, sementara meningkat dalam kelompok agomir miR-326-5p dan kelompok sh-STAT3 dibandingkan dengan kelompok NC (semua P < 0,05).

miR-326-5p Menenjadi Target STAT3

Ekspresi miR-326-5p dan STAT3 pada neuron kortikal dan jaringan otak terdeteksi oleh RT-qPCR dan analisis western blot. Pada neuron kortikal in vitro, penurunan diusulkan dalam ekspresi miR-326-5p dan peningkatan dalam ekspresi STAT3 dalam kelompok OGD terhadap kelompok kontrol (kedua P < 0,05). Terhadap kelompok NC, ekspresi miR-326-5p meningkat dan ekspresi STAT3 berkurang dalam kelompok agomir miR-326-5p (kedua P < 0,05); ekspresi STAT3 berkurang (P < 0,05) dalam kelompok sh-STAT3. Sebaliknya terhadap kelompok agomir miR-326-5p, ekspresi STAT3 meningkat dalam kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (P < 0,05) (Gambar 5a–c).

Pada jaringan otak in vivo, terkait dengan kelompok sham, miR-326-5p yang lebih rendah dan STAT3 yang lebih tinggi muncul dalam kelompok MCAO (kedua P < 0,05). Terhadap kelompok NC, ekspresi miR-326-5p meningkat sementara ekspresi STAT3 berkurang dalam kelompok agomir miR-326-5p (kedua P < 0,05). Ekspresi STAT3 berkurang dalam kelompok sh-STAT3 (P < 0,05). Dengan kelompok agomir miR-326-5p sebagai kontras, ekspresi STAT3 meningkat dalam kelompok agomir miR-326-5p + oe-STAT3 (P < 0,05) (Gambar 5d–f).

Situs pengikatan potensial miR-326-5p pada STAT3 3′UTR ditemukan oleh perangkat lunak DIANA dan miRDB (Gambar 5g). STAT3 3′UTR yang mengandung situs pengikatan WT miR-326-5p dan situs pengikatan Mut dikonstruksi dan dimasukkan ke dalam plasmid pmirGLO. Pengikatan miR-326-5p ke STAT3 3′UTR divalidasi lebih lanjut oleh uji pelapor luciferase. Uji pelapor luciferase menunjukkan bahwa agomir miR-326-5p mengurangi aktivitas luciferase relatif dari STAT3-WT, tetapi bukan STAT3-Mut (Gambar 5h), yang menyiratkan bahwa STAT3 adalah gen target langsung dari miR-326-5p.

Pembahasan

CI/RI adalah penyebab utama kematian serebrovaskular [22]. miRNA dinyatakan terlibat dalam CI/RI [23]. Namun, pemahaman yang komprehensif tentang mekanisme terkait miR-326-5p masih tidak cukup dalam CI/RI. Oleh karena itu, studi ini bertujuan untuk mengungkap peran konkret miR-326-5p dalam CI/RI dengan penekanan pada interaksi gabungan miR-326-5p dan STAT3. Secara produktif, studi ini telah menyatakan bahwa penaikan miR-326-5p mengurangi CI/RI dan meningkatkan ekspresi Mfn2 melalui inhibisi STAT3.

Pada awalnya, ekspresi miR-326-5p ditentukan berkurang dalam CI/RI in vivo dan in vitro. Selanjutnya, kami mengatur serangkaian uji dan menemukan bahwa penaikan miR-326-5p meningkatkan kelangsungan hidup neuron dan fungsi mitokondria, meningkatkan ekspresi Mfn2 dan menahan stres oksidatif serta apoptosis. Selain itu, eksperimen in vivo pada tikus lebih lanjut memverifikasi peran fungsional pemulihan miR-326-5p dalam CI/RI. Sebagai kenyataan, terbukti bahwa miR-326 yang tinggi berkorelasi dengan kelangsungan hidup keseluruhan yang panjang pada pasien dengan glioblastoma, jenis tumor otak yang umum [24]. Juga, terbukti lebih lanjut bahwa ekspresi miR-326 berkurang dalam penyakit Parkinson dan miR-326 dapat menekan apoptosis neuron dopaminergik dan mengurangi respons inflamasi [25]. Kecuali itu, penurunan miR-326-5p dinyatakan pada sel progenitor endotel selama infark miokard, dan pengenalan sel progenitor endotel yang overexpressed dapat mempromosikan pemulihan fungsi jantung [11]. Ada studi yang menggambarkan bahwa penaikan miR-326 meningkatkan fungsi perilaku, meningkatkan kelangsungan hidup neuron dan menekan apoptosis neuron pada tikus dengan penyakit Alzheimer [26]. Selanjutnya, tercatat bahwa penaikan miR-326 oleh miR-326 mimic dapat menekan sintetase oksida nitrogen dapat diinduksi pada neuron dopaminergik dalam penyakit Parkinson [27].

Dalam studi ini, kami menemukan bahwa STAT3 adalah gen target dari miR-326-5p. Didukung oleh studi lanjutan, dinyatakan bahwa ekspresi STAT3 diatur secara negatif oleh miR-326 pada sel stem karsinoma endometrium manusia [28]. Dalam studi saat ini, kami mengukur bahwa ekspresi STAT3 ditingkatkan dalam CI/RI. Saat ini, telah ditemukan bahwa cedera I/R dan OGD akan menginduksi peningkatan ekspresi STAT3 [29]. Menariknya, ekspresi mRNA STAT3 cenderung meningkat pada hewan I/R [30]. Selain itu, ekspresi protein STAT3 dilaporkan meningkat dalam CI/RI [31]. Selanjutnya, studi kami mengungkapkan bahwa penurunan STAT3 memiliki efek terapeutik pada tikus CI/RI dan neuron yang dirawat OGD. Seperti yang didukung oleh studi, disimpulkan bahwa induksi miR-31 menahan stres oksidatif dengan inaktivasi jalur JAK/STAT3 pada stroke ischemik [32]. Juga, inhibisi jalur JAK2/STAT3 bermanfaat untuk kerusakan stres oksidatif dalam CI/RI [31]. Selain itu, knockdown jalur JAK/STAT3 diketahui meningkatkan kelangsungan hidup sel, dan mengurangi stres oksidatif serta apoptosis neuron pada cedera otak ischemik [33]. Akhirnya, jalur sinyal JAK/STAT3 yang diinhibisi dinyatakan meredakan infark miokard dalam cedera I/R miokard [34]. Seperti yang ditunjukkan, pengosongan STAT3 menurunkan apoptosis neuron pada tikus dengan cedera putih otak [35]. Selain itu, penindasan apoptosis neuron, dan pengurangan ukuran infark serebral dikaitkan dengan inhibisi JAK2/STAT3 pada tikus dengan CI/RI [36].

Akhirnya, kami berfokus pada efek miR-326-5p dan STAT3 pada ekspresi Mfn2 dan menemukan bahwa tingkat Mfn2 yang berkurang pada tikus dengan CI/RI dan neuron yang dirawat OGD dapat ditingkatkan dengan memulihkan miR-326-5p atau melemahkan STAT3. Seperti yang diimplikasikan oleh studi sebelumnya, tercatat bahwa Mfn2 berkurang pada tahap akhir reperfusio dan ekspresi Mfn2 yang buruk memperburuk CI/RI melalui pembentukan autofagosom yang tertekan dan fusi autofagosom dan lisosom [18]. Selain itu, Mfn2 diimplikasikan berkurang bahkan hilang dalam cedera I/R pada hepatos tua [37]. Namun, sedikit penelitian yang membahas mekanisme pengaturan miR-326-5p dan STAT3 untuk Mfn2.

Kesimpulan

Secara umum, studi ini telah mengungkap mekanisme bahwa miR-326-5p yang meningkat mencegah apoptosis neuron, mengurangi kerusakan patologis pada neuron dan meningkatkan ekspresi Mfn2 melalui penurunan STAT3 dalam CI/RI. Studi ini mungkin memperbarui mekanisme potensial miR-326-5p dan STAT3 dalam CI/RI. Namun, masih diperlukan lebih banyak studi untuk pengembangan lebih lanjut mekanisme molekuler dalam CI/RI.

Ketersediaan Data dan Bahan

Tidak berlaku.

Singkatan

Tersedia dalam daftar singkatan asli.