Toksikasi Hati, Otak, dan Embrio Bergantung Dosis Nanopartikel Dioxid Titanium pada Tikus
Abstrak
Nanopartikel dioxid titanium (TiO₂-NP) banyak ditemukan dalam makanan, kosmetik, dan produk medis, namun profil keamanannya masih tidak pasti. Menggunakan tikus ICR, kami memeriksa distribusi bio, toksisitas organ spesifik, dan mekanisme yang mendasarinya dari TiO₂-NP yang diberikan melalui injeksi intraperitoneal (i.p.) dan sonda oral. Akumulasi titanium mengikuti pola yang bergantung pada dosis, dengan hati menunjukkan beban tertinggi, diikuti oleh ginjal, plupa, paru-paru, otak, dan jantung. Paparan dosis tinggi (≥150 mg kg⁻¹) menyebabkan perubahan rasio berat organ terhadap berat badan yang signifikan, gangguan fungsi hati dan ginjal, dan gangguan metabolik seperti yang tercermin dalam biokimia serum. Dalam hati, TiO₂-NP menyebabkan pembengkakan mitokondria, apoposis hepatosit, produksi spesies reaktif oksigen (ROS) berlebihan, dan dysregulation gen antioksidan serta detoksifikasi (SOD, CAT, GST, HSP70, CYP1A1). Dalam otak, dosis tinggi menyebabkan pecahan neuron, infiltrasi inflamasi, aktivitas sintase nitrogen oksida yang meningkat, level glutamate dan asetilkolinesterase yang berubah, dan peroksidasi lipid. Kultur embrio ex vivo yang diekpos pada ≥100 µg mL⁻¹ TiO₂-NP menunjukkan panjang crown-rump yang terkurangi, panjang kepala yang terkurangi, dan tingkat malformasi yang meningkat, dengan toksisitas meningkat seiring dengan ukuran partikel. Temuan ini menekankan risiko organ spesifik dan bergantung dosis dari paparan TiO₂-NP dan memberikan dasar untuk evaluasi risiko kesehatan manusia.
Latar Belakang
Nanopartikel dioxid titanium (TiO₂-NP) dimasukkan dalam spektrum luas produk konsumen, termasuk permen, minuman, susu, kosmetik, dan farmasi. Konsentrasi yang dilaporkan dalam makanan dapat mencapai 0,5–9 g kg⁻¹, dan produk yang dipasarkan sebagai “bebas nano” seringkali masih mengandung TiO₂-NP [1–3]. Meskipun TiO₂-NP menawarkan properti fungsional yang berharga, potensinya untuk mengakumulasi dalam jaringan biologis dan menyebabkan toksisitas adalah kekhawatiran yang berkembang [4–6]. Studi hewan telah menunjukkan bahwa TiO₂-NP dapat diabsorpsi melalui saluran pencernaan atau inhalasi, kemudian mendistribusikan ke hati, ginjal, plupa, paru-paru, jantung, dan otak [7–8]. In vitro, TiO₂-NP telah menghasilkan sitotoksisitas dalam sel linfoblastoid dan hepatoma, menginduksi stres oksidatif pada sel glia, dan mengakibatkan kelangkaan neuron dalam cara yang bergantung pada dosis [9–12]. Mekanisme melibatkan kerusakan oksidatif, perubahan permeabilitas membran, oksidasi DNA (8-OHG), inflamasi, dan apoposis [13–19]. Data yang komprehensif dan sistematis tentang toksisitas TiO₂-NP masih jarang; oleh karena itu, studi ini mencoba untuk mengungkapkan efek dan mekanismenya in vivo.
Metode
Bahan dan Reagen
TiO₂ skala mikro dan 5 nm anatase TiO₂ diperoleh dari Sigma-Aldrich (Shanghai). 10, 60, dan 90 nm anatase TiO₂ dibeli dari Run He Ltd. (Shanghai). Reagen kualitas analitis diperoleh dari Sigma-Aldrich (Shanghai) dan Gibco (USA). Suspensi TiO₂ (1%) dipasteur, di sonikasi, dan dicairkan ke konsentrasi yang diinginkan sebelum penggunaan.
Hewan dan Model
Tikus ICR (22 ± 3 g, 50% jantan/betina) digunakan untuk studi toksisitas organ; betina ICR (45, 20–35 g) dan jantan (15, 35–40 g) untuk toksisitas embrio. Semua prosedur disetujui oleh Komite Etika Universitas Ilmu dan Teknologi Tianjin dan mematuhi pedoman perawatan hewan internasional.
Regimen Dosis
Untuk toksisitas umum, tikus menerima i.p. TiO₂-NP pada 5, 10, 50, 100, 150, atau 200 mg kg⁻¹ harian selama 14 hari (10 tikus/grup). Hewan kontrol menerima larutan garam. Untuk toksisitas hati, tikus diberi sonda oral dengan 5, 10, atau 50 mg kg⁻¹ harian selama 60 hari (10 tikus/grup); kontrol menerima 0,5% CMC.
Kuantifikasi Titanium
Sampel jaringan dicerna dengan HNO₃/H₂O₂, dicairkan, dan dianalisis dengan ICP-MS. Konsentrasi titanium dinyatakan per gram jaringan.
Biokimia Darah
Aktivitas enzim serum (ALT, ALP, AST, LDH, CK, dll.) diukur menggunakan analyzer Toshiba TBA-2000FR. Rasio berat organ terhadap berat badan dihitung setelah eutanasi.
Histopatologi dan TEM
Organ yang dikonsentrasi dalam formalin 10% diwarnai dengan hematoxylin-eosin. Jaringan hati dan otak diproses untuk mikroskopi elektron transmisi untuk menilai integritas mitokondria dan struktur ultra-seluler.
Stres Oksidatif dan Ekspresi Gen
Level ROS (O₂⁻, H₂O₂, MDA) dikuantifikasi dengan ensayos warna. Aktivitas enzim antioksidan (SOD, CAT, GPx, APX) dan antioksidan non-enzimatik (ASA/DASA, GSH/GSSG) diukur dalam homogenisasi otak. Level mRNA gen antioksidan dan terkait stres dikuantifikasi dengan qPCR, dinormalisasi ke β-aktin.
Toksisitas Embrio Ex Vivo
Embrio pada hari embrio 8,5 dikultur dengan TiO₂-NP (0–200 µg mL⁻¹) selama 48 jam, dengan studi time-course tambahan (16, 26, 48 jam). Parameter perkembangan (panjang crown-rump, panjang kepala, diameter kantung yakin, bagian tubuh) dan tingkat malformasi dievaluasi menggunakan skor Maele-Fabry Van [22].
Analisis Statistik
Data dianalisis dengan SPSS 13; signifikansi ditetapkan pada p < 0,05. Perbandingan menggunakan uji t Dunnett, ANOVA, LSD, SNK, chi-square, atau uji rank-sum sesuai kebutuhan.
Hasil
Distribusi Titanium dalam Jaringan
TiO₂-NP mengakumulasi di hati, ginjal, plupa, paru-paru, otak, dan jantung dalam cara yang bergantung pada dosis (Fig. 1). Hati menunjukkan beban titanium tertinggi, diikuti oleh ginjal, dengan level yang serupa di plupa, paru-paru, otak, dan jantung.
Gambar 1. Konsentrasi titanium dalam organ setelah paparan i.p. 14 hari TiO₂-NP. *p < 0,05, #p < 0,01 versus kontrol.
Toksisitas Umum
Peningkatan berat badan tidak terpengaruh di semua dosis. Dosis rendah (5–10 mg kg⁻¹) tidak mengubah rasio berat organ terhadap berat badan. Dosis tinggi (≥50 mg kg⁻¹) meningkatkan rasio hati, ginjal, plupa, dan jantung sambil mengurangi rasio paru-paru dan otak (Fig. 2).
Gambar 2. Rasio berat organ terhadap berat badan setelah paparan i.p. 14 hari. *p < 0,05, #p < 0,01 versus kontrol.
Paparan dosis tinggi (150–200 mg kg⁻¹) meningkatkan enzim hati serum (ALT, ALP, LAP, PChE, TBIL, TP, ALB) dan marker ginjal (UA, BUN yang menurun), dan meningkatkan marker cedera jantung (AST, CK, LDH, HBDH) dan parameter metabolik (GLU, TG, TC, HDL). Dosis rendah tidak menunjukkan perubahan biokimia yang signifikan (Fig. 3).
Gambar 3. Biokimia serum setelah paparan i.p. 14 hari. *p < 0,05, #p < 0,01 versus kontrol.
Toksisitas Hati
Histologi mengungkapkan kongesti vaskular, infiltrasi basofil, ischemi, dan obstruksi vena sentral yang bergantung pada dosis pada ≥50 mg kg⁻¹ (Fig. 4). TEM menunjukkan pembengkakan mitokondria, kondensasi kromatin, dan badan apoposis pada dosis sebesar 5 mg kg⁻¹ sonda oral (Fig. 5). Sonda oral dosis rendah tidak mengubah ROS, MDA, atau ekspresi gen antioksidan, sedangkan 10–50 mg kg⁻¹ meningkatkan ROS (O₂⁻, H₂O₂, NO, MDA) dan menurunkan regulasi SOD, CAT, GSHPx, MT, GST, HSP70, P53, TF, sambil meningkatkan regulasi CYP1A1 (Fig. 6 & 7).
Gambar 4. Histologi hati pada berbagai dosis TiO₂-NP.
Gambar 5. TEM hepatosit setelah paparan sonda oral.
Gambar 6. Produksi ROS dan level MDA dalam hati.
Gambar 7. Ekspresi relatif gen antioksidan dan stres hati.
Toksisitas Otak
Dosis tinggi (≥100 mg kg⁻¹) mengurangi rasio otak terhadap berat badan dan meningkatkan level titanium otak (Fig. 1). Histologi menunjukkan pecahan neuron, retakan, dan infiltrasi inflamasi pada 150–200 mg kg⁻¹ (Fig. 8). Parameter oksidatif meningkat, sementara aktivitas enzim antioksidan dan antioksidan non-enzimatik menurun. Aktivitas sintase nitrogen oksida dan level NO meningkat; aktivitas asetilkolinesterase dan glukosa menurun (Fig. 9 & 10).
Gambar 8. Histologi otak pada berbagai dosis TiO₂-NP.
Gambar 9. Rasio ASA/DASA dan GSH/GSSG.
Gambar 10. Perubahan ROS, enzim antioksidan, sinyal NO, glutamate, dan asetilkolinesterase.
Toksisitas Embrio
Embrio ex vivo yang diekpos pada ≥100 µg mL⁻¹ TiO₂-NP menunjukkan panjang crown-rump yang terkurangi, panjang kepala yang terkurangi, dan tingkat malformasi yang meningkat, dengan toksisitas meningkat seiring dengan ukuran partikel (Tabel 2). Studi time-course menunjukkan penundaan perkembangan yang signifikan dan malformasi setelah paparan 24–48 jam pada 200 µg mL⁻¹, terlepas dari ukuran (Tabel 3).
Pembahasan
Data kami mengonfirmasi bahwa TiO₂-NP mengakumulasi di beberapa organ dalam cara yang bergantung pada dosis. Paparan dosis tinggi mengakibatkan cedera sel hati, disfungsi ginjal, dan gangguan metabolik, konsisten dengan laporan sebelumnya [7, 23–28]. Stres oksidatif, terbukti oleh peningkatan ROS dan MDA serta penurunan pertahanan antioksidan, tampaknya sentral untuk heptotoksisitas. Analisis ekspresi gen mendukung gangguan jalur detoksifikasi (SOD, CAT, GST), respons stres (HSP70, P53), dan metabolisme xenobiotik (CYP1A1).
Dalam otak, TiO₂-NP menginduksi peroksidasi lipid, kerusakan neuron, dan respons inflamasi, disertai dengan dysregulation sinyal nitrogen oksida dan ketidakseimbangan neurotransmitter. Temuan ini sejalan dengan neurotoksisitas yang dilaporkan untuk nanopartikel oksida logam lainnya [24, 26, 37, 40].
Kultur embrio mengungkapkan toksisitas perkembangan yang bergantung pada dosis dan ukuran, mencerminkan studi in vivo yang menunjukkan bahaya reproduksi dan perkembangan dari TiO₂-NP [46–48, 49, 51]. Tren toksisitas yang lebih besar dengan partikel yang lebih besar mungkin mencerminkan penyerapan sel yang ditingkatkan atau reaktivitas permukaan yang berubah.
Secara kolektif, TiO₂-NP menimbulkan risiko organ spesifik yang sangat bergantung pada dosis. Kapasitasnya untuk menghasilkan stres oksidatif, mengganggu pertahanan antioksidan, dan mengubah ekspresi gen mendasari heptotoksisitas, neurotoksisitas, dan toksisitas perkembangan yang diamati.
Kesimpulan
TiO₂-NP yang dikonsumsi menyebar ke jantung, otak, plupa, paru-paru, dan ginjal, menyebabkan disfungsi hati, ginjal, dan jantung, gangguan metabolik glukosa dan lipid, dan neurotoksisitas melalui stres oksidatif dan dysregulation gen. Perkembangan embrio terganggu dalam cara yang bergantung pada dosis dan ukuran. Temuan ini menekankan kebutuhan akan evaluasi risiko yang ketat terhadap paparan TiO₂-NP pada manusia.
