Menghambat MicroRNA-301 Menahan Angiogenesis dan Pertumbuhan Sel pada Karsinoma Sel Skuamosa Kerongkongan dengan Meningkatkan PTEN
Abstrak
Tujuan
Karsinoma sel skuamosa esofagus (ESCC) ditampilkan oleh metastasis dini dan diagnosis terlambat. MicroRNA-301 (miR-301) diketahui berpartisipasi dalam beragam kanker. Namun demikian, efek miR-301 pada ESCC tetap belum diselidiki. Oleh karena itu, kami bertujuan untuk mengeksplorasi peran miR-301 dalam perkembangan ESCC.
Metode
Ekspresi miR-301 dan fosfatase dan tensin homolog (PTEN) dalam jaringan ESCC dan garis sel dinilai. Selanjutnya, sel-sel yang disaring diperlakukan dengan oligonukleotida dan plasmid miR-301 atau PTEN yang diubah, dan kemudian, kemampuan pembentukan koloni, viabilitas sel, migrasi, invasi, distribusi siklus sel dan apoptosis sel ESCC dinilai. Selain itu, pertumbuhan tumor dan densitas pembuluh mikro (MVD) juga dinilai, dan hubungan penargetan antara miR-301 dan PTEN telah dikonfirmasi.
Hasil
MiR-301 diregulasi, dan PTEN diturunkan regulasi di jaringan dan sel ESCC. Sel KYSE30 dan sel Eca109 dipilih untuk pengujian fungsional. Dalam sel KYSE30, menghambat miR-301 atau PTEN yang diekspresikan secara berlebihan menekan perilaku ganas sel, dan membungkam PTEN menghilangkan dampak penghambatan miR-301 pada perkembangan ESCC. Dalam sel Eca109, ekspresi berlebih miR-301 atau penghambatan PTEN mendorong perilaku ganas sel, dan ekspresi berlebih PTEN membalikkan efek peningkatan miR-301 pada perkembangan ESCC. Uji in vivo mengungkapkan bahwa penghambatan miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menekan pertumbuhan tumor ESCC dan MVD, dan peningkatan miR-301 atau pengurangan PTEN memiliki efek sebaliknya. Selain itu, PTEN menjadi sasaran miR-301.
Kesimpulan
Secara keseluruhan, hasil dalam penelitian kami mengungkapkan bahwa miR-301 memengaruhi pertumbuhan sel, metastasis, dan angiogenesis melalui pengaturan ekspresi PTEN di ESCC.
Pengantar
Kanker esofagus (EC), kanker paling umum ke-8 di seluruh dunia, merupakan keganasan kritis dengan mortalitas tinggi dan prognosis buruk [1]. Terhitung sekitar 90% dari total kasus EC, karsinoma sel skuamosa esofagus (ESCC) adalah bentuk utama EC di Cina [2]. Berbagai penyebab termasuk status sosial ekonomi rendah, merokok, konsumsi alkohol, asupan gizi yang buruk, makanan yang kaya nitrosamin atau terkontaminasi mikotoksin menyebabkan terjadinya ESCC [3]. Terlepas dari hasil klinis yang dipromosikan serta administrasi, masih ada prognosis yang buruk di antara pasien ESCC, yang menyertai tingkat kelangsungan hidup 5 tahun sebesar 15-25% [4]. Oleh karena itu, sangat penting untuk mengkonfirmasi onkogen atau gen represi tumor yang dapat berfungsi sebagai biomarker dalam pengembangan ESCC untuk menyediakan metode terapi yang lebih efektif bagi pasien ESCC.
MicroRNAs (miRNAs) adalah RNA non-coding kecil yang memainkan peran penting dalam memodulasi ekspresi gen [5] dan diklarifikasi memiliki kapasitas untuk mempengaruhi perkembangan tumor melalui pengaturan stabilitas mRNA dan kemampuan mRNA [6]. Sejumlah miRNA seperti miR-4324 [7], miR-889-3p [8] dan miR-9 [9] telah ditemukan terkait dengan proses ESCC. MiR-301 adalah anggota miRNA yang dibentuk oleh unit transkripsi fam33a yang terletak di 17q22-23 dalam genom manusia. Ekspresi berlebihan miR-301 telah diidentifikasi sebelumnya, yang mencerminkan bahwa hal itu terlibat dalam penyakit manusia [6, 10]. Namun, mekanisme fungsi miR-301 belum ditemukan di ESCC. Selain itu, phosphatase dan tensin homologue (PTEN) telah dipastikan sering terganggu pada tumor dan ditargetkan oleh mutasi germ line pada pasien kanker, yang memainkan peran penghambatan tumor [11]. Telah divalidasi bahwa disregulasi PTEN berkorelasi dengan perkembangan ESCC [12]. Menariknya, penelitian terbaru mengungkapkan bahwa miR-301 menargetkan PTEN pada kanker paru-paru non-sel kecil [13]. Namun, hubungan penargetan antara miR-301 dan PTEN dalam pengembangan ESCC ini masih harus diungkapkan. Penelitian kami berfokus pada efek miR-301 dan PTEN pada perkembangan ESCC, yang sebagian besar masih belum diketahui dan merupakan hal baru. Kami menyimpulkan bahwa miR-301 dapat mempengaruhi angiogenesis dan pertumbuhan sel di ESCC dengan memodulasi ekspresi PTEN.
Bahan dan Metode
Pernyataan Etika
Informed consent tertulis diperoleh dari semua pasien sebelum penelitian. Protokol penelitian ini telah disetujui oleh Komite Etik Rumah Sakit Kedua Universitas Jilin dan berdasarkan prinsip-prinsip etik untuk penelitian medis yang melibatkan subyek manusia dari Deklarasi Helsinki. Eksperimen hewan sangat konsisten dengan Panduan Pengelolaan dan Penggunaan Hewan Laboratorium yang dikeluarkan oleh National Institutes of Health. Protokol percobaan hewan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional dari Rumah Sakit Kedua Universitas Jilin.
Mata Pelajaran
Seratus sepuluh sampel jaringan ESCC dan jaringan normal yang berdekatan (> 5 cm dari tumor) dikumpulkan dari pasien ESCC (78 laki-laki dan 32 perempuan) yang telah menerima esofagektomi di departemen bedah toraks Rumah Sakit Kedua Universitas Jilin dari Januari 2015 hingga Desember 2017. Di antara 110 pasien, ada 84 kasus > 60 tahun, dan 26 kasus ≤ 60 tahun; ukuran tumor:65 kasus ≥ 5 cm dan 45 kasus < 5 cm; 71 kasus tanpa metastasis kelenjar getah bening (LNM) dan 39 kasus dengan LNM; stadium tumor, node, dan metastasis (TNM):60 kasus pada stadium I + II, dan 50 kasus pada stadium III; lokasi tumor:13 kasus adalah ESCC atas, dan 97 kasus adalah ESCC menengah bawah. Semua pasien didiagnosis dengan ESCC dan belum pernah menerima radioterapi atau kemoterapi sebelumnya. Tumor benar-benar dipotong, dan margin bedah negatif telah dikonfirmasi oleh patologi. Menurut kriteria stadium ESCC yang diusulkan oleh Union for International Cancer Control (UICC) pada tahun 2009 [14], stadium patologis pasien pascaoperasi diidentifikasi sebagai stadium pT1-4N1-2(I-IIIb). Tidak ada komplikasi yang signifikan pada pasien setelah operasi, dan kematian perioperatif dikeluarkan.
Total RNA dalam jaringan dan sel diekstraksi menggunakan kit Trizol (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA). Konsentrasi dan kualitas RNA diukur. Primer RNA (Tabel 1) dirancang dan disintesis oleh TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning China). RNA ditranskripsikan secara terbalik menjadi cDNA berdasarkan instruksi Kit reagen Takara PrimeScript™ RT dengan g DNA Eraser (Takara). Kami melakukan qPCR pada Light Cycler 480II (Roche) dengan campuran master PCR hijau (Takara) Power PCR SYBR hijau. U6 digunakan sebagai kontrol pemuatan miR-301, dan -aktin digunakan sebagai referensi internal PTEN. Data dianalisis menggunakan 2
−△△Ct
metode [15].
Analisis Western Blot
Buffer lisis RIPA (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) digunakan untuk mengekstrak protein total dalam sel dan jaringan, dan protein diukur dengan kit BCA Protein Assay (Beyotime). Konsentrasi protein masing-masing sampel diukur, dan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 10% dilakukan. Sampel dipindahkan ke membran nitroselulosa, yang kemudian diblokir dengan susu bubuk skim 5% pada suhu 4 ° C semalaman. Setelah itu, membran dilengkapi dengan antibodi primer PTEN dan -aktin (keduanya 1:500 dan dari Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA) untuk inkubasi semalam, kemudian ditambahkan dengan antibodi sekunder masing-masing dan diinkubasi selama 1 jam. Setelah direndam dalam reagen chemiluminescent yang disempurnakan (Pierce Chemical Inc., Dallas, TX, USA) selama 1 menit, membran diekspos dalam lingkungan gelap dan dikembangkan menggunakan LAS4000 mini chemiluminescence imager. Nilai abu-abu dievaluasi oleh perangkat lunak sistem pencitraan dengan -aktin sebagai kontrol; oleh karena itu, protein relatif akhir yang diekspresikan diperoleh. Pita protein dianalisis dengan perangkat lunak ImageJ2x.
Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda
Urutan 3′-untranslated region (UTR) PTEN diprediksi berinteraksi dengan miR-301, atau urutan bermutasi dalam situs target yang diprediksi disintesis dan dimasukkan ke dalam situs XbaI dan FseI dari vektor reporter luciferase kontrol pGL3 (Promega, WI, AS). Kemudian dihasilkan vektor pGL3-PTEN-wt dan pGL3-PTEN-mut. Plasmid reporter wt dan mut luciferase yang diidentifikasi dengan benar dengan miR-301 mimik dan mimik NC ditransfusikan bersama ke dalam sel KYSE30 dan Eca109 selama 48 jam. Selanjutnya, sel-sel dilisiskan, dan aktivitas luciferase masing-masing ditentukan oleh kit deteksi luciferase (Promega).
Budaya, Pengelompokan, dan Transfeksi Sel
Garis sel ESCC (KYSE-150, KYSE-30, Eca109 dan KYSE-70) diperoleh dari Institut Biokimia dan Biologi Sel Shanghai, Akademi Ilmu Pengetahuan Cina (Shanghai, Cina), dan sel epitel esofagus manusia (HEECs) diperoleh dari Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, Cina). Sel dikultur dalam media RPMI 1640 (Invitrogen) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (FBS, Life Technologies, USA), 100 unit/ml penisilin G natrium (Sigma) dan 100 g/ml streptomisin sulfat (Sigma). Ekspresi MiR-301 dan ekspresi mRNA PTEN di setiap garis sel diukur dengan RT-qPCR, dan garis sel dengan ekspresi relatif tertinggi dan terendah dipilih untuk eksperimen seluler berikutnya.
Sel KYSE-30 dipisahkan menjadi 7 kelompok dan, masing-masing, diobati dengan inhibitor miR-301, inhibitor kontrol negatif (NC), pcDNA-PTEN (bernama overexpressed (oe)-PTEN), pcDNA-NC (bernama oe-NC), miR-301 inhibitor + kecil mengganggu RNA (si)-PTEN atau miR-301 inhibitor + si-NC. Sel-sel Eca109 dipisahkan menjadi 7 kelompok juga dan diperlakukan secara terpisah dengan miR-301, mimik NC, si-PTEN, si-NC, miR-301 mimik + oe-PTEN, miR-301 mimik + oe-NC. inhibitor NC, inhibitor miR-301, miR-301, mimic NC, si-NC dan si-PTEN dibeli dari GenePharma Ltd., Company (Shanghai, China); pcDNA-PTEN NC dan pcDNA-PTEN diperoleh dari (Shanghai Sangon Bio-technology Corporation (Shanghai, China)). Sel-sel ditransfusikan secara sementara ke dalam sel ESCC oleh lipofectamine 2000 (Invitrogen) ketika pertemuan sel mencapai 60%.
Kit Penghitung Sel (CCK-8) Uji
Sel diunggulkan dalam piring 96-sumur (1 × 10
3
sel/sumur) dan diinkubasi untuk periode waktu yang berbeda. Setelah diinkubasi selama 24 jam, 48 jam, 72 jam, dan 96 jam, masing-masing sumuran diberi 10 L larutan CCK-8 (5 mg/mL), kemudian sel-sel masing-masing kelompok diinkubasi pada suhu 37 °C tanpa cahaya. paparan selama 2 jam. Nilai densitas optik (OD) pada 450 nm dianalisis dengan pembaca lempeng mikro (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
Pengujian Pembentukan Koloni
Sel diunggulkan pada 500 sel / sumur di piring 6-sumur setelah transfeksi dan dikultur selama 14 hari. Koloni difiksasi dengan metanol, diwarnai menggunakan kristal violet 0,5% dan dihitung di bawah mikroskop terbalik.
Pengujian Transwell
Sel (5 × 10
3
) yang diinkubasi dalam media RPMI 1640 diunggulkan ke dalam ruang apikal perangkat Transwell dengan membran non-coated atau matrigel-coated (Corning, NY, USA). Setelah 24 jam, sel-sel pada ruang apikal dihilangkan, sementara sel-sel yang tersisa di bagian bawah difiksasi dan kemudian diwarnai menggunakan kristal violet 0,1%. Mikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang) digunakan untuk menghitung 3 bidang acak untuk menghitung jumlah sel.
Flow Cytometry
Siklus sel dan apoptosis dievaluasi dengan flow cytometry. Annexin V-fluorescein isothiocyanate (10 L) dan propidium iodide (PI; 5 L, Sigma) diinkubasi dengan sel (5 × 10
5
sel/sumur) dalam gelap pada suhu 4 °C selama 30 menit. Persentase sel apoptosis dihitung menggunakan flow cytometer (BD Biosciences, CA, USA) dengan perangkat lunak FlowJo versi 10 (FlowJo LLC, OR, USA).
Untuk menilai siklus sel, sel (5 × 10
5
sel / sumur) difiksasi dengan etanol 75% semalaman pada suhu 4 ° C dan diwarnai dengan 5 l PI / ribonuclease A (Sigma) pada suhu 4 ° C selama 30 menit dalam gelap. Data dianalisis dengan flow cytometer (BD Biosciences). Sinyal fluoresensi (14.000) dari setiap sampel dikumpulkan dan dihitung menggunakan perangkat lunak ModFit LT versi 3.2 (Verity Software House, Inc., ME, USA).
Tumorigenesis Subkutan pada Tikus Telanjang
Empat puluh dua tikus telanjang BALB/c-nu betina (penuaan 4 w, berat 16-24 g) diperoleh dari Pusat Hewan Eksperimental Universitas Jilin (Changchun, Cina). Tikus telanjang dipisahkan menjadi 14 kelompok (n = 3). Tikus telanjang dari tujuh kelompok, masing-masing, disuntik dengan sel KYSE-30 sesuai dengan pengelompokan sel, dan tikus telanjang di tujuh kelompok lainnya disuntik secara terpisah dengan sel Eca109 berdasarkan pengelompokan. Konsentrasi sel KYSE-30 dan Eca109 yang ditransfusikan disesuaikan menjadi 5 × 10
6
sel/100 L. Tikus telanjang difiksasi dan disuntikkan secara subkutan dengan sel ESCC yang sesuai dalam kondisi steril. Panjang terbesar (L) dan lebar (W) tumor diukur setiap minggu dan volume tumor (V ) = 1/2 × L × A
2
. Tikus telanjang di-eutanasia dalam 5
th
minggu injeksi dengan tumor direseksi, dan tumor ditimbang dan difoto. Tingkat pembentukan tumor dihitung sebagai jumlah tikus dengan tumor subkutan / jumlah total tikus telanjang yang disuntikkan dalam kelompok × 100%. Waktu injeksi diambil sebagai absis, dan ukuran tumor diambil sebagai ordinat; dengan demikian, kurva pertumbuhan tumor digambarkan.
Pewarnaan imunohistokimia
Jaringan tumor tikus telanjang difiksasi dengan formaldehida 10%, disematkan oleh parafin dan dipotong menjadi 4 m. Selanjutnya, potongan dikeringkan pada suhu 60 °C selama 2 jam, dikeringkan dengan xilena, didehidrasi dengan etanol gradien dan diinkubasi dengan 50 L 3% H2 O2 selama 10 menit. Selanjutnya bagian direndam dalam larutan buffer asam sitrat 0,01 M, direbus pada suhu 95 °C selama 20 menit, diblokir dengan larutan kerja serum kambing normal pada suhu 37 °C selama 10 menit dan ditambahkan CD34 (1:100, Santa Cruz) pada suhu 4 °C semalaman. Setelah itu, bagian-bagian tersebut dilengkapi dengan polimer IgG kambing anti-kelinci/tikus berlabel HRP (ZSGB-Bio, Beijing, China), diwarnai dengan hematoxylin, didehidrasi dan ditembus dan kemudian disegel dengan balsam netral. PBS digunakan untuk menggantikan antibodi primer sebagai NC. Pengukuran microvessel density (MVD):bagian diamati di bawah mikroskop perbesaran rendah. Sel endotel atau kelompok sel endotel diwarnai menjadi kuning kecoklatan dan dibedakan secara signifikan dengan sel tumor di sekitarnya, dan jaringan ikat diambil sebagai pembuluh mikro. Struktur cabang juga dianggap sebagai pembuluh jika terputus, sedangkan pembuluh dengan ukuran lumen> 8 eritrosit, lapisan otot atau lumen yang lebih tebal dikeluarkan. Jumlah pembuluh darah mikro dari 3 lapang pandang tinggi dicatat, dan jumlah rata-rata adalah MVD untuk setiap kasus.
Analisis Statistik
Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS versi SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) dan disajikan dengan Perangkat Lunak Graphpad Prism 6.0. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Perbedaan antara dua kelompok independen diuji dengan uji t Student. ANOVA satu arah dilakukan untuk membandingkan tiga atau lebih kelompok. P nilai < 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik.
Hasil
MiR-301 Sangat Diekspresikan, Sementara PTEN Diekspresikan dengan Buruk di Jaringan dan Sel ESCC
Ekspresi MiR-301 dan PTEN dalam jaringan ESCC dan jaringan normal yang berdekatan dinilai menggunakan RT-qPCR dan analisis Western blot untuk mengungkapkan peran mereka dalam ESCC, dan ditemukan bahwa (Gbr. 1a-c) miR-301 diregulasi, sementara PTEN diregulasi dalam jaringan ESCC. Pasien dibagi menjadi kelompok ekspresi rendah dan tinggi menurut nilai median ekspresi miR-301 atau PTEN untuk menganalisis korelasi antara ekspresi miR-301 atau PTEN dan karakteristik klinikopatologis pasien ESCC. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi miR-301/PTEN tidak berhubungan dengan usia, jenis kelamin, ukuran tumor, lokasi dan diferensiasi, sedangkan berkorelasi dengan stadium TNM dan LNM pasien ESCC (Tabel 2).
MiR-301 sangat diekspresikan, sementara PTEN diekspresikan dengan buruk dalam jaringan dan sel ESCC. a Ekspresi miR-301 dan ekspresi mRNA PTEN dalam jaringan ESCC dideteksi menggunakan RT-qPCR; b ekspresi protein PTEN dalam jaringan ESCC yang dideteksi menggunakan analisis Western blot; c pita protein PTEN dalam jaringan ESCC dalam analisis Western blot; d ekspresi miR-301 dan ekspresi mRNA PTEN dalam garis sel ESCC yang dideteksi menggunakan RT-qPCR; e ekspresi protein PTEN dalam garis sel ESCC terdeteksi menggunakan analisis Western blot; f pita protein PTEN dalam analisis Western blot. *P < 0,05 versus HEEC. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi, dan uji t dilakukan untuk perbandingan antara dua kelompok
Kemudian, ekspresi miR-301 dan PTEN dalam 4 garis sel ESCC dan HEEC ditentukan menggunakan RT-qPCR dan analisis Western blot. Kami menemukan bahwa (Gbr. 1d-f) miR-301 diregulasi dan PTEN diturunkan regulasi di garis sel ESCC, di antaranya KYSE-30 memiliki ekspresi miR-301 tertinggi dan ekspresi PTEN terendah, sementara Eca109 memiliki kecenderungan sebaliknya. Dengan demikian, garis sel KYSE-30 diperlakukan dengan downregulated miR-301/overexpressed PTEN dan Eca109 cell line diperlakukan dengan overexpressed miR-301/silenced PTEN dalam eksperimen seluler.
PTEN Ditargetkan oleh miR-301
Perangkat lunak bioinformatika (http://www.microrna.org/) memperkirakan bahwa PTEN adalah gen target miR-301 (Gbr. 2a). Lebih lanjut dikonfirmasi oleh uji gen reporter luciferase ganda bahwa aktivitas luciferase menurun secara signifikan dalam sel ESCC yang ditransfeksi bersama dengan vektor PTEN-wt dan miR-301 mimik dibandingkan dengan yang ditransfeksi bersama dengan vektor PTEN-mut dan miR-301 mimik, menyiratkan bahwa miR-301 secara khusus dapat mengikat PTEN (Gbr. 2b, c).
PTEN adalah gen target miR-301. a Situs pengikatan miR-301 dan PTEN diprediksi oleh perangkat lunak prediksi online; b hubungan target antara miR-301 dan PTEN dalam sel KYSE-30 dinilai dengan uji gen reporter luciferase ganda; c hubungan target antara miR-301 dan PTEN dalam sel Eca109 dinilai dengan uji gen reporter luciferase ganda; d ekspresi miR-301 dan ekspresi mRNA PTEN dalam sel KYSE-30 yang dideteksi menggunakan RT-qPCR setelah downregulasi miR-310 atau upregulasi PTEN; e ekspresi protein PTEN dalam sel KYSE-30 yang terdeteksi menggunakan analisis Western blot setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; f pita protein PTEN dalam sel KYSE-30 dalam analisis Western blot setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; g ekspresi miR-301 dan ekspresi mRNA PTEN dalam sel Eca109 terdeteksi menggunakan RT-qPCR setelah upregulasi miR-310 atau downregulasi PTEN; h ekspresi protein PTEN dalam sel Eca109 terdeteksi menggunakan analisis Western blot setelah peningkatan regulasi miR-310 atau penurunan regulasi PTEN; saya pita protein PTEN dalam sel Eca109 dalam analisis Western blot setelah peningkatan regulasi miR-310 atau penurunan regulasi PTEN. *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC, &P < 0.05 versus kelompok oe-NC,
#P < 0,05 versus kelompok penghambat miR-301 + si-NC, a P < 0,05 versus grup NC peniru, b P < 0,05 versus kelompok si-NC, c P < 0,05 versus kelompok miR-301 mimik + oe-NC; T = 3 Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi, dan uji t dilakukan untuk perbandingan antara dua kelompok. ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa grup
Analisis RT-qPCR dan Western blot digunakan untuk menilai ekspresi miR-301 dan PTEN dalam sel yang ditransfeksi, dan ditemukan bahwa dalam sel KYSE-30 (Gbr. 2d-f), sel yang diobati dengan inhibitor miR-301 menurunkan regulasi miR-301 , sementara PTEN diregulasi; sel yang diobati dengan pcDNA-PTEN (oe-PTEN) meningkatkan ekspresi PTEN, dan si-PTEN membalikkan efek inhibitor miR-301 pada ekspresi PTEN. Dalam sel Eca109 (Gbr. 2g-i), sel yang diobati dengan miR-301 meniru miR-301 yang diregulasi ke atas, sedangkan PTEN yang diregulasi ke bawah; sel yang diobati dengan si-PTEN menurunkan ekspresi PTEN, dan pcDNA-PTEN (oe-PTEN) membalikkan peran penghambat miR-301 dalam ekspresi PTEN. Data ini menunjukkan bahwa miR-301 menargetkan PTEN.
MiR-301 yang Dihambat atau PTEN yang Diekspresikan Secara Berlebihan Membatasi Viabilitas Sel ESCC; Peningkatan miR-301 atau Penurunan PTEN Meningkatkan Viabilitas Sel ESCC
Viabilitas sel sel ESCC dinilai menggunakan pembentukan koloni dan uji CCK-8. Hasilnya mengungkapkan bahwa pada garis sel KYSE-30 (Gbr. 3a-c), transfeksi inhibitor miR-301 atau oe-PTEN menekan kemampuan pembentukan koloni dan viabilitas sel; transfeksi PTEN yang dibungkam menghilangkan dampak penghambat miR-301 pada viabilitas sel ESCC; dalam garis sel Eca109 (Gbr. 3d-f), transfeksi miR-301 mimik atau si-PTEN meningkatkan kemampuan pembentukan koloni dan viabilitas sel; Ekspresi berlebih PTEN membalikkan peran promotif peningkatan miR-301 dalam kemampuan pembentukan koloni dan kelangsungan hidup sel Eca109. Hasil ini menunjukkan bahwa knockdown miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menekan kelangsungan hidup sel ESCC, yang dipromosikan oleh peningkatan miR-301 atau penghambatan PTEN.
MiR-301 yang dihambat atau PTEN yang diekspresikan secara berlebihan membatasi kelangsungan hidup sel ESCC; peningkatan miR-301 atau penurunan PTEN meningkatkan viabilitas sel ESCC. a Jumlah koloni dalam sel KYSE-30 setelah transfeksi terdeteksi menggunakan uji pembentukan koloni setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; b kemampuan pembentukan koloni sel KYSE-30 setelah transfeksi terdeteksi menggunakan uji pembentukan koloni setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; c viabilitas sel KYSE-30 setelah transfeksi terdeteksi menggunakan uji CCK-8 setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; d jumlah koloni dalam sel Eca109 setelah transfeksi terdeteksi menggunakan uji pembentukan koloni setelah peningkatan regulasi miR-310 atau penurunan regulasi PTEN; e kemampuan pembentukan koloni sel Eca109 setelah transfeksi terdeteksi menggunakan uji pembentukan koloni setelah peningkatan regulasi miR-310 atau penurunan regulasi PTEN; f viabilitas sel Eca109 setelah transfeksi terdeteksi menggunakan uji CCK-8 setelah peningkatan regulasi miR-310 atau penurunan regulasi PTEN; *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC; &P < 0,05 versus kelompok oe-NC;
#P < 0,05 versus kelompok miR-301 inhibitor + si-NC; sebuah P < 0,05 versus kelompok mimik-NC; b P < 0,05 versus kelompok si-NC; c P < 0.05 versus miR-301 miR-301 grup + oe-NC, N = 3. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi, dan ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa kelompok
MiR-301 yang Dihambat atau PTEN yang Diekspresikan Secara Berlebihan Menekan Migrasi dan Invasi Sel ESCC; Peningkatan miR-301 atau Pengurangan PTEN Menginduksi Migrasi dan Invasi Sel ESCC
Kemampuan migrasi dan invasi sel ESCC dinilai menggunakan uji Transwell. Hasilnya menunjukkan bahwa dalam garis sel KYSE-30 (Gbr. 4a, b), migrasi sel dan kemampuan invasi dibatasi oleh penghambatan miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN; peran penekan inhibitor miR-301 dalam migrasi sel dan kemampuan invasi dibalikkan oleh si-PTEN. Dalam garis sel Eca109 (Gbr. 4c, d), migrasi sel dan kemampuan invasi dipromosikan setelah transfeksi miR-301 mimik atau si-PTEN; PTEN yang diekspresikan secara berlebihan membalikkan dampak miR-301 mimik pada migrasi sel dan kemampuan invasi. Temuan di atas menyiratkan bahwa migrasi dan invasi sel ESCC dihambat oleh represi miR-301 atau elevasi PTEN, sedangkan difasilitasi oleh upregulasi miR-301 atau downregulasi PTEN.
MiR-301 yang dihambat atau PTEN yang diekspresikan secara berlebihan menekan migrasi dan invasi sel ESCC; peningkatan miR-301 atau penurunan PTEN mendorong migrasi dan invasi sel ESCC. a Kemampuan migrasi dan invasi sel KYSE-30 yang ditransfeksi dinilai menggunakan uji Transwell setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; b hasil statistik migrasi dan invasif dalam sel KYSE-30 melalui uji Transwell setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; c kemampuan migrasi dan invasi sel Eca109 di antara kelompok yang dinilai menggunakan uji Transwell setelah peningkatan regulasi miR-310 atau penurunan regulasi PTEN; d hasil statistik dari migrasi dan invasif dalam sel Eca109 melalui uji transwell miR-310 upregulation atau downregulation PTEN. *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC; &P < 0,05 versus kelompok oe-NC;
#P < 0,05 versus kelompok miR-301 inhibitor + si-NC; sebuah P < 0,05 versus kelompok mimik-NC; b P < 0,05 versus kelompok si-NC; c P < 0.05 versus miR-301 miR-301 grup + oe-NC, N = 3. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi, dan ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa kelompok
MiR-301 yang Dihambat atau PTEN yang Diekspresikan Berlebihan Menginduksi Penangkapan Siklus Sel dan Apoptosis Sel ESCC; Peningkatan miR-301 atau Pengurangan PTEN Menekan Penangkapan Siklus Sel dan Apoptosis Sel ESCC
Flow cytometry digunakan untuk mendeteksi transisi siklus sel dan apoptosis sel setelah transfeksi, dan hasilnya menunjukkan bahwa pada garis sel KYSE-30 (Gbr. 5a–d), transfeksi inhibitor miR-301 atau oe-PTEN mendorong laju apoptosis dan peningkatan sel pada fase G0/G1, sementara penurunan pada fase S dan G2/M; perubahan apoptosis dan penghentian siklus sel yang diinduksi oleh inhibitor miR-301 dapat dibalikkan oleh si-PTEN.
MiR-301 yang dihambat atau PTEN yang diekspresikan secara berlebihan menginduksi penghentian siklus sel dan apoptosis sel ESCC; peningkatan miR-301 atau penurunan PTEN menekan penghentian siklus sel dan apoptosis sel ESCC. a Distribusi siklus sel sel KYSE-30 di setiap kelompok dideteksi dengan flow cytometry setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; b hasil statistik persentase fase G0/G1, S dan G2/GM sel KYSE-30 dalam flow cytometry setelah downregulasi miR-310 atau upregulasi PTEN; c apoptosis sel KYSE-30 terdeteksi oleh flow cytometry setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; d tingkat apoptosis sel KYSE-30 yang ditransfusikan terdeteksi menggunakan flow cytometry setelah penurunan regulasi miR-310 atau peningkatan regulasi PTEN; e distribusi siklus sel sel Eca109 di setiap kelompok dideteksi dengan upregulasi flow cytometry miR-310 atau downregulasi PTEN; f hasil statistik persentase fase G0/G1, S dan G2/GM sel Eca109 dalam flow cytometry setelah upregulasi miR-310 atau downregulasi PTEN; g apoptosis sel Eca109 dideteksi oleh flow cytometry setelah peningkatan regulasi miR-310 atau penurunan regulasi PTEN; h tingkat apoptosis sel Eca109 yang ditransfusikan terdeteksi menggunakan flow cytometry setelah peningkatan regulasi miR-310 atau penurunan regulasi PTEN. *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC; &P < 0,05 versus kelompok oe-NC;
#P < 0,05 versus kelompok miR-301 inhibitor + si-NC; sebuah P < 0,05 versus kelompok mimik-NC; b P < 0,05 versus kelompok si-NC; c P < 0.05 versus miR-301 miR-301 grup + oe-NC, N = 3. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi, dan ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa kelompok
Menurut hasil flow cytometry, kami telah menemukan bahwa pada garis sel Eca109 (Gbr. 5e–h), transfeksi miR-301 mimik atau si-PTEN menghambat laju apoptosis, penurunan sel dalam fase G0/G1 dan peningkatan fase fase S dan fase G2/M; Ekspresi berlebih PTEN membalikkan efek miR-301 meniru pada tingkat apoptosis dan penangkapan siklus sel sel Eca109. Kami menyimpulkan dari hasil ini bahwa miR-301 yang diregulasi atau PTEN yang diregulasi mendorong transisi siklus sel dan apoptosis dalam sel ESCC, sementara miR-301 yang dihambat atau PTEN yang dibungkam memberikan efek yang berlawanan.
MiR-301 yang Dihambat atau PTEN yang Diekspresikan Berlebihan Menahan Pertumbuhan Tumor dan Angiogenesis In Vivo di ESCC; Peningkatan miR-301 atau Penurunan PTEN Meningkatkan Pertumbuhan Tumor dan Angiogenesis Di Vivo di ESCC
Pertumbuhan dan perubahan tumor ESCC pada tikus telanjang diamati pada setiap kelompok. Pertumbuhan tumor dinilai, dan hasilnya menyiratkan bahwa pada garis sel KYSE-30 (Gbr. 6a-e), tikus telanjang yang disuntik dengan miR-301 inhibitor atau oe-PTEN mengurangi volume dan berat tumor; peran represif inhibitor miR-301 dalam pertumbuhan tumor dihapuskan oleh si-PTEN. Dalam garis sel Eca109 (Gbr. 6f-j), volume tumor dan berat tumor dimajukan pada tikus telanjang yang disuntik dengan miR-301 mimik atau si-PTEN; ekspresi berlebih PTEN membalikkan efek miR-301 meniru pada pertumbuhan tumor. Sementara itu, ekspresi CD34 dalam xenografts dari tikus telanjang dinilai menggunakan pewarnaan imunohistokimia dan temuan menunjukkan bahwa (Gbr. 7a-d) dalam xenografts KYSE-30, MVD tertahan setelah downregulasi miR-301 atau upregulasi PTEN; membungkam PTEN membalikkan dampak penghambatan miR-301 pada MVD. Dalam xenografts Eca109, MVD meningkat setelah peningkatan regulasi miR-301 atau penurunan regulasi PTEN; peningkatan MVD yang diinduksi oleh miR-301 yang diregulasi dapat dihapuskan oleh PTEN yang diekspresikan secara berlebihan. Data ini menunjukkan bahwa penghambatan miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menekan pertumbuhan tumor dan angiogenesis di ESCC, sedangkan peningkatan miR-301 atau pembungkaman PTEN memiliki efek sebaliknya.
Inhibited miR-301 or overexpressed PTEN restrains tumor growth in ESCC; elevated miR-301 or reduced PTEN increases tumor growth in ESCC. a Representative figures for the tumor growth observed by subcutaneous tumorigenesis in nude mice after KYSE-30 cells were transfected; b–d changes of tumor volume of each group after KYSE-30 cells were transfected; e changes of tumor weight of each group after KYSE-30 cells were transfected; f representative figures for the tumor growth observed by subcutaneous tumorigenesis in nude mice after Eca109 cells were transfected; g–i changes of tumor volume of each group after Eca109 cells were transfected; j changes of tumor weight of each group after Eca109 cells were transfected. *P < 0.05 versus the inhibitor-NC group; &P < 0.05 versus the oe-NC group;
#P < 0.05 versus the miR-301 inhibitors + si-NC group; sebuah P < 0.05 versus the mimic-NC group; b P < 0.05 versus the si-NC group; c P < 0.05 versus the miR-301 mimic + oe-NC group, n = 3 mice. Data were expressed as mean ± standard deviation, and ANOVA was used for comparisons among multiple groups
Inhibited miR-301 or overexpressed PTEN restrains angiogenesis in ESCC; elevated miR-301 or reduced PTEN increases angiogenesis in ESCC. a Representative images of tumor tissues observed by immunohistochemical staining in nude mice after KYSE-30 cells were transfected; b comparisons of MVD of KYSE-30 in tumor tissues among the groups; c representative images of tumor tissues observed by immunohistochemical staining in nude mice after Eca109 cells were transfected; d comparisons of MVD of Eca109 in tumor tissues among the groups *P < 0.05 versus the inhibitor-NC group; &P < 0.05 versus the oe-NC group;
#P < 0.05 versus the miR-301 inhibitors + si-NC group; sebuah P < 0.05 versus the mimic-NC group; b P < 0.05 versus the si-NC group; c P < 0.05 versus the miR-301 mimic + oe-NC group, n = 3 mice. Data were expressed as mean ± standard deviation, and ANOVA was used for comparisons among multiple groups
Diskusi
EC is a kind of invasive malignancy in the gastrointestinal tract [16]. As the major type of EC, ESCC is a malignant tumor occurring in esophageal epithelial cells [17]. The miRNAs, known as small non-coding RNAs, have been demonstrated to function as a significant roles in leading molecules in the silencing of RNA [18]. Our research was designed to explore the effects of miR-301 and its target gene PTEN on ESCC progression, and we have found that the inhibited miR-301 could suppress angiogenesis and cell growth in ESCC by elevating PTEN.
MiR-301 expression was assessed, and we found that miR-301 was highly expressed in ESCC cells in comparison with HEEC, and the higher expression of miR-301 has also been found in ESCC tissues in contrast to the adjacent normal tissues. Similar to this result, Li et al. have identified that miR-301 presented high expression in myocardial infarction tissues [19]. In addition, we have elucidated that PTEN was targeted by miR-301, and the target relation has been pointed out by an extant literature [20]. We have also discovered that PTEN, which has been affirmed to be targeted by miR-301, was downregulated in both ESCC tissues and cells. Similarly, a previous research has unearthed that PTEN was poorly expressed in ESCC compared with non-tumor esophageal epithelial tissue [21]. Furthermore, Ma et al. have illuminated that PTEN expression was degraded in Eca109 cell line [22], which has also been selected for a series of experiments in this research. These studies provide evidence for the high expression of miR-301 and low expression of PTEN in ESCC.
Another important outcome in this research indicated that the inhibited miR-301 could repress the colony formation ability as well as the cell proliferation of ESCC cells via enhancing the PTEN expression, and elevated miR-301 or reduced PTEN had contrary effects. Similarly, Han et al. have elucidated that the downregulation of miR-301 mediated by luteolin has the ability to restrain the cell proliferation in prostate cancer [6]. A recent literature has revealed that the overexpression of PTEN suppresses the proliferation of pancreatic cancer cells [23], and a same result has been summarized in a study focusing on prostate cancer [24]. Besides, we have also unearthed that the downregulation of miR-301 or the elevation of PTEN could inhibit migration and invasion of ESCC cells, and elevated miR-301 or reduced PTEN exhibited the opposite trends. In accordance with this outcome, Shi et al. have supported that inhibited miR-301 attenuated migration and invasion of breast cancer cells [10], and it has been reported that the migration and invasion of ESCC cells could be repressed by the inhibition of miR-130b and the elevation of PTEN [25]. These publications helped verifying the oncogenic role of miR-301 and tumor-repressive effect of PTEN in diverse human cancers. Another result in our research was that inhibited miR-301 overexpressed PTEN to promote cell apoptosis and induce cell cycle arrest at the G0/G1 phase in ESCC cells, and elevated miR-301 or reduced PTEN had the inverse results. Similarly, it has been uncovered by a recent literature that activated PTEN induces cell cycle arrest and apoptosis in ESCC [26]. Consistently, Tian et al. have found in their study that the elevation of PTEN inhibited the angiogenesis by reducing the expression of vascular endothelial growth factor in hepatocellular carcinoma [27]. Based on the above data, the roles of miR-301 and PTEN in cell apoptosis and angiogenesis in diverse diseases were further confirmed. Consequently, we concluded that the downregulation of miR-301 could restrain the tumor growth in ESCC through the high expression of PTEN, and the similar conclusion has also been unveiled in breast cancer [10] and prostate cancer [28]. On the contrary, miR-301 elevation or PTEN reduction induced the tumor growth in ESCC. It could be concluded that miR-301 and PTEN participated in the in vivo cancer cell growth.
Conclusion
In this study, we have shown that the repression of miR-301 prohibits angiogenesis, cell proliferation, migration and invasion but promotes apoptosis in ESCC cells by upregulating PTEN. This research may further the understanding on potential molecular mechanisms of ESCC and provide novel targets for ESCC treatment.
