Penargetan miR-301 Menghambat Angiogenesis dan Pertumbuhan Tumor Karsinoma Sel Seksium Eofagus melalui Aktivasi PTEN
Abstrak
Tujuan
Karsinoma sel seksium eofagus (ESCC) ditandai dengan metastase dini dan diagnosis terlambat. MikroRNA-301 (miR-301) diketahui berpartisipasi dalam berbagai kanker. Namun, efek miR-301 pada ESCC belum dieksplorasi. Oleh karena itu, kami bertujuan untuk mengeksplorasi peran miR-301 dalam progresi ESCC.
Metode
Ekspresi miR-301 dan fosfatase dan homolog tensin (PTEN) dalam jaringan dan baris sel ESCC dievaluasi. Selanjutnya, sel yang telah di screening diobati dengan oligonukleotida miR-301 atau PTEN yang diubah dan plasmida, dan kemudian kemampuan pembentukan kolon, kelayakan sel, migrasi, invasi, distribusi siklus sel, dan apoptosis sel ESCC dievaluasi. Selain itu, pertumbuhan tumor dan densitas mikrovessel (MVD) juga dievaluasi, dan hubungan target antara miR-301 dan PTEN dikonfirmasi.
Hasil
miR-301 meningkat, dan PTEN menurun dalam jaringan dan sel ESCC. Sel KYSE30 dan Eca109 dipilih untuk uji fungsional. Dalam sel KYSE30, inhibisi miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menekan perilaku malignant sel, dan penekanan PTEN menghilangkan dampak inhibisi miR-301 pada progresi ESCC. Dalam sel Eca109, ekspresi berlebih miR-301 atau inhibisi PTEN mempromosikan perilaku malignant sel, dan ekspresi berlebih PTEN membalikkan efek kenaikan miR-301 pada progresi ESCC. Uji in vivo menunjukkan bahwa inhibisi miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menekan pertumbuhan tumor ESCC dan MVD, dan kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN memiliki efek yang berlawanan. Selain itu, PTEN ditargetkan oleh miR-301.
Kesimpulan
Bersamaan, hasil studi kami mengungkapkan bahwa miR-301 mempengaruhi pertumbuhan sel, metastase, dan angiogenesis melalui regulasi ekspresi PTEN dalam ESCC.
Pendahuluan
Kanker eofagus (EC), kanker ke-8 paling umum di seluruh dunia, adalah malignitas kritis dengan mortalitas tinggi dan prognose buruk [1]. Mengakibatkan sekitar 90% dari total kasus EC, karsinoma sel seksium eofagus (ESCC) adalah bentuk utama EC di Tiongkok [2]. Beberapa penyebab termasuk status sosial ekonomi rendah, merokok, konsumsi alkohol, asupan nutrisi yang buruk, makanan kaya nitrosamin atau terkontaminasi mikotoxin menyebabkan terjadinya ESCC [3]. Meski ada peningkatan hasil klinis dan administrasi, masih ada prognose buruk pada pasien ESCC, disertai tingkat kelangsungan hidup 5 tahun 15–25% [4]. Oleh karena itu, sangat penting untuk mengonfirmasi onkogen atau gen penekan tumor yang dapat berfungsi sebagai biomarker dalam perkembangan ESCC untuk memberikan metode terapeutik yang lebih efektif bagi pasien ESCC.
MikroRNA (miRNA) adalah RNA non-koding kecil yang memainkan peran penting dalam modulasi ekspresi gen [5] dan telah diuraikan memiliki kapasitas untuk mempengaruhi progresi tumor melalui regulasi stabilitas mRNA dan kemampuan mRNA [6]. Sejumlah miRNA seperti miR-4324 [7], miR-889-3p [8] dan miR-9 [9] telah ditemukan terkait dengan proses ESCC. miR-301 adalah anggota dari miRNA yang dibentuk oleh unit transkripsi fam33a yang terletak pada 17q22-23 dalam genom manusia. Ekspresi berlebih miR-301 telah sebelumnya diidentifikasi, yang mencerminkan bahwa ia terlibat dalam penyakit manusia [6, 10]. Namun, mekanisme fungsi miR-301 belum diungkapkan dalam ESCC. Selain itu, fosfatase dan homolog tensin (PTEN) telah dikonfirmasi sering terganggu dalam tumor dan ditargetkan oleh mutasi garis kelahiran pada pasien kanker, yang memainkan peran penekan tumor [11]. Terdivalidasi bahwa disregulasi PTEN berkaitan dengan perkembangan ESCC [12]. Menariknya, penelitian terbaru telah mengungkapkan bahwa miR-301 menargetkan PTEN dalam kanker paru non-sel kecil [13]. Namun, hubungan target antara miR-301 dan PTEN dalam perkembangan ESCC masih perlu diungkapkan. Penelitian kami berfokus pada efek miR-301 dan PTEN pada progresi ESCC, yang sebagian besar belum diketahui dan bersifat baru. Kami mengasumsikan bahwa miR-301 mungkin mempengaruhi angiogenesis dan pertumbuhan sel dalam ESCC dengan memodulasi ekspresi PTEN.
Bahan dan Metode
Pernyataan Etika
Surat keterangan informasi tertulis diperoleh dari semua pasien sebelum studi. Protokol studi ini disetujui oleh Komite Etika Rumah Sakit Kedua Universitas Jilin dan berdasarkan prinsip etika untuk penelitian medis yang melibatkan subjek manusia Deklarasi Helsinki. Eksperimen hewan secara ketat sesuai dengan Panduan Pengelolaan dan Penggunaan Hewan Laboratorium yang dikeluarkan oleh National Institutes of Health. Protokol eksperimen hewan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Rumah Sakit Kedua Universitas Jilin.
Subjek Studi
Seratus sepuluh sampel jaringan ESCC dan jaringan normal berdekatan (> 5 cm dari tumor) dikumpulkan dari pasien ESCC (78 pria dan 32 wanita) yang telah menjalani esofagektomi di departemen bedah thoraks Rumah Sakit Kedua Universitas Jilin dari Januari 2015 hingga Desember 2017. Dari 110 pasien, ada 84 kasus > 60 tahun, dan 26 kasus ≤ 60 tahun; ukuran tumor: 65 kasus ≥ 5 cm dan 45 kasus < 5 cm; 71 kasus tanpa metastase nodul limfatik (LNM) dan 39 kasus dengan LNM; tahap tumor, nodul dan metastase (TNM): 60 kasus berada pada tahap I + II, dan 50 kasus berada pada tahap III; lokasi tumor: 13 kasus adalah ESCC atas, dan 97 kasus adalah ESCC tengah-bawah. Semua pasien didiagnosis dengan ESCC dan belum pernah menerima radioterapi atau kemoterapi sebelumnya. Tumor sepenuhnya diangkat, dan margin bedah negatif telah dikonfirmasi oleh patologi. Menurut kriteria tahapan ESCC yang diusulkan oleh Union for International Cancer Control (UICC) pada 2009 [14], tahapan patologi pascaoperasi pasien diidentifikasi sebagai tahap pT1-4N1-2(I-IIIb). Tidak ada komplikasi signifikan pada pasien setelah operasi, dan kematian perioperative dikecualikan.
Total RNA dalam jaringan dan sel diekstraksi menggunakan kit Trizol (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, AS). Konsentrasi dan kualitas RNA diukur. Primer RNA (Tabel 1) dirancang dan disintesis oleh TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning Tiongkok). RNA ditranskripsikan terbalik menjadi cDNA berdasarkan petunjuk kit Takara PrimeScript™ RT reagent Kit with g DNA Eraser (Takara). Kami melakukan qPCR pada Light Cycler 480II (Roche) dengan Power PCR SYBR green PCR master mix (Takara). U6 digunakan sebagai kontrol beban miR-301, dan β-actin digunakan sebagai referensi internal PTEN. Data dianalisis dengan metode 2−△△Ct [15].
Analisis Western Blot
RIPA lysis buffer (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Tiongkok) digunakan untuk mengekstrak total protein dalam sel dan jaringan, dan protein diukur dengan kit BCA Protein Assay (Beyotime). Konsentrasi protein setiap sampel diukur, dan elektroforesis gel poliakrilamida natrium dodecilsulfat 10% dilakukan. Sampel ditransfer ke membran nitroselulosa, yang kemudian diblokir dengan 5% serbuk susu skim pada 4 °C selama semalaman. Kemudian, membran ditambahi dengan antibodi primer PTEN dan β-actin (kedua 1: 500 dan dari Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, AS) untuk inkubasi selama semalaman, kemudian ditambahi dengan antibodi sekunder yang sesuai dan diinkubasi selama 1 jam. Setelah direndam dalam reagen kemiluminesensia ditingkatkan (Pierce Chemical Inc., Dallas, TX, AS) selama 1 menit, membran diekspos dalam lingkungan gelap dan dikembangkan menggunakan imager kemiluminesensia mini LAS4000. Nilai abu-abu dievaluasi oleh perangkat lunak sistem citra dengan β-actin sebagai kontrol; dengan demikian, nilai protein relatif akhir diperoleh. Pita protein dianalisis oleh perangkat lunak ImageJ2x.
Uji Gen Laporan Dual Luciferase
Urutan wilayah 3′-nonterjemahan (UTR) PTEN diprediksi berinteraksi dengan miR-301, atau urutan mutasi dalam situs target yang diprediksi disintesis dan dimasukkan ke dalam situs XbaI dan FseI vektor pGL3 control luciferase reporter (Promega, WI, AS). Kemudian, vektor pGL3-PTEN-wt dan pGL3-PTEN-mut dihasilkan. Plasmida pelapor luciferase wt dan mut yang diidentifikasi dengan benar dengan miR-301 mimic dan mimic NC ditransfeksikan bersama ke dalam sel KYSE30 dan Eca109 selama 48 jam. Selanjutnya, sel dilisis, dan aktivitas luciferase, masing-masing, ditentukan oleh kit deteksi luciferase (Promega).
Kultur Sel, Pengelompokan, dan Transfeksi
Baris sel ESCC (KYSE-150, KYSE-30, Eca109 dan KYSE-70) diperoleh dari Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok (Shanghai, Tiongkok), dan sel epitel eofagus manusia (HEECs) diperoleh dari Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, Tiongkok). Sel dikultur dalam media RPMI 1640 (Invitrogen) yang dilengkapi dengan 10% serum sapi janin (FBS, Life Technologies, AS), 100 units/ml penicilin G natrium (Sigma) dan 100 μg/ml sulfat streptomisin (Sigma). Ekspresi miR-301 dan ekspresi mRNA PTEN di setiap baris sel diukur oleh RT-qPCR, dan baris sel dengan ekspresi relatif tertinggi dan terendah dipilih untuk eksperimen selanjutnya.
Sel KYSE-30 dipisahkan menjadi 7 kelompok dan, masing-masing, diobati dengan inhibitor miR-301, kontrol negatif inhibitor (NC), pcDNA-PTEN (disebut overexpressed (oe)-PTEN), pcDNA-NC (disebut oe-NC), inhibitor miR-301 + RNA interferensi kecil (si)-PTEN atau inhibitor miR-301 + si-NC. Sel Eca109 juga dipisahkan menjadi 7 kelompok dan masing-masing diobati dengan mimic miR-301, mimic NC, si-PTEN, si-NC, miR-301 mimic + oe-PTEN, miR-301 mimic + oe-NC. inhibitor NC, inhibitor miR-301, mimic miR-301, mimic NC, si-NC dan si-PTEN dibeli dari GenePharma Ltd., Company (Shanghai, Tiongkok); pcDNA-PTEN NC dan pcDNA-PTEN diperoleh dari (Shanghai Sangon Bio-technology Corporation (Shanghai, Tiongkok)). Sel ditransfeksi secara sementara ke dalam sel ESCC dengan lipofectamine 2000 (Invitrogen) ketika kepadatan sel mencapai 60%.
Uji Kit Penghitung Sel (CCK-8)
Sel ditanam dalam piring 96-lubang (1 × 103 sel/lubang) dan diinkubasi untuk periode waktu yang berbeda. Setelah diinkubasi selama 24 jam, 48 jam, 72 jam, dan 96 jam, setiap lubang ditambahi dengan 10 μL larutan CCK-8 (5 mg/mL), dan kemudian, sel setiap kelompok diinkubasi pada 37 °C tanpa paparan cahaya selama 2 jam. Nilai densitas optik (OD) pada 450 nm dianalisis oleh pembaca mikropiring (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, AS).
Uji Pembentukan Koloni
Sel ditanam pada 500 sel/lubang dalam piring 6-lubang setelah transfeksi dan dikultur selama 14 hari. Koloni dikonfirmasi dengan metanol, diwarnai dengan kristal violet 0,5% dan dihitung di bawah mikroskop terbalik.
Uji Transwell
Sel (5 × 103) yang diinkubasi dalam media RPMI 1640 ditanam pada kamar apical perangkat Transwell dengan membran tidak dilapisi atau dilapisi matrigel (Corning, NY, AS). Setelah 24 jam, sel pada kamar apical dihilangkan, sementara sel yang tersisa di bagian bawah dikonfirmasi dan kemudian diwarnai dengan kristal violet 0,1%. Mikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang) digunakan untuk menghitung pada 3 bidang acak untuk menghitung jumlah sel.
Sitometri Aliran
Siklus sel dan apoptosis dievaluasi oleh sitometri aliran. Annexin V-fluorescein isothiocyanate (10 µL) dan iodida propidium (PI; 5 µL, Sigma) diinkubasi dengan sel (5 × 105 sel/lubang) dalam gelap pada 4 °C selama 30 menit. Persentase sel apoptotik dihitung menggunakan sitometer aliran (BD Biosciences, CA, AS) dengan perangkat lunak FlowJo versi 10 (FlowJo LLC, OR, AS).
Untuk menilai siklus sel, sel (5 × 105 sel/lubang) dikonfirmasi dengan etanol 75% selama semalaman pada 4 °C dan diwarnai dengan 5 µl PI/ribonuklease A (Sigma) pada 4 °C selama 30 menit dalam gelap. Data dianalisis dengan sitometer aliran (BD Biosciences). Sinyal fluoresens (14.000) dari setiap sampel dikumpulkan dan dihitung menggunakan perangkat lunak ModFit LT versi 3.2 (Verity Software House, Inc., ME, AS).
Tumorigenesis Subkutan pada Tikus Nua
Empat puluh dua tikus nua BALB/c-nu betina (usia 4 minggu, berat 16–24 g) diperoleh dari Pusat Hewan Eksperimental Universitas Jilin (Changchun, Tiongkok). Tikus nua dipisahkan menjadi 14 kelompok (n = 3). Tikus nua dari tujuh kelompok, masing-masing, diinjeksi dengan sel KYSE-30 sesuai dengan pengelompokan sel, dan tikus nua dari tujuh kelompok yang lain masing-masing diinjeksi dengan sel Eca109 berdasarkan pengelompokan. Konsentrasi sel KYSE-30 dan Eca109 yang ditransfeksi disesuaikan menjadi 5 × 106 sel/100 μL. Tikus nua dikonfirmasi dan diinjeksi subkutan dengan sel ESCC yang sesuai dalam kondisi steril. Panjang terbesar (L) dan lebar (W) tumor diukur setiap minggu dan volume tumor (V) = 1/2 × L × W2. Tikus nua diutamakan pada minggu ke-5 setelah injeksi dengan tumor diangkat, dan tumor ditimbang dan difoto. Rasio pembentukan tumor dihitung sebagai jumlah tikus dengan tumor subkutan/jumlah total tikus nua yang diinjeksi dalam kelompok × 100%. Waktu injeksi diambil sebagai absis, dan ukuran tumor diambil sebagai ordinat; dengan demikian, kurva pertumbuhan tumor digambar.
Pewarnaan Imunohistokimia
Jaringan tumor tikus nua dikonfirmasi dengan formaldehide 10%, diembed parafin dan dipotong menjadi 4 μm. Selanjutnya, bagian dijemur pada 60 °C selama 2 jam, dilemakan dengan xylene, didesidratkan dengan etanol bertingkat dan diinkubasi dengan 50 μL H2O2 3% selama 10 menit. Kemudian, bagian direndam dalam larutan citrat asam 0,01 M, direbus pada 95 °C selama 20 menit, diblokir dengan larutan kerja serum kambing normal pada 37 °C selama 10 menit dan ditambahi dengan CD34 (1: 100, Santa Cruz) pada 4 °C selama semalaman. Setelah itu, bagian ditambahi dengan polimer anti-kelinci/tikus IgG yang dilabeli HRP (ZSGB-Bio, Beijing, Tiongkok), diwarnai kembali dengan hematoxylin, didesidratkan dan melaluiabilitas dan kemudian diaperkan dengan balsam netral. PBS digunakan untuk menggantikan antibodi primer sebagai NC. Pengukuran densitas mikrovessel (MVD): bagian diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran rendah. Sel endotel atau klaster sel endotel yang diwarnai kekuning-kuningan dan signifikan dibedakan dengan sel tumor di sekitarnya, dan jaringan ikat dianggap sebagai mikrovessel. Struktur cabang juga dianggap sebagai vessel jika terputus, sementara vessel dengan ukuran lumen > 8 eritrosit, lapisan otot atau lumen yang lebih tekik dikecualikan. Jumlah mikrovessel dari 3 bidang visual tinggi dicatat, dan jumlah rata-rata adalah MVD dari setiap kasus.
Analisis Statistik
Semua analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak SPSS versi SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, AS) dan disajikan dengan Graphpad Prism Software 6.0. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar. Perbedaan antara dua grup independen diuji dengan uji t Student. Uji ANOVA satu arah dilakukan untuk membandingkan tiga grup atau lebih. Nilai P < 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik.
Hasil
miR-301 Tinggi Ekspresi, Sementara PTEN Rendah Ekspresi dalam Jaringan dan Sel ESCC
Ekspresi miR-301 dan PTEN dalam jaringan ESCC dan jaringan normal berdekatan dievaluasi menggunakan RT-qPCR dan analisis Western blot untuk mengungkapkan peran mereka dalam ESCC, dan ditemukan bahwa (Gambar 1a–c) miR-301 meningkat, sementara PTEN menurun dalam jaringan ESCC. Pasien dibagi menjadi kelompok ekspresi rendah dan tinggi sesuai dengan nilai median ekspresi miR-301 atau PTEN untuk menganalisis korelasi antara ekspresi miR-301 atau PTEN dan karakteristik klinis patologis pasien ESCC. Hasilnya menunjukkan bahwa ekspresi miR-301/PTEN tidak terkait dengan usia, jenis kelamin, ukuran tumor, lokasi dan diferensiasi, sementara terkait dengan tahap TNM dan LNM pasien ESCC (Tabel 2).
miR-301 tinggi ekspresi, sementara PTEN rendah ekspresi dalam jaringan dan sel ESCC. a Ekspresi miR-301 dan ekspresi mRNA PTEN dalam jaringan ESCC yang terdeteksi menggunakan RT-qPCR; b ekspresi protein PTEN dalam jaringan ESCC yang terdeteksi menggunakan analisis Western blot; c pita protein PTEN dalam jaringan ESCC dalam analisis Western blot; d ekspresi miR-301 dan ekspresi mRNA PTEN dalam baris sel ESCC yang terdeteksi menggunakan RT-qPCR; e ekspresi protein PTEN dalam baris sel ESCC yang terdeteksi menggunakan analisis Western blot; f pita protein PTEN dalam analisis Western blot. *P < 0,05 versus HEEC. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan uji t dilakukan untuk perbandingan antara dua grup
Kemudian, ekspresi miR-301 dan PTEN dalam 4 baris sel ESCC dan HEECs ditentukan menggunakan RT-qPCR dan analisis Western blot. Kami menemukan bahwa (Gambar 1d–f) miR-301 meningkat dan PTEN menurun dalam baris sel ESCC, di mana KYSE-30 memiliki ekspresi miR-301 tertinggi dan ekspresi PTEN terendah, sementara Eca109 memiliki tendensi yang berlawanan. Dengan demikian, baris sel KYSE-30 diobati dengan miR-301 menurun/PTEN diekspresikan berlebih dan baris sel Eca109 diobati dengan miR-301 diekspresikan berlebih/PTEN dinonaktifkan dalam eksperimen seluler.
PTEN Ditargetkan oleh miR-301
Perangkat lunak bioinformatika (https://www.microrna.org/) memprediksi bahwa PTEN adalah gen target miR-301 (Gambar 2a). Ini lebih lanjut dikonfirmasi oleh uji gen pelapor luciferase dual bahwa aktivitas luciferase secara signifikan menurun dalam sel ESCC yang ditransfeksi bersama dengan vektor PTEN-wt dan mimic miR-301 dibandingkan dengan yang ditransfeksi bersama dengan vektor PTEN-mut dan mimic miR-301, yang menyiratkan bahwa miR-301 dapat secara khusus terikat pada PTEN (Gambar 2b, c).
PTEN adalah gen target miR-301. a Situs ikut miR-301 dan PTEN diprediksi oleh perang lunak prediksi daring; b hubungan target antara miR-301 dan PTEN dalam sel KYSE-30 dievaluasi oleh uji gen pelapor luciferase dual; c hubungan target antara miR-301 dan PTEN dalam sel Eca109 dievaluasi oleh uji gen pelapor luciferase dual; d ekspresi miR-301 dan ekspresi mRNA PTEN dalam sel KYSE-30 yang terdeteksi menggunakan RT-qPCR setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; e ekspresi protein PTEN dalam sel KYSE-30 yang terdeteksi menggunakan analisis Western blot setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; f pita protein PTEN dalam sel KYSE-30 dalam analisis Western blot setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; g ekspresi miR-301 dan ekspresi mRNA PTEN dalam sel Eca109 yang terdeteksi menggunakan RT-qPCR setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN; h ekspresi protein PTEN dalam sel Eca109 yang terdeteksi menggunakan analisis Western blot setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN; i pita protein PTEN dalam sel Eca109 dalam analisis Western blot setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN. *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC, & P < 0,05 versus kelompok oe-NC, #P < 0,05 versus kelompok inhibitor miR-301 + si-NC, a P < 0,05 versus kelompok mimic-NC, b P < 0,05 versus kelompok si-NC, c P < 0,05 versus kelompok mimic miR-301 + oe-NC; N = 3. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan uji t dilakukan untuk perbandingan antara dua grup. ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa grup
RT-qPCR dan analisis Western blot digunakan untuk mengevaluasi ekspresi miR-301 dan PTEN dalam sel yang ditransfeksi, dan ditemukan bahwa dalam sel KYSE-30 (Gambar 2d–f), sel yang diobati dengan inhibitor miR-301 menurunkan miR-301, sementara meningkatkan PTEN; sel yang diobati dengan pcDNA-PTEN (oe-PTEN) meningkatkan ekspresi PTEN, dan si-PTEN membalikkan efek inhibitor miR-301 pada ekspresi PTEN. Dalam sel Eca109 (Gambar 2g–i), sel yang diobati dengan mimic miR-301 meningkatkan miR-301, sementara menurunkan PTEN; sel yang diobati dengan si-PTEN menurunkan ekspresi PTEN, dan pcDNA-PTEN (oe-PTEN) membalikkan peran hemmat mimic miR-301 pada ekspresi PTEN. Data ini menyiratkan bahwa miR-301 menargetkan PTEN.
Inhibisi miR-301 atau Ekspresi Berlebih PTEN Membatasi Kelayakan Sel ESCC; Kenaikan miR-301 atau Penurunan PTEN Memromosikan Kelayakan Sel ESCC
Kelayakan sel ESCC dievaluasi menggunakan uji pembentukan koloni dan CCK-8. Hasilnya mengungkapkan bahwa dalam baris sel KYSE-30 (Gambar 3a–c), transfeksi inhibitor miR-301 atau oe-PTEN menekan kemampuan pembentukan koloni dan kelayakan sel; transfeksi PTEN yang dinonaktifkan menghilangkan dampak inhibitor miR-301 pada kelayakan sel ESCC; dalam baris sel Eca109 (Gambar 3d–f), transfeksi mimic miR-301 atau si-PTEN memromosikan kemampuan pembentukan koloni dan kelayakan sel; ekspresi berlebih PTEN membalikkan peran memromosikan kenaikan miR-301 pada kemampuan pembentukan koloni dan kelayakan sel Eca109. Hasil ini menyiratkan bahwa penekanan miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menekan kelayakan sel ESCC, yang dipromosikan oleh kenaikan miR-301 atau inhibisi PTEN.
Inhibisi miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN membatasi kelayakan sel ESCC; kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN memromosikan kelayakan sel ESCC. a Jumlah koloni dalam sel KYSE-30 setelah transfeksi yang terdeteksi menggunakan uji pembentukan koloni setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; b kemampuan pembentukan koloni sel KYSE-30 setelah transfeksi yang terdeteksi menggunakan uji pembentukan koloni setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; c kelayakan sel KYSE-30 setelah transfeksi yang terdeteksi menggunakan uji CCK-8 setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; d jumlah koloni dalam sel Eca109 setelah transfeksi yang terdeteksi menggunakan uji pembentukan koloni setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN; e kemampuan pembentukan koloni sel Eca109 setelah transfeksi yang terdeteksi menggunakan uji pembentukan koloni setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN; f kelayakan sel Eca109 setelah transfeksi yang terdeteksi menggunakan uji CCK-8 setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN; *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC; & P < 0,05 versus kelompok oe-NC; #P < 0,05 versus kelompok inhibitor miR-301 + si-NC; a P < 0,05 versus kelompok mimic-NC; b P < 0,05 versus kelompok si-NC; c P < 0,05 versus kelompok mimic miR-301 + oe-NC, N = 3. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa grup
Inhibisi miR-301 atau Ekspresi Berlebih PTEN Menahan Migrasi dan Invasi Sel ESCC; Kenaikan miR-301 atau Penurunan PTEN Menginduksi Migrasi dan Invasi Sel ESCC
Kemampuan migrasi dan invasi sel ESCC dievaluasi menggunakan uji Transwell. Hasilnya menyiratkan bahwa dalam baris sel KYSE-30 (Gambar 4a, b), kemampuan migrasi dan invasi sel ditekan oleh inhibisi miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN; peran menekan inhibitor miR-301 pada kemampuan migrasi dan invasi sel dibalikkan oleh si-PTEN. Dalam baris sel Eca109 (Gambar 4c, d), kemampuan migrasi dan invasi sel dipromosikan setelah transfeksi mimic miR-301 atau si-PTEN; ekspresi berlebih PTEN membalikkan dampak mimic miR-301 pada kemampuan migrasi dan invasi sel. Temuan di atas menyiratkan bahwa migrasi dan invasi sel ESCC ditekan oleh penekanan miR-301 atau elevasi PTEN, sedangkan dipromosikan oleh kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN.
Inhibisi miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menahan migrasi dan invasi sel ESCC; kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN memromosikan migrasi dan invasi sel ESCC. a Kemampuan migrasi dan invasi sel KYSE-30 yang ditransfeksi dievaluasi menggunakan uji Transwell setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; b hasil statistik migrasi dan invasi dalam sel KYSE-30 melalui uji Transwell setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; c kemampuan migrasi dan invasi sel Eca109 di antara kelompok dievaluasi menggunakan uji Transwell setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN; d hasil statistik migrasi dan invasi dalam sel Eca109 melalui uji Transwell peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN. *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC; & P < 0,05 versus kelompok oe-NC; #P < 0,05 versus kelompok inhibitor miR-301 + si-NC; a P < 0,05 versus kelompok mimic-NC; b P < 0,05 versus kelompok si-NC; c P < 0,05 versus kelompok mimic miR-301 + oe-NC, N = 3. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa grup
Inhibisi miR-301 atau Ekspresi Berlebih PTEN Menginduksi Penahanan Siklus Sel dan Apoptosis Sel ESCC; Kenaikan miR-301 atau Penurunan PTEN Menekan Penahanan Siklus Sel dan Apoptosis Sel ESCC
Sitometri aliran digunakan untuk mendeteksi transisi siklus sel dan apoptosis sel setelah transfeksi, dan hasilnya menunjukkan bahwa dalam baris sel KYSE-30 (Gambar 5a–d), transfeksi inhibitor miR-301 atau oe-PTEN meningkatkan tingkat apoptosis dan meningkatkan sel dalam fase G0/G1, sementara menurunkan yang dalam fase S dan G2/M; perubahan apoptosis dan penahanan siklus sel yang diinduksi oleh inhibitor miR-301 dapat dibalikkan oleh si-PTEN.
Inhibisi miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menginduksi penahanan siklus sel dan apoptosis sel ESCC; kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN menekan penahanan siklus sel dan apoptosis sel ESCC. a Distribusi siklus sel sel KYSE-30 di setiap kelompok terdeteksi oleh sitometri aliran setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; b hasil statistik persentase dalam fase G0/G1, S dan G2/GM sel KYSE-30 dalam sitometri aliran setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; c apoptosis sel KYSE-30 terdeteksi oleh sitometri aliran setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; d tingkat apoptosis sel KYSE-30 yang ditransfeksi terdeteksi menggunakan sitometri aliran setelah penurunan miR-310 atau peningkatan PTEN; e distribusi siklus sel sel Eca109 di setiap kelompok terdeteksi oleh sitometri aliran peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN; f hasil statistik persentase dalam fase G0/G1, S dan G2/GM sel Eca109 dalam sitometri aliran setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN; g apoptosis sel Eca109 terdeteksi oleh sitometri aliran setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN; h tingkat apoptosis sel Eca109 yang ditransfeksi terdeteksi menggunakan sitometri aliran setelah peningkatan miR-310 atau penurunan PTEN. *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC; & P < 0,05 versus kelompok oe-NC; #P < 0,05 versus kelompok inhibitor miR-301 + si-NC; a P < 0,05 versus kelompok mimic-NC; b P < 0,05 versus kelompok si-NC; c P < 0,05 versus kelompok mimic miR-301 + oe-NC, N = 3. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa grup
Menurut hasil sitometri aliran, kami telah menemukan bahwa dalam baris sel Eca109 (Gambar 5e–h), transfeksi mimic miR-301 atau si-PTEN menurunkan tingkat apoptosis, menurunkan sel dalam fase G0/G1 dan meningkatkan fase S dan G2/M; ekspresi berlebih PTEN membalikkan efek mimic miR-301 pada tingkat apoptosis dan penahanan siklus sel sel Eca109. Kami menyimpulkan dari hasil ini bahwa penurunan miR-301 atau peningkatan PTEN mempromosikan transisi siklus sel dan apoptosis dalam sel ESCC, sementara penurunan miR-301 atau penekanan PTEN memberikan efek yang berlawanan.
Inhibisi miR-301 atau Ekspresi Berlebih PTEN Menahan Pertumbuhan Tumor dan Angiogenesis In Vivo dalam ESCC; Kenaikan miR-301 atau Penurunan PTEN Meningkatkan Pertumbuhan Tumor dan Angiogenesis In Vivo dalam ESCC
Pertumbuhan dan perubahan tumor ESCC dalam tikus nua diamati di setiap kelompok. Pertumbuhan tumor dievaluasi, dan hasilnya menyiratkan bahwa dalam baris sel KYSE-30 (Gambar 6a–e), tikus nua yang diinjeksi dengan inhibitor miR-301 atau oe-PTEN mengurangi volume dan berat tumor; peran menekan inhibitor miR-301 pada pertumbuhan tumor dibatalkan oleh si-PTEN. Dalam baris sel Eca109 (Gambar 6f–j), volume dan berat tumor ditingkatkan dalam tikus nua yang diinjeksi dengan mimic miR-301 atau si-PTEN; ekspresi berlebih PTEN membalikkan efek mimic miR-301 pada pertumbuhan tumor. Sementara itu, ekspresi CD34 dalam xenograft dari tikus nua dievaluasi menggunakan pewarnaan imunohistokimia dan temuan menunjukkan bahwa (Gambar 7a–d) dalam xenograft KYSE-30, MVD ditekan setelah penurunan miR-301 atau peningkatan PTEN; penekanan PTEN membalikkan dampak inhibisi miR-301 pada MVD. Dalam xenograft Eca109, MVD meningkat setelah kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN; peningkatan MVD yang diinduksi oleh kenaikan miR-301 dapat dibatalkan oleh ekspresi berlebih PTEN. Data ini menyiratkan bahwa inhibisi miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menekan pertumbuhan tumor dan angiogenesis dalam ESCC, sementara kenaikan miR-301 atau penekanan PTEN memiliki efek berbalik.
Inhibisi miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menahan pertumbuhan tumor dalam ESCC; kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN meningkatkan pertumbuhan tumor dalam ESCC. a Gambar representatif pertumbuhan tumor yang diamati oleh tumorigenesis subkutan dalam tikus nua setelah sel KYSE-30 ditransfeksi; b–d perubahan volume tumor dari setiap kelompok setelah sel KYSE-30 ditransfeksi; e perubahan berat tumor dari setiap kelompok setelah sel KYSE-30 ditransfeksi; f gambar representatif pertumbuhan tumor yang diamati oleh tumorigenesis subkutan dalam tikus nua setelah sel Eca109 ditransfeksi; g–i perubahan volume tumor dari setiap kelompok setelah sel Eca109 ditransfeksi; j perubahan berat tumor dari setiap kelompok setelah sel Eca109 ditransfeksi. *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC; & P < 0,05 versus kelompok oe-NC; #P < 0,05 versus kelompok inhibitor miR-301 + si-NC; a P < 0,05 versus kelompok mimic-NC; b P < 0,05 versus kelompok si-NC; c P < 0,05 versus kelompok mimic miR-301 + oe-NC, n = 3 tikus. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa grup
Inhibisi miR-301 atau ekspresi berlebih PTEN menahan angiogenesis dalam ESCC; kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN meningkatkan angiogenesis dalam ESCC. a Gambar representatif jaringan tumor yang diamati oleh pewarnaan imunohistokimia dalam tikus nua setelah sel KYSE-30 ditransfeksi; b perbandingan MVD KYSE-30 dalam jaringan tumor di antara kelompok; c gambar representatif jaringan tumor yang diamati oleh pewarnaan imunohistokimia dalam tikus nua setelah sel Eca109 ditransfeksi; d perbandingan MVD Eca109 dalam jaringan tumor di antara kelompok *P < 0,05 versus kelompok inhibitor-NC; & P < 0,05 versus kelompok oe-NC; #P < 0,05 versus kelompok inhibitor miR-301 + si-NC; a P < 0,05 versus kelompok mimic-NC; b P < 0,05 versus kelompok si-NC; c P < 0,05 versus kelompok mimic miR-301 + oe-NC, n = 3 tikus. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar, dan ANOVA digunakan untuk perbandingan di antara beberapa grup
Diskusi
EC adalah jenis malignitas invasi dalam saluran pencernaan [16]. Sebagai jenis utama EC, ESCC adalah tumor ganas yang terjadi pada sel epitel eofagus [17]. miRNA, yang dikenal sebagai RNA non-koding kecil, telah dibuktikan berperan sebagai molekul utama yang signifikan dalam pengampitan RNA [18]. Penelitian kami dirancang untuk mengeksplorasi efek miR-301 dan gen targetnya PTEN pada progresi ESCC, dan kami telah menemukan bahwa inhibisi miR-301 dapat menekan angiogenesis dan pertumbuhan sel dalam ESCC dengan meningkatkan PTEN.
Ekspresi miR-301 dievaluasi, dan kami menemukan bahwa miR-301 diekspresikan tinggi dalam sel ESCC dibandingkan dengan HEEC, dan ekspresi miR-301 yang lebih tinggi juga ditemukan dalam jaringan ESCC dibandingkan dengan jaringan normal berdekatan. Mirip dengan hasil ini, Li et al. telah mengidentifikasi bahwa miR-301 diekspresikan tinggi dalam jaringan infark miokard [19]. Selain itu, kami telah uraikan bahwa PTEN ditargetkan oleh miR-301, dan hubungan target telah ditunjukkan oleh literatur yang ada [20]. Kami juga telah menemukan bahwa PTEN, yang telah dikonfirmasi ditargetkan oleh miR-301, diekspresikan rendah baik dalam jaringan maupun sel ESCC. Mirip dengan itu, penelitian sebelumnya telah mengungkapkan bahwa PTEN diekspresikan rendah dalam ESCC dibandingkan dengan epitel eofagus non-tumor [21]. Selain itu, Ma et al. telah mengungkapkan bahwa ekspresi PTEN terdegradasi dalam baris sel Eca109 [22], yang juga telah dipilih untuk serangkaian eksperimen dalam penelitian ini. Studi-studi ini memberikan bukti atas ekspresi tinggi miR-301 dan ekspresi rendah PTEN dalam ESCC.
Hasil penting lainnya dalam penelitian ini mengindikasikan bahwa inhibisi miR-301 dapat menekan kemampuan pembentukan koloni serta proliferasi sel ESCC melalui peningkatan ekspresi PTEN, dan kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN memiliki efek yang berlawanan. Mirip dengan itu, Han et al. telah uraikan bahwa penurunan miR-301 yang diinduksi oleh luteolin memiliki kemampuan untuk menekan proliferasi sel dalam kanker prostat [6]. Literatur terbaru telah mengungkapkan bahwa ekspresi berlebih PTEN menekan proliferasi sel kanker pankreas [23], dan hasil yang sama telah diringkas dalam studi yang berfokus pada kanker prostat [24]. Selain itu, kami juga telah mengungkapkan bahwa penurunan miR-301 atau elevasi PTEN dapat menekan migrasi dan invasi sel ESCC, dan kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN menunjukkan tren yang berlawanan. Sesuai dengan hasil ini, Shi et al. telah mendukung bahwa inhibisi miR-301 melemahkan migrasi dan invasi sel kanker payudara [10], dan telah dilaporkan bahwa migrasi dan invasi sel ESCC dapat ditekan oleh inhibisi miR-130b dan elevasi PTEN [25]. Publikasi-publikasi ini membantu memverifikasi peran onkogen miR-301 dan efek penekan tumor PTEN dalam berbagai kanker manusia. Hasil lain dalam penelitian kami adalah bahwa inhibisi miR-301 mengekspresikan berlebih PTEN untuk mempromosikan apoptosis sel dan menginduksi penahanan siklus sel pada fase G0/G1 dalam sel ESCC, dan kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN memiliki hasil yang berbalik. Mirip dengan itu, literatur terbaru telah mengungkapkan bahwa aktivasi PTEN menginduksi penahanan siklus sel dan apoptosis dalam ESCC [26]. Secara konsisten, Tian et al. telah menemukan dalam studi mereka bahwa elevasi PTEN menekan angiogenesis dengan mengurangi ekspresi faktor pertumbuhan endotel vaskular dalam kanker hati [27]. Berdasarkan data di atas, peran miR-301 dan PTEN dalam apoptosis dan angiogenesis dalam berbagai penyakit dikonfirmasi lebih lanjut. Akibatnya, kami menyimpulkan bahwa penurunan miR-301 dapat menekan pertumbuhan tumor dalam ESCC melalui ekspresi tinggi PTEN, dan kesimpulan yang serupa juga telah diungkapkan dalam kanker payudara [10] dan kanker prostat [28]. Sebaliknya, kenaikan miR-301 atau penurunan PTEN menginduksi pertumbuhan tumor dalam ESCC. Dapat disimpulkan bahwa miR-301 dan PTEN berpartisipasi dalam pertumbuhan sel kanker in vivo.
Kesimpulan
Dalam studi ini, kami telah menunjukkan bahwa penekanan miR-301 mencegah angiogenesis, proliferasi sel, migrasi dan invasi tetapi mempromosikan apoptosis dalam sel ESCC dengan meningkatkan PTEN. Penelitian ini dapat memperdalam pemahaman tentang mekanisme molekular potensial ESCC dan memberikan target baru untuk pengobatan ESCC.
