Identifikasi Karakteristik Makromolekul Genotipe Escherichia coli dengan Mikroskop Kekuatan Atom Pemetaan Mekanik Skala Nano
Abstrak
Kategorisasi galur mikroba secara konvensional didasarkan pada metode molekuler, dan jarang karakteristik morfologi galur bakteri yang dipelajari. Dalam penelitian ini, kami mengungkapkan struktur makromolekul permukaan bakteri melalui pemetaan mekanis AFM, yang resolusinya tidak hanya ditentukan oleh ukuran ujung skala nano tetapi juga sifat mekanik spesimen. Teknik ini memungkinkan studi skala nano dari struktur membran strain mikroba dengan persiapan spesimen sederhana dan lingkungan kerja yang fleksibel, yang mengatasi berbagai pembatasan dalam mikroskop elektron dan metode analisis biokimia yang memungkinkan label. Makromolekul karakteristik yang terletak di antara permukaan sel dianggap sebagai protein lapisan permukaan dan ditemukan spesifik untuk Escherichia coli genotipe, dari mana ukuran molekul rata-rata dicirikan dengan diameter berkisar antara 38 hingga 66 nm, dan bentuk molekulnya seperti ginjal atau bulat. Kesimpulannya, struktur makromolekul permukaan memiliki karakteristik unik yang terhubung ke E. koli genotipe, yang menunjukkan bahwa efek genomik pada morfologi seluler dapat diidentifikasi dengan cepat menggunakan pemetaan mekanis AFM.
Kuantifikasi makromolekul permukaan E. koli sel menggunakan pemetaan mekanis AFM. Makromolekul permukaan permukaan seluler tiga E. koli genotipe, MG1655, CFT073, dan RS218, dicirikan dengan ukuran mulai dari 38 hingga 66 nm dan dengan bentuk bulat atau seperti ginjal. Gambar topografi diwarnai dengan pemetaan adhesi dengan batang skala = 200 nm.
Latar Belakang
Karena resolusi mikroskop optik yang lebih rendah dan lingkungan kerja mikroskop elektron yang terbatas, para peneliti di bidang mikroba jarang mempertimbangkan untuk menggunakan penampilan sel bakteri tetapi sebaliknya mengadopsi metode analisis molekuler atau kimia untuk identifikasi fragmen genom, ekspresi protein, dll. Tidak mengherankan, metode tersebut memiliki sejumlah kelemahan, termasuk padat karya dan memakan waktu, dan dengan demikian, diperlukan pendekatan yang lebih lugas, efisien, dan fleksibel. Ditemukan pada tahun 1982 oleh Binnig et al., mikroskop gaya atom (AFM) dirancang untuk menggunakan probe skala nano yang dipantau oleh sinar laser untuk pengamatan permukaan spesimen dengan resolusi nanoscopic atau bahkan atom [1]. Pencitraan morfologi melalui ujung probe fisik, teknik ini mengatasi batas resolusi dan batasan lingkungan dari mikroskop optik dan elektron dan memiliki sejumlah keunggulan, seperti persiapan spesimen yang sederhana dan lingkungan kerja yang fleksibel dalam kondisi udara atau cairan ambien [2, 3]. Namun, sehubungan dengan studi mikroba, aplikasi AFM saat ini terutama melibatkan pencitraan kualitatif morfologi statis atau dinamis sel bakteri atau ekspresi flagela dan pili [4,5,6], sementara beberapa penelitian berfokus pada ultrastruktur permukaan bakteri. sel mikroba dan analisis kuantitatif sifat seluler.
Dalam penelitian ini, AFM dipilih untuk studi permukaan Escherichia coli (E.coli ) sel, dan bentuk serta dimensi masing-masing bakteri diamati dengan topografi AFM dan gambar fase. Selanjutnya, pemetaan mekanis simultan ditemukan untuk mengungkapkan informasi biomekanik tambahan tentang komponen permukaan, di mana perbedaan kecil dalam karakteristik perekat antara makromolekul dan matriks sekitarnya dapat dideteksi selama setiap kontak fisik antara ujung dan sampel. Menerapkan teknik canggih seperti itu ke bidang mikroba, kami telah memeriksa tiga E. koli genotipe yang berisi satu strain laboratorium dan dua strain patogen manusia untuk identifikasi makromolekul permukaan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa teknik ini dapat menawarkan resolusi gambar yang melebihi skala ujung AFM dengan merasakan distribusi mekanis spesimen. Sebagai kesimpulan, kami menyarankan bahwa perkembangan seperti itu dalam ilmu permukaan tidak hanya akan memberikan para peneliti yang bekerja di bidang mikroba dengan detail penampilan seluler, tetapi juga berkontribusi pada pengetahuan kami tentang karakteristik permukaan sistem bio atau nanomaterial lain.
Metode
Sampel Mikroba
Tiga E. koli galur yang diuji dalam penelitian ini diisolasi secara klinis dan disediakan oleh laboratorium Prof. Ching-Hao Teng di Institut Kedokteran Molekuler, Universitas Nasional Cheng Kung. MG1655 adalah strain laboratorium usus dan tipe liar dari E. koli K-12, dan dua strain lainnya adalah patogen manusia—CFT073, penyebab utama infeksi saluran kemih, dan RS218, terkait dengan meningitis neonatus pada bayi [7].
Substrat yang Difungsikan
Dua langkah modifikasi permukaan diterapkan untuk ikatan kovalen antara permukaan padat dan sel mikroba. Pertama, larutan 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES, Sigma-Aldrich Co. LLC, USA) digunakan untuk membentuk NH2 awal -lapisan yang difungsikan pada permukaan, di mana lapisan APTES yang stabil berkontribusi pada ikatan Si-O yang stabil—Si yang disediakan oleh APTES dan O dari permukaan yang teroksidasi. Memiliki dua fungsi COOH, glutaraldehid bergabung menjadi NH2 fungsi APTES dengan satu COOH dan bekerja dengan NH2 pada permukaan bakteri dengan COOH lainnya.
Substrat bersih direndam dalam larutan APTES, dengan campuran 5% APTES dalam etanol, selama satu jam dan dibilas dengan etanol dan ddH2 O. Preparat dikeringkan menggunakan aliran nitrogen dan kemudian ditempatkan dalam larutan glutaraldehid, 2% dalam PBS, selama semalam, dan dicuci dengan PBS.
Persiapan Sampel
Koloni tunggal E. koli strain dipilih dari lisogeni kaldu (LB) piring agar dan diinkubasi dalam kaldu LB. Setelah waktu kultivasi 12 jam, larutan bakteri kemudian diencerkan 1:100 dalam kaldu LB segar yang telah diseimbangkan sebelumnya. Setelah 12 jam lagi untuk budidaya mikroba, larutan bakteri tersebut disentrifugasi pada 1500×g (4000 rpm) selama 3 mnt dan disuspensikan kembali dalam kaldu LB, dengan proses ini diulang dua kali. Dua ratus mikroliter larutan bakteri dijatuhkan ke substrat yang berfungsi dan dibiarkan selama 30 menit. Spesimen kemudian direndam dalam air suling dua kali untuk menghilangkan sel yang tidak terikat dan segera dicitrakan di bawah AFM di udara sekitar.
Karakterisasi AFM
Instrumen AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) dan probe silikon nitrida dengan konstanta pegas terkalibrasi 0,7 N/m dan radius ujung 10 nm dipilih untuk pemeriksaan permukaan spesimen mikroba. Laju pemindaian AFM dan piksel garis masing-masing adalah 0,5 Hz dan 256 baris, untuk ukuran pemindaian 10 μm untuk deteksi pertama topografi, dan parameter kemudian ditetapkan sebagai 0,3 Hz dan 512 baris untuk ukuran pemindaian 2 μm untuk pengamatan rinci. Mode kuantitatif nanomekanis (QNM) PeakForce digunakan untuk pemetaan nanomekanis, di mana sifat perekat permukaan dihitung dari gaya tarik maksimum di antara kurva jarak gaya penarikan.
Studi kami sebelumnya tentang Streptococcus mutans menunjukkan evolusi mekanis pada permukaan bakteri selama 2 jam, dipantau dengan pemetaan mekanis AFM berkelanjutan, dan sampel mikroba diverifikasi untuk tetap hidup dalam durasi tersebut [8,9,10]. Untuk memastikan kelangsungan hidup E. koli sampel yang digunakan dalam pekerjaan ini, pra-studi pada sampel bakteri dilakukan, dan perubahan terus menerus pada adhesi permukaan selama 4 jam menyiratkan bahwa sel tetap hidup setidaknya selama 4 jam setelah persiapan sampel (ditunjukkan dalam file tambahan 1). Akibatnya, sampel mikroba yang diuji dalam pekerjaan ini diukur dengan AFM dalam waktu 2 jam setelah persiapan spesimen. Semua E. koli genotipe dibudidayakan secara individu dan pada waktu yang berbeda, dan pengukuran AFM dilakukan segera setelah persiapan spesimen. Dengan kata lain, sampel bakteri tidak berbaris menunggu pemeriksaan, sehingga efek waktu penahanan terhadap perbedaan antara E. koli strain diminimalkan. Data kuantitatif untuk setiap E. koli regangan dikumpulkan dari pengukuran yang dilakukan dalam waktu 2 jam dalam penelitian ini.
Analisis Statistik
Prism (GraphPad Software, USA) digunakan untuk analisis statistik dalam pekerjaan ini. Panjang seluler dan ukuran makromolekul disajikan sebagai nilai rata-rata bersama dengan kesalahan standar rata-rata (SEM). Beberapa perbandingan antara E. koli genotipe diproses menggunakan analisis varians satu arah biasa (ANOVA). Tingkat kepercayaan 95% (p < 0,05) dipilih, dan tanda bintang menunjukkan tingkat perbedaan signifikan yang ditemukan. Nomor sampel n dari setiap galur adalah> 40.
Hasil dan Diskusi
Ultrastruktur Permukaan dengan Pemetaan Ganda
Saat memindai dengan AFM pada skala pengamatan 10 μm pada sampel bakteri, beberapa E. koli Sel MG1655 dapat dilihat, dan bentuk seluler dalam tiga dimensi dapat diamati dari gambar topografi (Gbr. 1a); garis besar sel yang ditunjukkan dalam dua dimensi diperoleh dengan gambar kesalahan defleksi (Gbr. 1b), dan beberapa tubulus selain sel bakteri dapat ditemukan. Filamen seperti gelombang (Gbr. 1c) konsisten dengan penampilan flagela mikroba yang dilaporkan dalam karya lain, yang mengkonfirmasi temuan seperti flagela, dan pili yang lebih pendek dan seperti rambut juga dapat dilihat [11]. Saat mengurangi area pengamatan probe untuk studi mendetail sel mikroba tunggal, topografi menunjukkan sedikit perbedaan dalam arah vertikal di antara permukaan seluler, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1d, dan gambar kesalahan defleksi tampaknya memberikan lebih banyak informasi morfologis sementara kebisingan lingkungan yang dikumpulkan terlalu banyak untuk menyelidiki ultrastruktur permukaan seluler (Gbr. 1e). Ketika sifat biomekanik simultan dari spesimen diukur selama kontak antara ujung dan objek yang diuji, ditemukan bahwa permukaan bakteri sebenarnya terdiri dari sejumlah besar makromolekul dengan bentuk dan ukuran tertentu, seperti yang diungkapkan oleh pemetaan kekuatan perekat ( Gambar. 1f); dengan demikian, resolusi morfologi pada gambar kesalahan topografi dan defleksi lebih ditingkatkan dengan informasi biomekanik.
Ultrastruktur permukaan E. koli MG1655 menggunakan pemetaan ganda AFM. a dan b adalah gambar kesalahan topografi dan defleksi, dan c merupakan gambaran detail defleksi sel bakteri dengan ekspresi flagela dan pili. Satu sel kemudian difokuskan, di mana d dan e adalah gambar kesalahan topografi dan defleksi, dan f adalah pemetaan adhesi yang sesuai. Bilah skala = 1 μm dalam a dan b , 500 nm dalam c , dan 200 nm dalam d –f
Pada Gambar. 2a, ekspresi flagela oleh E. koli MG1655 dapat dilihat dengan jelas, di mana ukuran filamen mirip dengan yang ada di Gambar 1b, dengan sifat adhesi yang relatif lebih rendah daripada substrat. Selain itu, permukaan bakteri ditemukan terdiri dari komponen melingkar yang dicirikan kurang perekat bila dibandingkan dengan matriks sekitarnya. Pengamatan ini mirip dengan temuan kami sebelumnya pada lapisan jaringan kulit tikus, dan butiran yang berulang dan sebanding dianggap sebagai makromolekul, yang strukturnya lebih padat dan konsisten daripada yang terlihat di wilayah antarmolekul sehingga perbedaan kinerja adhesi dapat mudah dirasakan [12]. Lapisan terluar dari selubung seluler pada bakteri Gram-negatif adalah lapisan protein rakitan sendiri, seperti yang diilustrasikan pada Gambar 2b, yang dikenal sebagai protein lapisan permukaan (lapisan S) [13]. Struktur lapisan-S secara tradisional diukur dengan mikroskop elektron sementara persyaratan lingkungan vakum dan lapisan konduktif kehilangan informasi asli dan waktu nyata tentang protein. Meskipun beberapa penelitian mengekstraksi protein lapisan-S dan memasangnya kembali ke substrat mika untuk pemindaian AFM, hasilnya kurang untuk kinerja in situ dan waktu nyata dari struktur lapisan-S [14, 15]. Berdasarkan arsitektur seluler dan beberapa gambar permukaan mikroba sebelumnya dengan mikroskop elektron, kami menganggap makromolekul yang diamati sebagai protein lapisan-S [16].
Ilustrasi struktur vertikal dan permukaan E. koli sel. a Makromolekul permukaan pada E. koli Sel MG1655 dicitrakan dengan pemetaan adhesi AFM. b Arsitektur molekuler selubung sel pada mikroba Gram negatif, yang terdiri dari membran sitoplasma, peptidoglikan, membran luar, dan S-layer. Bilah skala = 200 nm
Membandingkan pengukuran AFM dan mikroskop elektron transmisi (TEM), yang pertama memiliki beberapa keunggulan dibandingkan yang terakhir, seperti persiapan spesimen yang lebih sederhana, persyaratan eksperimental yang lebih sedikit, dan aplikasi pencitraan yang lebih ramah-biologis. Pemilihan TEM di bidang biologi umumnya dipilih karena kemampuannya untuk melihat organel antar sel dan pencitraan ultra-resolusi (biasanya nanometer atau sub-nanometer) yang dapat diperoleh. Pemetaan adhesi AFM dalam pekerjaan saat ini meningkatkan resolusi fitur dan menyajikan pengaturan makromolekul permukaan dengan cara yang tidak bergantung pada ukuran ujung, tetapi pada struktur intrinsik sampel itu sendiri. Selain itu, pendekatan ini memungkinkan resolusi skala nano dari permukaan mikroba di seluruh rentang area puluhan mikrometer persegi.
Perbedaan Manipulasi Genomik dalam Karakteristik Morfologi
Setelah mengamati ultrastruktur permukaan E. koli Sel MG1655, salah satu isu yang menarik adalah bagaimana makromolekul diatur dalam strain lain. Patogen manusia E. koli CFT073 dan RS218 dengan demikian diperiksa oleh AFM dengan parameter eksperimental yang sama, dan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam bentuk dan dimensi seluler antara ketiga genotipe ini pada ukuran fitur 10 μm, terlihat pada Gambar. 3a–c. Pemetaan gaya perekat digunakan untuk mengidentifikasi protein lapisan-S, dan struktur yang berbeda dengan berbagai bentuk dan ukuran terdeteksi di antara E. koli strain, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3d–f. Untuk memudahkan perbandingan, gambar pemetaan adhesi mendetail dari E. koli strain ditampilkan pada Gambar. 3g–i. Makromolekul permukaan dicirikan memiliki bentuk bulat pada sel MG1655 dan RS218, meskipun diameter molekulnya berbeda, yaitu 38 ± 1,1 nm (n = 80) untuk MG1655 dan 58 ± 2,7 nm (n = 46) untuk RS218. Di sisi lain, sel CFT073 memiliki bentuk unik dari protein lapisan-S, yang mirip ginjal dengan perbedaan panjang antara dua titik akhir 66 ± 3,2 nm (n = 44). Setelah menganalisis ukuran protein lapisan-S dari ketiga genotipe ini untuk beberapa perbandingan, hasilnya menunjukkan perbedaan yang signifikan antara galur ini (Gbr. 4).
Karakteristik morfologi E. koli genotipe. Baris atas menampilkan gambar kesalahan defleksi a MG1655, b CFT073, dan c RS218. Baris tengah menunjukkan topografi 3D yang diwarnai dengan pemetaan adhesi pada d MG1655, e CFT073, dan f sel RS218. Baris bawah adalah pemetaan adhesi mendetail pada g MG1655, h CFT073, dan i RS218. Dalam pemetaan adhesi, warna yang lebih gelap mengacu pada kinerja adhesi yang lebih sedikit dan sebaliknya. Bilah skala adalah 2 μm untuk a –c , 200 nm untuk h –f , dan 100 nm untuk g –i
Ukuran molekul E. koli genotipe. Diameter protein permukaan dideteksi oleh AFM dan diproses melalui ANOVA satu arah untuk beberapa perbandingan. ****p < 0.001 dan *p < 0,05
Lapisan-S mikroba dilaporkan memainkan peran penting dalam banyak fungsi, yang mengandung perlindungan sel dari lingkungan yang parah, serangan fagositosis, dan bakteri pemangsa. Selain itu, lapisan S juga berfungsi sebagai adhesin yang memungkinkan terjadinya kolonisasi yang efektif [17]. Struktur lapisan-S telah dipelajari dengan baik oleh TEM dan telah dikategorikan ke dalam berbagai jenis kisi dengan jarak antara pusat-ke-pusat dalam kisaran 4–35 nm [16]. Variasi antara hasil AFM kami dan laporan TEM dari literatur dianggap sebagai metodologi pencitraan yang berbeda, di mana TEM memberikan morfologi 2D struktur lapisan S dan AFM menangkap topografi 3D yang mencakup berbagai pengaruh yang disumbangkan oleh radian seluler dan kekasaran dan geometri probe AFM.
Berbagai jenis struktur lapisan-S pada awalnya dianggap mungkin untuk menggunakan berbagai karakteristik taksonominya untuk membedakan spesies bakteri, meskipun kemudian ditemukan bahwa bahkan untuk spesies tunggal, noda mikroba dapat memiliki kisi protein yang berbeda [13, 16, 18, 19]. Sementara beberapa penelitian menyelidiki peran lapisan-S dalam pembentukan filamen, jenis protein pada membran sel dan keragaman genomik dalam ukuran di antara E. koli genotipe, perbedaan protein lapisan-S jarang dicatat [20,21,22]. Hasil penelitian saat ini mengungkapkan perbedaan karakteristik morfologi antara E. koli MG1655, CFT073, dan RS218 dan menyarankan bahwa penampilan makromolekul permukaan mungkin spesifik untuk individu E. koli genotipe.
Kesimpulan
Dalam karya ini, informasi nanostruktur spesifik genom tentang permukaan bakteri dideteksi oleh pemetaan mekanis AFM, yang membedakan perbedaan perekat antara makromolekul dan matriks di sekitarnya. Makromolekul permukaan sel mikroba dianggap sebagai protein lapisan permukaan, menurut arsitektur molekul mikroba Gram-negatif. Susunan dan ukuran makromolekul tersebut ditemukan spesifik untuk E yang diuji. koli genotipe dengan bentuk dan ukuran yang berbeda, dengan perbedaan ini terbukti signifikan dengan analisis statistik. Sebagai kesimpulan, kami menganggap struktur lapisan-S bakteri bergantung pada genom dan dapat menjadi metode potensial untuk diagnosis cepat penyakit terkait mikroba atau galur mikroba. Untuk mengimplementasikan aplikasi praktis karakteristik lapisan-S, diperlukan pemeriksaan lebih banyak genotipe bakteri untuk katalog pelengkap. Kami sedang membangun database yang menghubungkan karakteristik morfologi bakteri dan kinerja fisiologis/patologis dan percaya bahwa ini akan menjadi kemajuan yang menjanjikan untuk aplikasi praktis pemeriksaan AFM.
