Mengungkap Makromolekul Khusus Genotipe E. coli dengan Pemetaan Mekanik AFM
Abstrak
Kategorisasi strain mikroba secara konvensional berdasarkan metode molekuler, dan jarang sekali karakteristik morfologis dalam strain bakteri yang diteliti. Dalam penelitian ini, kami mengungkap struktur makromolekul permukaan bakteri melalui pemetaan mekanik AFM, yang resolusinya tidak hanya ditentukan oleh ukuran tip skala nano tetapi juga properti mekanis spesimen. Teknik ini memungkinkan studi skala nano dari struktur membran strain mikroba dengan persiapan spesimen yang sederhana dan lingkungan kerja yang fleksibel, yang mengatasi keterbatasan banyak mikroskopi elektron dan metode analisis biokimia yang memerlukan label. Makromolekul karakteristik yang terletak di antara permukaan seluler dianggap sebagai protein lapisan permukaan dan ditemukan spesifik untuk genotipe Escherichia coli, dari mana ukuran molekular rata-rata dikarakterisikan dengan diameter yang bervariasi dari 38 hingga 66 nm, dan bentuk molekuler mirip ginjal atau bulat. Dalam kesimpulan, struktur makromolekul permukaan memiliki karakteristik unik yang terkait dengan genotipe E. coli, yang menunjukkan bahwa efek genom pada morfologi seluler dapat dengan cepat diidentifikasi menggunakan pemetaan mekanik AFM.
Kuantifikasi makromolekul permukaan sel E. coli menggunakan pemetaan mekanik AFM. Makromolekul permukaan permukaan sel dari tiga genotipe E. coli, MG1655, CFT073, dan RS218, dikarakterisikan dengan ukuran yang bervariasi dari 38 hingga 66 nm dan dengan bentuk bulat atau mirip ginjal. Gambar topografi diwarnai dengan pemetaan adhesi dengan skala bar = 200 nm.
Latar Belakang
Karena resolusi yang rendah dari mikroskopi optik dan lingkungan kerja yang terbatas dari mikroskopi elektron, peneliti di bidang mikroba jarang mempertimbangkan penggunaan penampilan sel bakteri tetapi justru mengadopsi metode analisis molekuler atau kimiawi untuk identifikasi fragmen genom, ekspresi protein, dll. Tidak mengherankan, metode-metode ini memiliki sejumlah kekurangan, termasuk memerlukan banyak tenaga dan waktu, sehingga pendekatan yang lebih langsung, efisien, dan fleksibel diperlukan. Ditemukan pada 1982 oleh Binnig et al., mikroskop gaya atom (AFM) dirancang untuk menggunakan probe skala nano yang dipantau oleh sinar laser untuk pengamatan permukaan spesimen dengan resolusi nanoskopik atau bahkan atomik. Pengcitraan morfologi melalui tip probe fisik, teknik ini mengatasi batas resolusi dan keterbatasan lingkungan dari baik mikroskopi optik maupun elektron dan memiliki sejumlah keuntungan, seperti persiapan spesimen yang sederhana dan lingkungan kerja yang fleksibel dalam kondisi udara atau fluida sekitar. Namun, dengan studi mikroba, aplikasi AFM saat ini terutama melibatkan pengcitraan kualitatif morfologi statis atau dinamis sel bakteri atau ekspresi flagella dan pili, sementara sedikit penelitian yang berfokus pada struktur ultra permukaan sel mikroba dan analisis kuantitatif properti seluler.
Dalam penelitian ini, AFM dipilih untuk studi permukaan sel Escherichia coli (E. coli), dan bentuk serta dimensi bakteri individual diamati melalui gambar topografi dan fase AFM. Selanjutnya, pemetaan mekanik simultan ditemukan untuk mengungkap informasi biomekanis tambahan tentang komponen permukaan, di mana perbedaan kecil dalam karakteristik adesi antara makromolekul dan matriks sekitar dapat terdeteksi selama setiap kontak fisik antara tip dan sampel. Menerapkan teknik canggih ini ke bidang mikroba, kami telah memeriksa tiga genotipe E. coli yang berisi satu strain laboratorium dan dua strain patogen manusia untuk identifikasi makromolekul permukaan. Hasil menunjukkan bahwa teknik ini dapat menawarkan resolusi gambar yang melebihi skala tip AFM dengan merasakan distribusi mekanis spesimen. Dalam kesimpulan, kami menyarankan bahwa perkembangan seperti ini dalam ilmu permukaan tidak hanya akan memberikan detail penampilan seluler bagi peneliti yang bekerja di bidang mikroba tetapi juga akan berkontribusi pada pengetahuan kami tentang karakteristik permukaan sistem bio- atau nanomaterial lainnya.
Metode
Sampel Mikroba
Tiga strain E. coli yang diuji dalam penelitian ini diisolasi secara klinis dan disediakan oleh Laboratorium Prof. Ching-Hao Teng di Institut Kedokteran Molekuler, Universitas Nasional Cheng Kung. MG1655 adalah strain laboratorium tipe liar dan usus dari E. coli K-12, dan dua strain lainnya adalah patogen manusia—CFT073, penyebab utama infeksi saluran kemih, dan RS218, yang terkait dengan meningitis neonatus pada bayi.
Substrat yang Difungsikan
Dua langkah modifikasi permukaan diterapkan untuk ikatan kovalen antara permukaan padat dan sel mikroba. Pertama, larutan 3-aminopropiltrietoksisilan (APTES, Sigma-Aldrich Co. LLC, USA) digunakan untuk membentuk lapisan awal yang difungsikan NH₂ pada permukaan, di mana lapisan APTES yang stabil berkontribusi pada ikatan Si-O yang stabil—Si yang disediakan oleh APTES dan O dari permukaan yang dioksidasi. Memiliki dua fungsi COOH, glutaraldehida terikat dengan fungsi NH₂ dari APTES dengan satu COOH dan bekerja dengan NH₂ pada permukaan bakteri dengan COOH lainnya.
Substrat yang bersih direndam dalam larutan APTES, dengan campuran 5% APTES dalam etanol, selama satu jam dan dicuci dengan etanol dan air ddH₂. Slid dikeringkan dengan aliran nitrogen dan kemudian ditempatkan dalam larutan glutaraldehida, 2% dalam PBS, selama malam hari, dan dicuci dengan PBS.
Persiapan Sampel
Koloni tunggal dari strain E. coli dipilih dari plat agar LB dan diinkubasi dalam kaldu LB. Setelah waktu budidaya 12 jam, larutan bakteri kemudian dicairkan 1:100 dalam kaldu LB segar yang telah disejajarkan. Setelah 12 jam lagi untuk budidaya mikroba, larutan bakteri diisolasikan melalui sentrifugasi pada 1500×g (4000 rpm) selama 3 menit dan didispersikan kembali dalam kaldu LB, dengan proses ini diulang dua kali. Dua ratus mikroliter larutan bakteri dijatuhkan pada substrat yang difungsikan dan dibiarkan diam selama 30 menit. Specimen kemudian direndam dalam air destilasi dua kali untuk menghilangkan sel yang tidak tertancap dan segera diimajing dengan AFM di udara sekitar.
Karakterisasi AFM
Instrumen AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) dan probe silikon nitrida dengan konstanta pegas yang dikalkulasi 0,7 N/m dan radius tip 10 nm dipilih untuk pemeriksaan permukaan spesimen mikroba. Laju pemindaian AFM dan piksel baris adalah 0,5 Hz dan 256 baris, masing-masing, untuk ukuran pemindaian 10 µm untuk deteksi topografi pertama, dan parameter kemudian diatur sebagai 0,3 Hz dan 512 baris untuk ukuran pemindaian 2 µm untuk observasi detail. Mode PeakForce quantitative nanomechanical (QNM) digunakan untuk pemetaan mekanik nano, di mana properti adesi permukaan dihitung dari gaya tarik maksimum di antara kurva gaya-jarak penarikan.
Studi kami sebelumnya tentang Streptococcus mutans menunjukkan evolusi mekanis pada permukaan bakteri selama 2 jam, dipantau melalui pemetaan mekanik AFM berkelanjutan, dan sampel mikroba diverifikasi tetap hidup selama durasi tersebut. Untuk memastikan keberadaan sampel E. coli yang digunakan dalam karya ini, studi pra pada sampel bakteri dilakukan, dan perubahan berkelanjutan dalam adesi permukaan selama 4 jam mengimplikasikan sel tetap hidup setidaknya 4 jam setelah persiapan spesimen (ditunjukkan dalam File Tambahan 1). Akibatnya, sampel mikroba yang diuji dalam karya ini diukur oleh AFM dalam waktu 2 jam setelah persiapan spesimen. Semua genotipe E. coli dibudidayakan secara terpisah dan pada waktu yang berbeda, dan pengukuran AFM dilakukan segera setelah persiapan spesimen. Dengan kata lain, sampel bakteri tidak ditunggu-tunggu untuk pemeriksaan, sehingga efek waktu penahanan pada perbedaan antara strain E. coli diminimalkan. Data kuantitatif untuk setiap strain E. coli dikumpulkan dari pengukuran yang dilakukan dalam waktu 2 jam dalam studi ini.
Analisis Statistik
Prism (GraphPad Software, USA) digunakan untuk analisis statistik dalam karya ini. Panjang sel dan ukuran makromolekul disajikan sebagai nilai rata-rata beserta standar error rata-rata (SEM). Perbandingan multipe antara genotipe E. coli diproses menggunakan analisis variansi satu arah (ANOVA) biasa. Tingkat kepercayaan 95% (p < 0,05) dipilih, dan bintang menunjukkan tingkat perbedaan yang signifikan yang ditemukan. Jumlah sampel n dari setiap strain adalah > 40.
Hasil dan Diskusi
Struktur Ultra Permukaan melalui Pemetaan Berganda
Saat memindai dengan AFM pada skala observasi 10 µm pada sampel bakteri, beberapa sel E. coli MG1655 tunggal dapat terlihat, dan bentuk sel dalam tiga dimensi dapat diamati dari gambar topografi (Gambar 1a); garis tepis yang jelas dari sel dalam dua dimensi diperoleh dari gambar error defleksi (Gambar 1b), dan beberapa tubulusselain sel bakteri dapat ditemukan. Filamen gelombang (Gambar 1c) sesuai dengan penampilan flagella mikroba yang dilaporkan dalam karya lain, yang mengonfirmasi temuan tersebut sebagai flagella, dan pili yang lebih pendek dan seperti rambut juga dapat terlihat. Saat mengurangi area observasi probe untuk studi detail sel mikroba tunggal, topografi menunjukkan perbedaan kecil dalam arah vertikal di antara permukaan sel, seperti ditunjukkan dalam Gambar 1d, dan gambar error defleksi sepertinya memberikan informasi morfologis lebih banyak sementara kebisingan lingkungan yang dikumpulkan terlalu banyak untuk menyelidiki struktur ultra permukaan sel (Gambar 1e). Ketika properti biomekanis simultan dari spesimen diukur selama kontak antara tip dan objek yang diuji, ditemukan bahwa permukaan bakteri sebenarnya terdiri dari sejumlah besar makromolekul dengan bentuk dan ukuran spesifik, seperti yang diungkapkan oleh pemetaan gaya adesi (Gambar 1f); oleh karena itu, resolusi morfologis dalam gambar topografi dan error defleksi ditingkatkan lebih lanjut dengan informasi biomekanis.
Struktur ultra permukaan E. coli MG1655 menggunakan pemetaan berganda AFM. a dan b adalah gambar topografi dan error defleksi, dan c adalah gambar error defleksi detail dari sel bakteri dengan ekspresi flagella dan pili. Sel tunggal kemudian difokuskan, di mana d dan e adalah gambar topografi dan error defleksi, dan f adalah pemetaan adesi yang sesuai. Skala bar = 1 µm dalam a dan b, 500 nm dalam c, dan 200 nm dalam d–f
Dalam Gambar 2a, ekspresi flagella oleh E. coli MG1655 dapat terlihat dengan jelas, di mana ukuran filamen serupa dengan yang ada dalam Gambar 1b, dengan properti adesi yang relatif lebih rendah daripada substrat. Selain itu, permukaan bakteri ditemukan terdiri dari komponen bulat yang dikarakterisikan sebagai kurang adesif dibandingkan dengan matriks sekitar. Pengamatan ini mirip dengan temuan kami sebelumnya pada lapisan jaringan kulit tikus, dan butiran yang berulang dan serupa dianggap sebagai makromolekul, di mana strukturnya lebih padat dan konsisten dibandingkan yang ada di wilayah antar-molekul sehingga perbedaan dalam performa adesi dapat dengan mudah dirasakan. Lapisan terluar dari amplop seluler dalam bakteri Gram-negatif adalah lapisan protein yang berasembli sendiri, seperti diilustrasikan dalam Gambar 2b, yang dikenal sebagai protein lapisan permukaan (S-layer). Struktur S-layer tradisional diukur oleh mikroskopi elektron sementara persyaratan lingkungan vakum dan pelapisan konduktif kehilangan informasi asli dan real-time tentang protein. Meskipun beberapa penelitian mengekstrak protein S-layer dan merakitnya kembali pada substrat mica untuk pemindaian AFM, hasilnya kurang dalam performa in situ dan real-time dari struktur S-layer. Berdasarkan arsitektur seluler dan beberapa gambar sebelumnya dari permukaan mikroba oleh mikroskopi elektron, kami menganggap makromolekul yang diamati sebagai protein S-layer.
Ilustrasi struktur vertikal dan permukaan sel E. coli. a Makromolekul permukaan pada sel E. coli MG1655 diimajing oleh pemetaan adesi AFM. b Arsitektur molekular amplop sel dalam mikroba Gram-negatif, yang terdiri dari membran sitoplasma, peptidoglikan, membran luar, dan S-layer. Skala bar = 200 nm
Membandingkan pengukuran AFM dan mikroskopi elektron transmisi (TEM), yang pertama memiliki beberapa keuntungan atas yang terakhir, seperti persiapan spesimen yang lebih sederhana, persyaratan eksperimental yang lebih terbatas, dan aplikasi citra yang lebih ramah biologi. Pemilihan TEM di bidang biologi umumnya dipilih karena kemampuannya untuk melihat organel antar-sel dan citra resolusi ultra (biasanya nanometer atau sub-nanometer) yang dapat diperoleh. Pemetaan adesi AFM dalam karya ini meningkatkan resolusi fitur dan menyajikan pengaturan makromolekul permukaan dengan cara yang tidak tergantung pada ukuran tip, melainkan pada struktur intrinsik dari sampel itu sendiri. Selain itu, pendekatan ini memungkinkan resolusi skala nano dari permukaan mikroba di seluruh area persegi meter puluhan mikrometer.
Perbedaan Karakteristik Morfologis yang Dikaitkan dengan Genom
Setelah mengamati struktur ultra permukaan sel E. coli MG1655, satu hal yang menarik adalah bagaimana makromolekul diatur dalam strain lain. Patogen manusia E. coli CFT073 dan RS218 kemudian diperiksa dengan AFM dengan parameter eksperimental yang sama, dan tidak ada perbedaan signifikan dalam bentuk dan dimensi sel di antara ketiga genotipe ini pada ukuran fitur 10 µm, terlihat dalam Gambar 3a–c. Pemetaan gaya adesi digunakan untuk mengidentifikasi protein S-layer, dan struktur yang berbeda dengan berbagai bentuk dan ukuran terdeteksi di antara strain E. coli yang berbeda, seperti ditunjukkan dalam Gambar 3d–f. Untuk kemudahan perbandingan, gambar pemetaan adesi detail dari strain E. coli ditampilkan dalam Gambar 3g–i. Makromolekul permukaan dikarakterisikan sebagai memiliki bentuk bulat pada sel MG1655 dan RS218, meskipun diameter molekular yang berbeda, yaitu 38 ± 1,1 nm (n = 80) untuk MG1655 dan 58 ± 2,7 nm (n = 46) untuk RS218. Di sisi lain, sel CFT073 memiliki bentuk unik protein S-layer, yaitu mirip ginjal dengan perbedaan panjang antara dua titik ujung sebesar 66 ± 3,2 nm (n = 44). Setelah menganalisis ukuran protein S-layer dari ketiga genotipe ini untuk perbandingan multipe, hasil menunjukkan perbedaan yang signifikan di antara strain ini (Gambar 4).
Karakteristik morfologis genotipe E. coli. Baris atas menampilkan gambar error defleksi dari a MG1655, b CFT073, dan c RS218. Baris tengah menunjukkan topografi 3D yang diwarnai dengan pemetaan adesi pada d MG1655, e CFT073, dan f sel RS218. Baris bawah adalah pemetaan adesi detail pada g MG1655, h CFT073, dan i RS218. Dalam pemetaan adesi, warna yang lebih gelap merujuk pada performa adesi yang lebih rendah dan sebaliknya. Skala bar adalah 2 µm untuk a–c, 200 nm untuk d–f, dan 100 nm untuk g–i
Ukuran molekular genotipe E. coli. Diameter protein permukaan terdeteksi oleh AFM dan diproses melalui one-way ANOVA untuk perbandingan multipe. ****p < 0,001 dan *p < 0,05
S-layers mikroba dilaporkan memainkan peran penting dalam banyak fungsi, yang melindungi sel dari lingkungan yang parah, serangan fagositosis, dan bakteri predator. Selain itu, S-layers juga berfungsi sebagai adesin yang memungkinkan kolonisasi yang efektif. Struktur S-layer telah dipelajari dengan baik oleh TEM dan dikategorikan ke dalam berbagai jenis jaringan dengan jarak antara pusat-ke-pusat dalam rentang 4–35 nm. Variasi antara hasil AFM kami dan laporan TEM dari literatur dianggap sebagai metodologi pengcitraan yang berbeda, di mana TEM memberikan morfologi 2D dari struktur S-layer dan AFM menangkap topografi 3D yang mencakup pengaruh multiple yang disumbangkan oleh radian sel, kekasaran, dan geometri probe AFM.
Jenis struktur S-layer yang berbeda awalnya dianggap dapat digunakan untuk membedakan antara spesies bakteri berdasarkan karakteristik taksonomi yang berbeda, meskipun kemudian ditemukan bahwa bahkan untuk spesies tunggal, strain mikroba dapat memiliki jaringan protein yang berbeda. Meskipun beberapa penelitian menyelidiki peran S-layer dalam pembentukan filamen, jenis protein pada membran sel, dan diversitas genom dalam ukuran di antara genotipe E. coli, perbedaan dalam protein S-layer jarang diperhatikan. Hasil studi saat ini mengungkapkan perbedaan dalam karakteristik morfologis di antara E. coli MG1655, CFT073, dan RS218 dan menunjukkan bahwa penampilan makromolekul permukaan mungkin spesifik untuk genotipe E. coli individual.
Kesimpulan
Dalam karya ini, informasi struktural nano spesifik genom tentang permukaan bakteri terdeteksi oleh pemetaan mekanik AFM, yang membedakan perbedaan adesi antara makromolekul dan matriks sekitar. Makromolekul permukaan sel mikroba dianggap sebagai protein lapisan permukaan, sesuai dengan arsitektur molekular mikroba Gram-negatif. Pengaturan dan ukuran makromolekul tersebut ditemukan spesifik untuk genotipe E. coli yang diuji dengan bentuk dan ukuran yang berbeda, dengan perbedaan ini terbukti signifikan oleh analisis statistik. Dalam kesimpulan, kami menganggap struktur S-layer bakteri bergantung pada genom dan dapat menjadi metode potensial untuk diagnosis cepat penyakit yang terkait mikroba atau strain mikroba. Untuk menerapkan aplikasi praktis dari karakteristik S-layer, diperlukan pemeriksaan pada lebih banyak genotipe bakteri untuk katalog yang lengkap. Kami saat ini mendirikan database yang menghubungkan karakteristik morfologis bakteri dan kinerja fisiologis/patologis dan menganggap itu akan menjadi kemajuan yang menjanjikan untuk aplikasi praktis pemeriksaan AFM.
