Nanopartikel Gd₂O₃ Fungsional Asam Hialuronik: Peningkatan Radioterapi Terpandu MRI untuk Tumor

Abstrak

Lokasi yang tidak akurat dan radioresistensi intrinsik tumor padat secara serius menghambat implementasi klinis radioterapi. Dalam studi ini, kami membuat nanopartikel oksida gadolinium fungsional asam hialuronik (HA-Gd₂O₃ NPs) melalui proses hidrotermal satu panci untuk citra magnetik resonansi (MR) yang efektif dan radiosensitisasi tumor. Berkat fungsionalisasi HA, HA-Gd₂O₃ NPs yang disiapkan dengan diameter 105 nm menunjukkan dispersibilitas yang baik dalam air, sitotoksisitas rendah, dan biokompatibilitas yang excellent serta mudah masuk ke sitoplasma sel kanker melalui endositosis reseptor HA. Pentingnya, HA-Gd₂O₃ NPs menunjukkan relaksivitas longitudinal (r₁) yang tinggi 6,0 mM⁻¹S⁻¹ sebagai agen kontras MRI dan peningkatan radiosensitisasi dengan cara yang bergantung pada dosis. Temuan ini menunjukkan bahwa HA-Gd₂O₃ NPs yang disintesis sebagai agen teranostik bifungsi memiliki potensi besar dalam diagnosis dan radioterapi tumor.

Pendahuluan

Radioterapi telah diterapkan secara luas pada kanker, yang melibatkan sinar X energi tinggi dan penyetoran dosis radiasi pada situs tumor dengan menyebabkan kerusakan radikal bebas atau kerusakan DNA [1,2,3,4]. Namun, sensitivitas radiasi yang rendah, ketidakakuratan lokasi tumor dan diskriminasi yang buruk di antara lesi dan jaringan normal yang menyebabkan efek samping radiasi membatasi implementasi klinis radioterapi [5]. Oleh karena itu, penting untuk mengembangkan metode untuk meningkatkan sensitivitas radiasi tumor sambil meminimalkan efek samping sistemik. Kombinasi nanoteknologi dan radioterapi adalah prioritas yang sudah terbentuk untuk radiosensitisasi.

Dalam beberapa tahun terakhir, nanoteknologi dianggap sebagai strategi yang menarik untuk diagnosis dan terapi kanker [6,7,8,9,10,11]. Salah satu fungsi utama nanopartikel (NP) adalah penargetan tumor yang akurat berdasarkan akuisensi selektif NP pada jaringan tumor melalui penargetan pasif, efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR), penargetan aktif, dan waktu sirkulasi yang panjang [12,13,14]. Kerja kami sebelumnya menunjukkan bahwa doping NP karbon dengan heteroatom secara efektif menyesuaikan properti intrinsik mereka dan memperkenalkan fitur bermanfaat [15,16,17]. Menariknya, NP dapat digunakan sebagai radiosensitizer [18]. NP logam berat (dengan elemen Z tinggi) (misalnya, Au, Bi, Gd) sebagai radiosensitizer yang menjanjikan dapat digunakan dalam terapi radiosensitisasi karena penangkap sinar X photon yang tinggi dan efek pencaran Kompton [19]. ketika siner X berinteraksi dengan NP logam berat tinggi, elektron Auger dan fotoelektron, pelepasan elektron sekunder melukai sel kanker, menyediakan peningkatan dosis selama radioterapi [20]. Sampai saat ini, NP berbasis gadolinium (GdNPs) terbukti efektif sebagai agen kontras (CA) MRI [21, 22] dan membedakan jaringan normal dari jaringan sakit dan lesi secara non-invasif dan secara real-time. Agen ini mempersingkat waktu relaksasi longitudinal untuk mempengaruhi relaksivitas longitudinal r₁ [23], dan penargetan yang tidak akurat sering mengakibatkan efek samping. Diketahui bahwa asam hialuronik (HA) adalah ligan utama dan pengiriman obat ke situs target dengan reseptor HA seperti klaster determinan 44 (CD44) [24,25,26].

Berdasarkan hasil studi sebelumnya, kami menggunakan HA sebagai ligan penarget untuk fungsionalisasi NP Gd₂O₃ dengan fungsi ganda: agen kontras MRI yang efektif untuk penargetan tumor dan radiosensitizer untuk mengatasi radioresistensi inheren dan ketidakakuratan lokasi tumor. Selain itu, NP HA-Gd₂O₃ menampilkan relaksivitas longitudinal (r₁) yang tinggi sebagai agen citra MR yang menjanjikan dengan kualitas citra MR yang lebih baik. Dibandingkan dengan CA yang tersedia saat ini [27, 28], NP HA-Gd₂O₃ yang dihasilkan menunjukkan tiga keuntungan signifikan: pertama, NP HA-Gd₂O₃ menunjukkan biokompatibilitas yang baik karena menggunakan matriks ekstraselular alami sebagai prekursor. Kedua, fungsionalisasi HA secara signifikan meningkatkan penargetan tumor dan mengurangi efek samping. Akhirnya, NP HA-Gd₂O₃ memiliki kemampuan bifungsi dalam diagnosis dan terapi. Untuk memverifikasi efektivitas dan mengeksplorasi mekanisme peningkatan radiosensitisasi, kami mengevaluasi efek radiosensitisasi NP HA-Gd₂O₃ pada kelangsungan sel tumor, siklus sel, dan apoptosis.

Hasil dan Pembahasan

Persiapan dan Karakterisasi NP HA-Gd₂O₃

Dalam studi ini, NP HA-Gd₂O₃ berhasil disiapkan menggunakan proses hidrotermal sederhana seperti ditunjukkan dalam Skema 1. Ukuran partikel dianalisis oleh pencaran cahaya dinamis, sementara pemeriksaan morfologi dilakukan oleh mikroskop elektron transmisi. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 1a, NP HA-Gd₂O₃ menunjukkan dispersi seragam dan bentuk quasi-sferik diskrit tanpa agregasi yang jelas. Diameter rata-rata NP HA-Gd₂O₃ adalah 105 nm. Dibandingkan dengan jaringan normal, permeabilitas endotel kapiler pada jaringan tumor meningkat dan rongga endotel adalah 100–600 nm [29]. Oleh karena itu, NP dengan ukuran yang diinginkan dengan mudah tercelup ke jaringan tumor, dan mereka mungkin meningkatkan secara dramatis efisiensi pengiriman obat penargetan pasif.

Nanopartikel Gd₂O₃ Fungsional Asam Hialuronik: Peningkatan Radioterapi Terpandu MRI untuk Tumor

Struktur fase NP HA-Gd₂O₃ diteliti menggunakan XRD dengan bubuk oksida grafit (GO) sebagai kontrol. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 1d, satu puncak difraksi utama (2θ = 12,04°) dan dua puncak kecil (2θ = 29,6°, 42,1°) diamati dalam pola difraksi NP HA-Gd₂O₃, yang sesuai dengan puncak karakteristik GO (bidang 100) dan grafit (bidang 002), masing-masing. Jarak jaring utama NP HA-Gd₂O₃ menunjukkan jarak yang lebih kecil (0,73 nm yang dihitung dengan rumus Bragg) dibandingkan jarak GO d₀₀₁ = 0,85 nm, di mana perpindahan naik pada posisi puncak dapat diatribusikan pada penurunan jarak di antara lapisan sp³. Semua puncak difraksi lebar menunjukkan bahwa NP HA-Gd₂O₃ memiliki struktur amorf, yang dapat diatribusikan pada karbon yang sangat tidak teratur dan penurunan jarak lapisan sp² (C–C) selama proses karbonisasi. Hasil ini lebih menunjukkan bahwa NP HA-Gd₂O₃ dengan sifat kristal yang buruk memiliki struktur multilayer heterogen, yang konsisten dengan laporan kami sebelumnya tentang titik karbon [30, 31].

Struktur Kimia dan Komposisi Permukaan NP HA-Gd₂O₃

Grup fungsional permukaan dan komposisi NP HA-Gd₂O₃ diteliti menggunakan spektroskopi inframerah transformasi Fourier dan spektroskopi fotoelektron sinar-X. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2a, spektra XPS menunjukkan empat puncak tipikal pada 284,0, 400,0, 530,6, dan 1188,5 eV, yang menunjukkan bahwa NP HA-Gd₂O₃ terutama terdiri dari elemen gadolinium, karbon, oksigen, dan hidrogen. Spektra resolusi tinggi Gd_3d (Gambar 2b) mengungkapkan keberadaan dua puncak kuat pada 1187,5 eV dan 1221 eV, yang sesuai dengan pembagian spin-orbit sebesar 32 eV, yang masing-masing sesuai dengan level energi 3d_5/2 dan 3d_3/2 dari Gd. Pengamatan ini dalam kesepakatan yang baik dengan laporan sebelumnya tentang NP HA-Gd₂O₃. Spektra O (1s) yang ditunjukkan dalam Gambar 2c didominasi oleh satu puncak utama yang terletak pada 531,4 eV, yang sesuai dengan ikatan antara O²⁻ dan Gd³⁺. Spektroskopi FITR dilakukan untuk sampel NP HA-Gd₂O₃ telanjang dan yang di-HA (Gambar 2d). Untuk sampel telanjang, seperti ditunjukkan dalam Gambar 2a, pita serapan karakteristik v_as O–C–O pada 1580 dan 1380 cm⁻¹ mengungkapkan keberadaan grup karbonat. Pita lebar pada 3340 dan 2900 cm⁻¹ diatribusikan pada getaran peregangan O–H dan C–H, masing-masing, yang sesuai dengan air yang terserap pada permukaan. Untuk NP HA-Gd₂O₃, getaran peregangan COO⁻ pada 1580 dan 1380 cm⁻¹ ditingkatkan, menunjukkan perkenalan grup karboksil asam hialuronik. Hasil ini mengungkapkan bahwa grup fungsional NP HA-Gd₂O₃ terutama terdiri dari sejumlah besar grup karbonil, karbonilat, dan hidroksil. Kehadiran grup fungsional ini yang terletak pada permukaan memberikan NP HA-Gd₂O₃ dengan dispersibilitas yang baik dalam air. Pentingnya, ion Gd yang tersemat di permukaan NP mungkin berguna untuk citra MR dan radiosensitisasi, yang secara dramatis mencegah ion Gd bocor ke lingkungan sekitar.

Biokompatibilitas NP HA-Gd₂O₃

Biokompatibilitas NP HA-Gd₂O₃, sebagai agen biomedik potensial, sangat penting untuk aplikasi biomediknya. Pertama, sitotoksisitas inheren NP HA-Gd₂O₃ dievaluasi pada sel HepG2 dan VSMC menggunakan uji CCK-8. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 3a dan S. Gambar 1, NP HA-Gd₂O₃ tidak menunjukkan sitotoksisitas yang jelas hingga 3 hari. Bahkan pada konsentrasi 200 μg/mL setelah waktu paparan 24 jam, kelangsungan sel sekitar 90%. Kedua, hemokompatibilitas NP HA-Gd₂O₃ in vivo diestimasi menggunakan uji hemolisis. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 3b, kami mengamati hemolisis sel darah merah dalam air (kontrol positif). Sebaliknya, tidak ada hemolisis yang jelas yang diamati setelah inkubasi NP HA-Gd₂O₃ pada konsentrasi yang berbeda dari 0 hingga 200 μg/mL selama 2 jam, yang serupa dengan hasil untuk larutan PBS (kontrol negatif). Dibandingkan dengan kontrol negatif, persentase hemolisis pada konsentrasi berbeda NP HA-Gd₂O₃ sedikit dievaluasi berdasarkan penyerapan sobrenatan pada 541 nm. Hasil menunjukkan bahwa persentase hemolisis NP HA-Gd₂O₃ semua kurang dari 3% dalam konsentersi yang dipelajari, memverifikasi hemokompatibilitas yang baik. Untuk memeriksa toksisitas potensial, NP HA-Gd₂O₃ disuntik secara intravenus ke tikus Balb/c (seperti terlihat dalam S. Gambar 2). Setelah 1 minggu, tikus ini dibunuh, dan kandung kemih, ginjal, dan limpa diambil untuk analisis patologis. Seperti ditunjukkan dalam S. Gambar 2, hasil analisis patologis menunjukkan bahwa tidak ada lesi atau respons inflamasi yang terlihat pada organ tikus yang diobati NP HA-Gd₂O₃. Hasil ini secara jelas menunjukkan bahwa NP HA-Gd₂O₃ yang disintesis memiliki sitokompatibilitas yang baik dan hemokompatibilitas yang baik.

Studi Fanto MRI

Waktu relaksasi longitudinal (T₁) NP HA-Gd₂O₃ diteliti in vitro bersama dengan kontras komersial Magnevist (Gd-DTPA) sebagai kontrol menggunakan larutan penyeimbang fosfat (pH = 7,4, 0,2 M). Dengan peningkatan konsentrasi Gd, intensitas sinyal citra fanto T₁-berbobot secara jelas meningkat, yang menunjukkan bahwa semua sampel dapat menghasilkan peningkatan kontras MRI pada urutan T₁-berbobot (Gambar 4a). Selain itu, plot intensitas sinyal versus waktu inversi memberikan waktu relaksasi T₁ dari setiap agen kontras pada konsentrasi tertentu. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 4b, nilai r₁ NP HA-Gd₂O₃ diukur sebesar 6,0 mM⁻¹S⁻¹, yang secara signifikan lebih tinggi dari Magnevist (3,86 mM⁻¹S⁻¹) dalam kondisi yang sama. Peningkatan r₁ dapat diatribusikan pada radius hidrodinamis yang jauh lebih besar dan luas permukaan NP HA-Gd₂O₃; oleh karena itu, lebih banyak atom Gd yang tersemat dalam jaring NP menjadi dapat diakses oleh molekul air, mempersingkat relaksasi longitudinal dan meningkatkan nilai r₁.

Citra MR In Vivo

Untuk menentukan potensi aplikasi in vivo, performa citra MR dan nasib sirkulasi NP HA-Gd₂O₃ (10 mg/kg) diteliti menggunakan scanner MR dengan tikus BALB/c normal sebagai model. Dibandingkan dengan citra sebelum suntikan (Gambar 4c), wilayah yang lebih terang di ginjal dan kandung kemih yang ditunjukkan dengan lingkaran putus-putus dengan jelas diamati 10 menit setelah suntikan, menunjukkan bahwa NP HA-Gd₂O₃ dapat digunakan sebagai CA untuk meningkatkan relaksasi T₁ pada organ-organ utama ini in vivo. Pentingnya, peningkatan kontras NP HA-Gd₂O₃ dipertahankan hingga 60 menit setelah suntikan, yang jauh lebih lama dari kompleks Gd molekul kecil (umur setengah sekitar beberapa menit pada hewan kecil) [27], menunjukkan bahwa NP HA-Gd₂O₃ memiliki waktu retensi yang lebih lama in vivo dibandingkan kontras komersial. Untuk menganalisis efek kontras MR secara kuantitatif, kami menghitung rasio sinyal ke derau (SNR) dengan menganalisis dengan baik wilayah minat dari citra MRI dan menghitung nilai SNR_post/SNR_pre untuk mewakili peningkatan sinyal relatif (RSE) (Gambar 4d). Nilai RSE NP HA-Gd₂O₃ di ginjal adalah 1,35, 1,99, dan 1,86. Sebaliknya, nilai RSE NP HA-Gd₂O₃ di kandung kemih lebih tinggi dari pada ginjal (1,29, 3,59, dan 2,26). NP HA-Gd₂O₃ dengan ukuran besar (lebih dari 100 nm) menampilkan waktu sirkulasi yang panjang, kemudian mungkin dieliminasi melalui jalan saluran empedu-usus sesuai hasil sebelumnya [32]. Selain itu, waktu sirkulasi yang panjang in vivo mungkin meningkatkan penargetan pasif pada tumor dengan meningkatkan efek EPR.

Citra Tumor

NP HA-Gd₂O₃ dengan performa citra MR yang excellent dan waktu sirkulasi yang panjang memberikan kesempatan yang besar untuk citra tumor melalui efek EPR. Kami demikian mendirikan model tumor hati subkutan untuk menyelidiki apakah karsinoma sel hepatoseluler (HCC) dapat terdeteksi oleh citra MR yang ditingkatkan NP HA-Gd₂O₃. Setelah suntikan intravenus NP HA-Gd₂O₃, kami mengamati bahwa wilayah tumor subkutan menjadi lebih terang dari jaringan sekitar seperti terlihat baik pada pemindaian koronal maupun lintang. RES tumor subkutan secara dramatis mencapai 1,54 dan 1,83 dengan pemindaian lintang dan koronal, masing-masing, yang menunjukkan akuisisi efektif NP HA-Gd₂O₃ di wilayah tumor melalui efek EPR. Temuan ini menunjukkan bahwa NP HA-Gd₂O₃ sangat sensitif untuk visualisasi MRI tumor. Banyak studi menunjukkan bahwa waktu sirkulasi yang panjang dapat meningkatkan efisiensi penargetan pasif melalui vaskularisasi bocor tumor padat [33].

Peningkatan Radiosensitisasi NP HA-Gd₂O₃

Performa excellent NP HA-Gd₂O₃ sebagai agen kontras T₁ mendorong kami untuk menentukan lokasinya dalam radiosensitisasi tumor dengan akurat. Pertama, apakah peningkatan dosis terjadi dengan kombinasi perawatan ini dieksplorasi menggunakan uji CCK-8. Seperti digambar dalam Gambar 6a, NP HA-Gd₂O₃ tunggal (konsentrasi 0–200 μg/mL) tidak mempengaruhi secara signifikan kelangsungan HepG-2, tetapi radiasi X (rentang 0–9 Gy) menurunkan kelangsungan sel HepG-2 menjadi kurang dari 70% pada 9 Gy. Pentingnya, kombinasi radiasi X dengan NP HA-Gd₂O₃ secara dramatis menurunkan kelangsungan sel HepG-2 menjadi kurang dari 50%, terutama pada konsentrasi 200 μg/mL pada 9 Gy. Selanjutnya, uji klonogenik dilakukan untuk mengevaluasi kelangsungan sel HepG-2 setelah kombinasi radiasi X dan NP HA-Gd₂O₃. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 6b, NP HA-Gd₂O₃ tunggal tidak memiliki pengaruh dramatis pada pembentukan koloni sel HepG-2, tetapi radiasi X menurunkan pembentukan koloni sel HepG-2 menjadi 46,7%. Namun, perawatan dengan radiasi X dan NP HA-Gd₂O₃ secara signifikan menghambat kelangsungan pembentukan koloni menjadi 29,8%. Citra yang sesuai lebih memverifikasi radiosensitisasi NP HA-Gd₂O₃ terhadap sel HepG-2.

Efektivitas radioterapi in vitro mendorong kami untuk menerapkan NP HA-Gd₂O₃ yang digabungkan dengan iradiasi untuk mengontrol pertumbuhan tumor pada tikus yang ditanami tumor. Volume tumor dalam kontrol dan perawatan tunggal NP HA-Gd₂O₃ tumbuh dengan cepat dan keduanya meningkat sebesar 180%. Dibandingkan dengan perawatan radiasi tunggal 58%, NP HA-Gd₂O₃ yang digabungkan dengan radiasi menunjukkan inhibisi tumor yang efisien sebesar 38% setelah 10 hari radiasi (Gambar 6d). Tumor difoto, dan volume tumor rata-rata di setiap kelompok menunjukkan bahwa volume tumor rata-rata di kelompok (a) adalah yang tertinggi sementara di kelompok (d) adalah yang terendah di antara semua kelompok (Gambar 6e). Hasil ini mengungkapkan bahwa NP HA-Gd₂O₃ yang disiapkan menjanjikan untuk inhibisi pertumbuhan tumor di bawah iradiasi X.

Uji sitorometrika aliran dan uji pewarnaan hidup/mati dilakukan untuk memahami lebih lanjut mekanisme radiosensitisasi dalam perawatan kombinasi NP HA-Gd₂O₃ dan radiasi X. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 7a, fluorescensi hijau yang intens tanpa merah diamati pada sel HepG-2 yang diobati dengan NP HA-Gd₂O₃ tunggal, yang memverifikasi kelangsungan sel yang tinggi. Sejumlah kecil fluorescensi merah diamati setelah perawatan radiasi X, yang menunjukkan tingkat apoptosis yang rendah. Namun, fluorescensi merah yang kuat diamati setelah perawatan kombinasi NP HA-Gd₂O₃ (200 μg/mL) dan radiasi, menunjukkan bahwa NP HA-Gd₂O₃ dapat secara dramatis meningkatkan apoptosis sel yang diinduksi iradiasi X. Mekanisme radiosensitisasi NP HA-Gd₂O₃ diteliti lebih lanjut menggunakan sitorometrika aliran. Seperti digambar dalam Gambar 7b, radiasi tunggal dan NP HA-Gd₂O₃ menginduksi penahanan fase G2/M sebesar 27,55% dan 19,12%, masing-masing. Namun, perawatan kombinasi NP HA-Gd₂O₃ dan radiasi secara signifikan meningkatkan penahanan fase G2/M, berkisar dari 30,89 hingga 33,27% dengan cara yang bergantung pada dosis. Sementara itu, perawatan kombinasi menginduksi kematian sel apoptosis dari 10,63 hingga 22,67%, seperti terlihat dari proporsi sub-G1 ketika NP HA-Gd₂O₃ tunggal dan radiasi menginduksi 3,02% dan 13,87%. Untuk menyelidiki lebih lanjut mekanisme kemungkinan kematian sel, metode Annexin V-EGFP/PI dilakukan oleh sitorometrika aliran. Sinyal emisi Annexin V-EGFP diplot pada sumbu x, sementara sinyal emisi PI diplot pada sumbu y (Gambar 8). Kuantitas sel nekrotik, sel apoptosis awal, sel apoptosis akhir, dan sel hidup ditentukan oleh persentase Annexin V⁻/PI⁺(Q3), Annexin V⁺/PI⁺ (Q2), dan Annexin V⁻/PI⁻ (Q4), masing-masing. Persentase apoptosis sel dalam kelompok kontrol dan kelompok NP HA-Gd₂O₃ tunggal (100 μg/mL) kurang dari 5%, resulting in pengaruh yang halus. Dibandingkan dengan kelompok perawatan radiasi tunggal (8,8%), tingkat apoptosis dari kombinasi NP HA-Gd₂O₃ dan radiasi meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi berkisar dari 50 hingga 200 μg/m5. Khususnya, tingkat apoptosis awal sel secara jelas meningkat menjadi 33,2%, dan apoptosis awal dan akhir mencapai 44,3% ketika konsentrasi adalah 200 μg/mL. Secara umum, kombinasi NP HA-Gd₂O₃ dan iradiasi X memiliki efek sinergi pada pembentukan koloni sel, kelangsungan sel dengan cara yang bergantung pada dosis, dan efek peningkatan radiosensitisasi. Berdasarkan hasil ini, NP HA-Gd₂O₃ mungkin merupakan alternatif yang efisien untuk meningkatkan radiosensitisasi untuk radioterapi.

Kesimpulan

Secara kesimpulan, kami mengembangkan NP HA-Gd₂O₃ bifungsi untuk citra MR yang efektif dan radiosensitisasi tumor dalam proses hidrotermal satu panci. Setelah dilapisi HA, HA-Gd₂O₃ NPs yang disintesis menunjukkan dispersibilitas yang baik dalam air, biokompatibilitas yang excellent. NP HA-Gd₂O_{3> yang dihasilkan yang melindungi atom Gd tidak hanya secara efektif menunjukkan relaksivitas longitudinal (r₁) yang tinggi untuk MRI sebagai agen kontras T₁, tetapi juga meningkatkan sensitivitas radiasi tumor dengan menginduksi apoptosis sel dan mencegah siklus sel sebagai radiosensitizer. Dengan demikian, NP HA-Gd₂O₃ yang baru ini menunjukkan potensi yang menjanjikan untuk diagnosis dan radioterapi tumor.}

Bahan dan Metode

Bahan

Fluorescein diacetate (FDA) dan propidium iodide (PI) diperoleh dari Sigma (New York, NY, AS). GdCl₃·6H₂O, etilena glikol (99%) dibeli dari Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, Republik Rakyat China). Cell Counting Kit-8 (CCK-8) dibeli dari Dojindo (Kumamoto, Jepang). NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, dan H₂SO₄ diperoleh dari Guangfu Fine Chemical Research Institute (Nankai, Tianjin, Republik Rakyat China). Serum bovin fetal dan medium minimum esensial Dulbecco (DMEM) dibeli dari Invitrogen China Limited (Shanghai, Republik Rakyat China). Semua kimia adalah grade analitis dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.

Sintesis NP HA-Gd₂O₃

NP HA-Gd₂O₃ disiapkan menggunakan pendekatan hidrotermal satu panci sebagai berikut: Pertama, 0,1 g HA dilarutkan dalam 20 mL air di bawah pengadukan keras pada suhu ruang selama malam hari. Selanjutnya, 0,1 g GdCl₃·6H₂O dan 0,5 mL NaOH (1 M) ditambahkan, masing-masing. Kemudian, campuran diaduk selama 5 menit lagi untuk membentuk larutan jernih homogen dan dipindahkan ke autoklaf 50 mL, dilindirkan, dan diobati hidrotermal pada 120 °C selama 6 jam. Setelah pendingin secara alami ke suhu ruang, suspensi jernih difilter dengan membran 0,22 μm untuk menghilangkan aglomerasi besar. Larutan yang disiapkan kemudian dialisis terhadap air selama 3 hari dalam kantong dialisis dengan batas bobot molekuler 14 kDa. Larutan dialisis dikumpulkan dan dikering beku menggunakan freezer domba vakum. Bubuk NP HA-Gd₂O₃ sehingga diperoleh dan disimpan untuk karakterisasi lebih lanjut.

Instrumentasi dan Karakterisasi

Morfologi NP HA-Gd₂O₃ diperiksa oleh mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi pada mikroskop JEM-2100 (JEOL, Tokyo, Jepang) di bawah tegangan percepatan 200 kV. Komposisi elemen NP HA-Gd₂O₃ ditentukan oleh pengukuran XPS dalam spektrometer fotoelektron MK II, menggunakan Al-Ka (1486,6 eV) sebagai sumber siner-X dan spektrometer inframerah transformasi Fourier (FTIR) (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, AS). Struktur kristal NP HA-Gd₂O₃ dikarakterisasi melalui pola difraksi sinar-X (XRD) pada difraktometer Rigaku-D/MAX2500 (Rigaku, Jepang) yang dilengkapi radiasi Cu Kα (λ = 0,15405 nm) pada laju pemindaian 4°/min dalam rentang 5 hingga 80°.

Uji Kelangsungan Sel

Pengaruh NP HA-Gd₂O₃ terhadap kelangsungan sel diteliti melalui uji Cell Counting Kit CCK-8 (uji CCK-8). Sel HepG2 (kanker hati manusia, Nomor ATCC: HB-8065) dan VSMC (sel otot halus vaskular) ditanami pada plate 96-sumur dengan densitas 3 × 10³ sel/sumur dan dibudidayakan pada 37 °C dalam inkubator 5% CO₂ selama 24 jam, kemudian menggunakan DMEM yang mengandung berbagai konsentrasi NP HA-Gd₂O₃ (0 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, dan 200 μg/mL) mengganti medium pertumbuhan. Setelah inkubasi selama 4 jam lagi, menambahkan 10-μL larutan CCK-8 ke setiap sumur, sel diinkubasi selama 4 jam dalam tempat gelap. Penyerapan diukur pada 490 nm menggunakan Pembaca Plate Multi-Mode Synergy HT (Bio Tek, Winooski, VT, AS). Sel yang tidak diobati (dalam DMEM) digunakan sebagai kontrol, dan kelangsungan sel relatif (mean SD, n = 5) dinyatakan sebagai Abssample/Abscontrol × 100%.

Uji Hemolisis

Singkatnya, tikus BALB/c betina berumur 6 minggu dengan berat badan 19–21 g dipersiapkan dengan baik oleh Aturan Manajemen Hewan Kementerian Kesehatan Republik Rakyat China. 3 mililiter darah yang stabilized dengan natrium heparin diperoleh dari pengangkaran bola mata. Kemudian, diaseos untuk menghilangkan sobrenatan dengan 1200 rpm, 15 menit sesuai literatur. Setelah itu, mencuci endapan dengan PBS lima kali untuk mendapatkan sel darah merah tikus (MRBCs), kemudian mengambil sekitar 3-mL darah dengan mengangkarkan bola mata, stabilized dengan natrium heparin, diaseos (1, 200 rpm, 15 menit) untuk menghilangkan sobrenatan sesuai literatur [27], dicuci dengan PBS lima kali untuk mendapatkan sel darah merah tikus (MRBCs). Mencairkan sepuluh kali dengan PBS, 0,1 mL MRBCs dipindahkan ke tabung 1,5 mL yang terisi sebelumnya dengan 0,9 mL PBS yang mengandung berbagai konsentrasi partikel (50–200 μg/mL) NP HA-Gd₂O₃, 0,9 mL air (sebagai kontrol positif), dan 0,9 mL PBS (sebagai kontrol negatif), masing-masing. Campuran diinkubasi selama 2 jam pada suhu ruang setelah diayunkan lembut, kemudian, diaseos pada 12.000 rpm selama 1 menit. Akhirnya, foto semua sampel diambil dan penyerapan sobrenatan (hemoglobin) diukur oleh spektrofotometer UV-2450 UV–Vis. Persentase hemolisis berbagai sampel dihitung dengan membagi selisih penyerapan di antara sampel, kontrol positif, dan kontrol negatif pada 541 nm.

Studi Fanto MR In Vitro dan In Vivo

Citra MR in vitro dan in vivo diambil pada scanner MRI 3 Tesla (Magnetom Trio Tim, Siemens, Jerman). Untuk mempelajari citra fanto T₁ in vitro, larutan NP HA-Gd₂O₃ dengan berbagai konsentrasi yang bervariasi dari 0 hingga 16 mM ditambahkan ke plate budaya 96-sumur, menggunakan Magnevist (agen kontras MR komersial, Gd-DTPA) sebagai kontrol. Untuk citra MR in vivo, kami memilih tikus BALB/c normal sebagai model (n = 4). Eksperimen hewan secara ketat sesuai dengan Aturan Manajemen Hewan Kementerian Kesehatan Republik Rakyat China. Sepuluh miligram per kilogram NP HA-Gd₂O₃ yang difilter melalui membran sterilis (ukuran pori 0,22 μm) disuntik secara intravenus ke hewan, kemudian segera diperiksa dengan scanner MRI. Sampel ini untuk citra MR in vitro dan hewan in vivo diimage dengan parameter berikut: TR/TE = 300/10 ms, matriks 256 × 256, irisan = 5, ketebalan = 2 mm, rata-rata = 2, FOV = 80 × 80.

Efek Radiosensitisasi In Vitro

Uji CCK-8 digunakan untuk mengevaluasi aktivitas radiosensitisasi NP HA-Gd₂O₃ in vitro. Sel ditanami pada lima plate 96-sumur dengan densitas 3 × 10³ sel/sumur, dan setiap plate diobati pada kondisi yang sama: dibudidayakan pada 37 °C dalam inkubator 5% CO₂ selama 24 jam, kemudian menggunakan DMEM yang mengandung berbagai konsentrasi NP HA-Gd₂O₃ (0 μg/mL, 12,5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, dan 200 μg/mL) mengganti medium pertumbuhan. Setelah inkubasi selama 4 jam, lima plate diiradiasi dengan berbagai dosis X-ray (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, dan 9 Gy), 300 cGy/menit, masing-masing. Setelah radiasi, semua plate diinkubasi selama 4 jam, kemudian mengukur penyerapan dengan parameter yang sama.

Uji kelangsungan klonogenik juga dilakukan untuk mempelajari efek radiosensitisasi in vitro. Sel HepG2 ditanami pada plate enam-sumur pada 4,0 × 10⁴ sel/sumur dan diizinkan tumbuh selama 16 jam. Sel diinkubasi dengan NP HA-Gd₂O₃ yang dicairkan dalam medium budaya sel selama 6 jam. Sel kemudian diiradiasi pada 6 Gy menggunakan accelerador linier klinis (Oncor, Siemens, Jerman) dengan iradiasi 6 MeV menggunakan lapangan radiasi 10 cm × 10 cm pada jarak sumber-kulit (SSD) 100 cm untuk menutupi seluruh sel. Kemudian, sel yang diiradiasi diizinkan tumbuh selama 14 hari, diperbaiki dengan paraformaldehida 4% pada suhu ruang selama 40 menit, dicuci, dan diberi kristal violet 1%.

Uji Pewarnaan Hidup-Mati dan Sitorometrika Aliran

Untuk mempelajari efek radiosensitisasi NP HA-Gd₂O₃, sel HepG2 ditanami pada plate enam-sumur pada densitas 4,0 × 10⁴ sel/sumur dan diizinkan tumbuh selama 12 jam dan ditetapkan enam kelompok (kontrol, NP HA-Gd₂O₃, radiasi, radiasi + 50 μg/mL NP HA-Gd₂O₃, radiasi + 100 μg/mL NP HA-Gd₂O₃ dan radiasi + 200 μg/mL NP HA-Gd₂O₃). Ketika sel tumbuh hingga 80% pada plate, kelompok pertama tidak diberi perawatan, kelompok kedua diinkubasi dengan 100 μg/mL NP HA-Gd₂O₃ selama 24 jam, kelompok ketiga hanya diiradiasi, dan kelompok keempat hingga keenam diiradiasi dan diinkubasi dengan berbagai konsentrasi NP HA-Gd₂O₃ (50, 100, dan 200 μg/mL) selama 24 jam, masing-masing. Setelah itu, buffer kerja FDA dan PI ditambahkan untuk pewarnaan sel. Fluorescensi sel yang diberi warna diamati di bawah mikroskop fluoresens (×20), dan sel hidup menunjukkan warna hijau dan sel mati menunjukkan warna merah. Selanjutnya, sel dengan berbagai perawatan dicuci tiga kali dengan PBS, dicerna, dikumpulkan, dan diaseos pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menit, kemudian diperbaiki dengan etanol 70% pada −20 °C selama malam hari diikuti dengan pewarnaan PI. Fragmentasi DNA dikuantifikasi oleh intensitas fluorescensi PI pada sitorometrika aliran (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), dianalisis oleh perangkat lunak (FLOWJO 7.6.2) untuk memastikan distribusi siklus sel.

Efek Radiosensitisasi In Vivo

Tikus BALB/c betina dengan berat badan 19–21 g dan usia 6 minggu diperoleh dari Pusat Hewan Laboratorium Universitas Yangzhou dalam kondisi standar. Eksperimen hewan sesuai dengan Aturan Manajemen Hewan Kementerian Kesehatan Republik Rakyat China. Model tumor subkutan didirikan dengan prosedur sebagai berikut: Pertama, 1 × 10⁶ sel HepS diinokulasikan ke dalam tikus intraperitoneal, dan ascites dikumpulkan setelah 5 hari. Kemudian, ascites ini disuntik ke dalam subkutan. Ketika ukuran tumor mencapai sekitar 100 mm³, model tumor subkutan didirikan dan diterapkan pada eksperimen berikut.

Delapan tikus yang membawa tumor subkutan per kelompok diobati dengan radiasi 3 Gy per fraksi hingga total dosis 9 Gy dalam 7 hari. Radioterapi dilakukan setelah 3 jam suntikan intravenus NP HA-Gd₂O₃ (10 mg/Kg), pada accelerador linier klinis Siemens Primus (6 MeV) menggunakan perangkat buatan sendiri untuk menutupi seluruh tumor. Tikus ini dianestesi dengan pentobarbital 1% (50 mg/kg) untuk memastikan ketidakgerakan selama iradiasi. Volume diukur dan dicatat setiap hari, ditentukan dari pengukuran kaliper, dan dihitung dengan rumus: V = 0,5 × a × b², di mana V (mm³) adalah volume tumor, dan a (mm) dan b (mm) adalah panjang dan lebar tumor, masing-masing. Volume tumor relatif dinormalisasi ke ukuran awalnya. Setiap kelompok dilakukan pada delapan tikus, di mana analisis statistik dilakukan menggunakan uji t Student dua ekor (*p < 0,05, **p < 0,001).