5-Aminolevulinic Acid-Squalene Nanoassemblies untuk Fotodeteksi dan Terapi Tumor:Studi In Vitro

Abstrak

Protoporfirin IX (PpIX) sebagai fotosensitizer alami yang berasal dari pemberian asam 5-aminolevulinat (5-ALA) telah ditemukan penggunaan klinis untuk fotodiagnosis dan terapi fotodinamik beberapa kanker. Namun, penggunaan 5-ALA yang lebih luas dalam onkologi terhambat oleh muatan dan polaritasnya yang mengakibatkan berkurangnya kapasitasnya untuk melewati penghalang biologis dan mencapai jaringan tumor. Platform penghantaran obat yang canggih diperlukan untuk meningkatkan biodistribusi 5-ALA. Di sini, kami melaporkan pendekatan baru untuk pengiriman 5-ALA. Strategi squalenoylation digunakan untuk mengkonjugasikan 5-ALA secara kovalen menjadi squalene, prekursor alami kolesterol. Nanoassembly 5-ALA-SQ dibentuk oleh self-assembly dalam air. Nanoassembly adalah monodisperse dengan ukuran rata-rata 70 nm, indeks polidispersitas 0,12, dan -potensial + 36 mV. Mereka menunjukkan stabilitas yang baik selama beberapa minggu. Pemuatan obat 5-ALA sangat tinggi pada 26%. Dalam sel kanker prostat manusia PC3 dan sel glioblastoma manusia U87MG, produksi PpIX dipantau secara in vitro pada inkubasi dengan nanoassemblies. Mereka lebih efisien dalam menghasilkan fluoresensi yang diinduksi PpIX dalam sel kanker dibandingkan dengan 5-ALA-Hex pada 1,0 hingga 3,3 mM pada waktu inkubasi pendek dan panjang. Dibandingkan dengan 5-ALA, mereka menunjukkan kinerja fluoresensi yang unggul pada 4 jam yang berkurang pada 24 jam. 5-ALA-SQ menghadirkan platform pengiriman nano baru dengan potensi besar untuk administrasi sistemik 5-ALA.

Latar Belakang

Nanoteknologi medis telah memperkenalkan platform pengiriman obat baru yang menjanjikan. Mereka terdiri dari nanomaterial biokompatibel dan biodegradable yang membantu meningkatkan stabilitas kimia dan profil farmakokinetik senyawa aktif farmakologis sambil memberikan pengiriman terkontrol di lokasi aksi [1,2,3]. Namun, hanya sedikit sistem nanopartikel yang sejauh ini telah mencapai pasar. Perangkap utama nanopartikel (NP) yang ada terutama adalah pemuatan obat yang buruk (biasanya kurang dari 5%) dan "efek pelepasan meledak" yang menyebabkan pelepasan dini sebagian besar obat sebelum mencapai situs target. Hal ini menyebabkan efek samping yang merugikan dan dapat menyebabkan toksisitas dan hilangnya aktivitas farmakologis [4].

Squalene (SQ) adalah triterpen linier dengan rumus kimia C₃₀ H₅₀ dan prekursor kolesterol dan steroid lainnya [5]. Di dalam tubuh manusia, squalene disintesis di hati dan di kulit dan diangkut oleh low density lipoprotein (LDL) dan very low density lipoprotein (VLDL) dalam darah [6]. Dalam konteks terapi tumor, squalene menunjukkan efek potensiasi yang kuat pada agen kemoterapi tertentu [7]. Karena banyak ditemukan di alam dan aman, squalene telah ditemukan aplikasinya dalam teknologi farmasi sebagai eksipien dalam pembuatan emulsi lipid untuk pengiriman vaksin, berbagai senyawa aktif, dan gen [6, 8, 9]. Squalene telah ditemukan cocok untuk konjugasi kovalen obat yang berbeda. Sistem nano canggih yang dibuat dengan cara ini menggabungkan squalene terkonjugasi ke agen kemoterapi seperti gemcitabine [10,11,12], paclitaxel [13], cisplatin [14], atau doxorubicin [15]. Pendekatan ini disebut "squalenoylation" dan melibatkan strategi prodrug dengan pembentukan sistem nano-koloid di mana prinsip aktif terikat secara kovalen [16, 17]. Nanoassemblies (NAs) berbasis squalene dibentuk oleh perakitan sendiri komponen fungsional dalam media berair dan ditandai dengan pemuatan obat yang tinggi [18]. Squalenoylation telah ditemukan untuk meningkatkan stabilitas obat dan meningkatkan kelarutan obat yang sukar larut dalam air, sehingga meningkatkan bioavailabilitas dan memperpanjang waktu paruh obat dalam sirkulasi sistemik [14, 16]. Dalam kebanyakan kasus, NA yang dirakit sendiri tersebut menunjukkan aktivitas farmakologis yang lebih baik daripada obat induknya [16, 19]. Selain itu, squalenoylation menyediakan sarana untuk membangun NA yang mengandung modalitas terapeutik dan pencitraan [20]. NA teranostik serupa telah dilaporkan oleh Couvreur dan rekan kerja dengan memasukkan agen MRI ke dalam rakitan nano squalenoyl-gemcitabine (SQgem) [14]. Jenis sistem multifungsi ini mungkin sangat penting dalam mengembangkan agen theranostik baru untuk pengobatan yang dipersonalisasi.

Dalam konteks theranostics kanker, pemberian molekul kecil asam 5-aminolevulinic (5-ALA) (Gbr. 1) telah menyebabkan penggunaan klinis 5-ALA untuk terapi fotodinamik (PDT) [21,22,23] , fotodiagnosis (PD) [24], dan reseksi tumor yang dipandu fluoresensi pada pasien glioma kanker otak [25,26,27]. Theranostics dicapai dengan metabolisme 5-ALA dan akumulasi selektif protoporphyrin IX (PpIX) dalam jaringan kanker sebagai konsekuensi dari bypassed feedback inhibisi dari siklus heme [22]. Namun, kemanjuran 5-ALA PD dan PDT secara serius terhambat oleh sifat zwitterioniknya pada pH netral yang ditemukan dalam aliran darah. Berbagai upaya telah dilakukan untuk meningkatkan stabilitas 5-ALA dan profil farmakokinetik. Baik ujung amino dan karboksilat 5-ALA telah dimodifikasi dengan berbagai pendekatan [28]. Esterifikasi gugus karboksil 5-ALA telah menghasilkan metil ester 5-ALA (Metvix®) [29] dan digunakan dalam pengobatan topikal keratosis aktinik, karsinoma sel basal, dan jerawat akut. Heksil ester dari 5-ALA (5-ALA-Hex) (Hexvix®) telah memperoleh izin edar untuk fotodiagnosis (PD) kanker kandung kemih [30, 31] dan secara eksperimental dieksploitasi untuk pengobatan kanker serviks dan jerawat parah [32 ,33,34].

Struktur kimia elemen blok bangunan NA. 5-ALA (a ), 5-ALA-Hex (b ), squalene (c ), dan 5-ALA-SQ (d )

Namun, dengan pengecualian Gliolan™, penggunaan klinis 5-ALA dan turunannya sebagian besar terbatas pada pemberian topikal. Ini membatasi penggunaannya pada jenis kanker yang lebih penting, seperti kanker payudara, kolorektal, paru-paru, dan prostat. Upaya untuk memperluas penggunaan 5-ALA memiliki turunan sensitif fosfatase termodifikasi amino-akhir dari 5-ALA yang telah menunjukkan aktivitas yang sangat menjanjikan baru-baru ini [35, 36]. Selanjutnya, upaya telah dilakukan untuk merangkum 5-ALA ke dalam sistem nano yang berbeda termasuk NA polimer [37,38,39] atau liposom [40,41,42,43] dan konjugasinya menjadi dendrimer [44, 45] atau NP emas [46 , 47]. Meskipun beberapa dari solusi ini telah membantu meningkatkan stabilitas 5-ALA dan profil farmakokinetiknya, tidak satu pun dari upaya yang disebutkan di atas telah menghasilkan kandidat klinis yang sukses di bidang pengobatan nano kanker.

Tujuan dari pekerjaan ini adalah desain dan sintesis blok bangunan konjugat 5-ALA-squalene (5-ALA-SQ) (Gbr. 1d) yang dirakit sendiri dalam media berair dan mengandung pemuatan obat 5-ALA yang tinggi, prasyarat untuk aktivitas farmakologis pada kanker. NA diuji pada dua garis sel kanker yang berbeda untuk kemampuan PD fluoresensinya. Dikombinasikan dengan laporan terbaru dari NA berbasis squalene yang mengeksploitasi lipoprotein plasma untuk mencapai penargetan kanker tidak langsung [48], pendekatan nanoteknologi 5-ALA ini memperluas penggunaan 5-ALA untuk PD dan PDT dari kanker yang berbeda, seperti kanker prostat yang digunakan dalam penelitian ini. .

Hasil dan Diskusi

Sintesis Blok Bangunan 5-ALA-SQ

Strategi kimia konvergen yang efisien digunakan untuk mensintesis blok bangunan 5-ALA-SQ dari squalene dan 5-ALA (Gbr. 2). 5-ALA pertama kali dilindungi pada ujung amino dengan N -Boc melindungi grup menggunakan kondisi standar. Alkohol squalene yang memicu perakitan nano (3 ) disintesis dari squalene dalam empat langkah sintetik sesuai dengan prosedur yang dijelaskan dalam literatur [49]. Boc-5-ALA (2 ) dan squalene alkohol (3 ) kemudian digabungkan dengan adanya EDC dan DMAP untuk menghasilkan turunan ester yang dilindungi (4 ) dalam hasil yang baik. Deproteksi Boc terakhir harus dilakukan di bawah kondisi asam ringan untuk menghindari penambahan elektrofilik ke perancah squalene. Produk akhir dimurnikan dengan HPLC fase terbalik untuk menghasilkan blok pembangun NA dengan hasil yang baik.

Sintesis blok bangunan 5-ALA-SQ. 5-ALA-SQ disintesis dalam empat langkah sintetis menggunakan sintesis konvergen dari 5-ALA dan SQ

5-ALA-SQ Nanoassemblies

Untuk mencapai pengiriman yang efisien dari senyawa aktif oleh nanopartikel (NPs) ke situs kerjanya, parameter seperti ukuran partikel nano, bentuk, dan muatan permukaan memainkan peran penting dan mengatur farmakokinetik sistem pengiriman nano dalam tubuh. 50]. Secara khusus, ukuran partikel mengatur beberapa fenomena farmakokinetik seperti waktu paruh NP dalam sirkulasi sistemik, sekuestrasi oleh makrofag, dan ekstravasasi melalui pembuluh darah yang bocor ke tempat kerja [51]. Bentuk dan ukuran nanopartikel mengatur kemampuannya untuk ekstravasasi melalui fenestrasi yang ditemukan di pembuluh darah [50, 51]. Ukuran dan bentuk juga sangat penting untuk penargetan aktif dan penyerapan ke dalam sel karena NP yang lebih kecil dan bentuk sferis memiliki luas permukaan yang lebih kecil, sehingga banyak titik kontak yang terbatas dibandingkan dengan sistem nanopartikel non-sferis yang lebih besar [51].

Perakitan sendiri blok bangunan 5-ALA-SQ terjadi secara spontan di media berair. NA dibentuk oleh nanopresipitasi. Konjugat 5-ALA-SQ dilarutkan dalam pelarut organik dan ditambahkan tetes demi tetes ke dalam air. Penguapan total pelarut organik menghasilkan larutan NA dalam air. 5-ALA-SQ NA adalah monodispersi dengan indeks polidispersitas rendah 0,12. Pengukuran mobilitas elektroforesis memberikan -potensial 36 mV, dan hamburan cahaya dinamis (DLS) mengungkapkan distribusi monodispersi NA dengan ukuran rata-rata 70 nm (Gbr. 3). Kisaran ukuran NA menawarkan potensi yang baik untuk sirkulasi berkepanjangan dalam aliran darah [50]. Namun demikian, 5-ALA-SQ NA secara signifikan lebih kecil dari komposit SQ yang dilaporkan sebelumnya yang berkisar antara 100 dan 300 nm yang menunjukkan susunan supramolekul yang berbeda [19].

Karakterisasi NA 5-ALA-SQ. Rendah (a ) dan tinggi (b ) perbesaran gambar cryo-TEM, analisis DLS (c ), dan stabilitas pada 4 °C (d )

Ukuran yang lebih kecil mungkin karena gugus amino bermuatan positif dan molekul 5-ALA yang relatif kecil dibandingkan dengan bagian SQ. Telah ditunjukkan bahwa variasi molekul kecil yang melekat pada squalene menyebabkan perubahan dalam perakitan sendiri dan pengemasan konjugat senyawa-squalene akibatnya mengubah bentuk dan ukuran NA [16]. Ada kemungkinan bahwa gugus amino 5-ALA yang bermuatan sangat positif mengarahkan dirinya sendiri ke arah air curah sementara rantai lipofilik menempati bagian dalam NA ini; namun, struktur supramolekul yang tepat masih harus dijelaskan. Meskipun ukurannya jauh lebih kecil dibandingkan dengan nanokomposit squalene lainnya, NA menunjukkan stabilitas rak yang sangat baik dengan ukuran dan PDI tetap konstan selama beberapa minggu.

Aspek penting lainnya dari NA 5-ALA-SQ baru adalah bahwa mereka mencapai pemuatan obat 26% yang tinggi dibandingkan dengan sistem nanopartikel 5-ALA lain yang dilaporkan di mana pemuatannya jauh lebih efisien [37, 38, 41]. Pemuatan obat sangat penting dalam penghantaran NP karena pada NP dengan muatan obat yang buruk, dosis yang diberikan mungkin tidak cukup untuk mencapai konsentrasi aktif secara farmakologis di jaringan target [4]. Pembebanan dapat ditentukan dengan perhitungan sederhana dengan mempertimbangkan berat molekul 5-ALA dan 5-ALA-SQ karena 5-ALA terikat secara kovalen dengan perancah squalene dalam rasio molar 1:1.

Pengukuran Kinetik Fluoresensi PpIX dalam Sel Kanker

Pembentukan PpIX yang bergantung waktu dievaluasi dalam sel kanker prostat manusia PC3 dan glioblastoma U87MG yang diinkubasi dengan 5-ALA-SQ NA dan 5-ALA-Hex sebagai referensi. Gambar 4 menunjukkan pembentukan PpIX dalam sel kanker prostat manusia PC3 yang terpapar pada peningkatan konsentrasi 5-ALA-SQ NA atau 5-ALA-Hex selama 24 jam.

Pengukuran fluoresensi kinetik dari akumulasi PpIX dalam sel PC3. Sel-sel diinkubasi dengan peningkatan konsentrasi NA 5-ALA-SQ (a ) atau 5-ALA-Hex (b )

Profil fluoresensi PpIX yang bergantung pada konsentrasi diamati untuk NA 5-ALA-SQ. Pada 1,0 dan 2,0 mM, fluoresensi PpIX meningkat secara stabil selama 24 jam saat mencapai dataran tinggi setelah 8 jam inkubasi untuk konsentrasi yang lebih rendah. Di sisi lain, 5-ALA-Hex menginduksi akumulasi tertinggi PpIX dalam rentang konsentrasi yang lebih rendah antara 0,10 dan 0,30 mM seperti yang dilaporkan sebelumnya [35, 52]. Namun, 5-ALA-Hex pada konsentrasi di atas 1 mM ditemukan menjadi racun bagi sel yang mengurangi keseluruhan fluoresensi yang diamati dan menghambat penggunaannya [36].

Selanjutnya, akumulasi PpIX yang bergantung pada dosis dalam sel kanker glioblastoma manusia PC3 dan U87MG dilakukan dengan tujuan memperkirakan dosis NA yang optimal. Intensitas fluoresensi pada 4 dan 24 jam inkubasi dengan NA 5-ALA-SQ dan 5-ALA-Hex ditunjukkan pada Gambar 5. Sangat penting, NA 5-ALA-SQ menginduksi produksi PpIX di kedua lini sel. Selanjutnya, tingkat fluoresensi maksimum sebanding dengan kontrol ALA-Hex di kedua garis sel. Dapat juga dicatat bahwa dalam sel PC3, konsentrasi 1,0 dan 2,0 mM 5-ALA-SQ NA optimal untuk menginduksi akumulasi PpIX tertinggi. Dalam sel U87MG, tidak ada perbedaan yang signifikan antara konsentrasi yang berbeda dari 5-ALA-SQ NAs untuk waktu inkubasi yang singkat (Gbr. 5c). Pada 24 jam, akumulasi PpIX ditemukan bergantung pada konsentrasi NA 5-ALA-SQ atau 5-ALA-Hex yang mirip dengan sel PC3. Penurunan induksi PpIX agak mirip dengan ALA-Hex ditemukan setelah masa inkubasi yang lebih lama pada konsentrasi NA 5-ALA-SQ yang lebih tinggi yang lebih sensitif terhadap keberadaan NA.

Kurva dosis-respon. Akumulasi PpIX yang bergantung pada konsentrasi dengan NA 5-ALA-SQ (biru) dan 5-ALA-Hex (merah) di PC3 (a , b ) dan U87MG (c , d ) sel setelah inkubasi 4 jam (kiri) dan 24 jam (kanan)

Gambar 5 menunjukkan bahwa pada 24 jam, kurva produksi PpIX berbentuk lonceng di sel PC3 dan U87MG. Sementara konsentrasi 1 mM 5-ALA-SQ NA menginduksi akumulasi PpIX tertinggi dalam sel PC3, sel U87MG mentoleransi konsentrasi yang lebih tinggi dan peningkatan fluoresensi PpIX terlihat hingga 2 mM 5-ALA-SQ NA. Secara umum, konsentrasi NA 5-ALA-SQ yang lebih tinggi diperlukan untuk menginduksi biosintesis PpIX secara efisien bila dibandingkan dengan 5-ALA-Hex, mungkin karena tingkat pembelahan ikatan ester yang berbeda dalam sel kanker. Penurunan produksi PpIX diamati ketika konsentrasi yang lebih tinggi dari 1 mM 5-ALA-Hex digunakan karena toksisitas non-spesifik 5-ALA-Hex. Efek ini jauh lebih kecil untuk 5-ALA-SQ di mana fluoresensi tingkat mulai turun hanya pada konsentrasi tertinggi yang diuji (3,3 mM) dan waktu inkubasi yang berkepanjangan (Gbr. 5b, d). Namun, tingkat fluoresensi serupa untuk kedua senyawa tanpa jeda fluoresensi yang diamati untuk NA.

NA juga diuji dalam glioblastoma U87MG terhadap kontrol 5-ALA yang dipasarkan untuk PD glioblastoma selama reseksi bedah. Gambar 6 menunjukkan fluoresensi sel U87MG setelah 4 dan 24 jam. 5-ALA-SQ NA menginduksi fluoresensi yang lebih tinggi secara signifikan setelah 4 jam dibandingkan dengan 5-ALA yang sangat relevan dalam pengaturan klinis. Pada 24 jam, profil fluoresensi bergeser mendukung 5-ALA pada konsentrasi yang lebih rendah karena penyerapan 5-ALA yang lambat dan aktif memberikan jumlah 5-ALA yang cukup di dalam sel. NA masih menunjukkan tingkat fluoresensi yang serupa dengan 5-ALA pada konsentrasi NA 1,0 dan 2,0 mM yang optimal (Gbr. 6b).

Kurva dosis-respon. Akumulasi PpIX yang bergantung pada konsentrasi dalam sel U87MG setelah 4 jam (a ) dan 24 jam (b ) inkubasi dengan 5-ALA-SQ NAS (biru) dan 5-ALA (hijau)

Dalam praktik klinis, 5-ALA diberikan baik secara topikal atau oral, tetapi karena sifatnya yang bermuatan, hanya sebagian kecil dari dosis awal yang masuk ke dalam sel target melalui transporter peptida endogen seperti transporter PEPT1, PEPT2, atau BETA, tergantung pada jenis selnya. [40, 53]. Studi terbaru tentang NA dari turunan SQgem menunjukkan bahwa masuknya sel diatur oleh difusi yang ditingkatkan albumin dari blok bangunan molekul tunggal dan ditemukan sangat bergantung pada keberadaan protein ekstraseluler [54, 55]. Lebih lanjut, NA fluoresen merah jauh yang kami laporkan baru-baru ini juga menunjukkan internalisasi yang cepat, dan eksperimen kinetik fluoresensi 5-ALA-SQ dan kurva respons-dosis menguatkan internalisasi blok penyusun molekul tunggal dan metabolisme berikutnya yang efisien untuk menghasilkan PpIX fluoresen.

Kesimpulan

Dalam studi pembuktian konsep in vitro ini, strategi kimia konvergen digunakan untuk mensintesis blok bangunan 5-ALA-SQ dari squalene dan 5-ALA. NA 5-ALA-SQ disiapkan dengan nanopresipitasi spontan dalam air. NA bersifat monodispersi dan stabil dengan ukuran rata-rata 70 nm, indeks polidispersitas 0,12, potensi positif 36 mV, dan pemuatan 5-ALA tinggi 26%. Produksi ppIX dievaluasi secara in vitro dalam dua garis sel kanker dengan mengukur peningkatan fluoresensi dari waktu ke waktu dan dibandingkan dengan 5-ALA dan 5-ALA-Hex. Hasil penelitian menunjukkan bahwa SQ-ALA NAs sangat efisien dalam menginduksi produksi PpIX pada sel kanker tipe PC3 dan U87MG. Mereka mengungguli 5-ALA-Hex dalam induksi fluoresensi pada konsentrasi yang lebih tinggi pada waktu inkubasi 4 dan 24 jam secara in vitro; namun, dibandingkan dengan 5-ALA, mereka menunjukkan induksi fluoresensi yang unggul pada waktu inkubasi yang lebih singkat. Dalam ruang lingkup dengan temuan ini, kita dapat menyimpulkan bahwa 5-ALA-SQ NAs menghadirkan solusi nanoteknologi yang menarik untuk mengatasi kelemahan farmakokinetik 5-ALA. Lebih lanjut, eksperimen in vivo akan mengevaluasi potensinya untuk pengiriman sistemik 5-ALA untuk terapi fluoresensi PD dan PDT tumor.

Metode/Eksperimental

Reagen dibeli dari pemasok komersial Sigma-Aldrich (Bucks, Swiss) dan Acros Organics (Basel, Swiss) dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Pelarut NMR terdeuterasi diperoleh dari Cambridge Isotop Laboratories (Tewksbury, USA). Tetrahidrofurana (THF) dan diklorometana (CH₂ Kl₂ ) diperoleh dari sistem pengeringan berbasis kolom alumina Anhydrous Engineering. Semua pelarut lain yang digunakan adalah kelas HPLC. N,N-dimetilformamida (DMF), metanol (CH₃ OH), dietil eter (Et₂ O) dan aseton dibeli dari Sigma-Aldrich (Buchs, Swiss). Etil asetat (AcOEt) dibeli dari Biosolve (Dieuze, Prancis); asetonitril (CH₃ CN) dipasok oleh Reagen Carlo Erba (Balerna, Swiss). Heksana 95% dari n-heksana dibeli dari Fisher Chemical (Basel, Swiss). Air yang digunakan untuk persiapan dideionisasi oleh sistem air laboratorium Milli-Q (Millipore, Molsheim, Prancis). Reaksi kimia dilakukan menggunakan septa jarum suntik standar dengan tekanan positif argon untuk memastikan kondisi anhidrat.

Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan dengan pelat silika yang didukung aluminium (Merck-Keiselgel 60 F254) dengan fase gerak yang sesuai dan divisualisasikan menggunakan lampu fluoresensi UV (254 dan 366 nm) dan/atau dikembangkan dengan ninhidrin, 20% sulfat asam, atau asam fosfomolibdat (PMA). Kromatografi flash dilakukan pada mesin PuriFlash® 4100 otomatis dari Interchim (Montlucon, Prancis) menggunakan kolom silika Interchim puriFlash® HP 30 μm yang dilengkapi dengan detektor PDA (200–800 nm) dan pengumpul pecahan otomatis. Profil elusi dipantau menggunakan software Flash Interchim versi 5.0x. Kolom HPLC semi-preparatif dilakukan pada Waters Symmetry 300TM - 5 μm (19 × 150 mm), kolom C8 (Baden-Dättwil, Swiss). UPLC analitik dilakukan menggunakan kolom Macherey-Nagel EC50/2 Nucleodur Gravity 1,8 m (50 × 2.1 mm) yang dipasang pada sistem air yang dilengkapi dengan detektor PDA Perairan (Baden-Dättwil, Swiss). Penyangga A = CH₃ CN + 0,1% Asam format) dan buffer B = H₂ O + 0,1% Asam format. Laju aliran =400,0 μL/mnt pada 25 °C. ¹ H dan ¹³ Spektrum C NMR direkam pada spektrometer Varian Gemini 300 MHz, Varian Innova 500 MHz, atau Bruker Avance III Cryo 600 MHz pada 298 K. Pergeseran kimia (δ) dinyatakan dalam bagian per juta (ppm) dan konstanta kopling (J) dinyatakan dalam hertz (Hz). s untuk singlet, d untuk doublet, dd untuk doublet doublet, t untuk triplet, q untuk quartet, dan m untuk multiplet. Puncak pelarut sisa digunakan sebagai referensi internal untuk pergeseran kimia proton dan karbon. Spektrum NMR diproses dengan paket perangkat lunak Mnova versi 10.0.2. Spektrometri massa resolusi rendah (LRMS) dilakukan pada instrumen HTS PAL-LC10A – API 150Ex dalam ESI (mode positif). Spektrometri massa resolusi tinggi (HRMS) dilakukan pada instrumen QSTAR Pulsar (AB/MDS Sciex) dalam ESI (mode positif). Struktur kimia digambar dan diberi nama sesuai nomenklatur IUPAC menggunakan paket perangkat lunak ChemBioDraw Ultra versi 14.0.0.117. pH diukur pada pH meter Metrohm 691 menggunakan elektroda ujung tombak (Zofingue, Swiss), dikalibrasi dengan buffer Metrohm. Analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 6, 2016, (GraphPad Software). P nilai < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Sintesis Blok Bangunan SQ-ALA

5-(tert-Butoxycarbonylamino)-4-oxopentanoic Acid (2)

Boc-5-ALA disintesis menurut prosedur yang diterbitkan. Data spektroskopi identik dengan literatur [56]. ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d6) 12,12 (s, 1H), 7,06 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3,76 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 2,61 (t, J = 6.6 Hz , 2H), 2,40 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 1,38 (s, 9H). ¹³ C NMR (151 MHz, DMSO) 206.62, 174.07, 156.21, 78.54, 49.97, 40.38, 40.24, 40.11, 39.97, 39.83, 39.69, 39.55, 34.22, 28.64. [M+H]⁺ 232.1, ditemukan 232.7.

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-pentaen-1-ol (3)

Alkohol squalene 3 disintesis dari squalene dalam empat langkah sintetik dengan hasil 23,7% sebagai minyak tidak berwarna menurut prosedur yang dilaporkan [49]. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃ ) 5,17-5,06 (m, 5H, CH), 3,62 (q, J =6,3 Hz, 2H, CH₂ -OH), 2,17 – 1,92 (m, 18H, CH₂ ), 1,67 (dtk, 3H, CH₃ ), 1,59 (m, 17 H, CH₃ dan CH₂ ). ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃ ) 135.35, 135.17, 135.14, 134.81, 131.49, 125.05, 124.64, 124.60, 124.47, 63.07, 39.98, 39.95, 39.89, 36.24, 30.92, 28.48, 26.98, 26.88, 26.78, 25.94, 17.92, 16.28. LRMS (ESI):m/z dihitung untuk [M+NH₄ <⁺ 404.4, ditemukan 404.8.

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-pentaen-1-yl 5-((tert-butoxy karbonil)amino)-4-oxopentanoate (4)

Alkohol squalene (3 ) (100 mg, 0,26 mmol), EDC (74 mg, 0,38 mmol) dan DMAP (94 mg, 0,78 mmol), dan 5-(tert-Butoxycarbonylamino)-4-asam oksopentanoat (2) (77 mg, 0,34 mmol) dilarutkan dalam DCM (15 mL). Setelah diaduk semalaman pada suhu kamar, pelarut diuapkan pada tekanan tereduksi dan produk kasar dimurnikan dengan kromatografi Flash menggunakan gradien DCM/etil asetat (EA) menghasilkan minyak tidak berwarna (108 mg, 0,18 mmol, 70%). ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃ ) 5,31 – 5,20 (br s, 1H), 5,13 – 5,07 (m, 5H), 4,09 – 3,95 (m, 4H), 2,75 – 2,53 (m, 4H), 2,02 – 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63 – 1,50 (m, 19H), 1,41 (dt, 9H). ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl3) 204.46, 172.65, 135.30, 135.16, 135.09, 133.75, 131.43, 125.34, 124.60, 124.57, 124.48, 124.45, 64.81, 50.53, 39.96, 39.93, 39.87, 35.92, 34.56, 28.52 , 28.43, 28.24, 28.02, 26.97, 26.86, 25.92, 23.11, 17.90, 16.25, 16.21, 16.06. LRMS (ESI):m/z dihitung untuk [M+NH₄ <⁺ 617.5, ditemukan 617.8.

Garam asam trifluoroasetat dari 5-amino-(((4E,8E,12E,16E)-4,8,13 ,17,21-pentamethyldocosa-4,8,12,16,20-pentaen-1-yl)oxy)-4-oxopentanoate (5)

Senyawa 4 (34 mg, 57 mmol) dilarutkan dalam DCM (2,0 mL). Asam trifluoroasetat (TFA) (200 L) ditambahkan dan campuran reaksi diaduk pada suhu kamar. Setelah 10 menit, pelarut diuapkan dalam vakum pada suhu rendah dan sisa-sisa TFA dihilangkan dengan evaporasi bersama dengan EA (3 × 10 mL). Produk mentah dimurnikan dengan RP-HPLC menggunakan H₂ . penuh Gradien O/AcN (0,025% TFA) menghasilkan minyak tidak berwarna (25 mg, 74%). %). ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃ ) 5,31 – 5,20 (br s, 1H), 5,13 – 5,07 (m, 5H), 4,09 – 3,95 (m, 4H), 2,75 – 2,53 (m, 4H), 2,02 – 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63 – 1,50 (m, 19H). LRMS (ESI):m/z dihitung untuk [M+H]⁺ 500,4, ditemukan 500,6.

Persiapan Rakitan Nano

NA disiapkan oleh nanopresipitasi dijelaskan secara rinci di tempat lain [20]. Secara singkat, blok penyusun 5 (1,2 mg, 2,0 μmol) dilarutkan dalam 50/50 V /V campuran aseton/etanol (500 L). Fase organik kemudian ditambahkan tetes demi tetes menggunakan jarum suntik mikro ke dalam air MilliQ (1,25 mL) pada 100 μL/menit dengan pengadukan magnetik. Setelah 5 menit di bawah pengadukan, batang pengaduk magnet dihilangkan dan pelarut organik dan kelebihan air dihilangkan menggunakan rotary evaporator pada 30 °C. Konsentrasi akhir rakitan nano adalah 2,00 mM.

Karakterisasi NA 5-ALA-SQ

Pemuatan 5-ALA dari 5-ALA.SQ NA dihitung dari kontribusi masing-masing bobot molekul 5-ALA dan konjugat 5-ALA-SQ sebagai berikut [19]:

$$ \mathrm{Memuat}\ \left(\%\right)=\frac{\mathrm{MW}\ \left(5-\mathrm{ALA}\right)}{\mathrm{MW}\left(5 -\mathrm{ALA}-\mathrm{SQ}\right)}\times 100 $$

Diameter hidrodinamik NA diukur dengan hamburan cahaya dinamis (DLS) menggunakan instrumen NANO ZS dari Malvern (Worcestershire, Inggris) yang menjalankan perangkat lunak ZetaSizer 7.01. Analisis dilakukan dengan 4 mW He-Ne Laser (633 nm) pada sudut hamburan 173° pada 25 °C dalam kuvet mikro polistirena (PS) dari Brand (Wertheim, Jerman). Potensi zeta (ZP) ditentukan menggunakan instrumen Nano ZS yang sama dari Malvern dalam sel kapiler terlipat DTS 1070 dari Malvern. Distribusi ukuran dan ukuran diameter rata-rata dihitung dari data. Stabilitas NA yang disimpan pada 4 °C diuji oleh DLS pada titik waktu reguler selama periode 1 bulan.

Morfologi NA dinilai dengan mikroskop elektron transmisi kriogenik (cryo-TEM) menggunakan TECNAI® G² Mikroskop sphera (FEI, Thermo Fisher Scientific) dilengkapi dengan kamera digital TCL resolusi tinggi 2000 x 2000 piksel (Gräfelfing, Jerman). Sampel es vitrifikasi disiapkan menggunakan cryo-plunger Virtobot (FEI, Thermo Fisher Scientific). NA (2.0 μL, 2.0 mM) diterapkan pada kisi Quantifoil Cu/Rh 200 mesh R3.5/1 (SPI, West Chester, USA) dan divitrifikasi menggunakan etana cair.

Budaya Sel

Sel kanker prostat manusia PC3 (ATTC® CRL-1435™) dan sel glioblastoma manusia U87MG (ATTC® HTB-14™) ditumbuhkan dan dipelihara melalui jalur serial dalam campuran nutrisi F-12K (21127-022, Thermo Fisher Scientific) atau minimum Media Esensial (31095-029, Thermo Fisher Scientific), masing-masing. Media sel dilengkapi dengan serum betis janin (10%, CVFSVF00-01, Eurobio), streptomisin (100 L/mL), dan penisilin (100 IU/mL, 15140-122, Thermo Fisher Scientific). Sel dibudidayakan pada suhu 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 95% udara dan 5% CO_2.

Pengukuran Kinetik Fluoresensi PpIX In Vitro

Sel kanker prostat manusia PC3 (12.000 sel/sumur) dan sel glioblastoma U87MG (10.000 sel/sumur) diunggulkan dalam pelat 96-sumur (pelat hitam bawah bening, 3603, Corning). Hari berikutnya, sel-sel diekspos ke peningkatan konsentrasi 5-ALA-SQ NAs, 5-ALA-Hex, dan 5-ALA dalam media bebas serum. Fluoresensi PpIX direkam dengan pembaca pelat (Safire, Tecan, Swiss) pada titik waktu yang berbeda. Panjang gelombang eksitasi diatur ke 405 nm dan panjang gelombang emisi ke 630 nm. Nilai rata-rata dan s.d. untuk setiap konsentrasi pada setiap titik waktu per piring dikurangi dengan nilai referensi (tanpa perlakuan) dan diplot untuk setiap baris sel.

Studi Pengaruh Arah Berdampak Pada Proses Pemotongan Nanometrik Abrasive dengan Dinamika Molekuler Perovskite Hibrida Uap-Grown Berurutan untuk Sel Surya Heterojunction Planar

bahan nano