Nanopartikel 5-Aminolevulinat–Skualen Tinggi Muatan: Deteksi dan Terapi Fototumor yang Ditingkatkan dalam Model Sel

Abstrak

Protoporfirin IX (PpIX), fotosensitiser endogen yang dihasilkan setelah pemberian 5-aminolevulinat (5-ALA), merupakan sumbu pusat fotodiagnosis (PD) dan terapi fotodinamis (PDT) untuk beberapa malignitas. Namun, sifat zewitterionik 5-ALA membatasi penetrasi melalui barier biologis, mengurangi utilitas klinis sistemiknya. Di sini kami menggambarkan 5-ALA-kuilen (5-ALA-SQ) yang baru yang self-assemble menjadi nanoassemblies (NA) dengan diameter rata-rata 70 nm, indeks polidispersi rendah (0,12), potensial zeta +36 mV, dan muatan obat yang luar biasa sebesar 26 %. Dalam baris sel prostat manusia (PC3) dan glioblastoma (U87MG), NA 5-ALA-SQ menghasilkan fluoresensi PpIX yang sama atau melebihi ester heksil komersial (5-ALA-Hex) pada konsentrasi yang serupa, sementara menunjukkan performa yang lebih baik pada titik waktu awal (≤4 jam). Hasil ini menyoroti NA 5-ALA-SQ sebagai platform yang menjanjikan untuk pengiriman sistemik 5-ALA dalam aplikasi PD dan PDT.

Latar Belakang

Teknologi nano menawarkan pembawa yang biokompatibel dan terbiodegradasi yang dapat meningkatkan stabilitas kimia, farmakokinetik, dan pengiriman spesifik situs agen terapeutik. Namun, banyak sistem nanopartikel (NP) menderita muatan obat rendah (<5 %) dan efek rilis lonjakan yang mengkompromikan efikasi dan keamanan. Skualen, triterpena alami dan precursori kolesterol, telah muncul sebagai kerangka kerja yang serbaguna untuk “squalenoylasi” – konjugasi kovalen obat ke skualen yang mendorong self-assembly spontan ke dalam nanoassemblies (NA) dengan muatan tinggi dan stabil. NA yang dikonjugasi skualen telah berhasil digunakan untuk kemoterapeutik seperti gemcitabin, paklitaksel, sitaplatina, dan doksorubisin, sering menghasilkan aktivitas farmakologis yang lebih baik dan, dalam beberapa kasus, memungkinkan fungsionalitas teranostik.

5-ALA, precursori PpIX, sudah digunakan secara klinis untuk PD, PDT, dan reseksi glioma yang dipandu fluoresensi. Jendela terapeutiknya dibatasi oleh struktur bermuatan, yang membatasi penyerapan sistemik dan akumulasi tumor. Meskipun derivat ester seperti 5-ALA-Hex telah meningkatkan bioavailabilitas, penggunaannya tetap sebagian besar topikal atau terbatas pada kanker spesifik seperti kanker kandung kemih. Studi terbaru telah menjelajahi enkapsulasi 5-ALA dalam NA polimerik, liposom, dendrimer, dan nanopartikel emas, namun tidak ada yang terjemahkan menjadi formulasi sistemik yang layak klinis.

Tujuan kami adalah untuk merancang konjugat 5-ALA-skualen yang self-assemble menjadi NA dengan muatan obat tinggi, stabilitas yang kuat, dan penyerapan tumor yang efisien, sehingga mengembangkan jangkauan klinis 5-ALA untuk PD dan PDT pada tumor padat di luar indikasi saat ini.

Hasil dan Pembahasan

Sintesis Blok Bangunan 5-ALA-SQ

Konjugat disatukan dalam empat langkah konvergen. 5-ALA yang dilindungi Boc dikaitkan dengan derivat skualen hidroksilasi melalui esterifikasi yang dimediasi EDC/DMAP, diikuti oleh deproteksi asam ringan dan pemurnian akhir dengan kromatografi cairan fasa terbalik. Rendemen keseluruhan tinggi dan produk sepenuhnya dikarakterisasi oleh NMR dan spektrometri massa.

Gambar 2. Sintesis blok bangunan 5-ALA-SQ dalam empat langkah.

Karakterisasi Nanoassemblies 5-ALA-SQ

Self-assembly diinduksi oleh nanoprecipitasi: konjugat dilarutkan dalam campuran aseton/etanol 1:1 dan ditambahkan secara titik-titik ke dalam air Milli-Q di bawah pengacakan, diikuti oleh penghapusan pelarut. Pencaran cahaya dinamis (DLS) dan cryo-TEM mengungkapkan partikel monodisperse dengan diameter hidrodinamik rata-rata 70 nm dan indeks polidispersi 0,12. Potensial zeta +36 mV menunjukkan stabilitas koloidal yang kuat dan interaksi yang menguntungkan dengan sel sel membran bermuatan negatif. Pentingnya, muatan obat 26 % merupakan perbaikan yang besar dibandingkan dengan sebagian besar formulasi nanopartikel 5-ALA, yang biasanya menunjukkan muatan <5 %.

Gambar 3. (a) Citra cryo-TEM dan (b) analisis DLS NA 5-ALA-SQ. (c) Stabilitas ukuran partikel pada 4 °C selama beberapa minggu.

Kinetik Fluoresensi PpIX In Vitro dalam Sel Kanker

Sel PC3 dan U87MG diinkubasi dengan berbagai konsentrasi NA 5-ALA-SQ atau 5-ALA-Hex komersial. Fluoresensi dipantau selama 24 jam menggunakan plate reader (eksitasi 405 nm, emisi 630 nm). Pada 1,0–2,0 mM, NA 5-ALA-SQ menghasilkan peningkatan stabil dalam fluoresensi PpIX, mencapai plat after ~8 jam. Sebaliknya, 5-ALA-Hex mencapai puncak pada 0,10–0,30 mM tetapi menunjukkan sitotoksisitas di atas 1 mM, yang mengurangi fluoresensi keseluruhan.

Gambar 4. Kinetik fluoresensi PpIX dalam sel PC3 setelah paparan NA 5-ALA-SQ (biru) atau 5-ALA-Hex (merah).

Kurva respons dosis pada 4 jam dan 24 jam mengungkapkan bahwa NA 5-ALA-SQ cocok atau melebihi 5-ALA-Hex dalam intensitas fluoresensi di kedua baris sel. Fluoresensi maksimum pada 4 jam dicapai dengan 1–2 mM NA 5-ALA-SQ, sedangkan paparan 24 jam memerlukan konsentrasi yang lebih tinggi (hingga 3,3 mM) untuk mendekati tingkat yang sama. Menariknya, NA 5-ALA-SQ mempertahankan profil fluoresensi yang lebih sosten, dengan penurunan bertahap hanya pada konsentrasi tertinggi dan waktu inkubasi terlama.

Gambar 5. Kurva respons dosis akumulasi PpIX dengan NA 5-ALA-SQ (biru) dan 5-ALA-Hex (merah) dalam sel PC3 (a,b) dan U87MG (c,d) setelah 4 jam (kiri) dan 24 jam (kanan).

Ketika dibandingkan dengan formulasi 5-ALA yang dipasarkan, NA 5-ALA-SQ menghasilkan fluoresensi yang jauh lebih tinggi setelah 4 jam dalam sel U87MG, jendela waktu yang penting untuk imaging operasi. Pada 24 jam, fluoresensi NA 5-ALA-SQ searah dengan 5-ALA pada konsentrasi optimal, yang menunjukkan produksi PpIX yang sebanding seiring waktu.

Gambar 6. Kurva respons dosis akumulasi PpIX dalam sel U87MG setelah 4 jam (a) dan 24 jam (b) dengan NA 5-ALA-SQ (biru) dan 5-ALA (hijau).

Penyerapan seluler yang ditingkatkan NA 5-ALA-SQ kemungkinan didorong oleh transportasi yang dimediasi albumen dari konjugat monomerk, seperti yang sebelumnya telah divisualisasikan untuk NA gemcitabin-skualen. Grup amino yang bermuatan positif 5-ALA mungkin berorientasi ke fase akuatik, sementara inti skualen hidrofobik mengumpulkan ke dalam interior partikel, yang menjelaskan ukuran partikel yang lebih kecil relatif terhadap NA skualen lainnya.

Kesimpulan

Kami telah merancang konjugat 5-ALA-skualen yang secara spontan membentuk nanoassemblies yang sangat stabil, muatan tinggi (26 %) dengan ukuran dan muatan permukaan yang menguntungkan. Studi in vitro pada sel prostat dan glioblastoma menunjukkan bahwa NA ini secara efisien menyampaikan 5-ALA, menghasilkan fluoresensi PpIX yang rival atau melebihi formulasi komersial, dan mempertahankan performa yang kuat selama inkubasi yang diperpanjang. Temuan ini mendukung evaluasi in vivo lebih lanjut dari NA 5-ALA-SQ sebagai platform sistemik untuk fotodiagnosis tumor dan terapi fotodinamis.

Metode/Eksperimen

Semua reagen diperoleh dari pemasok komersial dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. 5-ALA dilindungi Boc, dikaitkan dengan derivat skualen hidroksilasi (3) menggunakan EDC/DMAP, kemudian di-deproteksi dalam kondisi asam ringan. Produk akhir (5) difurnisikan dengan kromatografi cairan fasa terbalik dan dikarakterisasi oleh NMR dan HRMS.

Nanoassemblies disiapkan oleh nanoprecipitasi: 1,2 mg blok bangunan (5) dilarutkan dalam campuran aseton/etanol 50/50 (500 µL) dan ditambahkan secara titik-titik ke dalam 1,25 mL air Milli-Q pada 100 µL/min. Setelah 5 menit pengacakan, pelarut dihilangkan dengan evaporasi rotary pada 30 °C, menghasilkan larutan NA 2,00 mM.

Ukuran partikel, indeks polidispersi, dan potensial zeta diukur oleh DLS (Malvern Nano ZS) pada 25 °C. Cryo-TEM dilakukan pada sampel vitrifikasi yang disiapkan dengan Virtobot plunger. Stabilitas dievaluasi oleh DLS selama 1 bulan pada 4 °C.

Sel PC3 (12.000 sel/well) dan U87MG (10.000 sel/well) ditanam pada plate 96-well, diinkubasi dengan deret pengenceran NA 5-ALA-SQ, 5-ALA-Hex, atau 5-ALA (media serum bebas) untuk hingga 24 jam. Fluoresensi PpIX direkam pada plate reader Safire (eksitasi 405 nm, emisi 630 nm). Data dinormalkan terhadap kontrol yang tidak dirawat dan diplot sebagai mean ± SD. Signifikansi statistik ditetapkan pada p < 0,05 (GraphPad Prism 6).