Potensi Antioksidan Ekstrak Artemisia capillaris, Portulaca oleracea, dan Prunella vulgaris untuk Biofabrikasi Emas Nanopartikel dan Penilaian Sitotoksisitas
Abstrak
Tiga ekstrak tumbuhan berair (Artemisia capillaris , Portulaca oleracea , dan Prunella vulgaris ) dipilih untuk biofabrikasi nanopartikel emas. Aktivitas antioksidan (yaitu, aktivitas radikal bebas, kandungan total fenolik, dan daya reduksi) dari ekstrak dan bagaimana aktivitas ini mempengaruhi biofabrikasi nanopartikel emas diselidiki. P. vulgar mengerahkan aktivitas antioksidan tertinggi, diikuti oleh A. kapiler dan kemudian P. oleracea . P. vulgar merupakan reduktor yang paling efisien dalam proses biofabrikasi. Nanopartikel emas dibuat secara biologis oleh P. vulgar (PV-AuNPs) memiliki resonansi plasmon permukaan maksimum 530 nm dengan berbagai bentuk. Analisis difraksi sinar-X resolusi tinggi menunjukkan bahwa PV-AuNPs memiliki struktur kubik berpusat pada muka. Hasil reaksi diperkirakan 99,3% dengan spektroskopi emisi optik plasma yang digabungkan secara induktif. Ukuran hidrodinamik ditentukan menjadi 45 ± 2 nm dengan potensi zeta 13,99 mV. PV-AuNPs mengerahkan aktivitas antioksidan yang bergantung pada dosis. Hebatnya, sitotoksisitas tertinggi dari PV-AuNPs diamati terhadap sel adenokarsinoma kolorektal manusia tanpa adanya serum janin sapi, sedangkan untuk sel adenokarsinoma duktal pankreas manusia, sitotoksisitas tertinggi diamati dengan adanya serum janin sapi. Hasil ini menunjukkan bahwa P. vulgar ekstrak adalah agen pereduksi yang efisien untuk biofabrikasi nanopartikel emas yang memberikan sitotoksisitas terhadap sel kanker.
Pengantar
Minat nanopartikel logam telah sangat meningkat karena beragam aplikasinya [1]. Secara khusus, nanopartikel emas (AuNPs) memiliki banyak aplikasi berharga sebagai pembawa obat/gen, katalis, agen pencitraan, dan sensor kimia/biologi [2]. Berbagai metode kimia dan fisik, seperti sputtering ion, misel terbalik, dan reduksi kimia, tersedia untuk membuat AuNPs. Namun, metode ini dibatasi oleh kekhawatiran mengenai biaya dan potensi toksisitasnya. Penggunaan ekstrak tumbuhan dalam biofabrikasi (atau sintesis hijau) AuNPs memiliki keunggulan dibandingkan metode lain, yang menjadikannya alternatif yang sangat menjanjikan [2]. Proses biofabrikasi hemat biaya dan mudah ditingkatkan. Ini menggunakan bahan ramah lingkungan dan menunjukkan aktivitas sinergis dengan menggabungkan aktivitas dua bahan (AuNPs dan ekstrak tumbuhan). Biofabrication tidak memperkenalkan zat pereduksi kimia berbahaya selama sintesis, yang membuat proses sepenuhnya hijau. Selanjutnya, fitur ini meningkatkan biokompatibilitas AuNP yang dihasilkan dan meningkatkan stabilitasnya. Berbagai fitokimia yang berasal dari ekstrak tumbuhan digunakan tidak hanya sebagai reduktor tetapi juga sebagai capping dan stabilizer [3].
Artemisia capillaris termasuk dalam genus Artemisia , yang merupakan salah satu genus terbesar dari famili Asteraceae [4]. Sejak zaman kuno, A. kapiler telah banyak digunakan sebagai obat herbal karena berbagai efek farmakologisnya, yang meliputi aktivitas antibakteri, antiinflamasi, antioksidan, dan hepatoprotektif. Studi sebelumnya mengaitkan efek ini dengan konstituen aktif A. kapiler , termasuk capillin, capillene, scoparone, dan -sitosterol [4,5,6]. Portulaca oleracea , sukulen tahunan dalam keluarga Portulacaceae, menunjukkan berbagai efek farmakologis, seperti aktivitas antibakteri, antijamur, antiinflamasi, antioksidan, dan antiulserogenik. Efek ini telah dibuktikan sebagai hasil dari berbagai komponen aktif, termasuk alkaloid, asam lemak, flavonoid, polisakarida, dan terpenoid [7, 8]. Prunella vulgaris adalah tanaman herba abadi dari keluarga Lamiaceae. Sejumlah penelitian telah menunjukkan antivirus [9], antikanker [10], imunomodulator [11], antioksidan [11, 12], dan aktivitas hipoglikemik [13] dari P. vulgar . Komponen aktif utama yang berkontribusi terhadap efek ini adalah asam organik, asam fenolik, dan triterpenoid, termasuk asam linolenat, asam palmitat, cis- dan trans- asam caffeic, asam rosmarinic, asam oleanolic, dan asam ursolat [14].
Kesenjangan besar sering terjadi antara hasil in vitro dan in vivo dalam penelitian nanopartikel karena "protein korona". Saat memasuki lingkungan biologis, permukaan nanopartikel menjadi tertutup oleh lapisan protein yang beragam, yang disebut protein korona [15]. Nanopartikel protein berlapis korona masuk ke dalam sel dan mempengaruhi serapan seluler, sitotoksisitas, biodistribusi, ekskresi, respon sel, pelepasan obat, dan efisiensi terapeutik [16]. Menariknya, sifat fisikokimia nanopartikel logam, seperti bentuk, ukuran, muatan permukaan, dan kekasaran permukaan, sangat mempengaruhi adsorpsi protein serum ketika membentuk korona protein [17]. Shannahan dan rekan kerjanya melaporkan bahwa pembentukan korona protein pada nanopartikel perak (AgNPs) memediasi toksisitas seluler terhadap sel epitel paru-paru tikus dan sel endotel aorta tikus via reseptor pemulung [18]. Albumin serum mempengaruhi AgNPs koloid hidrogel dengan mengurangi efek antibakteri dan sitotoksiknya [19].
Dalam laporan ini, kami menilai aktivitas antioksidan, termasuk aktivitas pembersihan radikal bebas, kandungan fenolik total, dan daya pereduksi, dari ekstrak air A. kapiler , P. oleracea , dan P. vulgar . Selanjutnya, biofabrikasi AuNPs menggunakan ketiga ekstrak ini dilakukan untuk menyelidiki bagaimana aktivitas antioksidan ekstrak mempengaruhi warna larutan koloid dan bentuk pita resonansi plasmon permukaan (SPR) AuNPs. Selanjutnya, AuNPs biofabrikasi diberi nama sesuai nama ilmiah masing-masing tanaman:AuNPs diperoleh dengan menggunakan ekstrak A. kapiler disebut sebagai AC-AuNPs, AuNPs diperoleh dengan menggunakan ekstrak P. oleracea disebut sebagai PO-AuNPs, dan AuNPs diperoleh dengan menggunakan ekstrak P. vulgar disebut sebagai PV-AuNPs. Aktivitas antioksidan P. vulgar ekstrak adalah yang tertinggi; dengan demikian, kami mengkarakterisasi PV-AuNPs dengan berbagai metode spektroskopi dan mikroskopis, termasuk spektrofotometri UV-tampak, mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HR-TEM), difraksi sinar-X resolusi tinggi (HR-XRD), dan plasma yang digabungkan secara induktif. spektroskopi emisi optik (ICP-OES). Ukuran hidrodinamik PV-AuNPs diukur dengan hamburan cahaya dinamis (DLS) bersama dengan potensi zeta. Selanjutnya, kami memeriksa aktivitas antioksidan PV-AuNPs dengan memantau aktivitas pemulungan radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH). Sitotoksisitas terhadap tiga sel kanker diselidiki dengan uji tetrazolium (WST) yang larut dalam air baik dengan ada atau tidak adanya serum janin sapi (FBS) dalam kultur sel. Sel kanker berikut digunakan:adenokarsinoma kolorektal manusia (HT-29), sel adenokarsinoma payudara manusia (MDA-MB-231), dan sel adenokarsinoma duktus pankreas manusia (PANC-1).
Metode
Materi
Kalium emas(III) klorida (KAuCl4 ), butylated hydroxytoluene (BHT), natrium fosfat monobasa, natrium fosfat dibasa, asam trikloroasetat, reagen fenol Folin-Ciocalteu, natrium karbonat, asam galat, kalium natrium tartrat, natrium bikarbonat, asam sulfat, 2,2′-azino-bis- 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS), kalium persulfat, dan d-(+)-glukosa dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). DPPH dibeli dari Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA). Kalium heksasianoferat(III) diperoleh dari Wako (Osaka, Jepang). Natrium sulfat, heksa-amonium heptamolibdat tetrahidrat, dan dinatrium hidrogen arsenat heptahidrat dibeli dari Junsei (Tokyo, Jepang). Besi(III) klorida diperoleh dari Duksan (Gyeonggi, Republik Korea), dan tembaga sulfat pentahidrat diperoleh dari Deajeng (Gyeonggi, Republik Korea). Reagen lainnya adalah kelas analitis dan digunakan sebagai diterima. Medium Elang (DMEM) Dulbecco yang dimodifikasi glukosa tinggi, penisilin-streptomisin (10.000 U/mL), tripsin-EDTA (0,5%, tanpa fenol merah), dan saline buffer fosfat (PBS) dibeli dari Gibco (Thermo Fisher Scientific, MA, AS). FBS diperoleh dari GE Healthcare HyClone™ (Victoria, Australia).
Instrumen
Spektrofotometer Shimadzu UV-2600 digunakan untuk memperoleh spektrum UV-tampak dan mengamati SPR (Shimadzu Corporation, Kyoto, Jepang). Informasi mengenai ukuran dan bentuk partikel diperoleh dari gambar HR-TEM. Untuk memperoleh gambar HR-TEM, digunakan instrumen JEM-2100F yang beroperasi pada 200 kV (JEOL, Tokyo, Jepang). Larutan koloid PV-AuNPs dimuat pada kisi tembaga berlapis karbon (karbon tipe-B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, USA). Kotak sampel yang dimuat dikeringkan dengan udara pada suhu sekitar. Difraktometer Rigaku Miniflex (40 kV, 30 mA) digunakan untuk memperoleh pola HR-XRD dengan sumber radiasi CuKα (λ = 1.54056 Å) dalam kisaran 10º hingga 80° (2θ skala) (Rigaku, Jepang). Pengering beku FD5505 digunakan untuk menyiapkan sampel bubuk untuk analisis HR-XRD (Il Shin Bio, Seoul, Republik Korea). Untuk memperkirakan hasil reaksi, ICP-OES dilakukan pada instrumen Perkin Elmer Optima 8300 (Waltham, MA, USA). Sentrifugasi dilakukan (18.500g kekuatan, 7 h, 18 °C), dan supernatan dikumpulkan. Dua sampel, yaitu larutan koloid PV-AuNP dan supernatan, dijadikan sasaran analisis ICP-OES. Sebuah centrifuge Eppendorf 5424R digunakan untuk sentrifugasi (Eppendorf AG, Hamburg, Jerman). Ukuran hidrodinamik dan potensi zeta diukur dengan penganalisis NanoBrook 90 Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA).
Persiapan Ekstrak Berair A. kapiler , P. oleracea , dan P. vulgar
Bagian udara kering P. vulgar dan A. kapiler , termasuk bunga dan daunnya, dibeli dari Omniherb (Daegu, Republik Korea), dan P. oleracea diperoleh dari Handsherb (Youngchun, Republik Korea). Ekstrak berair dari bagian udara dari setiap tanaman disiapkan dengan sonikasi (WUC-A22H, Daihan Scientific Co. Ltd., Republik Korea). Untuk setiap tanaman, 100 g tanaman cincang diekstraksi tiga kali dengan air deionisasi (1000 mL). Prosedur ekstraksi terdiri dari sonikasi tanaman pada 25 °C selama 3 jam. Ekstrak berair disaring, dan filtratnya diliofilisasi dalam pengering beku vakum (FD8518, IlShinBioBase Co. Ltd., Republik Korea). Terakhir, ekstrak bubuk dari setiap tanaman diperoleh dan disimpan pada suhu 20°C sebelum digunakan.
Aktivitas Penanggulangan Radikal DPPH
Di setiap sumur dari 96-sumur microplate, 20 L masing-masing ekstrak dicampur dengan larutan radikal DPPH dalam etanol (0,1 mM, 180 L) untuk memberikan beberapa konsentrasi akhir ekstrak (31,25 μg/mL, 62,5 μg/mL, 125 μg/mL, dan 250 g/mL). Pelat diinkubasi dalam gelap selama 30 menit pada suhu sekitar, dan kemudian, absorbansi masing-masing sumur diukur pada 517 nm menggunakan pembaca multi-deteksi (Synergy HT, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). BHT digunakan sebagai standar. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Absorbansi AuNP dikurangi dari absorbansi setiap sampel untuk menghilangkan absorbansi intrinsik AuNP pada 517 nm.
Aktivitas Penanggulangan Radikal ABTS
Kation radikal ABTS dibuat dengan reaksi 1:1 (v/v ) campuran larutan ABTS 7,4 mM dan larutan kalium persulfat 2,6 mM selama 24 jam dalam gelap pada suhu sekitar. Larutan radikal ABTS diencerkan dengan etanol hingga absorbansi 0,74 pada 730 nm untuk pengukuran. Di setiap sumur dari 96-sumur mikroplate, larutan radikal ABTS dalam etanol (180 μL) ditambahkan ke 20 L setiap ekstrak (konsentrasi akhir ekstrak, 15,63 μg/mL, 31,25 μg/mL, 62,5 μg/mL, dan 125 μg/mL). Setelah inkubasi selama 10 menit dalam gelap pada suhu kamar, absorbansi masing-masing sumur diukur pada 730 nm menggunakan pembaca multi-deteksi. Larutan vitamin C disiapkan sebagai standar. Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.
Mengurangi Daya
Volume yang sama (500 L) dari berbagai konsentrasi ekstrak dicampur dengan buffer fosfat 0,2 M (pH 6,6, 500 L) dan 1% kalium heksasianoferat(III) (500 L). Konsentrasi akhir ekstrak adalah 52,1 g/mL, 104,2 g/mL, 208,3 μg/mL, dan 416,7 g/mL. Setiap campuran diinkubasi pada suhu 50 °C. Setelah 20 menit, asam trikloroasetat (10%, 500 L) ditambahkan ke dalam campuran, diikuti dengan sentrifugasi pada 3400g paksa selama 10 menit. Kemudian, larutan besi klorida (0,1%, 100 L) ditambahkan ke 500 L supernatan. Setelah 10 menit, absorbansi campuran reaksi diukur pada 700 nm menggunakan pembaca multi-deteksi. BHT digunakan sebagai standar. Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga.
Total Konten Fenolik
Hubungan antara aktivitas antioksidan dan kandungan senyawa fenolik diselidiki. Dua puluh mikroliter ekstrak dicampur dengan 100 L reagen Folin-Ciocalteu (diencerkan 10 kali dengan air deionisasi) dan 80 L natrium karbonat (7,5%, b/v ). Reaksi dilakukan dalam gelap pada suhu kamar. Setelah 30 menit, absorbansi pada 765 nm diukur, dan kandungan total fenolik ditentukan menggunakan kurva kalibrasi yang dibuat dengan asam galat. Semua penentuan dilakukan dalam rangkap tiga.
Biofabrication PO-AuNPs, AC-AuNPs, dan PV-AuNPs
Dua larutan stok disiapkan sebelum reaksi biofabrikasi:kalium emas(III) klorida (10 mM) dan ekstrak (2%, w/v ). Larutan stok dari setiap ekstrak (2%) disentrifugasi (18.500g gaya, 30 menit, 18 °C). Supernatan dikumpulkan dan digunakan untuk reaksi biofabrikasi. Konsentrasi akhir disesuaikan dengan 0,5 mM kalium emas(III) klorida dan 0,05% (b/v ) ekstrak dalam botol kaca 2 mL untuk biofabrikasi AuNPs. Setelah garam Au dicampur dengan ekstrak, inkubasi dilakukan pada suhu 37°C dalam oven kering selama 5 jam. Kemudian, spektrum UV-tampak diperoleh dalam kisaran 300~800 nm.
Budaya Sel
Tiga sel kanker (HT-29, PANC-1, dan MDA-MB-231) dibeli dari Korean Cell Line Bank (Seoul, Republik Korea). Sel ditumbuhkan dalam DMEM glukosa tinggi yang dilengkapi dengan 10% FBS, penisilin (100 unit/mL), dan streptomisin (100 g/mL). Sel dikultur pada suhu 37 °C (disediakan 5% CO2 ) dalam inkubator dan mempertahankan sekitar 80% pertemuan sebelum tripsinisasi.
Sitotoksisitas
Kit EZ-CYTOX dari DoGenBio (Gyonggi, Republik Korea) digunakan untuk uji WST untuk menilai sitotoksisitas terhadap sel kanker. Sel-sel diunggulkan dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 5,0 × 10
3
sel / sumur. Inkubasi dilakukan selama 24 jam dalam inkubator 37°C di bawah CO2 (5%) atmosfer. Setelah inkubasi, media dibuang. Kemudian, konsentrasi PV-AuNPs yang berbeda (0, 29.9, 59.8, 119.6, 239.2, dan 478.3 μg/mL berdasarkan konsentrasi Au yang diukur dengan analisis ICP-OES) ditambahkan ke sel dengan media kultur baik di hadapan atau tidak adanya FBS. Setelah inkubasi 24 jam lagi pada suhu 37°C dalam inkubator, reagen EZ-CYTOX (10 μL) ditambahkan, dan sel-sel diinkubasi dalam CO2 inkubator selama 1 jam tambahan. Absorbansi diukur pada 450 nm menggunakan pembaca multimode hybrid Cytation (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Absorbansi intrinsik PV-AuNPs mengganggu pengukuran sitotoksisitas pada 450 nm. Oleh karena itu, absorbansi latar belakang PV-AuNPs dikurangi dari absorbansi setiap titik data yang diukur pada 450 nm. Absorbansi latar belakang PV-AuNPs diukur dalam kondisi bebas WST. Selain itu, volume air deionisasi yang sama digunakan sebagai kontrol sebagai pengganti PV-AuNPs.
Analisis Statistik
Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, dan hasilnya disajikan sebagai mean ± standard error (SE). Signifikansi perbedaan diselidiki menggunakan ANOVA (one-way analysis of variance) diikuti dengan uji perbandingan ganda Tukey atau uji perbandingan ganda Newman-Keuls. Analisis statistik dihitung menggunakan Perangkat Lunak GraphPad (Perangkat Lunak GraphPad versi 5.02, San Diego, CA, USA). Hasilnya dianggap signifikan secara statistik untuk nilai p < 0,05.
Hasil dan Diskusi
Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak
Ekstrak berair dari bagian udara dari setiap tanaman diperoleh dengan sonikasi. Hasil ekstraksi A. kapiler , P. oleracea , dan P. vulgar adalah 14,1%, 39,12%, dan 28,6%, masing-masing. Hasil ekstraksi tertinggi ditunjukkan pada P. oleracea , diikuti oleh P. vulgar dan terakhir oleh A. kapiler . Untuk menilai aktivitas antioksidan dari ekstrak, kami mengukur aktivitas penangkapan radikal bebas, daya pereduksi, dan kandungan total fenolik. Aktivitas penangkapan radikal bebas dari ekstrak ditentukan dengan uji DPPH dan ABTS. DPPH banyak digunakan untuk menilai aktivitas antioksidan senyawa fenolik karena radikal DPPH merupakan radikal bebas stabil yang kehilangan intensitas absorbansinya ketika direduksi oleh antioksidan. Uji ABTS mengukur kemampuan antioksidan untuk mengais radikal yang dihasilkan oleh reaksi zat pengoksidasi kuat dengan ABTS. Pengurangan absorbansi radikal ABTS oleh antioksidan dengan sifat pendonor hidrogen dinilai. Ekstrak air menunjukkan aktivitas pemulungan dengan cara yang bergantung pada dosis. Pada konsentrasi yang diuji (15,63 μg/mL, 31,25 μg/mL, 62,5 μg/mL, 125 μg/mL, dan 250 μg/mL), ekstrak P. vulgar (IC50 50.35 ± 1.22 μg/mL terhadap radikal DPPH; IC50 38.6 ± 0.44 μg/mL terhadap radikal ABTS) menunjukkan aktivitas yang paling ampuh melawan radikal DPPH dan ABTS diikuti oleh ekstrak A. kapiler (IC50 156.72 ± 0.97 μg/mL terhadap radikal DPPH; IC50 147.28 ± 2.95 μg/mL terhadap radikal ABTS) dan kemudian ekstrak P. oleracea (IC50 247.33 ± 1.57 μg/mL terhadap radikal DPPH; IC50 305,54 ± 4,86 μg/mL melawan radikal ABTS). Khususnya, P. vulgar menunjukkan aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH yang lebih kuat daripada BHT (IC50 71,37 ± 0,84 μg/mL), yang digunakan sebagai standar (Tabel 1 dan Gambar 1a, b). Ekstrak P. vulgar menunjukkan aktivitas pemulungan radikal DPPH dan ABTS tertinggi di antara ketiga ekstrak. Hasil ini menyiratkan bahwa kemungkinan lebih banyak senyawa antioksidan akan ada di P. vulgar daripada di A. kapiler dan P. oleracea.
Aktivitas pemulungan radikal DPPH dan ABTS dan kekuatan pereduksi ekstrak air A. kapiler , P. oleracea , dan P. vulgar . a Kegiatan penangkal radikal DPPH. b Kegiatan penangkal radikal ABTS. c Mengurangi kekuatan ekstrak. Data disajikan sebagai mean ± SEM. Tanda bintang menunjukkan signifikansi perbedaan versus standar (BHT atau vitamin C):*p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001. Hasilnya mewakili tiga eksperimen independen
Kami juga memeriksa aktivitas antioksidan dari ekstrak via uji daya pereduksi. Dengan adanya antioksidan, potasium ferricyanide (Fe
3+
) diubah menjadi kalium ferrosianida (Fe
2+
), yang bereaksi dengan besi klorida untuk membentuk kompleks besi-besi. Kompleks besi-besi memiliki serapan maksimum pada 700 nm, yang dapat digunakan untuk mengevaluasi daya reduksi antioksidan. Dalam laporan saat ini, daya pereduksi dinyatakan sebagai konsentrasi (μg/mL) dari setiap ekstrak yang memberikan absorbansi 0,7 pada 700 nm. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1c, P. vulgar (162,98 μg/mL) menghasilkan daya reduksi yang jauh lebih tinggi daripada A. kapiler (235,38 μg/mL) dan Hal. oleracea (396,16 μg/mL). Seperti disebutkan sebelumnya, hasil daya reduksi juga menunjukkan bahwa kemungkinan lebih banyak senyawa antioksidan akan ada di P. vulgar daripada di A. kapiler dan P. oleracea.
Kandungan total fenolik masing-masing ekstrak juga diselidiki. Telah diketahui dengan baik bahwa senyawa fenolik merupakan antioksidan potensial dan memiliki kemampuan untuk mengais radikal karena gugus hidroksilnya. Dengan demikian, aktivitas antioksidan ekstrak tumbuhan dapat berkorelasi baik dengan kandungan fenoliknya. Kurva kalibrasi standar dibuat menggunakan asam galat, dan kurva ini menunjukkan hubungan linier (y = 6.0617x + 0.1293, r
2
= 0.9983). Menggunakan kurva standar, kandungan total fenolik dihitung dan dinyatakan sebagai miligram setara asam galat (GAE) per gram ekstrak. Total kandungan fenolik dari ekstrak adalah 90,53 ± 6.81 mg GAE/g untuk P. vulgar , 39,88 ± 4,55 mg GAE/g untuk A. kapiler , dan 18,32 ± 2,76 mg GAE/g untuk P. oleracea . Jumlah total kandungan fenolik tertinggi pada P. vulgar di antara tiga ekstrak.
Ada korelasi positif antara kandungan total fenolik dan kemampuan ekstrak untuk mengais radikal atau daya pereduksinya. Secara bersama-sama, ekstrak air A. kapiler , P. oleracea , dan P. vulgar menunjukkan aktivitas antioksidan yang signifikan. Secara khusus, ekstrak P. vulgar menunjukkan aktivitas pemulungan radikal terbesar terhadap radikal DPPH dan ABTS, daya pereduksi terkuat, dan kandungan total fenolik tertinggi, menyiratkan bahwa ekstrak P. vulgar akan mengerahkan aktivitas terkuat sebagai agen pereduksi untuk biofabrikasi AuNPs. Hasil menarik dari biofabrikasi AuNPs menggunakan ketiga ekstrak tersebut akan dibahas pada bagian berikut.
Biofabrication AC-AuNPs, PO-AuNPs, dan PV-AuNPs
Kami telah mengusulkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak sangat mempengaruhi proses biofabrikasi AuNPs. Karena aktivitas antioksidan merupakan kekuatan pendorong utama dalam reduksi garam Au menjadi AuNPs, P. vulgar , yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi, mampu menjadi agen pereduksi yang paling efisien. Proses biofabrikasi diikuti oleh spektrofotometri UV-tampak, karena AuNPs memiliki SPR yang khas dalam rentang panjang gelombang inframerah dekat-tampak. Biofabrikasi AuNPs dilakukan dengan mencampurkan garam Au dengan masing-masing larutan ekstrak. Setiap ekstrak mengandung beragam fitokimia yang sangat efisien untuk mereduksi garam Au menjadi AuNP.
Pita SPR AuNP yang berbeda menghasilkan perubahan warna larutan kuning pucat yang awalnya menjadi biru tua untuk PO-AuNPs, coklat fluoresen untuk AC-AuNPs, dan merah anggur untuk PV-AuNPs (Gbr. 2) . Spektrum UV-terlihat direkam setelah inkubasi pada 37 ° C dalam oven kering selama 5 jam untuk mengamati pita SPR yang berbeda dari setiap set AuNPs (Gbr. 3). Absorbansi maksimum diamati pada 530 nm untuk PV-AuNPs dan pada 555 nm untuk AC-AuNPs. Dalam kasus PO-AuNPs, pita SPR yang luas diamati dari 500 hingga 700 nm. Ketiga ekstrak tersebut menghasilkan AuNPs dengan pita SPR karakteristik dalam spektrum UV-tampak. Setiap perubahan warna bersama dengan pita SPR yang berbeda jelas mendukung keberhasilan biofabrikasi AuNPs dengan setiap ekstrak. Kami mengusulkan bahwa tiga faktor yang terkait dengan aktivitas antioksidan (aktivitas penangkal radikal bebas, kandungan fenolik total, dan daya pereduksi) mempengaruhi biofabrikasi AuNP. Ekstrak P. vulgar mencetak skor tertinggi untuk ketiga faktor, diikuti oleh A. kapiler dan terakhir oleh P. oleracea . Menariknya, PO-AuNPs diperlihatkan beragregasi setelah disimpan pada suhu sekitar (25 °C) selama 30 menit. Hasil ini menunjukkan bahwa PO-AuNPs adalah yang paling tidak stabil, seperti aktivitas antioksidan, jumlah senyawa fenolik total, dan daya pereduksi P. oleracea terendah di antara ketiga ekstrak tersebut. Sebaliknya, PV-AuNPs menunjukkan absorbansi tertinggi dan larutan merah anggur transparan. Absorbansi AC-AuNPs berada di antara PO-AuNPs dan PV-AuNPs. Oleh karena itu, berdasarkan pengamatan ini, ditentukan bahwa aktivitas penangkapan radikal bebas yang lebih tinggi, kandungan fenolik total, dan daya pereduksi P. vulgar ekstrak menghasilkan sintesis AuNP yang lebih stabil dibandingkan dengan AuNP yang dihasilkan oleh ekstrak A. kapiler dan P. oleracea . Secara kolektif, pita SPR maksimum menunjukkan pergeseran bathokromik dan hipokromik dengan penurunan aktivitas antioksidan ekstrak. Selanjutnya, bentuk pita SPR cenderung melebar dengan menurunnya aktivitas antioksidan. Dengan demikian, PV-AuNPs selanjutnya dicirikan oleh HR-TEM, HR-XRD, ukuran hidrodinamik dan pengukuran potensial zeta. Untuk mengetahui hasil reaksi, dilakukan analisis ICP-OES. Aktivitas antioksidan dan sitotoksisitas dengan ada/tidaknya FBS dievaluasi lebih lanjut terhadap sel kanker.
Foto digital PO-AuNPs, AC-AuNPs, dan PV-AuNPs
Spektrum UV-terlihat dari PO-AuNPs (garis hitam), AC-AuNPs (garis merah), dan PV-AuNPs (garis biru)
Gambar HR-TEM dari PV-AuNPs
Teknik mikroskopis adalah alat yang paling efektif untuk memvisualisasikan nanopartikel. Seiring dengan HR-TEM, pemindaian mikroskop elektron dan mikroskop gaya atom biasanya digunakan untuk menentukan ukuran, morfologi, topografi, dan struktur dua dimensi/tiga dimensi. Ukuran dan morfologi PV-AuNP diselidiki dengan HR-TEM. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, berbagai bentuk, termasuk bola, segitiga, batang, belah ketupat, dan segi enam, diamati (Gbr. 4a~e). Pengamatan struktur kisi dalam batang (Gbr. 4f, g) dan segitiga (Gbr. 4h) dengan jelas menunjukkan bahwa PV-AuNPs adalah kristal di alam. Hasil ini sangat didukung oleh hasil analisis HR-XRD selanjutnya. Ukuran setiap bentuk partikel diukur dari gambar HR-TEM, dan histogram ukuran yang dihasilkan diilustrasikan pada Gambar. 5. Semua histogram menunjukkan distribusi Gaussian. Nanopartikel diskrit dalam gambar dipilih secara acak untuk mendapatkan ukuran rata-rata setiap bentuk. Diameter bola ditentukan menjadi 23,8 ± 1,3 nm dari 250 nanopartikel (Gbr. 5a). Menariknya, segitiga sama sisi diproduksi; dengan demikian, kami mengukur ketinggian 64 nanopartikel (25,7 ± 2,2 nm, Gbr. 5b). Dua puluh tujuh nanopartikel berbentuk batang dipilih secara acak untuk menentukan panjang rata-rata (28,4 ± 0,4 nm, Gambar 5c). Rasio aspek rata-rata, yang didefinisikan sebagai panjang dibagi lebar, batang ditentukan menjadi 2,4. Untuk bentuk belah ketupat, 38 belah ketupat dipilih secara acak dalam gambar. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5d, e, panjang rata-rata garis diagonal panjang dan pendek diukur masing-masing menjadi 22,0 ± 0,6 nm dan 15,4 ± 0,3 nm. PV-AuNPs berbentuk beragam memiliki ukuran kurang dari 30 nm, dan ukurannya dibandingkan dengan ukuran hidrodinamik di bagian berikut.
HR-TEM Gambar PV-AuNPs. Bilah skala mewakili a 50 nm, b 50 nm, c 50 nm, d 50 nm, e 10 nm, f 2 nm, g 2 nm, dan h 2 nm
Histogram ukuran PV-AuNPs. a Diameter bola. b Tinggi segitiga sama sisi. c Panjang batang. d Panjang (garis diagonal panjang) belah ketupat. e Panjang (garis diagonal pendek) belah ketupat
Ukuran Hidrodinamika dan Potensi Zeta PV-AuNPs
Ukuran hidrodinamik dan potensi zeta merupakan karakteristik penting dalam penelitian nanopartikel untuk aplikasi lebih lanjut. Umumnya, ukuran yang diukur dari gambar HR-TEM lebih kecil daripada ukuran hidrodinamik, karena ukuran hidrodinamik mencerminkan biomolekul yang terikat pada permukaan nanopartikel. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, ukuran hidrodinamik ditentukan menjadi 45 ± 2 nm dengan indeks polidispersitas 0,258, yang lebih besar dari ukuran bola yang diukur dari gambar HR-TEM (23,8 ± 1,3 nm dari 250 nanopartikel) . Hasil ini dengan jelas menunjukkan bahwa fitokimia dalam ekstrak terikat pada permukaan PV-AuNPs dan menstabilkannya. Selain itu, PV-AuNPs memiliki potensi zeta negatif sebesar 13,99 mV (Gbr. 6b). Hasil ini menunjukkan bahwa fitokimia dengan muatan negatif kemungkinan besar berkontribusi pada potensi zeta negatif. This negative zeta potential gives repulsive forces in a colloidal solution of PV-AuNPs endowing its stability. Therefore, one of our future works will include the phytochemical screening on the extract of P. vulgaris to elucidate the exact compounds which contribute to the negative zeta potential.
Hydrodynamic size and zeta potential of PV-AuNPs. a Hydrodynamic size. b Zeta potential
HR-XRD Analysis of the PV-AuNPs
X-ray diffraction analysis is generally employed to obtain crystallographic information about metallic nanoparticles. The characteristic diffraction patterns in terms of the Bragg reflections obtained from HR-XRD showed that the PV-AuNPs possessed a crystalline structure. The diffraction peaks (2θ values) observed at 38.1°, 44.5°, 64.8°, and 77.4° corresponded to the (111), (200), (220), and (311) planes, respectively, of a face-centered cubic structure in the PV-AuNPs (Fig. 7). The Scherrer equation (D = 0.89·λ/W·cosθ ) was used to determine the approximate size of the PV-AuNPs. We selected the most intense (111) peak for application in the equation. The definition of each term in the equation is as follows:D is the size of the PV-AuNPs determined from the (111) peak, θ is the Bragg diffraction angle of the (111) peak, λ is the X-ray wavelength that was utilized, and W is the full width at half maximum (FWHM) of the (111) peak, in radians. From the Scherrer equation, the approximate size of the PV-AuNPs was determined to be 16.7 nm. The size determined from the Scherrer equation was smaller than the sizes measured from both HR-TEM images and the hydrodynamic size. The hydrodynamic size was the largest, possibly due to the fact that phytochemicals in the extract bound to the surface of the PV-AuNPs.
HR-XRD analysis of PV-AuNPs
Reaction Yield of the PV-AuNPs
ICP-OES was used to estimate the reaction yield. First, the total concentration of Au was obtained by analyzing the PV-AuNP solution. Second, the PV-AuNPs were centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was analyzed to ascertain the concentration of unreacted Au in the reduction reaction. Then, the reaction yield was estimated as follows:reaction yield (%) = 100 − [Au concentration in the supernatant/Au concentration in the colloidal solution] × 100.
Based on ICP-OES analysis, the concentrations of Au in the colloidal PV-AuNP solution and the supernatant were determined to be 96.337 ppm and 0.679 ppm, respectively. Therefore, the reaction yield of the PV-AuNPs was determined to be 99.3%. From the ICP-OES results, we concluded that the reaction condition was optimal which produced a high reaction yield of PV-AuNPs.
Antioxidant Activity of the PV-AuNPs
The DPPH radical scavenging activity was examined to evaluate the antioxidant activity of the PV-AuNPs. As shown in Fig. 8, the DPPH radical scavenging activity of the PV-AuNPs was nearly constant at a concentration of less than 20.9 μg/mL (based on the Au concentration). However, as the concentration increased (41.9~334.8 μg/mL based on the Au concentration), the DPPH radical scavenging activity also increased, suggesting that the activity was dose-dependent. The IC50 of the PV-AuNPs was observed to be 165.0 μg/mL, which was equivalent to the IC50 of vitamin C (49.4 μM).
DPPH radical scavenging activity of PV-AuNPs. The concentration was expressed as Au concentration
Green-synthesized AuNPs or AgNPs have been known to possess antioxidant activity in terms of DPPH radical scavenging activity [20, 21]. Ginseng-berry-mediated AuNPs demonstrated antioxidant activity [20]. The absorption of phytochemicals in the ginseng berry extract on the surface of nanoparticles having a large surface area can be credited to the antioxidant activity of AuNPs [20]. Green-synthesized AuNPs using Angelica pubescens roots showed antioxidant activity with a dose-dependent manner [21]. Secondary metabolites in A. pubescens such as flavonoids, sesquiterpenes, and phenolic compounds are potential contributors for the free radical scavenging activity [21]. However, AgNPs demonstrated higher antioxidant activity than AuNPs in the two articles mentioned above.
Cytotoxicity of the PV-AuNPs
The cytotoxicity of the PV-AuNPs against three cancer cells from different tissue types (colon, pancreas, and breast) was evaluated to examine the tissue-specific cytotoxicity of the nanoparticles in the presence/absence of FBS (Fig. 9). When serum was present during the cell culture, various kinds of protein coronas formed. The protein corona was dependent on the characteristics of the nanoparticles, such as the size, shape, surface charge, and surface roughness [22]. The protein corona can either increase or decrease the cellular uptake and cytotoxicity of the nanoparticles [23]. However, there are controversial reports regarding whether the protein corona causes the cytotoxicity to increase or decrease. Thus, the cytotoxicity of the PV-AuNPs was evaluated in the presence and absence of FBS. In the absence of FBS, HT-29 showed the greatest cytotoxicity at the tested concentrations (29.9~478.3 μg/mL) among three cells (Fig. 9a), followed by MDA-MB-231 (Fig. 9b) and lastly by PANC-1 (Fig. 9c). However, in the presence of FBS, these cells demonstrated a different phenomenon. PANC-1 showed the highest cytotoxicity, followed by HT-29 cells. In the absence of FBS and with 478.3 μg/mL Au, both the PANC-1 and MDA-MB-231 cells did not show any significant cytotoxicity, while strong cytotoxicity was observed for the HT-29 cells (65.6% cytotoxicity). However, in the presence of FBS, cytotoxicity was observed for PANC-1 (37.5% cytotoxicity) at 478.3 μg/mL Au. In general, the PV-AuNPs surrounded by a protein corona strongly influenced the cytotoxicity against cancer cells, although the results were tissue-specific. The protein corona produced by FBS increased the cytotoxicity against PANC-1 when compared with the cytotoxicity in the absence of FBS; however, the cytotoxicity decreased in the presence of the protein corona for HT-29 when compared with the cytotoxicity without the protein corona.
In vitro cytotoxicity on cancer cells. a HT-29. b MDA-MB-231. c PANC-1
It has been reported that a variety of proteins bind to both positively and negatively charged AuNPs, while few proteins bind to AuNPs with a neutral charge [17, 24]. The negatively charged AuNPs showed a higher affinity and a slower release of fibrinogen protein than the positively charged AuNPs, suggesting the existence of specific binding sites for fibrinogen on the negatively charged AuNPs [17]. The PV-AuNPs possessed a negative zeta potential; thus, the binding of fibrinogen may affect the cytotoxicity against cancer cells. The investigation of the protein corona of nanoparticles is beneficial in nanomedicine research for future biomedical and clinical applications.
Conclusions
The aqueous extracts of A. capillaris , P. oleracea , and P. vulgaris exhibited antioxidant activity which was evaluated by free radical scavenging activity, total phenolic content, and reducing power. P. vulgaris exerted the highest antioxidant activity, followed by A. capillaris and P. oleracea . The extract of P. vulgaris possessing the highest antioxidant activity was a very efficient green reducing agent for the biofabrication of AuNPs. The findings of our study demonstrate that the factors of the antioxidant activity, such as the free radical scavenging activity, reducing power, and total phenolic content, are closely correlated with the color of the colloidal solution and the shape of the SPR band of the resulting AuNPs. When the antioxidant activity was high, the resulting AuNPs showed a narrow SPR band with a strong absorbance. In contrast, a broad SPR band was observed for the PO-AuNPs, in which P. oleracea exhibited the lowest antioxidant activity among the three extracts. Furthermore, the PO-AuNPs aggregated easily after storage at ambient temperature. Consequently, the extract of P. vulgaris produced a wine-red colloidal solution of PV-AuNPs with various shapes with a maximum SPR of 530 nm. A face-centered cubic crystalline pattern of PV-AuNPs was confirmed by high-resolution X-ray diffraction analysis. The reaction yield was estimated by ICP-OES to be 99.3%. The hydrodynamic size (45 ± 2 nm) was larger than that measured from HR-TEM images suggesting that phytochemicals bound on the surface of the PV-AuNPs. Furthermore, phytochemicals with negative charges possibly attributed to a negative zeta potential of − 13.99 mV. The antioxidant activity of the PV-AuNPs was dependent on the Au concentration that was assessed based on the DPPH radical scavenging activity. Green-synthesized AuNPs using ginseng-berry and A. pubescens root extracts also showed DPPH radical scavenging activity [20, 21]. The PV-AuNPs showed cytotoxicity against HT-29, PANC-1, and MDA-MB-231 cells. Interestingly, the presence or absence of FBS dramatically affected the cytotoxicity against these cells. This phenomenon was possibly due to the protein corona that surrounded the surface of the nanoparticles.
Currently, AuNPs have diverse applications in nanomedicine as drug delivery vehicles or carriers of anticancer agents such as doxorubicin. P. vulgaris ethylacetate fraction showed cardioprotective effects with a concentration-dependent manner on isolated rat cardiomyocytes subjected to doxorubicin-induced oxidative stress [25]. PV-AuNPs can be applied as doxorubicin delivery vehicles with a cardioprotective ability. Therefore, our subsequent work will explore the anticancer activities of the PV-AuNPs loaded with doxorubicin for future biomedical and pharmaceutical applications. Diverse plant extracts have a potential to be effective reducing agents for biofabricating AuNPs. When the biofabrication reaction is conducted, it is essential to select a plant extract that possesses a high antioxidant activity in order to produce stable AuNPs. Additionally, P. vulgaris extract has a potential to be used as a reducing agent for the green synthesis of other novel metallic nanoparticles with valuable applications in the future.
