Nanopartikel emas dengan kitosan, kitosan N-terasilasi, dan oligosakarida kitosan sebagai pembawa DNA
Abstrak
Saat ini, nanopartikel emas telah menemukan aplikasi di bidang teknik dan ilmu kedokteran, mengambil keuntungan dari sifat dan karakteristiknya. Resonansi plasmon permukaan, misalnya, adalah salah satu fitur utama untuk aplikasi optik dan sifat fisik lainnya, seperti kepadatan tinggi, yang mewakili kunci untuk penyerapan seluler. Di antara aplikasi lain, di bidang medis, beberapa penyakit dapat diobati dengan menggunakan terapi gen, termasuk gangguan dan infeksi monogenetik atau poligenetik. Penambahan, supresi, atau substitusi gen adalah salah satu dari banyak pilihan untuk manipulasi genetik. Karya ini mengeksplorasi metode non-viral alternatif untuk transfer gen dengan menggunakan nanopartikel emas yang difungsikan dengan polimer organik; dua jalur sintesis yang digunakan:satu dengan natrium borohidrida sebagai reduktor dan yang lain dengan kitosan oligosakarida sebagai reduktor dan stabilisator. Nanopartikel emas terkonjugasi dengan kitosan, kitosan terasilasi dan oligosakarida kitosan, digunakan untuk mengevaluasi efisiensi transfeksi DNA plasmid ke dalam kultur sel (HEK-293). Sifat fisika dan kimia nanokomposit emas dikarakterisasi menggunakan Spektroskopi UV-Vis, - potensial, dan mikroskop elektron transmisi. Selanjutnya, interaksi antara nanopartikel emas dan DNA plasmid ditunjukkan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Tes transfeksi dilakukan dan dievaluasi oleh aktivitas -galaktosidase dan ekspresi protein fluoresensi hijau. Persentase transfeksi yang diperoleh dengan kitosan, kitosan terasilasi, dan oligosakarida kitosan masing-masing sebesar 27%, 33%, dan 60%.
Latar Belakang
Terapi gen secara singkat dapat didefinisikan sebagai cara memasukkan materi genetik ke dalam sel untuk tujuan yang berbeda, pengobatan penyakit genetik di antaranya [1]. Di antara dua jenis utama vektor DNA untuk terapi gen, virus dan non-virus, yang terakhir memiliki keunggulan tidak adanya imunogenisitas, kepatuhan yang baik, non-infektivitas [2], stabilitas dalam penyimpanan, dan kemudahan produksi. Di sisi lain, bahkan ketika vektor virus seperti retrovirus, adeno-virus, virus terkait adeno, dll., memiliki tingkat transfeksi tinggi dan transkripsi cepat, mereka menghadirkan kelemahan seperti pembersihan cepat dari sirkulasi, toksisitas, imunogenisitas, dan kapasitas yang berkurang. untuk membawa sejumlah besar informasi [3,4,5]. Biasanya, dalam kasus pembawa non-virus, DNA asing dimuat ke plasmid dan dilindungi dan distabilkan selama pembentukan konjugat atau kompleks. Secara khusus, kitosan (CO) telah dipelajari untuk pengembangan vektor DNA non-virus, karena telah menunjukkan tingkat transfeksi yang tinggi dan toksisitas yang rendah, melindungi DNA dari asam nukleat selama transportasi antar sel [4]. Polimer ini banyak terdapat di alam (ditemukan sebagai penyusun utama cangkang krustasea dan sebagai bagian dari dinding sel banyak jamur [6]) merupakan polisakarida yang dapat diperoleh setelah transformasi kitin (memperoleh 2-amino-2-deoksi - units-D-glukopiranosa unit berulang tetapi masih mempertahankan sejumlah kecil residu 2-asetamido-2-deoksi-β-D-glukopiranosa [7]) (Gbr. 1a). Aplikasi medis kitosan asli memerlukan, dalam banyak kasus, beberapa modifikasi polimer; Di antara kelemahan utama yang harus diatasi adalah ketidaklarutan dalam pH fisiologis dan viskositas tinggi dalam larutan asam encer [8]. Beberapa peneliti telah menunjukkan bahwa dinamika transfeksi sel tergantung pada ukuran dan bentuk kendaraan [1, 8,9,10,11,12], misalnya, Huo et. Al. melaporkan bagaimana sifat ini berkorelasi dengan efisiensi penetrasi untuk kasus nanopartikel emas [10].
Kelarutan kitosan dapat dimodifikasi dengan mengubah distribusi gugus asetil yang tersisa dalam rantai dan derajat asetilasi [13]. Metode lain untuk mengontrol sifat fisik kitosan adalah asilasi (Gbr. 1b). Berdasarkan ketersediaan gugus amino dan tingkat asetilasi, beberapa bio-interaksi kitosan dapat dikendalikan, misalnya meningkatkan hidrofobisitasnya melalui asilasi dengan asam lemak [7]. Le Tien et. Al. [7] telah melaporkan kitosan N-asilasi untuk matriks pelepasan terkontrol dalam obat-obatan. Bhattarai et. Al. [14] memperoleh nanopartikel emas terstabilisasi kitosan N-terasilasi untuk aplikasi dalam kondisi fisiologis, menunjukkan keunggulan kitosan non-terasilasi. Modifikasi kitosan lain yang bermanfaat adalah pengurangan panjang rantai polimer (Chitosan oligosaccharide, COS) [15]. Di antara sifat-sifat dari banyak jenis COS yang diperoleh dari kitosan, viskositasnya yang lebih rendah dan kelarutan yang lebih tinggi dalam air sangat berguna untuk banyak aplikasi [16]. Telah dilaporkan bahwa kitosan dengan berat molekul rendah dapat meningkatkan serapan seluler, terutama karena panjang rantainya yang lebih pendek (2-10 unit D-glukosamin) (Gbr. 1c) dan gugus amino bebas [17,18,19]. Selain itu, sintesis nanopartikel emas dengan kitosan oligosakarida sebagai reduktor tidak termasuk reagen toksik [20].
Struktur kimia a kitosan, b kitosan terasilasi, dan c oligosakarida kitosan
Nanopartikel emas (AuNPs) mengarah pada pengembangan bahan nano jenis baru, memanfaatkan sifat optiknya dan stabilitas fisik tinggi yang menjadikannya pilihan yang sangat layak untuk beberapa aplikasi [21,22,23,24,25]; dengan ini, mereka menyajikan peningkatan untuk transfeksi seluler melalui lipokompleks atau polimer, dengan memiliki kepadatan yang lebih tinggi dan dengan demikian mengurangi waktu serapan [12]. Karena emas memiliki afinitas yang besar terhadap amino (-NH2 ), gugus fungsi siano (-CN), dan tiol (-SH), peluang besar terbuka untuk berbagai jenis fungsi [9, 26]. Monolayer kationik diperoleh, misalnya, dengan menambahkan polimer kationik ke nanopartikel emas, meningkatkan interaksi asam nukleat dan adsorpsi elektrostatik [27, 28]. Dengan cara ini, nanokompleks yang menggabungkan kitosan dan emas mengambil keuntungan dari kedua bahan untuk aplikasi biologis [29,30,31,32,33], mewakili bahan yang menjanjikan untuk pengembangan pembawa DNA [5, 10, 12, 14].
Ada berbagai macam metode biologis untuk mensintesis AuNPs, yang terdiri dari penggunaan karbohidrat, mikroorganisme, enzim, vitamin, dan biopolimer, antara lain [34]. Di antara apa yang disebut sintesis hijau [35], penggunaan metode sintesis satu pot, menggunakan kitosan sebagai zat pereduksi dan penstabil, telah terbukti lebih merdu dan aman untuk aplikasi biomedis [36, 37]. Sama seperti metode sintesis tradisional, dalam kasus sintesis satu pot, ukuran partikel yang diperoleh tergantung pada konsentrasi zat pereduksi; Dengan cara ini, dalam kasus khusus kitosan oligosakarida, rasio kitosan/emas harus dikontrol untuk mendapatkan ukuran partikel yang berbeda, karena berat molekul kitosan merupakan faktor penting untuk distribusi ukuran dan bentuk nanopartikel. Karya ini ditujukan untuk evaluasi berbagai nanokompleks berbasis kitosan-AuNP untuk transfeksi DNA, termasuk sintesis hijau/satu pot dengan 5 kDa kitosan oligosakarida yang merupakan berat molekul lebih rendah daripada yang dilaporkan untuk aplikasi serupa [36, 38].
Tes transfeksi dilakukan pada garis sel HEK-293 (Homo sapiens (manusia)-morfologi epitel-ginjal-janin embrio) dengan plasmid pSV-β-Gal dan pIRES2-EGFP. Tes-tes ini dipilih berdasarkan efisiensi transfeksi dan sitotoksisitas yang bergantung pada tipe sel dan itu, menurut Corsi et. Al. [4], transfeksi lebih menguntungkan untuk garis sel HEK-293 dibandingkan dengan MG63 dan sel punca mesenkim.
Metode
Sintesis Nanokomposit
Setiap percobaan dilakukan dengan nanopartikel emas dengan kitosan termodifikasi dan tidak termodifikasi; dua metode sintesis utama yang digunakan:salah satunya melibatkan sintesis kimia untuk nanopartikel emas dengan kitosan dalam bentuknya yang sederhana (CO-AuNPs) dan kitosan yang dimodifikasi secara hidrofobik dengan gugus asil (Acyl-CO-AuNPs) dan yang lainnya hijau/satu- sintesis pot menggunakan kitosan rantai pendek (kitosan oligosakarida, COS@n-AuNPs). Gambar 2 menunjukkan diagram skematik untuk setiap sintesis; prosedur eksperimental yang sesuai dijelaskan di bawah ini.
Diagram skema untuk setiap sintesis:a –b sintesis kimia untuk nanopartikel emas dengan kitosan dalam bentuknya yang sederhana (CO-AuNPs) dan dengan gugus asil yang dimodifikasi secara hidrofobik (Acyl-CO-AuNPs) dan c –f sintesis hijau/satu pot untuk kitosan rantai pendek (chitosan oligosaccharide, COS@n-AuNPs)
Materi
Emas(III) klorida trihidrat (HAuCl4 3H2 O), natrium borohidrida (NaBH4 ), kitosan dengan berat molekul rendah (50-190 kDa, derajat deasetilasi 75%), dan kitosan oligosakarida (berat molekul rendah, 5 kDa) diperoleh dari Sigma Aldrich. Semua peralatan gelas dicuci dan dibiarkan dalam bak aqua regia yang baru disiapkan (HCl:HNO3 , 3:1 v /v ) selama 24 jam, dan dibilas secara menyeluruh dengan air Mili-Q sebelum digunakan, untuk menghilangkan sisa logam [39].
Nanopartikel Chitosan-Gold (CO-AuNPs)
Sintesis nanopartikel kitosan-emas dilakukan dengan mengikuti Huang et. Al. [9] metodologi. Untuk ini, 20 mg larutan kitosan dengan berat molekul rendah (2 mg/ml) ditambahkan ke 10 ml asam asetat 1% dan dicampur dengan vortex sampai benar-benar larut dan disimpan semalaman. Dua mililiter larutan yang diperoleh disaring menggunakan spuit filter polietersulfon 0,22 μm, kemudian dicampur dengan 1 ml HAuCl 10 mM4 3H2 larutan O dengan pengadukan kuat selama 30 menit. 0,4 ml 100 mM NaBH yang baru disiapkan4 larutan dingin digunakan sebagai zat pereduksi; itu ditambahkan dengan menjatuhkan sambil diaduk, dan perubahan warna yang cepat dari kuning menjadi merah anggur diamati; setelah itu, pengadukan dilanjutkan selama total waktu 2 jam (Gbr. 2a).
Kaproil klorida (C6 H11 ClO, Sigma Aldrich) digunakan untuk sintesis nanopartikel emas kitosan terasilasi.
Gelasi
Asilasi kitosan (berat molekul rendah) dilakukan dengan mengikuti metode yang dilaporkan oleh Remant Bahadur et al. [6] dengan sedikit modifikasi. Untuk ini, 0,83 g kitosan ditambahkan ke 100 ml larutan asam asetat 1% di bawah pengadukan magnetik yang dilanjutkan selama 24 h. Lima mililiter larutan ini disaring dengan filter spuit polietersulfon 0,22 m, dan kemudian pH-nya diatur menjadi 7,2 dengan larutan natrium hidroksida (NaOH) 0,1 M ditambahkan perlahan di bawah pengadukan kuat. Satu mililiter kaproil klorida ditambahkan ke 5 ml larutan terakhir ini dan campuran yang dihasilkan diaduk selama 5 jam. PH campuran diatur menjadi 6,8-7 dengan larutan hidroksida. Gel yang diperoleh diendapkan dengan aseton dan disentrifugasi pada 5000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 °C. Kelebihan asam kaproat dihilangkan dengan pencucian tiga kali dengan metanol (50–60 °C) dan penuangan, biarkan kering selama 3 hari di atas kompor. Gel ini digunakan untuk sintesis nanokomposit.
Nanokomposit
Satu mililiter HAuCl 10-mM4 3H2 Larutan O ditambahkan ke 2 ml gel yang diencerkan pada 0,33 % dalam larutan HCl 0,1 M, diaduk selama 1 jam. Terakhir, tambahkan 0,4 ml terakhir 0,1-M NaBH4 larutan dingin yang baru disiapkan sambil diaduk, pembentukan nanopartikel emas terlihat jelas dengan perubahan warna merah muda/merah sebelum menyelesaikan 2 jam pengadukan terus menerus (Gbr. 2b).
COS@n-AuNPs disiapkan dengan mengikuti metodologi yang dimodifikasi yang dilaporkan oleh Manivasagan et al. [20]. Kitosan oligosakarida (COS) ditambahkan ke 10 ml HAuCl4 3H2 larutan O dan diaduk selama 60 menit pada 80 ° C. Empat sintesis dilakukan dengan memvariasikan jumlah COS (100 dan 200 mg) dan konsentrasi emas dalam HAuCl4 3H2 larutan O (0,003 dan 0,017 wt%). Tabel 1 menunjukkan parameter yang digunakan dalam sintesis AuNP untuk setiap eksperimen. Pembentukan nanopartikel emas terbukti dengan perubahan warna merah anggur/merah muda-merah, mencatat perubahan warna pada waktu yang berbeda pada setiap kasus, tergantung pada jumlah zat pereduksi dan prekursor emas. Nanokomposit yang diperoleh dimurnikan dengan sentrifugasi pada 12.000g selama 30 mnt (Gbr. 2c–f).
Karakterisasi Nanokomposit
Spektroskopi Inframerah
Kitosan yang digunakan untuk CO-AuNPs, kitosan terasilasi untuk Asil-CO-AuNPs, dan kitosan oligosakarida untuk rangkaian COS@n-AuNPs dikarakterisasi dengan spektrometri FTIR (Spectrum One, Perkin Elmer) untuk mengkonfirmasi asilasi polimer Asil-CO dengan membandingkan intensitas pita karakteristik dari gugus fungsi antar sampel. Derajat substitusi (SD) diperkirakan dari informasi spektrum IR, menurut Remant Bahadur et. Al. [6].
ξ-Potential
Zetasizer (Nano Z, Malvern) digunakan untuk mengevaluasi potensi permukaan komposit. Potensi positif diharapkan untuk nanokomposit untuk adhesi yang sukses ke DNA untuk membentuk kompleks. ξ- Potensi dievaluasi sebelum dan sesudah pembentukan kompleks untuk mengkonfirmasi perubahan setelah adhesi DNA. 1,5 ml sampel encer yang sesuai digunakan untuk pengukuran potensial permukaan, menggunakan sel kapiler (DTS 1060, Malvern).
Spektroskopi UV-Vis
Spektrum UV-Vis (UV-1800 m, Shimadzu), dalam kisaran 400 hingga 700 nm, diperoleh untuk konfirmasi awal pembentukan nanopartikel emas melalui pita resonansi plasmon permukaan sekitar 530 nm. Sebagai pelengkap, spektrum dari nanokomposit yang baru disiapkan digunakan untuk mengevaluasi fotostabilitas sampel secara kualitatif; ini dilakukan dengan membandingkan dengan spektrum yang diperoleh dari sampel yang sama 150 hari setelah sintesis, dengan mengikuti perubahan di sekitar pita resonansi plasmon permukaan, memilih satu sampel untuk setiap metode, dan menggunakan COS@2-AuNPs sebagai yang paling representatif untuk COS@n-AuNP seri. Sel kuarsa digunakan sebagai wadah sampel dan air deionisasi sebagai blanko.
Transmission Electron Microscopy (TEM)
Mikroskop TEM (JEM 1010, JEOL) digunakan untuk penentuan bentuk dan distribusi ukuran partikel. Untuk gambar TEM, sampel nanokomposit disiapkan dengan mendepositkan 10 μl larutan di atas penyangga jaringan tembaga 200 mesh, ditutup dengan formvar, dan dikeringkan pada suhu kamar selama 15 menit. Tiga gambar untuk setiap sampel dipilih dan dianalisis melalui program pemrosesan pencitraan buatan sendiri yang dikembangkan di bawah perangkat lunak Matlab®.
Derajat Pembentukan dan Adhesi Kompleks
Nanocomposite-pDNA
pSV-β-Gal (6,82 kb) dan pIRES2-EGFP (5,3 kb) (pDNA) diisolasi dari DH5α yang diubah Escherichia coli . Pemurnian plasmid dilakukan dengan lisis basa, menggunakan Mo Bio® UltraClean Microbial DNA Isolation Kit. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memverifikasi integritas struktural plasmid, menggunakan transilluminator ultraviolet berkinerja tinggi, memperoleh gambar dengan Sistem Pencitraan Digital 100 Kodak Gel Logic. Konsentrasi dan kemurnian DNA plasmid divalidasi dengan Synergy™ 2 Multi-Detection Microplate Reader menggunakan program Gen5. Kompleks diperoleh dengan mencampur DNA plasmid (pDNA) dengan masing-masing jenis nanokomposit nanopartikel kitosan emas dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco tanpa serum (DMEM, Sigma-Aldrich) pada jumlah plasmid antara 200 dan 400 ng. Adhesi pDNA pada nanokomposit dievaluasi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa pada 0,8% dan tegangan 90 V selama 60 menit.
Transfeksi Kompleks Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA ke dalam Sel HEK-293
Budaya Sel
HEK-293 Homo sapiens (manusia)-morfologi-epitel sel-sel ginjal-janin embrio dibudidayakan dalam media Dulbecco yang dimodifikasi Eagle dengan serum sapi janin (SFB, Sigma-Aldrich) pada 37 °C di bawah 5% CO2 -mengandung atmosfer. Untuk transfeksi pDNA, sel HEK-293 diunggulkan pada 12.000 sel per sumur dalam pelat 96-sumur dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C dalam 5% CO2 -mengandung atmosfer, memperoleh 90% pertemuan.
Efisiensi Transfeksi dengan pIRES2-EGFP
Fungsionalisasi nanokomposit pDNA in vitro dilakukan dengan menuangkan media kultur dari sumur sampai hampir menutupi sel dan menambahkan larutan kompleks pada setiap sumur (15 μl nanokomposit dan 200 ng DNA), diinkubasi selama 2 h pada kondisi kultur yang sama. Setelah itu, 500 μl DMEM lengkap ditambahkan untuk inkubasi selama 48 h. Transfeksi pIRES2-EGFP dievaluasi secara langsung dengan mikroskop fluoresensi (Axio Vert.A1, Carl Zeiss).
Efisiensi Transfeksi dengan pSV-β-Gal
Histokimia X-gal digunakan untuk mengevaluasi aktivitas -galaktosidase, dengan memodifikasi ekspresi plasmid pSV-β-Gal pada garis sel HEK-293; dalam metodologi ini, sel-sel yang ditransfeksi menjadi biru. Fungsionalisasi nanokomposit pDNA in vitro dilakukan seperti yang dijelaskan di atas, inkubasi selama 2 jam pada kondisi kultur yang sama. Setelah itu, 500 μl DMEM lengkap ditambahkan untuk inkubasi selama 24 jam, ganti media dan inkubasi selama 24 jam. Sumur dicuci dua kali dengan 50 μl phosphate-buffered saline (PBS) steril 1x setelah menghilangkan media kultur, kemudian sel difiksasi dengan campuran formaldehida 2% dan Glutaraldehida 0,2% selama 5 min; setelah itu dicuci dua kali dengan 50 μl PBS 1×. Fixer dihilangkan sebelum dicuci dua kali dengan 50 μl PBS 1× dan kemudian dengan campuran 0,4 mg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, Sigma-Aldrich) yang diencerkan dalam 5 mM kalium ferrosianida (Meyer) dan magnesium klorida 2 mM (Meyer) pada PBS 1×. Kemudian, sel-sel diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Ekspresi -galaktosidase diamati dengan mikroskop brightfield (AE2000, Motic), mengambil 5 bidang per sumur dengan tujuan × 40, mengharapkan sel yang ditransfeksi menjadi biru. Efisiensi transfeksi dievaluasi dengan membandingkan sel dengan ekspresi -galaktosidase (berubah menjadi biru) terhadap total sel per bidang. LipofectAMINE
TM
2000 (30 μl) digunakan sebagai kontrol positif untuk setiap tes.
Viabilitas Sel dengan Metode Pengecualian Pewarna
Mikrokultur digunakan 24 jam setelah sel lewat. Media kultur telah dihapus, dan sel-sel dicuci dengan PBS 1 × sebelum menambahkan 40 μl larutan kompleks. Setelah itu, sel diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 ° C pada 5% CO2 -mengandung atmosfer. Untuk pengecualian pewarna, larutan kompleks dicuci dari sel dengan 50 μl PBS 1× dan 20 μl Trypan blue (0,2% pada PBS 1×) dimasukkan. Dengan campuran terakhir ini, sel diinkubasi selama 10 menit pada 37 °C dan 5% CO2 -mengandung atmosfer. Setelah inkubasi terakhir ini, pewarna dikeluarkan dari sumur dan dibersihkan dengan mencuci dua kali dengan 50 μl PBS 1x. Sel diamati dengan mikroskop brightfield, menghitung sel berwarna biru (mati atau rusak) terhadap total sel per bidang. Tes viabilitas sel diperoleh untuk konsentrasi kompleks yang berbeda pada air, dari 0,1 mM hingga 3 mM, CO-AuNPs dan Asil-CO, pada 3 mM; COS@3-AuNPs dan COS@4-AuNPs, pada 0,5 mM; dan konsentrasi terendah (0,1 mM) untuk COS@1-AuNPs dan COS@2-AuNPs.
Perangkat Lunak Gambar J (Perangkat Lunak Sumber Terbuka (OSS ) lisensi ) bersama dengan plugin Alat Berbasis Gambar untuk Menghitung Inti-ICTN digunakan untuk menghitung sel untuk tes transfeksi dan viabilitas.
Hasil dan Diskusi
Sintesis dan Karakterisasi Nanokomposit
Di antara tiga jenis kompleks yang disintesis dalam karya ini, COS@n-AuNP patut mendapat perhatian khusus karena mereka disintesis tanpa menggunakan reagen beracun, seperti natrium borohidrida atau setiltrimetilamonium bromida (CTAB). Telah dilaporkan bahwa kitosan cocok sebagai agen pereduksi dan penstabil dan konsentrasi optimal untuk mensintesis kompleks AuNP pada ukuran dan bentuk yang diinginkan tergantung pada beberapa faktor:waktu reaksi, suhu, dan derajat deasetilasi kitosan dan berat molekulnya, antara lain [38] , 40]. Berdasarkan pertimbangan ini, berat molekul kitosan dijaga konstan pada 5 kDa untuk empat sintesis COS@n-AuNP, dengan mengambil HAuCl4 3H2 O dan larutan kitosan pada konsentrasi yang berbeda.
Gambar 3 menunjukkan spektrum serapan UV-Vis dari nanokomposit AuNPs-kitosan yang disintesis dalam penelitian ini. Pita plasmon berpusat pada 534 nm untuk kitosan (CO-AuNPs), 507 nm untuk kitosan terasilasi (Acyl-CO-AuNPs), dan untuk berbagai oligosakarida kitosan pada 533 nm (COS@1-AuNPs), 530 nm (COS@2 -AuNPs), 535 nm (COS@3-AuNPs), dan 536 nm (COS@4-AuNPs) mengkonfirmasi keberadaan nanopartikel emas. Sisipan pada gambar ini menunjukkan gambar nanokomposit yang diperoleh yang pewarnaannya bergantung pada konsentrasi nanopartikel, ukuran, bentuk, dan fungsionalisasi permukaan.
Spektrum UV-Vis untuk nanokomposit. Nilai dalam sisipan sesuai dengan panjang gelombang maksimum dari resonansi plasmon permukaan terlokalisasi. Maksimal ini adalah sebagai berikut:untuk CO-AuNPs pada 534 nm (0,1 M NaBH4 ) (a ), untuk Asil-CO-AuNPs pada 507 nm (b ), dan untuk COS-@n-AuNP kitosan oligosakarida pada 533, 530, 535, 536 nm untuk masing-masing pada 1-4 preparat nanokomposit ketebalan yang berbeda (c )
Stabilitas Nanokomposit
Gambar 4 menunjukkan perbandingan antara spektrum serapan UV-Vis dari nanokomposit yang baru disintesis dan 150 hari setelah sintesis; seperti yang dapat diamati, dua spektrum untuk setiap kasus pada dasarnya tetap sama, tidak ada pergeseran signifikan dari pita resonansi maksimum, dan tidak ada bukti puncak tambahan. Hasil ini secara kualitatif menunjukkan stabilitas tinggi dari nanokomposit yang diperoleh.
Stabilitas nanokomposit nanopartikel emas menurut spektrum serapan UV-Vis diperoleh 150 hari setelah sintesis:CO-AuNPs yang disintesis secara kimiawi (a ) dan Asil-CO-AuNPs (b ) dan sintesis hijau/satu pot untuk COS@2-AuNPs (c )
Spektroskopi inframerah untuk tiga sampel kitosan yang berbeda ditunjukkan pada Gambar 5. Teknik ini digunakan untuk identifikasi kitosan terasilasi dengan membandingkan pita serapannya di dalam wilayah inframerah (IR) (yang merupakan karakteristik struktur kimia) dengan inframerah. basis data. Beberapa pita IR karakteristik yang layak untuk ditunjukkan:pita kitosan (50–190 kDa, 75% derajat deasetilasi) pada 1656 cm
−1
, 1593 cm
−1
, dan 1373 cm
−1
sesuai dengan kelompok amida (amida I, II, dan III, masing-masing); pita pada 2895 cm
−1
sesuai dengan ikatan C-H, dan ikatan antara 3200–3500 cm
−1
menjadi ikatan N-H dan O-H. Untuk kitosan terasilasi, pita IR diperoleh pada 1651 cm
−1
, 1591 cm
−1
, dan 1369 cm
−1
sesuai dengan kelompok amida (amida I, II, dan III, masing-masing), dan yang di dalam 3200–3500 cm
−1
sesuai dengan ikatan N-H dan O-H. Asilasi kitosan dikonfirmasi menurut data spektroskopi IR [7]:pita pada 1591 cm
−1
lebih rendah untuk kitosan terasilasi dibandingkan dengan kitosan asli karena jumlah amida sekunder yang lebih besar pada kitosan terasilasi. Pita di dalam 3200–3500 cm
−1
, karakteristik getaran N-H dan O-H dalam kitosan asli, menghilang untuk kitosan terasilasi dan oligosakarida kitosan karena reduksi amida primer.
Spektrum FT-IR kitosan, asil-kitosan, dan oligosakarida kitosan. Pita pada 1591 cm
−1
sesuai dengan amida sekunder; 3200–3500 cm
−11
daerah sesuai dengan getaran N-H dan O-H
Tingkat substitusi kitosan terasilasi diperkirakan, menurut Bahadur et. Al. [6], dengan ekspresi berikut:
dimana A1651 = 1.973965 dan A3350 = 1.977278 sesuai dengan absorbansi (untuk vibrasi amida I dan OH, masing-masing) kitosan terasilasi pada 1631 cm
−1
dan 3350 cm
−1
, masing-masing, dan 0,25 sesuai dengan kelompok amina bebas. Tingkat N-asilasi 75% diperoleh.
ξ Potensi
Nilai -Potential diperoleh untuk setiap komposit sebagai berikut (Tabel 2, kolom “ξ-Potential”):43,3 mV (CO-AuNPs), 40,2 mV (Acyl-CO-AuNPs), 52,2 mV (COS@1-AuNPs) , 55.3 mV (COS@2-AuNPs), 51.6 mV (COS@3-AuNPs), dan 46.3 mV (COS@4-AuNPs). Potensi untuk semua nanokomposit positif karena gugus amina dari kitosan seperti yang direncanakan untuk mencapai pembentukan kompleks DNA oleh gaya elektrostatik. Setelah pembentukan kompleks, pengurangan nilai -potensial mengkonfirmasi keberhasilan adhesi DNA (Tabel 2, kolom “ξ-Potential/DNA”).
Transmission Electron Microscopy (TEM)
Gambar 6 menunjukkan mikrograf TEM representatif untuk setiap nanokomposit, bersama dengan histogram ukuran nanopartikel untuk penghitungan distribusi ukuran. Distribusi ukuran untuk setiap nanokomposit diperoleh sebagai berikut:tiga gambar TEM untuk setiap sampel diperoleh dan dianalisis dengan perangkat lunak pengolah gambar buatan sendiri yang dikembangkan dengan Matlab® dan jumlah nanopartikel adalah 500 untuk Asil-CO-AuNPs, 1000 untuk CO-AuNPs , dan 100 untuk seri COS@n-AuNP. Ukuran rata-rata untuk setiap sampel dirangkum dalam Tabel 2, kolom “Diameter TEM rata-rata (nm)”. Penting untuk menunjukkan bahwa AuNPs yang disintesis dengan kitosan oligosakarida menghasilkan sferis, dengan distribusi ukuran yang lebih baik dibandingkan dengan yang serupa yang diperoleh dengan metodologi sintesis hijau lainnya yang dilaporkan dalam literatur [36, 38, 41,42,43].
Mikrograf TEM dari a 4.7 nm acylated chitosan AuNPs, b Kitosan AuNPs 3,5 nm (0,1 M NaBH4 ), c 7.4 nm oligosakarida kitosan AuNPs (COS@1), d 15,6 nm oligosakarida kitosan AuNPs (COS@2), e 10 nm oligosakarida kitosan AuNPs (COS@3), dan f 14 nm oligosakarida kitosan AuNPs (COS@4)
Derajat Pembentukan dan Adhesi Kompleks:Nanokomposit-pDNA
Elektroferogram dari semua kompleks pDNA dan DNA murni dilakukan, dengan mengambil konsentrasi plasmid yang berbeda; hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 7. Gambar 7a menunjukkan elektroferogram yang sesuai untuk plasmid murni dan semua kompleks yang dibawa dengan 200 dan 300 ng plasmid. Distribusi sampel nanokomposit untuk elektroferogram ini berjalan sebagai berikut:Asil-CO-AuNPs (300 dan 200 ng) pada jalur 1 dan 2, CO-AuNPs (300 ng) pada jalur 3, COS@1-AuNPs (300 dan 200 ng) pada 4 dan 5, COS@2-AuNPs (300 dan 200 ng) pada 6 dan 7, COS@3-AuNPs (300 dan 200 ng) pada 8 dan 9, COS@4-AuNPs (300 dan 200 ng) pada 10 dan 11, dan 300 ng pDNA murni pada jalur 12. Untuk semua pengujian, 10 μl larutan kompleks digunakan. Gambar ini menunjukkan bahwa hanya pDNA yang bergerak dalam gel (seperti yang terlihat pada jalur 12) dan kompleks pDNA lainnya tetap berada di sumur yang sesuai, dengan cara ini mengkonfirmasikan adhesi pDNA pada semua kompleks. Hal ini disebabkan oleh interaksi muatan positif gugus amino dari kitosan, yang tetap berada di permukaan nanopartikel emas, dan muatan negatif gugus fosfat dari heliks DNA.
a Elektroferogram untuk nanokompleks dengan konsentrasi pDNA 200 dan 300 ng. Jalur 12 sesuai dengan pDNA murni. b CO-AuNPs dan Asil-CO-AuNPs dengan 300 ng pDNA, pDNA murni di jalur 3. c COS@2-AuNPs nanocomplex with 300 and 350 ng of DNA, 400 ng of pure pDNA at lane 3. d same CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs at 1:10 dilution, with respectively pure DNA control at lane 3
To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.
Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection into HEK-293 Cells
As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE
TM
2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et. Al. [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.
HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE
TM
2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells
HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE
TM
2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells
Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells
Dye Exclusion Test
Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE
TM
2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.
Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells
Conclusions
Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.
Ketersediaan Data dan Materi
All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.
