Pengiriman Gen yang Ditingkatkan Menggunakan Nanopartikel Emas yang Difungsionalkan dengan Chitosan, N-Asilasi Chitosan, dan Oligosakarida Chitosan
Abstrak
Nanopartikel emas (AuNP) semakin banyak digunakan dalam penelitian biomedik karena properti optik unik, densitas tinggi, dan kemudahan modifikasi permukaan. Di sini, kami menyajikan platform pengiriman gen non-viral yang menggabungkan AuNP dengan tiga polimer turunan chitosan: chitosan asli (CO), chitosan N-asilasi (Acyl-CO), dan oligosakarida chitosan (COS). Dua rute sintesis dieksplorasi: reduksi kimia konvensional dengan borohidra natrium dan sintesis satu tanaman hijau di mana COS secara bersamaan mereduksi dan mengstabilkan AuNP. Nanokomposit yang dihasilkan sepenuhnya dikarakterisasi dengan spektroskopi UV-Vis, potensial zeta, FTIR, dan mikroskopi transmisi elektron (TEM). Elektroforesis gel agarose mengonfirmasi kompleksasi DNA plasmid (pDNA) yang kuat, dan efisiensi transfeiksi dalam sel HEK-293 dievaluasi melalui aktivitas β-galaktosidase dan fluoresensi EGFP. Tingkat transfeiksi 27 %, 33 %, dan 60 % dicapai dengan CO-AuNP, Acyl-CO-AuNP, dan COS-AuNP, masing-masing, menunjukkan bahwa formulasi berbasis COS yang hijau menawarkan performa pengiriman gen yang unggul sambil menghindari agen reduksi yang beracun.
Latar Belakang
Terapi gen bergantung pada pengiriman materi genetik terapeutik ke dalam sel target. Sementara vektor viral memberikan efisiensi transfeiksi tinggi, mereka menderita imunogenitas, kapasitas muatan terbatas, dan kompleksitas produksi. Karier non-viral, sebaliknya, lebih aman, lebih mudah diproduksi, dan lebih stabil selama penyimpanan. Chitosan, polisakarida alami yang berasal dari chitin, telah muncul sebagai vektor non-viral yang menjanjikan karena muatan positif, toksisitas rendah, dan kemampuan melindungi DNA dari degrensia enzimatik. Namun, chitosan asli memiliki larutnya buruk pada pH fisiologis dan viskositas yang tinggi dalam larutan asam yang cair, membatasi aplikasinya biomedik. Modifikasi kimia seperti N-asilasi meningkatkan hidrofobisitas dan menyesapkan tingkat deasetilasi, sedangkan oligomerisasi (COS) mengurangi viskositas dan meningkatkan pengambilan seluler karena panjang rantai yang lebih pendek.
Nanopartikel emas, dengan ukuran yang dapat disesuaikan, resonansi plasmon permukaan, dan afinitas kuat terhadap grup amina, tiol, dan sianida, adalah kandidat ideal untuk membangun nanokarier multifungsi. Polimer kationik seperti chitosan dapat diangkut pada AuNP untuk menciptakan permukaan positif yang secara elektrostatis mengikat DNA plasmid, memfasilitasi internalisasi seluler. Selainnya, densitas tinggi AuNP mempromosikan pengambilan seluler yang cepat, dan properti optiknya memungkinkan pemantauan waktu nyata dari pengiriman.
Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa konjugat chitosan-AuNP dapat mencapai efisiensi transfeiksi yang lebih tinggi dibandingkan liposom atau nanopartikel polimer. Namun, sebagian besar sintesis bergantung pada agen reduksi beracun seperti borohidra natrium atau bromida setiltrimetilamoniun (CTAB). Dalam karya ini, kami memperkenalkan rute sintesis hijau yang menggunakan COS sebagai agen reduksi dan stabilisasi, menghilangkan kimia berbahaya sambil mempertahankan properti fisikokimia yang menguntungkan dari nanokompleks.
Metode
Sintesis Nanokomposit
Tiga formulasi AuNP berbeda disiapkan (Gambar 2). CO-AuNP dan Acyl-CO-AuNP disintesis melalui reduksi kimia dengan NaBH₄, sedangkan COS-AuNP dihasilkan oleh metode satu tanaman hijau di mana COS secara bersamaan mereduksi Au³⁺ dan mencap nanopartikel.
Diagram skematik untuk setiap sintesis: a–b sintesis kimia untuk CO-AuNP dan Acyl-CO-AuNP; c–f sintesis hijau untuk COS-AuNP.
Bahan
Klorida emas(III) trihidrat (HAuCl₄·3H₂O), borohidra natrium (NaBH₄), chitosan berat molekuler rendah (50–190 kDa, 75 % deasetilasi), dan COS (5 kDa) dibeli dari Sigma-Aldrich. Semua kaca dibersihkan dengan aku regia selama 24 jam dan dicuci dengan air Milli-Q untuk menghilangkan jejak logam.
CO-AuNP
CO (2 mg mL⁻¹) dilarutkan dalam asam asetat 1 % dan disimpan selama malam hari. Larutan difilter (0,22 µm) dan dicampur dengan HAuCl₄ 10 mM (1 mL) di bawah pengadukan kuat selama 30 menit. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) ditambahkan secara bertitik-titik; warna berubah dari kuning menjadi merah anggur, menunjukkan pembentukan nanopartikel. Pengadukan dilanjutkan selama 2 jam.
Acyl-CO-AuNP
Asilasi chitosan berat molekuler rendah dilakukan dengan klorida kaproil mengikuti protokol yang dimodifikasi. Gel yang dihasilkan diendapkan dengan aseton, dicuci dengan metanol, dan dikeringkan. Gel (0,33 % dalam HCl 0,1 M) dicampur dengan HAuCl₄ 10 mM (1 mL) dan diaduk selama 1 jam. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) kemudian ditambahkan, menghasilkan larutan merah muda yang berwarna penuh dalam 2 jam pengadukan.
COS-AuNP
Untuk sintesis hijau, COS (100 – 200 mg) ditambahkan ke HAuCl₄ (0,003 – 0,017 wt %) dan diaduk pada 80 °C selama 60 menit. Empat varian disiapkan, berbeda dalam jumlah COS dan konsentrasi emas (Tabel 1). Nanopartikel difurnir melalui sentrifugasi (12.000 g, 30 menit).
Karakterisasi
FTIR
Spektra FTIR (Perkin Elmer Spectrum One) mengonfirmasi kehadiran bandas amida dan asilasi yang berhasil dari Acyl-CO. Tingkat substitusi (DS) dihitung sebesar 75 % menggunakan rasio absorbansi pada 1651 cm⁻¹ dan 3350 cm⁻¹.
Potensial Zeta
Pengukuran potensial zeta (Malvern Nano Z) mengungkapkan muatan permukaan positif (43–55 mV) untuk semua komposit, mengonfirmasi kesesuaiannya untuk ikatan DNA. Nilai pasca-kompleksasi turun, menunjukkan adsorpsi plasmid yang berhasil.
UV-Vis
Spektra UV-Vis (400–700 nm) menampilkan puncak resonansi plasmon lokal (LSPR) pada 534 nm (CO-AuNP), 507 nm (Acyl-CO-AuNP), dan 533–536 nm (COS-AuNP). Spektra tidak berubah setelah 150 hari, menunjukkan stabilitas koloid.
TEM
Citra TEM (JEOL JEM-1010) mengungkapkan nanopartikel bola dengan diameter berkisar dari 3 hingga 15 nm. Distribusi ukuran lebih sempit untuk COS-AuNP, mencerminkan monodispersi yang superior.
Formasi Kompleks dan Ikat DNA
Plasmid pSV-β-Gal (6,82 kb) dan pIRES2-EGFP (5,3 kb) difurnir melalui lisis alkaline. DNA (200–400 ng) dicampur dengan setiap nanokomposit dalam DMEM, dan elektroforesis gel agarose (agarose 0,8 %, 90 V, 60 menit) menunjukkan retensi DNA lengkap di lubang, mengonfirmasi kompleksasi elektrostatis.
Transfeiksi Sel
Kultur Sel
Sel HEK-293 ditanam pada 12.000 sel per lubang dalam papan 96-lubang, mencapai ~90 % konfluensi setelah 24 jam.
Transfeiksi EGFP
Kompleks (15 µL, 200 ng DNA) ditambahkan ke sel selama 2 jam, diikuti oleh inkubasi 48 jam dalam DMEM lengkap. Ekspresi EGFP dikuantifikasi melalui mikroskopi fluoresensi (Carl Zeiss Axio Vert.A1).
Transfeiksi β-Galaktosidase
Setelah 24 jam inkubasi, sel diperbaiki dan diinkubasi dengan larutan X-gal. Pewarnaan biru, yang menunjukkan aktivitas β-galaktosidase, diamati melalui mikroskopi bidang terang (Motic AE2000). LipofectAMINE™ 2000 berfungsi sebagai kontrol positif.
Keberadaan Sel
Penolakan blue tripans (0,2 %) menilai keberadaan 2 jam pasca-transfeiksi. Rentang konsentrasi adalah 0,1–3 mM untuk CO-AuNP dan Acyl-CO-AuNP, 0,5 mM untuk COS@3-AuNP dan COS@4-AuNP, dan 0,1 mM untuk COS@1-AuNP dan COS@2-AuNP.
Hasil dan Pembahasan
Sintesis dan Karakterisasi Nanokomposit
COS-AuNP hijau dihasilkan tanpa reagen berbahaya, menunjukkan kelayakan rute sintesis yang sepenuhnya kompatibel biologis. Spektra UV-Vis (Gambar 3) mengonfirmasi pembentukan AuNP, dengan puncak LSPR yang konsisten di seluruh formulasi. Uji stabilitas setelah 150 hari menunjukkan tidak ada pergeseran spektral, menunjukkan ketahanan koloid yang luar biasa.
Spektra FT-IR chitosan, chitosan asilasi, dan COS. Band kunci: 1651 cm⁻¹ (amida I), 1591 cm⁻¹ (amida II).
Potensial Zeta
Tabel 2 mencantumkan nilai potensial zeta: CO-AuNP 43,3 mV, Acyl-CO-AuNP 40,2 mV, COS-AuNP 46,3–55,3 mV. Semua nilai tetap positif setelah ikatan DNA, mengonfirmasi kompleksasi.
Gel agarose (Gambar 7) menunjukkan retensi DNA lengkap di semua nanokompleks, sedangkan plasmid bebas bermigrasi ke bawah. COS-AuNP menunjukkan ikatan terkuat, mempertahankan hingga 350 ng plasmid sebelum saturasi.
Elektroforesis gel agarose kompleks pDNA.
Efisiensi Transfeiksi
Dalam sel HEK-293, COS-AuNP mencapai tingkat transfeiksi tertinggi: 60 % dengan β-galaktosidase dan 48 % dengan EGFP. Acyl-CO-AuNP dan CO-AuNP mencapai 33 % dan 27 % masing-masing. Performa unggul COS-AuNP disebabkan oleh rasio chitosan/emas yang lebih tinggi dan ukuran partikel optimal.
Uji transfeiksi dalam sel HEK-293.
Citra fluoresensi EGFP.
Persentase efisiensi transfeiksi.
Keberadaan Sel
Penolakan blue tripans mengungkapkan keberadaan tinggi (>90 %) untuk COS-AuNP, sedangkan LipofectAMINE™ 2000 dan CO-AuNP menunjukkan tingkat kelangsungan lebih rendah (61 % dan 78 %). COS-AuNP oleh karena itu menggabungkan efisiensi transfeiksi tinggi dengan sitotoksisitas minimal.
Persentase keberadaan sel.
Kesimpulan
Kami berhasil membuat konjugat nanopartikel emas-chitosan melalui rute konvensional dan hijau. COS-AuNP, yang disintesis tanpa reagen beracun, menunjukkan efisiensi transfeiksi superior (hingga 60 %) dan citokompatibilitas yang utmunt (>93 %). Distribusi ukuran yang sempit dan muatan permukaan positif memungkinkan ikatan plasmid yang kuat dan pengambilan seluler yang efisien. Temuan ini memosisikan COS-AuNP sebagai platform pengiriman gen yang ramah lingkungan dan menjanjikan untuk pengembangan preklinis lebih lanjut.
Ketersediaan Data dan Bahan
Semua data set yang mendukung kesimpulan studi ini termasuk dalam teks utama.
