Depositasi MAPLE Bantu Laser Nanopartikel Upconversion Fungsional Antibodi Meningkatkan Performa Budaya Sel
Abstrak
Substrat budaya sel berkinerja tinggi bergantung pada permukaan optimal yang mendukung fungsi dan komunikasi sel. Pekerjaan terbaru menunjukkan bahwa lapisan nano struktur dapat meningkatkan adhesi sel, namun metode berbasis larutan konvensional sering memperkenalkan kontaminan. Matrix-assisted pulsed laser evaporation (MAPLE) menawarkan rute bersih dan non‑destruktif untuk menyetorkan biopolimer pada berbagai substrat. Dalam studi ini, kami sintetis nanopartikel upconversion NaGdF4:Yb3+,Er3+ (UCNPs) dan serata immunoglobulim‑G (IgG) fungsionalnya melalui metode satu‑pot. UCNPs menunjukkan diameter rata‑rata 50 ± 8 nm, dan gambar TEM mengonfirmasi kehadiran IgG pada permukaannya. Menggunakan laser Nd:YAG 532 nm (10 Hz), kami menyetorkan UCNPs—dengan dan tanpa IgG—pada caca kultur kaca kaca melalui MAPLE. Sel endotel vena tali pusat manusia (HUVEC) kemudian ditanam pada substrat ini dan dibandingkan dengan kontrol kaca dilapis gelatin. Ujian keberahan sel menunjukkan tidak ada sitotoksisitas, sementara analisis morfologi menunjukkan adhesi dan proliferasi yang ditingkatkan pada kedua permukaan terlapisi UCNP. Temuan ini menunjukkan bahwa UCNPs fungsional antibodi yang disetorkan MAPLE dapat berfungsi sebagai lapisan kompatibel biologis dan berkinerja tinggi untuk aplikasi budaya sel.
Pengantar
Sel epitel membatasi permukaan internal dan eksternal tubuh manusia, memainkan peran ganda sebagai rintangan fisik dan peserta aktif dalam proses fisiologis seperti fungsi rintangan, sinyalisasi, dan pertahanan imun [1]. Dalam teknik jaringan, interaksi antara sel dan permukaan substrat adalah penentu kritis dari adhesi, morfologi, dan fungsi sel. Lapisan protein konvensional—kolagen, gelatin, fibronectin—lama digunakan untuk meningkatkan penangkapan sel pada permukaan kaca atau plastik. Kemajuan terbaru menunjukkan bahwa lapisan nano struktur dapat memodulasi perilaku sel dengan memberikan petunjuk topografi dan meningkatkan luas permukaan efektif, sehingga meningkatkan adhesi dan proliferasi [2–4].
Nanopartikel upconversion (UCNPs) yang di‑dope ion lantanida, seperti NaGdF4:Yb3+,Er3+, menunjukkan eksitasi infra merah dekat (NIR) yang efisien dan emisi visible atau NIR, menawarkan keuntungan untuk imaging jaringan dalam dan biosensing karena fototoksisitas rendah dan stabilitas fotostabilitas tinggi [5–9]. Fungsionalisasi permukaan UCNPs dengan biomolekul—avidin, DNA, antibodi—telah memungkinkan imaging target, sensing, dan pelabelan sel [19–21]. Namun, pekerjaan terbatas telah mengeksplorasi UCNPs fungsional antibodi sebagai lapisan permukaan untuk budaya sel.
Teknik depositasi konvensional (sol‑gel, spin coating, dipenderetan) menderita ketebalan yang tidak terkontrol, residu pelarut, dan potensi denaturasi biomolekul. Matrix‑assisted pulsed laser evaporation (MAPLE) menghindari masalah ini dengan menangkap materi target dalam matriks pelarut beku; energi laser diserap oleh matriks, yang menghasilkan transfer lembut materi pada substrat tanpa ablasi langsung dari biomolekul [24,25]. MAPLE telah diterapkan dalam pengiriman obat, elektronika organik, dan lapisan biomedis [31–35], namun dampaknya pada substrat budaya sel masih belum dieksplorasi secara luas.
Dalam pekerjaan ini, kami melaporkan sintesis NaGdF4:Yb3+,Er3+ UCNPs dan analog fungsional IgG‑nya, diikuti oleh depositasi MAPLE pada caca kultur kaca kaca. Kami kemudian mengevaluasi kompatibilitas biologis dan pengaruhnya pada perilaku sel endotel vena tali pusat manusia (HUVEC), memberikan dasar untuk aplikasi teknik jaringan di masa depan.
Metode/Eksperimen
Bahan
Semua reagen kualitas analitis: Gd(NO3)3·6H2O (99,9 %), Yb(NO3)3·5H2O (99,9 %), Er(NO3)3·5H2O (99,9 %), NaF (≥ 99 %), polietilenimina cabang (PEI, Mw ≈ 800), anti‑human IgG (spesifik Fab, berlabel FITC), DAPI, Phalloidin‑TRITC, dan pelarut (etilena glikol, isopropanol). Bahan dibeli dari Sigma‑Aldrich, Fisher Scientific, dan Caledon.
Sintesis UCNPs Dengan dan Tanpa IgG melalui Proses Satu‑Pot
UCNPs (NaGdF4:Yb3+,Er3+) disintesis melalui rute hidrotermal yang dimodifikasi. Secara singkat, 720 mg Gd(NO3)3·6H2O, 170 mg Er(NO3)3·5H2O, 160 mg Yb(NO3)3·5H2O, dan 20 mL etilena glikol dicampur dalam kolong tiga leher. 0,7 g PEI ditambahkan, diikuti oleh penambahan titik‑titik 336 mg NaF yang dilarutkan dalam 10 mL etilena glikol. Campuran dipanaskan hingga 200 °C di bawah nitrogen dan direfluks selama 6 jam. Produk dikumpulkan melalui sentrifugasi, dicuci dengan etanol dan air, dan dikeringkan pada 60 °C.
Untuk fungsionalisasi IgG, 15 mg bubuk UCNP didispersi dalam 15 mL air terdistilasi, kemudian 5 mL larutan garam borat (pH 8) dan 20 µg IgG ditambahkan. Campuran diaduk pada suhu kamar selama 2 jam, kemudian dicuci dan dipellet melalui sentrifugasi. Konjugat, UCNPs‑IgG, disimpan dalam larutan penangkal.
Skematik sintesis satu‑pot UCNPs dan UCNPs‑IgG
Depositasi UCNPs Dengan/Tanpa Igg melalui MAPLE
Depositasi MAPLE dilakukan menggunakan sistem MAPLE 2000 (PVD Products, Inc.) dengan laser Nd:YAG 532‑nm. Larutan nanopartikel (1 wt % dalam isopropanol) dibeku dalam penangkol pendingin nitrogen cair. Parameter laser: 10 Hz, lebar pulsa 200 µs, fluensi 150 mJ cm–2, luas spot 0,63 cm2. Substrat kaca, yang sebelumnya dilapis 2 wt % gelatin, ditempatkan 4,5 cm dari penangkol dan dipertahankan pada 25 °C di bawah 1 × 10–6 Torr. Penangkol dan penangkol substrat berputar pada 10 rpm dan 25 rpm, masing‑masing, selama depositasi 2 jam. Film yang dihasilkan dikarakterisasi oleh EDX, FTIR, dan spektroskopi fotoluminesensi (PL).
Skematik depositasi MAPLE UCNPs dan UCNPs‑IgG
Karakterisasi Material
UCNPs dan UCNPs‑IgG sebelum depositasi diperiksa oleh mikroskopi elektron transmisi (TEM, Philips CM‑10, 80 kV). Spektra inframerah transform Fourier (FTIR) direkam pada Bruker Vector 22 (600–4500 cm–1, resolusi 4 cm–1, 64 skan). Spektra PL diukur dengan spektrofluorometer QuantaMaster 40 (Horiba). Film setelah depositasi diperiksa oleh EDX (Hitachi S‑3400 N dengan INCA PentaFET‑x3) dan mikroskopi konfokal (Zeiss LSM 5 Duo). Kompatibilitas sel dievaluasi melalui uji MTT pada HUVEC yang dibudidayakan selama 24 jam.
Studi Perilaku Sel
HUVEC (ATCC) ditanam pada ~1 × 10⁵ sel per dish pada substrat kaca (kontrol gelatin, UCNPs, UCNPs‑IgG). Setelah inkubasi 24 jam pada 37 °C, sel di‑fixed dengan formalin 4 %, diwarnai dengan Phalloidin‑TRITC (aktin) dan DAPI (nukleus), dan diimajing oleh mikroskopi konfokal. Luas sel, panjang koneksi, panjang sel, dan jumlah sel dikuantifikasi menggunakan ImageJ.
Uji Sitotoksisitas
MTT (3‑(4,5‑dimethylthiazol‑2‑yl)‑2,5‑diphenyl‑tetrazolium bromide) ditambahkan ke medium budaya setelah 24 jam, diinkubasi selama 3 jam, dan absorbansi diukur pada 490 nm menggunakan pembaca Bio‑Tek EL340I. Eksperimen dilakukan dalam tiga kali pengulangan.
Hasil dan Pembahasan
Karakterisasi UCNPs dan UCNPs‑IgG Sebelum Depositasi MAPLE
Gambar TEM mengonfirmasi morfologi kubik UCNPs dengan diameter rata‑rata 50 ± 8 nm. TEM resolusi tinggi mengungkapkan jarak kristal 0,312 nm, yang sesuai dengan bidang (111) dari kubik NaGdF4 (JCPDS 27‑0697). Setelah konjugasi IgG, ukuran partikel meningkat menjadi 54 ± 8 nm, dan lapisan antibodi (~10 ± 5 nm) terlihat sebagai lingkaran di sekitarnya (Gambar 3b).
Mikrogram TEM a UCNPs dan b UCNPs‑IgG sebelum depositasi MAPLE
Pola XRD bubuk menunjukkan puncak khas pada 32°, 37°, 54°, dan 65° (111, 200, 220, 311), yang mengonfirmasi fase kubik (Gambar 4).
Spektra FTIR mengungkapkan puncak amina (1515 cm–1, 1511 cm–1) dari PEI dan IgG, gerakan –CH2–/C‑C (2987, 2900, 1400 cm–1), dan pita karboksil serta amida (1249, 1650 cm–1) yang mengonfirmasi penambahan IgG (Gambar 5).
Spektra FTIR UCNPs‑IgG dan UCNPs, masing‑masing, yang dibuat oleh proses satu‑pot
Karakterisasi UCNPs Setelah Depositasi MAPLE
Pemetaan EDX substrat kaca yang dilapisi UCNPs dan UCNPs‑IgG mengonfirmasi kehadiran Gd, Er, Yb, dan F (Gambar 6a,b). Pengukuran PL menunjukkan emisi hijau (540 nm) dan merah (650 nm) yang dipertahankan di bawah eksitasi 980 nm, dengan variasi intensitas kecil yang dapat diatribusikan pada cacat permukaan atau kesalahan pengukuran.
Spektra EDX a sampel setelah perlakuan MAPLE dan b sampel tanpa perlakuan MAPLE (kaca polos)
FTIR permukaan yang dilapisi lebih lanjut mengonfirmasi pelestarian kelompok fungsional: pita –OH pada 3648 cm–1 (IgG) hanya muncul pada UCNPs‑IgG (Gambar 7a), sementara pita amina pada 1575 cm–1 jelas pada UCNPs (Gambar 7b). Absen pita ini pada kaca polos (Gambar 7c) menekankan depositasi yang berhasil dari lapisan nanopartikel.
Spektra FTIR kaca polos dan kaca dilapisi UCNPs‑IgG dan UCNPs, masing‑masing
Perilaku Sel pada Berbagai Lapisan
Gambar konfokal setelah 24 jam budaya menunjukkan jumlah sel yang serupa di semua permukaan, tetapi permukaan UCNPs‑IgG menunjukkan sel yang lebih luas, perluasan sitoplasma yang lebih panjang, dan konektivitas antar‑sel yang meningkat (Gambar 8). Analisis kuantitatif menunjukkan peningkatan luas sel sebesar 11,2 % dan 22,2 % untuk UCNPs dan UCNPs‑IgG, masing‑masing, dibandingkan kontrol gelatin; panjang koneksi meningkat sebesar 12,5 % dan 17,5 %; panjang sel tumbuh sebesar 8,2 % dan 17,3 %; dan jumlah sel naik sekitar 8 % pada permukaan terlapisi nanopartikel (Gambar 9). Metrik ini mengonfirmasi bahwa baik UCNPs maupun UCNPs‑IgG meningkatkan adhesi dan perluasan endotel tanpa menginduksi sitotoksisitas.
Mikrogram konfokal HUVEC pada a kontrol, b UCNPs, dan c UCNPs modifikasi IgG
HUVEC yang dibudidayakan pada berbagai lapisan: a luas sel, b panjang koneksi, c panjang sel, d jumlah sel
Efek Lapisan terhadap Keberahan Sel
Uji MTT menunjukkan keberahan relatif >99 % pada kaca polos, UCNPs, dan UCNPs‑IgG, melebihi benchmark >85 % untuk material kompatibel biologis. Peningkatan keberahan sedikit (105 % untuk UCNPs, 104 % untuk UCNPs‑IgG) menyiratkan efek stimulasi ringan dari lapisan nanopartikel, kemungkinan karena keasaran permukaan yang ditingkatkan dan adsorpsi protein.
Keberahan sel HUVEC pada kaca polos, UCNPs, UCNPs‑IgG, dan kontrol dilapis gelatin
Kesimpulan
Kami telah menunjukkan bahwa NaGdF4:Yb3+,Er3+ UCNPs dan serata IgG‑fungsionalnya dapat disintesis dalam proses hidrotermal satu‑pot dan disetorkan pada caca kultur kaca melalui MAPLE tanpa mengkompromikan integritas struktural atau fotoluminesensinya. TEM, FTIR, XRD, dan EDX mengonfirmasi sintesis, konjugasi, dan depositasi yang berhasil. Uji kompatibilitas biologis menunjukkan tidak ada sitotoksisitas, sementara mikroskopi konfokal menunjukkan adhesi, perluasan, dan jaringan antar‑sel HUVEC yang ditingkatkan pada permukaan terlapisi nanopartikel. Temuan ini memposisikan UCNPs fungsional antibodi yang disetorkan MAPLE sebagai lapisan yang menjanjikan dan terkontaminasi rendah untuk platform teknik jaringan dan obat regeneratif generasi lanjut.
