Deposisi Antibodi Dimodifikasi Upkonversi Nanopartikel pada Kaca dengan Metode Bantuan Laser untuk Meningkatkan Kinerja Kultur Sel
Abstrak
Permukaan yang cocok sangat penting untuk mempertahankan atau bahkan mempromosikan fungsi dan komunikasi sel. Baru-baru ini, penelitian menunjukkan bahwa pelapis berstruktur nano dapat memiliki potensi dalam meningkatkan adhesi sel. Namun, hampir tidak meminimalkan kontaminasi dengan menggunakan teknologi pelapisan solusi tradisional. Teknik evaporasi laser terbantu matriks (MAPLE) adalah proses bebas kontaminasi dan menunjukkan proses yang efisien untuk mendepositkan biopolimer tanpa merusak tulang punggungnya pada permukaan berbagai substrat. Di sini, nanopartikel konversi (NaGdF4 :Yb
3+
, Eh
3+
) dengan/tanpa modifikasi imunoglobulin G (IgG) diproduksi dengan metode sintesis satu pot. Ukuran rata-rata nanopartikel konversi (UCNPs) adalah 50 ± 8 nm. Biokonjugasi IgG pada permukaan UCNPs dapat diamati secara langsung dengan mikroskop elektron transmisi (TEM). Sistem MAPLE yang menggunakan laser Nd:YAG (λ = 532 nm, = 10 Hz) diterapkan untuk menyimpan UCNP dengan/tanpa modifikasi IgG pada dasar kaca cawan kultur. Selain itu, perilaku sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs) yang dikultur pada cawan kultur yang dilapisi dengan UCNPs dengan/tanpa IgG telah dipelajari dibandingkan dengan sampel kontrol, kaca yang dilapisi dengan gelatin. Tidak ada efek toksik yang dikenakan pada sel. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa deposisi UCNP dengan/tanpa antibodi dengan teknik MAPLE dapat meningkatkan adhesi dan proliferasi sel.
Pengantar
Sel epitel dapat ditemukan di permukaan dalam dan luar tubuh manusia, termasuk kulit, usus, saluran napas, dan saluran reproduksi. Sel epitel tidak hanya menyediakan cangkang pengaman terhadap kotoran dan mikroba, tetapi juga menunjukkan fungsi penting, misalnya, meregangkan, melacak, dll. [1]. Oleh karena itu, sel epitel telah banyak digunakan dalam rekayasa jaringan dan regenerasi jaringan. Interaksi antara sel epitel dan permukaan substrat sangat penting untuk menjaga fungsi dan komunikasi sel. Biasanya, lapisan berbasis protein, misalnya, kolagen ekor tikus, diterapkan untuk memungkinkan sel-sel epitel tumbuh di cawan petri, atau kaca, untuk studi lebih lanjut. Baru-baru ini, bahan nano yang dilapisi pada substrat menunjukkan potensi untuk mengontrol pertumbuhan sel dengan memanfaatkan morfologi halus, tekstur/pola khusus dari lapisan berstruktur nano [2,3,4]. Selain itu, nanomaterial luminescent telah menunjukkan keuntungan yang signifikan dibandingkan pewarna organik tradisional dalam mempelajari interaksi sel-sel, dan permukaan sel karena sifat fotoluminesensi yang sangat stabil. Sangat menarik untuk mengetahui interaksi sel dan permukaan yang dilapisi dengan struktur nano luminescent yang dimodifikasi protein.
Fenomena upconversion, pertama kali diselidiki pada tahun 1959, adalah penyerapan berurutan dari dua atau lebih foton untuk memancarkan cahaya dengan energi tinggi [5, 6]. Nanopartikel konversi yang didoping lantanida (UCNPs) terdiri dari tiga komponen berbeda termasuk aktivator, sensitizer, dan matriks host. Ion lantanida seperti Er
3+
, Ho
3+
, dan Tm
3+
dapat berperan sebagai aktivator karena memiliki struktur tingkat energi yang unik [7,8,9,10,11]. Yb
3+
ion adalah sensitizer paling umum yang dapat diterapkan untuk mentransfer energi dari cahaya tereksitasi ke aktivator [12,13,14]. Baik bahan oksida dan bahan fluoride biasanya digunakan sebagai inang kristal [15,16,17]. Nanopartikel upconversion, memancarkan cahaya dari kisaran terlihat ke kisaran inframerah-dekat di bawah eksitasi cahaya inframerah-dekat (NIR), dapat diterapkan dalam bioimaging jaringan dalam karena koefisien hamburan yang lebih rendah dari cahaya NIR yang dikenal sebagai "jendela terapi". [18]. Baru-baru ini, berbagai modifikasi permukaan UCNPs telah dikembangkan untuk pelabelan/penginderaan biologis [19, 20]. Misalnya, avidin terkonjugasi ke asam heksanedioat (HAD) yang dimodifikasi pada permukaan UCNPs untuk menunjukkan interaksi dengan antibodi [21]. UCNP cangkang inti termodifikasi ssDNA dikembangkan untuk mendeteksi oligonukleotida spesifik [24].
Di sisi lain, imunoglobulin G (IgG), antibodi yang ditemukan dalam darah dan cairan ekstraseluler, mengontrol infeksi jaringan. Interaksi antara IgG dan nanopartikel telah dipelajari, misalnya, IgG dapat digunakan sebagai template untuk menghasilkan nanopartikel emas, dan nanopartikel magnetik yang dimodifikasi IgG untuk memberi label pada sel bakteri [22, 23]. Namun, hanya sedikit penelitian yang dilaporkan tentang modifikasi IgG ke UCNPs untuk kultur sel atau kultur jaringan.
Metode konvensional seperti metode sol-gel, spin coating, dan penguapan pelarut telah diterapkan dalam deposit biomolekul nanopartikel dimodifikasi pada substrat untuk uji biomedis [27, 28]. Namun, metode pelapisan larutan untuk pengendapan protein atau struktur nano berbasis protein hampir tidak meminimalkan kontaminasi. Deposisi laser menunjukkan ketebalan yang terkontrol dengan baik dan menghindari kontaminasi operasi yang terjadi pada deposisi kimia. Sangat sedikit teknik deposisi laser yang telah digunakan untuk mengembangkan permukaan berbasis protein untuk kultur sel.
Tidak seperti metode deposisi fisik konvensional, teknik evaporasi laser terbantu matriks (MAPLE) tidak secara langsung mengikis bahan target; sebaliknya, sebagian besar energi laser diserap oleh pelarut beku (matriks) [24, 25]. Dalam proses MAPLE, bahan target yang terdispersi dalam pelarut yang sangat mudah menguap (matriks) dimasukkan ke dalam pemegang target yang didinginkan dengan nitrogen cair [26,27,28,29,30]. Di bawah iradiasi laser, bahan target dapat diangkut ke substrat dengan pelarut yang menguap. Teknik APLE telah diterapkan di berbagai bidang termasuk sensor, perangkat elektronik organik, pengiriman obat, pelapisan implan, dll. [31,32,33,34,35]. Namun, sangat sedikit penelitian yang telah dilaporkan mengenai efek substrat dengan nanopartikel biomolekul/protein yang diendapkan MAPLE pada kinerja kultur sel.
Dalam penelitian ini, kami memproduksi UCNP (NaGdF4 :Yb
3+
, Eh
3+
) dan UCNPs yang dimodifikasi imunoglobulin G (IgG) (UCNPs-IgG) dengan metode hidrotermal. Setelah itu, UCNP dengan/tanpa modifikasi IgG langsung diendapkan di dasar gelas cawan kultur sel dengan menggunakan proses MAPLE dengan laser 532 nm Nd:YAG. Sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs) diunggulkan pada kaca yang disimpan dengan UCNP untuk menyelidiki sitotoksisitas lapisan UCNP, dan perilaku sel pada permukaan yang diperlakukan dengan UCNP.
Metode/Eksperimental
Materi
Gadolinium (III) nitrat heksahidrat (Gd (NO3 )3 ·6H2 O, kristal dan gumpalan, 99,9% jejak logam dasar), iterbium (III) nitrat pentahidrat (Yb (NO3 )3 ·5H2 O, 99,9% jejak logam dasar), erbium (III) nitrat pentahidrat (Er (NO3 )3 ·5H2 O, 99,9% jejak logam dasar), natrium fluorida (NaF, BioReagent, cocok untuk kultur sel serangga, 99%), polietilen bercabang (PEI, rata-rata Mw ~ 800 oleh LS, rata-rata Mn ~ 600 oleh GPC), anti-manusia IgG (Fab spesifik) – Antibodi FITC yang diproduksi pada kambing (antibodi terisolasi afinitas, larutan buffer berair), 4′,6-diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI), dan Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate (Phalloidin-TRITC) dibeli dari Sigma-Aldrich. Etilen glikol (EG) dibeli dari bahan kimia Fisher. Isopropanol (2-propanol) dibeli dari bahan kimia laboratorium Caledon.
Sintesis UCNP Dengan dan Tanpa IgG dengan Menggunakan Proses Satu Pot
UCNPs (NaGdF4 :Yb
3+
, Eh
3+
) disintesis dengan metode satu pot yang dimodifikasi [36]. Secara singkat, 720 mg Gd (TIDAK3 )3 ·6H2 O, 170 mg Er (TIDAK3 )3 ·5H2 O, 160 mg Yb (TIDAK3 )3 ·5H2 O, dan 20 ml etilen glikol ditambahkan ke dalam labu leher tiga. Kemudian, 0,7 g PEI ditambahkan dengan hati-hati ke dalam labu. Kemudian, 336 mg NaF yang dilarutkan dalam 10 ml etilen glikol ditambahkan tetes demi tetes ke dalam labu. Campuran dipanaskan hingga 200 ° C dan direfluks selama 6 jam dalam perlindungan nitrogen. Produk reaksi dikumpulkan dengan sentrifugasi dan dicuci beberapa kali dengan etanol/air suling. Produk dikeringkan pada suhu 60 °C.
Antibodi IgG dimodifikasi pada permukaan UCNPs oleh hubungan amida. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1, 15 mg bubuk UCNPs dilarutkan dalam 15 ml air suling. Kemudian, 5 ml borat-buffered saline (BBS, pH = 8) dan 20 g IgG ditambahkan ke dalam larutan. Larutan diaduk pada suhu kamar selama 2 jam. Produk dicuci dan dikumpulkan dengan sentrifugasi.
Skema metode satu pot untuk memproduksi UCNP dan UCNPs-IgG
Deposisi UCNP Dengan/Tanpa IgG oleh MAPLE
Proses deposisi laser dilakukan oleh peralatan MAPLE 2000 (proyek 206, PVD Products, Inc., USA) yang berafiliasi dengan laser Nd:YAG 532-nm. Proses deposisi ditunjukkan pada Gambar. 2. Nanopartikel target dilarutkan dalam isopropanol dengan konsentrasi 1 wt.%. Campuran dibekukan dalam wadah target yang didinginkan dengan nitrogen cair. Tidak ada aditif dan surfaktan tambahan lain yang digunakan dalam proses ini.
Skema pengendapan UCNPs dan UCNPs-IgG dengan menggunakan teknik MAPLE
Selanjutnya, laser 532 nm Nd:YAG diaplikasikan dengan frekuensi laser pada 10 Hz dan fwhm 200 s. Ukuran area bintik laser adalah 0,63 cm
2
dan fluence laser adalah 150 mJ/cm
2
. Substrat kaca diperlakukan dengan larutan gelatin 2% berat yang difiksasi pada penahan substrat dan suhu substrat adalah 25 °C selama seluruh proses percobaan. Proses deposisi laser dilakukan di bawah 1 × 10
−6
Tor. Sesuai penelitian kami sebelumnya [42, 43], waktu deposisi diatur ke 2 jam. Jarak substrat-ke-target adalah 4,5 cm (konfigurasi vertikal). Penahan target dan penahan media berputar (target:10 rpm, substrat:25 rpm) selama periode penyinaran laser.
Karakterisasi Material
UCNPs dan UCNPs-IgG sebelum deposisi MAPLE dicirikan oleh mikroskop elektron transmisi (TEM, Philips CM-10, beroperasi pada 80 kV). Spektrum inframerah transformasi-fourier (FTIR) dari UCNPs dan UCNPs-IgG diperoleh dengan spektrometer FTIR Bruker Vector 22 (rentang pemindaian 600 cm
−1
~4500 cm
−1
, resolusi 4 cm
−1
, 64 pemindaian). Sifat fotoluminesensi UCNP dipelajari dengan menggunakan QuantaMaster™ 40 Spectrofluorometer (Horiba Canada—Photon Technology International Inc.). Pertumbuhan sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs) pada permukaan kaca dengan/tanpa deposisi nanopartikel diselidiki dengan mikroskop confocal (Zeiss LSM 5 Duo Vario Microscope). Mikroskop elektron pemindaian Hitachi S-3400 N yang dipasang dengan sistem INCA PentaFET-x3 EDX (Oxford Instruments) diterapkan untuk melakukan spektroskopi sinar-X (EDX) dispersi energi.
Studi tentang Perilaku Sel
Sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs, American Type Culture Collection) diterapkan untuk mempelajari biokompatibilitas UCNP dengan/tanpa modifikasi IgG setelah perawatan deposisi laser. HUVECs diunggulkan pada permukaan kaca yang disimpan dengan UCNPs dan UCNPs-IgG. Substrat kaca yang diolah dengan larutan gelatin 2% berat (tanpa UCNPs) digunakan sebagai kontrol setelah perlakuan deposisi MAPLE. Sampel yang disimpan direndam dalam media MCDB (10% serum janin sapi, 1% penisilin, dan amfoterisin B) untuk penyemaian HUVEC. HUVEC dikultur pada suhu 37 ° C selama 24 jam. HUVEC dipasang pada permukaan substrat dengan formalin 4% selama 2 jam untuk mendapatkan pencitraan confocal (Zeiss LSM 510 Duo). Sel-sel diwarnai dengan Phalloidin-TRITC dan DAPI. Sampel dicuci dengan PBS (pH 7,4) dan diberi bahan anti luntur.
Studi tentang Sitotoksisitas
HUVEC dikultur dalam media MCDB (10% serum janin sapi, 1% penisilin, dan amfoterisin B) pada permukaan sampel yang disimpan. Setelah dipindahkan ke cawan kultur, sel dikultur selama 24 jam (37 °C, 5% CO2 ) pada permukaan sampel. Sekitar 100.000 sel diunggulkan pada permukaan setiap sampel (dengan/tanpa deposisi UNCP). Semua sampel termasuk kontrol, substrat kaca dengan deposisi, UCNPs, dan UCNPs-IgG diukur dalam rangkap tiga. Kemudian agen MTT (3-(4, 5-dimetil tiazolil-2)-2, 5-difenil tetrazolium bromida) ditambahkan ke media sel dan sel diinkubasi selama 3 jam. Media sel telah dihapus dan sumur dibilas dua kali dengan PBS. Kemudian DMSO ditambahkan ke masing-masing sumur untuk melarutkan formazan. Cairan dipindahkan ke pelat 96-sumur dan dianalisis dengan pembaca bio-kinetik pada 490 nm (Pembaca Pelat Mikro Bio-Tek Instruments EL340I).
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi UCNPs/UCNPs-IgG Sebelum Deposisi MAPLE
Antibodi IgG dikonjugasikan ke UCNP yang dimodifikasi amina melalui hubungan amida. UCNP dengan/tanpa IgG dicirikan oleh TEM. Gambar 3a adalah mikrograf TEM dari UCNP kubik. Ukuran rata-rata UCNPs diperkirakan 50 ± 8 nm. Sisipan kecil dari Gambar 3a adalah mikrograf dari TEM resolusi tinggi (HRTEM). UCNPs memiliki struktur yang sangat kristal. Jarak antar bidang yang diukur antara dua bidang kisi yang berdekatan adalah 0,312 nm, sesuai dengan bidang (1 1 1) fase kubik NaGdF4 (JCPDS 27-0697). Gambar 3b adalah mikrograf TEM dari UCNP yang terkonjugasi dengan IgG (UCNPs-IgG). UCNP yang dimodifikasi dengan antibodi tetap berbentuk kubik, dan ukuran partikel rata-rata sekitar 54 ± 8 nm. Antibodi IgG yang terbiokonjugasi ke UCNPs dapat diamati secara langsung oleh TEM seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, ditandai dengan lingkaran merah. Ukuran antibodi IgG adalah sekitar 10 ± 5 nm yang mirip dengan perhitungan teoritis dan ukuran percobaan [44, 45].
Mikrograf TEM dari a UCNP dan b UCNPs-IgG sebelum deposisi MAPLE
Struktur kristal UCNPs (NaGdF4 :Yb
3+
, Eh
3+
) diungkapkan oleh pola difraksi serbuk sinar-X (XRD) seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4. Empat puncak pada profil XRD 32°, 37°, 54°, dan 65° dikaitkan dengan (111), (200), ( 220), dan (311) bidang kristal, yang sama dengan pola XRD standar fase kubik NaGdF4 (JCPDS 27-0697) dan referensi [36, 37]. Pengukuran HRTEM dan XRD mengkonfirmasi struktur kristal UCNP.
Untuk menyelidiki lebih lanjut biokonjugasi IgG ke UCNPs, spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) digunakan. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5, pita getaran lentur dari gugus amina diamati pada 1515 cm
−1
dan 1511 cm
−1
dalam spektrum UCNPs dan UCNPs-IgG karena antibodi PEI dan IgG memiliki gugus amino. Puncaknya pada 2987 cm
−1
, 2900 cm
−1
, dan 1400 cm
−1
dapat dikaitkan dengan vibrasi regangan -CH2 - dan ikatan C-C, masing-masing. Pita vibrasi ulur gugus hidroksil (-OH) teramati pada 3673 cm
−1
dalam spektrum UCNPs-IgG karena gugus karboksil IgG. Puncaknya pada 1249 cm
−1
dan 1650 cm
−1
dikaitkan dengan pita getaran peregangan dari ikatan karbon-oksigen dan hubungan amida, masing-masing, dalam spektrum UCNP yang dimodifikasi IgG. Puncak ini mengungkapkan keberadaan antibodi IgG pada permukaan UCNPs-IgG.
Spektrum FTIR dari UCNPs-IgG dan UCNPs, masing-masing, dibuat dengan proses satu pot
Karakterisasi UCNP Dengan/Tanpa IgG Setelah Deposisi MAPLE
UCNPs dan UCNPs-IgG diendapkan dengan proses MAPLE pada cawan kultur sel dengan dasar kaca. Permukaan kaca sebelum dan sesudah pengendapan UCNPs dan UCNPs-IgG, masing-masing, dicirikan oleh spektroskopi sinar-X dispersi energi (EDX). Gambar 6 menunjukkan adanya unsur gadolinium (Gd), erbium (Er), iterbium (Yb), dan fluor (F) dalam sampel kaca yang dilapisi UCNPs (Gbr. 6a) dan UCNPs-IgG (Gbr. 6b), masing-masing. Selain itu, fotoluminesensi UCNPs dan UCNPs-IgG setelah deposisi MAPLE dengan waktu iradiasi yang lebih lama diukur. Baik emisi hijau (540 nm) dan merah (650 nm) dapat diamati di bawah eksitasi 980 nm seperti yang ditunjukkan pada file tambahan 1:Gambar S1 dalam file pendukung. Perlu dicatat bahwa intensitas emisi sedikit berbeda antara sampel UCNP dengan dan tanpa IgG, yang dapat disebabkan oleh cacat permukaan, atau kesalahan pengukuran. Studi lebih lanjut akan dilakukan. Akibatnya, deposisi MAPLE dapat mempertahankan struktur dan sifat UCNPs dengan/tanpa IgG.
Spektrum EDX a sampel setelah perlakuan MAPLE dan b sampel tanpa perlakuan MAPLE (gelas kosong)
FTIR digunakan untuk menyelidiki lapisan UCNPS dan UCNPs-IgG yang dibuat dengan teknik MAPLE dibandingkan dengan sampel kaca kosong. Spektrum FTIR sampel yang diendapkan dengan UCNPs, UCNPs-IgG oleh deposisi MAPLE, dan sampel kosong (substrat kaca kosong) ditampilkan pada Gambar 7. Pita vibrasi regangan gugus –OH pada 3648 cm
−1
dikaitkan dengan gugus karboksil IgG, yang hanya diamati pada spektrum-1, yaitu lapisan UCNPs-IgG. Hasil ini menunjukkan adanya UCNP-IgG pada permukaan substrat. Dalam spektrum-2 (pelapisan UCNPs), pita getaran lentur pada 1575 cm
−1
dikaitkan dengan gugus amina yang dimodifikasi pada UCNP, sedangkan pita getaran lentur dari gugus amina hampir tidak diamati dalam spektrum-1 (UCNPs-IgG) karena biokonjugasi yang berhasil. Akibatnya, teknik MAPLE mampu mempertahankan sifat dan struktur mikro UCNP yang dimodifikasi dengan antibodi.
Spektrum FTIR kaca telanjang dan kaca yang dilapisi masing-masing dengan UCNPs-IgG dan UCNPs
Dibandingkan dengan spektrum kaca telanjang (spektrum-3), pita vibrasi regangan gugus metilen sekitar 2985 cm
−1
dan 2900 cm
−1
di kedua spektrum-1 dan spektrum-2 karena kelompok fungsional berbasis karbon pada permukaan UCNPs. Perlu dicatat bahwa puncak lapisan pada Gambar 7 secara signifikan lebih lemah daripada puncak pada Gambar 5 yang disebabkan oleh rendahnya jumlah nanopartikel yang diendapkan pada permukaan substrat, dan perubahan spektrum pada 1250 cm
−1
pada Gambar. 7 dibandingkan dengan Gambar. 5 berasal dari efek substrat kaca.
Perilaku Sel pada Lapisan yang Berbeda
Metode tradisional untuk sel HUVEC memerlukan pelapisan lapisan protein yang digunakan sebagai kontrol kami dalam studi kinerja kultur sel. Oleh karena itu, tiga pelapis yang berbeda dalam penelitian ini adalah (1) kontrol (kaca dilapisi gelatin), (2) kaca dilapisi UCNPs, dan (3) kaca dilapisi UCNPs-IgG. Gambar 8 menyajikan mikrograf mikroskop confocal dari sel yang dikultur pada permukaan yang berbeda selama 24 jam. Jumlah HUVECs yang tumbuh di permukaan yang dilapisi dengan UCNPs dan UCNPs-IgG, masing-masing, serupa dengan kontrol. Namun, perilaku sel HUVEC yang tumbuh pada permukaan yang dimodifikasi dengan UCNPs-IgG meningkat secara dramatis dalam periode kultur 24 jam pertama. Perilaku pertumbuhan sel dalam periode kultur termasuk area sel, panjang koneksi, panjang sel, dan jumlah sel total pada permukaan sampel diselidiki dan dianalisis.
Mikrograf confocal HUVEC pada permukaan a kontrol, b UCNP, dan c UCNP yang dimodifikasi IgG
Gambar 9 menampilkan analisis statistik dari perilaku sel setelah kultur 24 jam pada tiga permukaan yang berbeda. Area sel (Gbr. 9a), panjang koneksi (Gbr. 9b), panjang sel (Gbr. 9c), dan jumlah sel (Gbr. 9d) diselidiki oleh perangkat lunak ImageJ. Panjang sel didefinisikan sebagai nilai panjang terbesar sel ini. Panjang sambungan didefinisikan sebagai jarak antara tepi ujung sel dan inti sel. Dibandingkan dengan sel yang tumbuh pada sampel kontrol, area sel sel HUVEC pada permukaan yang dimodifikasi dengan UCNPs dan UCNPs-IgG meningkat masing-masing sebesar 11,2% dan 22,2%; panjang koneksi sel HUVEC pada permukaan yang dimodifikasi dengan UCNPs dan UCNPs-IgG meningkat dengan 12,5% dan 17,5%; dan panjang sel HUVEC pada permukaan yang dimodifikasi dengan UCNPs dan UCNPs-IgG meningkat sebesar 8,2% dan 17,3%. Selain itu, hasil analisis jumlah sel menunjukkan bahwa jumlah sel pada permukaan sampel berbasis UCNP sekitar 8% lebih tinggi daripada kontrol. Hasil ini menunjukkan bahwa sampel UCNPs dan sampel UCNPs-IgG biokompatibel dengan sel HUVECs yang konsisten dengan penelitian sebelumnya [38]. Pertumbuhan sel HUVEC yang dikultur pada permukaan yang diendapkan dengan UCNPs dan UCNPs-IgG telah dipromosikan dalam hal luas sel, panjang sel, dan panjang koneksi. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa struktur nano dapat memicu aktivasi endotel sel HUVEC [2,3,4, 39]. Telah dilaporkan bahwa pelepasan mediator inflamasi dan upregulasi molekul adhesi HUVECs akan diamati ketika terkena berbagai nanopartikel [40]. Mediator inflamasi dapat meningkatkan efek angiogenesis dan pro-angiogenesis berdasarkan penelitian sebelumnya [2, 41]. Selain itu, penelitian terbaru menunjukkan bahwa IgG dapat mempromosikan transformasi seperti angiogenesis dari HUVECs [3].
HUVECs dikultur pada lapisan yang berbeda termasuk kontrol, UCNPs, UCNPs-IgG:a area sel, b panjang koneksi sel, c panjang sel, dan d nomor sel
Pengaruh Pelapisan UCNPs Dengan/Tanpa IgG pada Viabilitas Sel
Viabilitas sel dipelajari dengan menggunakan sel HUVEC yang dikultur pada permukaan yang berbeda. Gambar 10 menunjukkan viabilitas sel relatif pada permukaan yang berbeda:kontrol (kaca dilapisi dengan gelatin), kaca telanjang, UCNPs disimpan pada substrat kaca, dan UCNPs-IgG disimpan pada substrat kaca. Viabilitas sel relatif dari kaca telanjang, kaca yang dilapisi dengan UCNPs, dan kaca yang dilapisi dengan UCNPs-IgG masing-masing adalah 99,6%, 105,44%, dan 103,96%. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa PEI dengan konsentrasi tinggi mungkin memiliki efek toksik, terutama bila diterapkan pada konsentrasi tinggi, tetapi penggunaan PEI sebagai ligan dapat diterima dan menunjukkan sitotoksisitas yang dapat diabaikan [44,45,46,47]. Karena mekanisme MAPLE, jumlah UCNPs/UCNPs-IgG pada permukaan substrat jauh lebih rendah dari ambang batas (1 mg/ml). Jelas, pengendapan UCNPs dan UCNPs-IgG pada kaca oleh MAPLE tidak menimbulkan efek toksik pada sel HUVEC. Perlu dicatat bahwa bahan biokompatibel biasanya dapat memiliki viabilitas sel relatif (> 85%) sel. [8]
Viabilitas sel sel HUVEC yang tumbuh pada kaca kosong, masing-masing dilapisi dengan UCNPs dan UCNPs-IgG, dan kaca yang dilapisi gelatin digunakan sebagai kontrol
Kesimpulan
Singkatnya, UCNPs dan UCNPs-IgG berhasil disintesis dengan metode satu pot dan telah diendapkan pada cawan kultur dengan alas kaca dengan teknik MAPLE. Hasil TEM dan FTIR mengungkapkan keberhasilan biokonjugasi IgG pada permukaan UCNPs. Ukuran partikel rata-rata UCNPs adalah 50 ± 8 nm. UCNP yang dimodifikasi dengan antibodi tetap berbentuk kubik, dan ukuran partikel rata-rata sekitar 54 ± 8 nm. Biokonjugasi IgG pada UCNPs dapat diamati secara langsung dengan TEM yang memiliki ukuran rata-rata 10 ± 5 nm. Spektrum FTIR juga mengkonfirmasi keberadaan gugus karboksil/ikatan peptida dari antibodi yang dimodifikasi pada permukaan UCNPs. Proses deposisi MAPLE digunakan untuk mendepositkan UCNPs dan UCNPs-IgG pada substrat kaca. Hasil pengukuran EDX, FTIR, dan PL menunjukkan retensi struktur dan sifat UCNPs dan UCNPS setelah deposisi MAPLE. Studi kami menunjukkan bahwa proses MAPLE dapat mencapai retensi sifat dan struktur UCNP dengan/tanpa modifikasi antibodi. Selain itu, kinerja kultur sel telah dipelajari secara statistik dengan mengkultur garis sel HUVEC pada permukaan berbeda yang masing-masing diperlakukan dengan UCNPs dan UCNPs-IgG, yang dibuat oleh proses MAPLE. Area sel, panjang sel, dan panjang sambungan sangat penting untuk mendukung pertemuan yang ideal dan pembentukan struktur pembuluh mikro. Permukaan kaca yang diperlakukan dengan sampel UCNPs dan UCNPs-IgG dengan teknik MAPLE tidak menunjukkan efek toksik pada garis sel HUVEC. Diharapkan bahwa deposisi MAPLE dari UCNPs dan UCNPs-IgG dapat diterapkan dalam pembuatan perangkat biologis baru untuk rekayasa jaringan dan regenerasi jaringan.
