Nanopartikel Termuat Icariin mPEG: Perlindungan Tinggi Terhadap Kardiotoksisitas Induksi LPS di Sel H9c2

Abstrak

Icariin (ICA), glikosida flavonol dari Epimedium, menunjukkan properti kardioprotektif, antioksidan, dan anti-inflamasi tetapi menderita kelarutan air yang buruk, klarifikasi cepat, dan bioavailabilitas oral rendah. Kami menyintesis konjugat hidrofilik polyethylene glycol monomethyl ether (mPEG) (mPEG-ICA) melalui esterifikasi yang dimediasi oleh anidra suksinat, dan kemudian mengenkapsulasi ICA bebas ke dalam polimer melalui dialysis untuk membentuk nanopartikel termuat ICA mPEG-ICA (NP). Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FT-IR) dan resonansi magnetik nukleus proton (^1H-NMR) mengonfirmasi konjugasi yang berhasil. Pencaran cahaya dinamis (DLS) mengungkapkan diameter hidrodinamik rata-rata 220 ± 13,7 nm dengan potensial ζ +2,30 ± 1,33 mV, sementara mikroskop transmisi elektron (TEM) menunjukkan morfologi bola yang seragam. Dalam larutan garam fosfat (PBS) pada pH 7,4, nanopartikel melepaskan 52,8 ± 1,7 % ICA selama 72 jam; pada pH 6,8, peluncuran mempercepat menjadi 75,7 ± 0,2 % dalam 48 jam. In vitro, NP mempertahankan kelangsungan sel H9c2, mengurangi kebocoran dehidrogenas laktat (LDH), dan menghambat apoptosis yang diinduksi oleh lipopolisakarida (LPS). Selain itu, tingkat mRNA sitokin peradaran pro-inflamasi TNF-α, IL-1β, dan IL-6 secara signifikan ditekan. Hasil ini menunjukkan bahwa NP termuat ICA mPEG-ICA menawarkan platform nanomedis yang menjanjikan untuk mengurangi cedera jantung yang diinduksi LPS.

Pendahuluan

Remodeling jantung setelah cedera jantung didorong secara besar oleh sinyal inflamasi yang berkelanjutan, terutama melalui TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-18. Sitokin ini memicu stres oksidatif, aktivasi fibroblast, dan apoptosis kardiomiosit, yang pada akhirnya mengakibatkan fungsi jantung yang terpengaruh. Icariin (C_33H_40O_15) telah secara luas dilaporkan memberikan efek imunomodulasi, antioksidan, dan anti-apoptosis dalam model prklinis, namun potensi terapeutiknya terbatas oleh hidrofobisitas, klarifikasi sistemik cepat, dan penyerapan oral yang buruk. Sistem nanokarrier—seperti misel, liposom, dan nanopartikel polimer—telah muncul sebagai strategi efektif untuk meningkatkan larutnya obat, memperpanjang waktu sirkulasi, dan mencapai pengiriman yang ditargetkan ke jaringan jantung yang terinflamasi, dengan memanfaatkan efek penetrasi dan retensi yang ditingkatkan (EPR).

Polyethylene glycol monomethyl ether (mPEG) menawarkan hidrofilik, kompatibilitas biologis, dan imunogenisitas minimal yang lebih baik dibandingkan PEG linier. Dengan meluncapkan ICA secara kovalen ke mPEG-COOH melalui ikatan ester, kami membuat amfifil hidrofilik–hidrofobik yang mampu menyusun diri menjadi nanopartikel. Ikat ester bersifat asam-labil, memungkinkan peluncran respons pH dari ICA di mikroenvironment asam ringan (pH ≈ 6,8) yang khas pada miocardium yang terinflamasi. Studi ini merinci sintesis mPEG-ICA, enkapsulasi ICA ke dalam nanopartikel, karakterisasi fisikokimia, profil peluncran in vitro, dan evaluasi efikasi kardioprotektif terhadap cedera yang diinduksi LPS dalam sel H9c2.

Bahan dan Metode

Instrumen Eksperimen

Instrumen analitik utama mencakup nol elektronik JA302, evaporator rotary RE52CS-1, penggerak magnetik 78HW-1, pengering blast 101-OA, spektrometer FT-IR NEXUS670, spektrofotometer UV–Vis, TEM Glacios, disperser ultrasonik JP-010S, sistem qPCR real-time, analyzer fluoresensi terpadu enzim, mikroskop terbalik Olympus, mikroskop fluoresensi Leica, dan inkubator CO₂ Thermo.

Reagen Eksperimen

Reagen kelas analitis diperoleh dari pemasok komersial: Icariin (95 %, 1 g, DL070208), LPS (55 mg, Sigma, Z06J9Y52452), mPEG-Me (250 g, Sigma, MKBT7172), diklorometana (500 mL, Sinopharm), 4-dimetilaminopiridin (100 g, Aladdin), N-hidroksisuksinimid (100 g, Ruiyong), kit sintesis cDNA FastKing (Tiangen), kit apoptosis Biyuntian, kit qPCR SYBR Green (QIAGEN), dan lainnya.

Sintesis mPEG-COOH

mPEG (5 g), anidra suksinat (0,40 g), dan DMAP (0,50 g) bereaksi dalam 50 mL diklorometana pada 60 °C selama 2 jam di bawah reflux. Larutan dipanaskan menguap, dan padatan putih yang dihasilkan difurnir melalui dialysis (2 kDa MWCO) terhadap air selama 48 jam. Produk yang di-freeze-drying menghasilkan mPEG-COOH.

Sintesis Polimer mPEG-ICA

mPEG-COOH (0,37 g) diaktifkan dengan NHS (0,024 g) dan DMAP (0,026 g) dalam 10 mL DMSO kering, kemudian bereaksi dengan 100 mg ICA (dilarutkan dalam 5 mL DMSO kering) di bawah nitrogen pada suhu kamar selama 48 jam. Setelah dialysis yang luas terhadap air dan freeze-drying, polimer mPEG-ICA diperoleh.

Persiapan Nanopartikel Termuat ICA mPEG-ICA (NP)

mPEG-ICA (5 mg) dilarutkan dalam 2 mL DMSO dan dicampur dengan 5 mg ICA dalam DMSO, diikuti dengan penambahan 5 mL air destilasi. Setelah diaduk selama 15 menit pada suhu kamar, larutan didialisis (3500 Da MWCO) selama 24 jam dengan pergantian air yang sering, kemudian difilter untuk menghasilkan NP termuat ICA mPEG-ICA.

Spektroskopi Inframerah Transformasi Fourier

Sampel dicampur dengan KBr, ditekan menjadi pellet, dan dipindai dari 4000 hingga 4400 cm^−1 untuk mengonfirmasi transformasi grup fungsional.

Spektrum Resonansi Magnetik Nukleus Hidrogen

Sampel dilarutkan dalam DMSO-d_6 dan dianalisis pada spektrometer NMR 500 MHz untuk mengonfirmasi pergeseran kimia yang konsisten dengan esterifikasi.

Spektrum UV–Vis

Kurva kalibrasi ICA pada 270 nm dihasilkan; konsentrasi polimer dan nanopartikel dikuantifikasi menggunakan kurva ini.

Karakterisasi Nanopartikel Termuat ICA mPEG-ICA

Deteksi Pencaran Cahaya Dinamis

Distribusi ukuran partikel dan potensial ζ diukur dengan Zetasizer 3000hs setelah lyophilization dan redispersi dalam air; setiap sampel dianalisis secara triplik.

Pengamatan Morfologi oleh TEM

Suspensi NP 1,0 mg/mL diterapkan pada grid tembaga dilapisi karbon, diwarnai dengan asam fosfotungstik 2 %, dan diimaging pada 80 kV.

Pengukuran Stabilitas

NP di-freeze-drying dengan manitol 5 %, dire-disperse dalam air, dan ukuran/PDI dipantau untuk menilai stabilitas penyimpanan.

Penentuan Muatan Obat dan Efisiensi Enkapsulasi

Muatan obat (EE%) dan efisiensi enkapsulasi (LC%) dihitung dari absorbansi UV-Vis menggunakan rumus: EE = massa obat dalam NP / massa total NP × 100 %; LC = massa obat dalam NP / massa obat awal × 100 %.

Peluncran Obat In Vitro

NP ditempatkan dalam 25 mL PBS (pH 7,4 atau 6,8) pada 37 °C dengan agitasi 100 rpm. Sampel (2 mL) ditarik pada interval yang ditentukan, diganti dengan medium segar, dan dianalisis oleh UV–Vis pada 270 nm. Peluncran kumulatif (%) dihitung menggunakan persamaan standar.

Eksperimen Pengujian Sel

Sel kardiomioblast tikus H9c2 dikultur dalam DMEM + 10 % FBS pada 37 °C/5 % CO_2. Sel ditempatkan pada plate 96-lubang (10^4 sel/lubang) untuk uji kelangsungan, LDH, apoptosis, dan qPCR.

Perlakuan Sel dengan LPS atau Nanopartikel ICA

Sel dibagi menjadi lima grup: (1) kontrol (tanpa perlakuan), (2) LPS (10 µg/mL) selama 24 jam, (3) ICA (20 µM) + LPS, (4) polimer mPEG-ICA (20 µM) + LPS, (5) NP termuat ICA mPEG-ICA (20 µM) + LPS.

MTT

Setelah perlakuan 24 jam, 0,5 mg/mL MTT ditambahkan selama 4 jam. Formazan dilarutkan dalam DMSO dan absorbansi diukur pada 570 nm.

Kebocoran Dehidrogenas Laktat (LDH)

Aktivitas LDH dalam sobrenatan kultur dikuantifikasi menggunakan kit komersial; absorbansi dibaca pada 490 nm.

Staining Hoechst 33342

Morfologi inti diperiksa setelah staining selama 15 menit dengan Hoechst 33342 (1 µg/mL) dan diimaging di bawah mikroskop fluoresensi. Indeks apoptosis = inti apoptosis/total inti × 100 %.

Assay TUNEL

Fragmentasi DNA terdeteksi menggunakan kit TUNEL; inti apoptosis dihitung sebagai fluoresensi hijau relatif terhadap total inti yang diwarnai DAPI.

Sitometri Aliran untuk Mendeteksi Apoptosis

Staining ganda Annexin V-FITC/PI dilakukan; populasi apoptosis awal dan akhir dikuantifikasi oleh sitometri aliran.

Transkripsi Balik Reaksi Rantai Polimerase Kuantitatif (RT–qPCR)

RNA diekstrak dengan TRIzol, ditranskripsi balik, dan difosforilasi pada sistem Bio-Rad CFX96 menggunakan SYBR Green. Ekspresi gen TNF-α, IL-1β, IL-6, dan aktin (rumah tangga) dinormalisasi terhadap aktin. Urutan primer tercantum dalam naskah asli.

Hasil dan Pembahasan

Spektrum FTIR dan ^1H NMR

Spektrum FT-IR menampilkan penyerapan karbonil ester karakteristik pada 1700 dan 1740 cm^−1, mengonfirmasi konjugasi yang berhasil. ^1H-NMR mengungkapkan sinyal hidroksil fenolik pada 12,6 ppm, proton aromatik pada 7,5 ppm, dan proton metilena rantai PEG pada 3,5 ppm, mengonfirmasi kehadiran baik ICA maupun mPEG.

Spektrum FTIR dari mPEG-ICA (A), ICA (B), dan mPEG-COOH (C). Spektrum ^1H-NMR untuk mPEG-COOH dan mPEG-ICA.

Ukuran Partikel, Potensial Zeta, dan TEM

NP polimer inti rata-rata 145 ± 15,2 nm (PDI = 0,277), sedangkan NP termuat ICA diperluas menjadi 220 ± 13,7 nm (PDI = 0,119). Potensial zeta bergeser dari +0,44 ± 0,26 mV menjadi +2,30 ± 1,33 mV setelah pemuatan, menunjukkan stabilitas koloid yang ditingkatkan. Gambar TEM mengonfirmasi morfologi bola yang seragam (Gambar 2).

Ukuran partikel, potensial zeta dan TEM dari NP termuat ICA mPEG-ICA.

Muatan Obat dan Efisiensi Enkapsulasi

Analisis UV-Vis menghasilkan muatan obat sebesar 21,9 ± 0,013 % dan efisiensi enkapsulasi sebesar 54,9 ± 0,032 % untuk NP termuat ICA, unggul dibandingkan NP polimer saja (muatan = 16,5 %; EE = 41,3 %). Nilai ini konsisten dengan muatan terapeutik yang diinginkan.

Penentuan Stabilitas

Setelah freeze-drying dengan manitol 5 %, NP yang dire-disperse menunjukkan peningkatan ukuran yang modest menjadi 255 nm (PDI = 0,326) namun tetap mempertahankan seragam yang dapat diterima, mengonfirmasi stabilitas penyimpanan (Gambar 3).

Stabilitas NP termuat ICA mPEG-ICA.

Peluncran Obat mPEG-ICA-ICA In Vitro

Dalam PBS pH 7,4, ICA bebas melepaskan 77,2 % dalam 12 jam, sedangkan NP mPEG-ICA melepaskan 44,1 % selama 72 jam. NP termuat ICA melepaskan 52,8 % selama 72 jam pada pH netral dan 75,7 % dalam 48 jam pada pH 6,8, mencerminkan peluncran respons pH yang dipercepat (Gambar 4).

A Peluncran ICA dari NP termuat ICA mPEG-ICA dalam PBS pada pH 7,4. B Peluncran pada pH 7,4 versus pH 6,8.

Kelangsungan Sel H9C2 dan Kebocoran Dehidrogenas Laktat

Assay MTT mengungkapkan tidak ada sytotoksisitas ICA, mPEG-ICA, atau NP termuat ICA pada 20 µM. Setelah paparan LPS, kelangsungan turun menjadi 50,0 % (kontrol = 100 %). Perlakuan dengan ICA, mPEG-ICA, dan NP termuat ICA memulihkan kelangsungan masing-masing menjadi 55,9 %, 61,0 %, dan 65,4 % (p < 0,05) (Gambar 5, 6).

Evaluasi sytotoksisitas nanopartikel ICA pada sel H9c2.

Efek nanopartikel ICA terhadap cedera sel H9c2 yang diinduksi LPS.

Assay LDH menunjukkan kenaikan yang signifikan dalam kebocoran enzim setelah perlakuan LPS; ICA, mPEG-ICA, dan NP termuat ICA secara signifikan mengurangi kebocoran LDH, dengan efek yang paling mencolok diperhatikan pada NP termuat ICA (Gambar 7).

Efek nanopartikel ICA terhadap tingkat LDH yang diinduksi LPS dalam sel H9c2.

Apoptosis Sel yang Diinduksi LPS

Staining Hoechst 33342 mengungkapkan kondensi dan fragmentasi kromatin dalam sel yang diperlakukan LPS; NP termuat ICA secara signifikan mengurangi morfologi apoptosis (Gambar 8). Assay TUNEL mengukur tingkat apoptosis: LPS menginduksi apoptosis 47,6 %, yang berkurang menjadi 35,5 % (ICA), 26,5 % (mPEG-ICA), dan 17,9 % (NP termuat ICA). Sitometri aliran mengonfirmasi temuan ini, menunjukkan total apoptosis 35,9 % dalam LPS versus 16,7 % (NP termuat ICA) dan 19,2 % (mPEG-ICA) (Gambar 9‑10).

Deteksi apoptosis oleh staining Hoechst 33342.

Deteksi apoptosis oleh TUNEL.

Tingkat apoptosis terdeteksi oleh sitometri aliran.

mRNA Sitokin Peradaran dalam Sel H9c2 yang Diinduksi LPS

RT-qPCR menunjukkan bahwa LPS secara signifikant meningkatkan transkrip TNF-α, IL-1β, dan IL-6. Perlakuan dengan ICA, mPEG-ICA, dan NP termuat ICA menekan sitokin ini, dengan NP termuat ICA mencapai regulasi turun yang paling signifikan (Gambar 11).

Efek NP termuat ICA mPEG-ICA terhadap ekspresi mRNA IL-1β, TNF-α, dan IL-6.

Temuan ini mengonfirmasi bahwa NP termuat ICA mPEG-ICA memberikan perlindungan jantung yang ditingkatkan dengan menyampaikan ICA secara langsung ke miocardium yang terinflamasi, mengurangi stres oksidatif, apoptosis, dan produksi sitokin peradaran.

Kesimpulan

Kami telah berhasil memproduksi NP termuat ICA mPEG-ICA melalui pendekatan hibrid kimia-fisik yang secara signifikant meningkatkan larutnya ICA, kapasitas pemuatan, dan peluncran berkelanjutan serta respons pH. Dalam sel H9c2 yang ditantang LPS, NP ini memulihkan kelangsungan sel, mengurangi kebocoran LDH, menghambat apoptosis, dan menekan ekspresi sitokin pro-inflamasi secara lebih efektif dibandingkan ICA bebas atau polimer saja. Data mendukung potensi NP termuat ICA mPEG-ICA sebagai nanomedis yang ditargetkan untuk merawat cedera jantung inflamasi.