Persiapan nanopartikel mPEG-ICA bermuatan ICA dan aplikasinya dalam pengobatan kerusakan sel H9c2 yang diinduksi LPS

Bahan dan metode

Instrumen eksperimental

Berikut ini digunakan:timbangan elektronik JA302 (Shanghai Suzhan Metrology instrument Co., Ltd.); rotary evaporator RE52CS-1 (Pabrik instrumen biokimia Shanghai Yarong); tampilan digital pengaduk magnet suhu konstan 78HW-1 (instrumen Hangzhou Motor Co., Ltd.); pengering ledakan listrik 101-OA (Tianjin Telester instrument Co., Ltd.); Spektrometer inframerah transformasi Fourier NEXUS670 (Neliko Co., Ltd.); Spektrofotometer UV–Vis (Beijing Leiboteke instrument Co., Ltd.); mikroskop elektron transmisi (TEM Glacios); osilator mandi air instrumen ekstraksi dispersi ultrasonik JP-010S (China Jiemeng Co., Ltd.); instrumen PCR kuantitatif fluoresensi waktu nyata; instrumen pelabelan enzim multifungsi; mikroskop terbalik (perusahaan Olympus) mikroskop fluoresensi (Leica, Heidelberg, Jerman); inkubator sel karbon dioksida (Perusahaan termo).

Reagen eksperimental

Berikut ini digunakan:kemurnian nama reagen/spesifikasi/nomor batch produksi (produsen):Icariin (95%/1 g/DL070208 Sahn Chemical Technology Co., Ltd.); lipopolisakarida (Model 055-100 g/Z06J9Y52452 B5 25 mg Sigma Co., Ltd.); polietilen glikol monometil eter (Analytical Pure/250 g/MKBT7172 V, Sigma Co., Ltd.); diklorometana (Analytical Pure/500 mL/20171103 Sinopharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); 4-dimethylaminopyridine (Analytical Pure/100 g/L170741 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); N-hidroksisuksinimida (Reagen Biologis/100 g/RA328L758 Shanghai Ruiyong Biotechnology Co., Ltd.); Metode satu langkah FastKing untuk menghilangkan untaian pertama kit pracampur sintesis cDNA genom (Tiangen Biotechnology Co., Ltd.); kit deteksi apoptosis (Biyuntian); Kit kuantitatif fluoresensi hijau SYBR (perusahaan QIAGENGmbH).

Sintesis mPEG-COOH

mPEG (5,00 g), suksinat anhidrida (SA, 0,40 g) dan 4-dimetilaminopiridin (rasio molar 1:1,5/1.5, 0,50 g) ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu alas bulat 250 mL. Lima puluh mililiter diklorometana ditambahkan, direfluks dan diaduk pada suhu 60 °C selama 2 jam. Diklorometana dihilangkan dengan rotavapor pada suhu 35 °C selama setengah hari, dan diperoleh padatan putih, yang disimpan pada suhu kamar dan tekanan atmosfer selama setengah hari sampai tidak ada residu eter yang muncul. Bubuk dilarutkan dalam 50 mL air suling sekunder dan didialisis dalam kantong dialisis 2 kDa selama 48 jam dengan air yang diganti secara konstan. SA terlarut telah dihapus, dan zat yang tidak larut disaring. mPEG terkarboksilasi (mPEG-COOH) diperoleh dengan pengeringan beku filtrat dan penimbangan.

Sintesis polimer mPEG-icariin

mPEG-COOH (0,37 g), N -hidroksi suksinimida (0,024 g) dan 4-dimetilaminopiridin (0,026 g) ditimbang dalam labu alas bulat 250 mL, kemudian 10 mL dimetil sulfoksida (DMSO) dehidrasi ditambahkan sebagai pelarut dan diaduk pada suhu kamar selama setengahnya. sehari untuk mengaktifkan gugus karboksil. Kemudian, 100 mg standar Icariin ditempatkan dalam tabung kecil, dan 5 mL DMSO yang airnya telah dihilangkan ditambahkan untuk melarutkan standar sepenuhnya. Kemudian, sampel standar ditambahkan ke labu alas bulat dan diaduk selama 48 jam di bawah perlindungan gas nitrogen pada suhu kamar. Setelah dialisis terus menerus dengan air suling sekunder, sampel standar tidak mengandung DMSO, dan kami mengkonfirmasi penghapusan DMSO menggunakan UV. Kemudian, bahan yang didialisis dikeringkan-beku dalam pengering beku vakum selama 48 jam untuk mendapatkan produk berwarna kuning muda, yaitu polimer mPEG-ICA.

Persiapan nanopartikel (NP) mPEG-ICA yang dimuat ICA

mPEG-ICA (5 mg) ditimbang dalam tabung kecil, dilarutkan dalam 2 mL DMSO lalu dikocok dalam air pada suhu 37 °C selama 5 menit. Lima miligram ICA dilarutkan dalam DMSO dalam jumlah yang tepat dan dimasukkan ke dalam gelas kimia kecil, dan mPEG-ICA ditambahkan secara perlahan dan dilarutkan dalam DMSO, dan ditambahkan 5 mL air suling. Larutan kemudian diaduk pada pengaduk magnet pada suhu kamar selama 15 menit. Kemudian, reaktan didialisis dalam tas dialisis 3500 dan didialisis dalam air selama 24 jam, selama itu air diganti secara konstan, pelarut DMSO didialisis bersih, dan nanopartikel mPEG-ICA bermuatan ICA diperoleh setelah penyaringan.

Spektroskopi inframerah transformasi Fourier

Jumlah yang tepat dari polimer ICA, mPEG-COOH dan mPEG-ICA standar digiling menjadi bubuk dalam mortar batu akik, dicampur dengan bubuk KBr kering dalam jumlah yang sesuai dan digiling menjadi bubuk halus. Setelah menekan tablet, campuran dipindai dalam spektrometer inframerah Fourier dengan rentang pemindaian 4000–4400 cm/mol ⁻¹ , dan spektrum inframerahnya direkam. ICA dan mPEG-COOH digunakan untuk karakterisasi material, dan polimer mPEG-ICA digunakan untuk karakterisasi produk.

Spektrum hidrogen resonansi magnetik nuklir

Polimer ICA, mPEG-COOH dan mPEG-ICA dilarutkan dalam deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-d6) dan dimasukkan ke dalam tabung sampel, yang dimasukkan ke dalam rotor. Kemudian, sampel ditempatkan pada spektrometer resonansi magnetik nuklir 500 MHz, dan parameter pengambilan sampel ditetapkan.

Spektrum UV–Vis

Icariin standar (4,0 mg) ditambahkan ke dalam labu ukur 25 mL, dengan metanol ditambahkan ke skala dan kemudian dikocok dan dilarutkan sampai diklarifikasi. Kemudian, 0,3 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, 1,5 mL, 2,0 mL, dan 2,5 mL larutan standar icariin diukur secara akurat dalam labu ukur 25 mL, dan metanol ditambahkan untuk mengatur volume. Nilai absorbansi larutan kemudian diukur pada spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 270 nm (panjang gelombang serapan maksimum), dengan methanol sebagai kontrol blanko. Data dicatat untuk menghasilkan regresi linier.

Polimer mPEG-ICA (4,3 mg) ditimbang secara akurat dalam labu ukur 25 mL, dengan metanol ditambahkan ke timbangan. Larutan dikocok sampai larut dan jernih. Kemudian, larutan sampel 2,0 mL diukur tiga kali secara akurat dan dilarutkan dalam labu ukur 25 mL, dengan volume disesuaikan dengan metanol. Nilai absorbansi larutan kemudian diukur pada spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 270 nm (panjang gelombang serapan maksimum), dengan methanol sebagai kontrol blanko, dan data dicatat tiga kali, dengan diambil rata-ratanya. Kemudian dihitung kandungan icariinnya.

Nanopartikel mPEG-ICA berisi ICA yang disiapkan menurut metode di atas ditempatkan dalam labu berkapasitas 25 mL, metanol ditambahkan ke skala, dan labu dikocok sampai larutan larut dan dijernihkan. Kemudian, larutan sampel 2,0 mL diukur tiga kali secara akurat dan dilarutkan dalam labu ukur 25 mL, dengan volume disesuaikan dengan metanol. Nilai absorbansi larutan kemudian diukur pada spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 270 nm (panjang gelombang serapan maksimum), dengan methanol sebagai kontrol blanko, dan data dicatat tiga kali, dengan diambil rata-ratanya. Data dikumpulkan untuk menghitung rata-rata kandungan ICA dari ICA-loaded mPEG-ICA nanopartikel.

Karakterisasi NP mPEG-ICA yang dimuat ICA

Deteksi hamburan cahaya dinamis

Pengukur partikel hamburan cahaya dinamis (DLS; Zetasizer 3000hs, instrumen Malvern, Malvern, UK) digunakan untuk mengukur distribusi ukuran partikel dan potensi NP mPEG-ICA yang dimuat ICA. NP mPEG-ICA dan mPEG-ICA yang baru disiapkan dan dimuat ICA diliofilisasi dan disebarkan kembali dalam air suling, dituangkan ke dalam cangkir kolorimetri dan kemudian ditempatkan dalam kumpulan sampel penganalisis ukuran partikel hamburan cahaya dinamis untuk deteksi. Setiap sampel dianalisis tiga kali.

Pengamatan morfologi dengan TEM

Larutan NP mPEG-ICA ICA (1,0 mg/mL) diteteskan pada kasa tembaga dengan film karbon dan kertas saring hingga kering. Kisi ditempatkan di pengering, dan 2% (b/b) asam fosfotungstat ditambahkan dan dibiarkan kering secara alami selama 10 menit. Kemudian, karakteristik morfologi NP mPEG-ICA yang dimuat ICA diamati pada tegangan yang dipercepat sebesar 80 kV dengan mikroskop elektron transmisi.

Pengukuran stabilitas

NP mPEG-ICA ICA-loaded yang disiapkan dikeringkan-beku dengan manitol 5% dalam pengering beku vakum selama 48 jam, dan kemudian nanopartikel beku-kering dilarutkan kembali dalam air suling ganda untuk mendeteksi perubahan ukuran partikel dan nilai PDI. .

Penentuan pemuatan obat dan efisiensi penjebakan

Larutan NP mPEG-ICA 1,8 mL berisi ICA diukur secara akurat dalam labu ukur 10 mL, 0,2 mL DMSO ditambahkan, dan ultrasound dilakukan selama 2 menit. Absorbansi larutan ditentukan pada 270 nm, dan polimer mPEG-ICA dengan pelarut yang sama digunakan sebagai blanko. Absorbansi sampel yang ditentukan disubstitusikan ke dalam persamaan kurva standar, dan kandungan Icariin dihitung. Di DMSO/H₂ O = 1/9 sistem pelarut, persamaan kuasi-kurva Icariin diukur pada 270 nm, dan pemuatan obat (EE%) dan efisiensi penjebakan (LC%) dari nanopartikel dihitung.

• Pemuatan obat (EE%) = massa obat nanopartikel/massa total nanopartikel pemuatan obat × 100%

• Laju enkapsulasi (LC%) = massa obat dalam nanopartikel/dosis × 100%.

Pelepasan obat secara in vitro

Lima mililiter ICA gratis, polimer mPEG-ICA, dan NP mPEG-ICA bermuatan ICA ditempatkan dalam kantong dialisis (3500 kDa), yang diikatkan pada kedua ujungnya dan didialisis dalam 25 mL PBS (media pelepas) pada suhu 37 °C dan Getaran ultrasonik 100 rpm (pH = 7.4). Dua mililiter telah dihapus dalam periode waktu yang telah ditentukan (Tn, n = 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, dan 72 jam) dan diganti dengan larutan baru dengan volume yang sama. Spektrofotometri UV–Vis dilakukan untuk menentukan absorbansi dialisat pada 270 nm pada waktu yang berbeda. Rasio persentase pelepasan ICA dihitung seperti yang dijelaskan, dan tiga sampel diukur untuk menghitung pelepasan obat rata-rata. Kandungan dialisat ditentukan dengan metode kurva standar, dan uji pelepasan diulang 3 kali secara in vitro.

Rumus pelepasan obat adalah Q % = (C _n × V + V _n ⁿ _{t =0} C _i )/(L_NP × LC%), di mana W adalah berat NP, LC% adalah pemuatan obat nanopartikel, C _n adalah konsentrasi sampel pada Tn, V adalah produk total dari media pelepasan (25 mL), Vn adalah berat sampel (2 mL), dan C _i adalah T _i (i = 0, 0,5, 1, …., n h ,V ₀ = C ₀ = 0).

Rilis NP mPEG-ICA-ICA di media rilis yang berbeda

Dua mililiter larutan NP mPEG-ICA ICA-loaded ditempatkan ke dalam tas dialisis (4–88 kDa, nilai cutoff berat molekul) dan dimasukkan ke dalam saline buffer fosfat pH 7,4 dan pH 6,8 (media pelepas PBS, 37°C, 25 ml). Kemudian, 2 mL media pelepas dikumpulkan untuk pengambilan sampel dan diganti dengan larutan baru dengan volume yang sama pada interval yang telah ditentukan (Tn, n = 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, dan 48 jam). Absorbansi dialisat pada 270 nm pada waktu yang berbeda ditentukan dengan spektrofotometri UV-Vis. Rasio persentase pelepasan ICA dihitung, dan tiga sampel diukur untuk menghitung pelepasan obat rata-rata.

Eksperimen pengujian sel

H9c2 (tikus H9c2), garis myoblast ventrikel tikus, dibeli dari Institut Biokimia dan Biologi Sel Shanghai, Cina. Sel-sel dikultur dalam DMEM yang mengandung 10% serum janin sapi (Gibco, USA) pada 37 °C dalam CO₂ -mengandung atmosfer. Sel H9c2 biasanya diinokulasi ke dalam cawan kultur 10 cm [25]. Ketika sel tumbuh menjadi sekitar 80%, mereka disubkultur dengan 0,25% tripsin (Gibco). Kemudian, sel-sel diunggulkan dalam cawan kultur yang sesuai atau pelat 96-sumur untuk penelitian berikut.

Perlakuan sel dengan LPS atau nanopartikel ICA

Sel H9c2 dibagi menjadi lima kelompok sebagai berikut:(1) kelompok kontrol:menggunakan media kultur normal, (2) kelompok LPS:sel diberi LPS 10 mg/L selama 24 jam; (3) kelompok ICA:sel diperlakukan dengan 20 mol/L ICA (1:1000, DMSO) dan 10 mg/L LPS untuk durasi yang sama, (4) kelompok polimer mPEG-ICA:sel diperlakukan dengan 20 mol /L polimer mPEG-ICA dan konsentrasi akhir LPS yang sama untuk durasi yang sama; (5) Kelompok mPEG-ICA NPS yang dimuat ICA:sel diperlakukan dengan 20 μmol/L mPEG-ICA NP yang dimuat ICA dan 10 mg/L LPS, dengan kondisi lain yang sama dengan kelompok di atas.

MTT

Viabilitas sel nanopartikel ICA terhadap cedera kardiomiosit yang diinduksi LPS ditentukan oleh MTT. Secara singkat, sel H9c2 diperlakukan dengan LPS dan nanopartikel ICA yang berbeda selama 24 jam. Setelah itu, sel diwarnai dengan MTT pada konsentrasi akhir 0,5 mg/mL selama 4 jam pada 37 °C dan kemudian ditambahkan 150 μL dimetil sulfoksida (DMSO) untuk melarutkan kristal tiroid. Densitas optik diukur pada 570 nm di pembaca lempeng mikro (*/SpectraMax i3 Molecular Devices, Afghanistan).

Pelepasan laktat dehidrogenase (LDH)

Untuk menyelidiki efek nano-ICA pada kerusakan H9c2 yang diinduksi LPS, kami menilai pelepasan LDH dalam media kultur. Secara singkat, menurut perlakuan yang sesuai selama 24 jam, media kultur dikumpulkan, dan LDH terdeteksi sesuai dengan protokol Kit Deteksi LDH (Beyotime Biotechnology). Terakhir, nilai OD diukur pada 490 nm dengan spektrometer.

Pewarnaan Hoechst 33.258

Pewarnaan Hoechst 33.258 digunakan untuk mengamati morfologi inti dengan mikroskop fluoresensi. Setelah perawatan, sel H9c2 dicuci dua kali dengan PBS, difiksasi dalam buffer paraformaldehyde 4% (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa), dibilas dengan PBS dan diwarnai dengan Hoechst 33.258 pada 37 °C selama 15 menit [26]. Setelah pewarnaan, aspek morfologi inti segera diamati dengan mikroskop fluoresensi (Leica, Heidelberg, Jerman). Indeks apoptosis = jumlah inti apoptosis/jumlah inti × 100%.

Uji TUNEL (pelabelan ujung-ujung dUTP terminal)

Untuk mendeteksi integritas DNA sel H9c2, kami mengadopsi teknik TUNEL. Sel H9c2 dikultur dalam piring kultur 24-sumur. Setelah perawatan, mereka dicuci 3 kali dengan PBS dan difiksasi dengan poliformaldehida 4% selama 30 menit [27]. Kemudian, 1% Triton X-100 ditambahkan selama 5 menit untuk meningkatkan permeabilitas membran sel. Kemudian, sel-sel diwarnai dengan kit deteksi satu langkah TUNEL (Beyotime Biotechnology) sesuai dengan instruksi, dan apoptosis sel diamati dengan mikroskop fluoresensi. Laju apoptosis masing-masing kelompok dinyatakan sebagai persentase inti fluoresen hijau (positif TUNEL) terhadap inti total (biru) (inti diwarnai dengan DAPI) [28].

Flow cytometry untuk mendeteksi apoptosis

Untuk menyelidiki lebih lanjut efek dari nanopartikel ICA yang berbeda pada apoptosis sel yang diinduksi LPS, kami menggunakan metode pewarnaan ganda Annexin V-FITC/PI untuk menganalisis laju apoptosis. Setelah perlakuan H9c2 seperti dijelaskan di atas, sel dipanen dan disuspensikan kembali dalam 195 L buffer pengikat yang mengandung 10 L Annexin V-FITC dan 5 L PI dan kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar dalam gelap. Setelah sentrifugasi pada 1500 rpm selama 10 menit pada 4 ° C, buffer pewarnaan diaspirasi, dan sel dicuci dua kali dengan PBS dan disuspensikan kembali dalam 100 µL PBS. Terakhir, sampel diukur dengan flow cytometer.

Reaksi berantai polimerase kuantitatif transkripsi terbalik (RT–qPCR)

RT-qPCR digunakan untuk mendeteksi tingkat ekspresi mRNA dari penanda inflamasi, termasuk TNF-α, IL-1β dan IL-6. Setelah sel H9c2 dirawat selama 24 jam, RNA total diekstraksi menggunakan TRIzol seperti yang dijelaskan sebelumnya dan diukur menggunakan spektrofotometer mikro ultraviolet-terlihat NanoDrop™ One/OneC (Thermo, ND-ONEC-W, USA). cDNA disintesis menggunakan kit ExScript RT, dan amplifikasi dilakukan pada mesin PCR kuantitatif fluoresen (BIO-RAD CFX96 Touch*) dengan reagen SYBR Green dalam kondisi berikut:95 °C selama 5 menit, 95 °C selama 30 detik, 58 °C selama 30 d, dan total 28 siklus. Primer yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:

Actin::

Maju 5′ GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′;

Terbalik 5′-TTGATGTCACCGATTT-3′;

TNF-α::

Teruskan 5′TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3′;

Terbalik 5′-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3′;

IL-1β::

Maju 5′GGATGATGACGACCTGCTA 3′;

Terbalik 5′-CACTTGTTGGCTTATGTTCTG3′

IL-6::

Teruskan 5′TGCCTTCTTGGGACTGAT-3′;

Membalikkan 5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3′.

Jumlah setiap gen target dinormalisasi dengan gen aktin. Eksperimen diulang dalam rangkap tiga.

Hasil dan diskusi

FTIR dan H ¹ Spektrum NMR

Dari spektrum mPEG-ICA, puncak serapan vibrasi regangan dua ikatan ester (–C=O–) berada pada 1700 ⁻¹ dan 1740 ⁻¹ cm. Dibandingkan dengan spektrum mPEG-COOH, terdapat puncak getaran regangan C=C berlebih pada 1650 cm ⁻¹ , menunjukkan bahwa sintesis esterifikasi ICA dan mPEG-COOH berhasil membentuk mPEG-ICA (Gbr. 1).

Spektrum FTIR mPEG-ICA (A ), ICA (B ), dan mPEG-COOH (C ). H ¹ Spektrum hidrogen NMR untuk mPEG-COOH dan mPEG-ICA

Dari spektrum hidrogen mPEG-ICA, 12,6 ppm menunjukkan gugus hidroksil fenolik ICA karena adanya gugus elektron serapan kuat –C=O yang bergerak ke medan rendah. Puncak hidrogen cincin benzena pada sekitar 7,5 ppm dan luas puncak 3,5 ppm sangat besar, dinilai sebagai –CH₂ –O– puncak hidrogen dalam polimer mPEG. Sejumlah besar analisis menunjukkan bahwa sinyal hidrogen alkil adalah 0–2 ppm. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa 1,7 ppm adalah puncak hidrogen ikatan rangkap di ICA. Puncak karakteristik mPEG-COOH dan ICA muncul dalam polimer mPEG-ICA, menunjukkan keberhasilan sintesis mPEG-COOH dengan ICA (Gbr. 1).

Ukuran partikel, potensi zeta, dan TEM

Ukuran partikel rata-rata nanopartikel mPEG-ICA adalah sekitar (145,0 ± 15,2) nm, dan nilai indeks dispersi (PDI) polimer adalah (0,277 ± 0,00). Ukuran partikel nanopartikel mPEG-ICA bermuatan ICA sedikit meningkat, menjadi kira-kira (220.0 ± 13.7) nm, dan PDI (0,119 ± 0.00). Semakin kecil PDI, semakin seragam distribusi NP mPEG-ICA yang dimuat ICA. Potensi zeta dari nanopartikel mPEG-ICA adalah (0,439 ± 0,258) mV, dan potensi zeta dari NP mPEG-ICA bermuatan ICA adalah (2,30 ± 1,33) mV. Mikroskop elektron transmisi mengungkapkan bahwa nanopartikel mPEG-ICA bermuatan ICA berbentuk bulat, morfologinya teratur, dan ukurannya relatif seragam (Gbr. 2).

Ukuran partikel, potensi zeta, dan TEM NP mPEG-ICA yang dimuat ICA

Efisiensi pemuatan obat dan enkapsulasi

Kandungan ICA dalam NP mPEG-ICA yang dimuat ICA dapat dihitung dengan spektrofotometri ultraviolet. Kurva standar konsentrasi ICA ditetapkan, dan kandungan ICA dalam polimer diperoleh dengan menghitung konsentrasi obat berdasarkan kurva standar. Menurut perhitungan, berdasarkan absorbansi polimer mPEG-ICA (1,2397 ± 0,1024), kandungan ICA adalah (0,4132 ± 0,0359) mg/mL, dengan absorbansi nanopartikel mPEG-ICA bermuatan ICA (1,6289 ± 0,0923), dan kandungan ICA adalah (0,5496 ± 0,3234) mg/mL. Dihitung menurut rumus dalam metode, pemuatan obat polimer mPEG-ICA adalah (16,5 ± 0,014) %, dan laju enkapsulasi adalah (41,3 ± 0,036)%; konten pemuatan obat dari NP mPEG-ICA yang dimuat ICA adalah (21,9 ± 0,013)%, dan tingkat enkapsulasi adalah (54,9 ± 0,032)% (Tabel 1).

Penentuan stabilitas

Ukuran partikel nanopartikel mPEG-ICA ICA-loaded yang dibuat dengan metode dialisis adalah (220.0 ± 13.7) nm, dan PDI adalah (0,119 ± 0.00). Setelah pengeringan beku dalam manitol 5% selama 48 jam, nanopartikel dapat dilarutkan kembali dalam air untuk membentuk nanopartikel yang stabil. Ukuran partikel adalah 255 nm, dan PDI (0,326 ± 0,00), yang sedikit lebih besar daripada nanopartikel dialisis (Gbr. 3).

Stabilitas NP mPEG-ICA yang dimuat ICA

pelepasan obat mPEG-ICA-ICA in vitro

Pada Gambar. 4, pelepasan ICA sangat bergantung pada pH media pelepasan. Dalam media pelepasan phosphate-buffered saline (PBS) pada pH 7,4, icariin bebas dilepaskan (77,21 ± 0,15)% dalam waktu 12 jam dan dilepaskan sepenuhnya. Karena NP mPEG-ICA yang dimuat dengan obat icariin dapat meningkatkan pelepasan nanopartikel, pelepasan obat dari nanopartikel mPE-ICA yang dilepaskan ke (44.08 ± 0.12)% dalam waktu 72 jam, dan nanopartikel mPEG-ICA yang dimuat ICA mencapai (52.80 ± 1.70) %. ICA-loaded mPEG-ICA nanopartikel ditempatkan dalam larutan buffer pH 6,8, dan kami menemukan bahwa pelepasan obat yang dimediasi nanopartikel mencapai (75,66 ± 0,17)% dalam 48 jam. Ini mungkin karena beberapa NP mPEG-ICA yang dimuat ICA memiliki NP yang didepolimerisasi atau molekul mPEG-ICA pecah di NP. Pengamatan ini menunjukkan bahwa pelepasan ICA lebih baik dalam kondisi asam pH 6,8. Ini juga menunjukkan bahwa karakteristik pelepasan nanopartikel mPEG-ICA yang mengandung ICA bermanfaat untuk pengobatan lokal cedera inflamasi miokard, karena lesi lokal mengarah ke fokus dengan lingkungan asam lemah.

A Pelepasan ICA dari NP mPEG-ICA yang dimuat ICA di PBS pada pH 7,4. B Pelepasan ICA dari NP mPEG-ICA yang dimuat ICA di PBS pada pH 7,4 dan pH 6,8 pada 37 °C in vitro

Viabilitas sel H9C2 dan pelepasan laktat dehidrogenase

Pertama, untuk mengamati sitotoksisitas nanopartikel mPEG-ICA yang dimuat ICA, kami menambahkan obat gratis (20 µM ICA), NP mPEG-ICA dan NP mPEG-ICA yang dimuat ICA ke sel H9c2, dan hasil MTT menunjukkan tidak ada sitotoksisitas yang nyata dari nanopartikel (Gbr. 5). Kemudian, kami mengeksplorasi lebih lanjut apakah mereka dapat melindungi sel H9c2 terhadap cedera yang diinduksi LPS (Gbr. 6). Setelah pengobatan LPS selama 24 jam, viabilitas sel berkurang menjadi (50,0 ± 3,22)% (kelompok kontrol 100%), di mana pengobatan dengan ICA, NP mPEG-ICA, dan NP mPEG-ICA yang dimuat ICA secara signifikan meningkatkan viabilitas sel H9c2 sebesar (55.94 ± 1.06)%, (60.97 ± 2.615)%, dan (65.36 ± 1.214)%, masing-masing (P < 0.05).

Evaluation of the cytotoxicity of ICA nanoparticles on H9c2 cells. Data are expressed as the mean ± SEM of three separate experiments

Evaluation of the effects of ICA nanoparticles on LPS-induced H9c2 cell injury. Cell viability in different groups was measured by MTT assay. Data are the mean ± SME. (**P  < 0.01 vs. con; # P  < 0.05 and, ## P < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In addition, LDH levels are a marker of cell damage; therefore, we measured the release level of LDH in the culture medium (Fig. 7). LDH levels were increased in the LPS group compared with the normal culture group. Treatment with ICA, mPEG-ICA NPs or ICA-loaded mPEG-ICA NPs reduced the LDH level increase induced by LPS, especially in the ICA-loaded mPEG-ICA NP group. These results showed that ICA nanoparticles could protect cells from LPS.

The effect of ICA nanoparticles on the LDH level induced by LPS in H9c2 cells. Data are the mean ± SD. ***P  < 0.01 versus con; ##P  < 0.01 versus LPS treatment group; *&P  < 0.05 versus LPS + mPEG-ICA group

Cell apoptosis induced by LPS

First, nuclear morphology was detected by Hoechst 33,258 staining (Fig. 8). Nuclear chromatin exhibited condensation, breakage and fragmentation after LPS damage in the LPS group. However, for ICA-loaded mPEG-ICA NP group, the number of apoptotic cells obviously decreased. Moreover, we used TUNEL staining to observe cellular DNA breaks or DNA damage (Fig. 9). The number of apoptotic nuclei in the LPS-induced group was (47.57 ± 3.41)% (P  ˂ 0.0001) compared to (6.47 ± 1.87)% in the normal culture group. After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA, the apoptosis rates decreased to (17.92 ± 3.12)% and (26.54 ± 3.68)% and (35.49 ± 4.25)%, respectively, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly reduced the apoptosis rate compared with mPEG-ICA NPs. In addition, flow cytometric analysis in LPS-induced H9c2 cells showed that (35.93 ± 2.23)% of the cells were in the early and late apoptotic stages (Fig. 10). After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs or mPEG-ICA NPs, the total apoptotic rates were reduced to (16.70 ± 2.77)% and (19.15 ± 3.67)%, respectively. These results were in line with the Hoechst 33,258 staining and TUNEL staining findings and indicated that ICA-loaded mPEG-ICA NPs largely prevented the cells from undergoing apoptosis.

Detection of apoptosis by Hoechst 33,258 staining. A Nuclear morphology in cells stained with Hoechst 33,258. B Quantitative analysis of the apoptosis rate by Hoechst 33,258 staining. Data are the mean ± SEM (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Detection of apoptosis by TUNEL. A Cells with TUNEL and DAPI staining; B apoptosis rate. Data are the mean ± SEM (****P  < 0.0001 vs. con; ###P  < 0.005 vs. LPS; &&P  < 0.01 vs. LPS + mPEG-ICA)

A . Apoptotic rate detected by flow cytometry. H9c2 cells were stained by Annexin V/PI double staining. Q1-LL cells were Annexin V/PI double-negative stained, indicating viable cells; Q1-LR cells were Annexin V-positive and PI-negative stained, indicating early apoptosis; Q1-UR cells were Annexin V/PI double-positive stained, indicating late apoptosis. B . Apoptotic rate (%). Data are the mean ± SME. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 and ##P < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Inflammatory cytokine mRNA in LPS-induced H9c2 cells

Next, we evaluated the effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. After LPS treatment for 24 h in H9c2 cells, the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased. These increases were attenuated by ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA treatment, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs treatment markedly lowed TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression (Fig. 11).

Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA IL-1β in the LPS induced H9c2 cells. (**P  < 0.01 compared with con; #P < 0.05 compared with LPS; &P  < 0.05 compared with LPS + mPEG-ICA.) (2) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA TNF-α. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS group; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA) (3) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on mRNA IL-6. Data are the mean ± SEM (* P  < 0.05 vs. con; #P < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In this study, we analyzed the suitability of polymer nanoparticles to load ICA for the treatment of LPS-induced H9c2 cell damage. The synthesis method is highly feasible and has many advantages. First, mPEG is nontoxic and has good biocompatibility [29]. In this study, a chemical bonding method was used to assemble mPEG and ICA into an mPEG-ICA polymer, and then dialysis was used to physically wrap the ICA and form stable nanoparticles [30]. Nanoparticles can significantly improve the water solubility of ICA and can realize the long circulation of nanoparticles in the body [31, 32]. Compared with mPEG-ICA nanoparticles, ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles have many significant advantages. First, their PDI value is smaller, which proves that the particle size distribution is more uniform [33]. Second, the drug loading and encapsulation efficiencies of ICA-loaded mPEG-ICA NPs are both higher than those of mPEG-ICA NPs, making it easier to reach the effective drug concentration of ICA [34]. In a pH 6.8 solution, nanoparticles release more drugs, and an acidic environment may destroy the self-assembly force of nanoparticles and accelerate the cleavage of ester bonds, resulting in faster release of the drug into the medium and effective enrichment of the drug in the inflammation site [35, 36]. Huang et al. used LPS-induced osteoblasts to validate the model to explore the anti-inflammatory mechanism of Icariin. They found that Icariin can significantly upregulate the expression of BMP-2 and Runx2 in LPS-induced osteoblasts, thereby achieving effective therapeutic effects [37]. A study has shown that ICA can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by LPS and reduce collagen formation [38]. In addition, ICA can also inhibit the caspase-1 signaling pathway mediated by the NLRP3 inflammasome and reduce LPS-induced sagging [39]. However, LPS-induced cells cannot effectively absorb ICA. Making ICA nanoparticles can solve this problem well. It may be that ICA is loaded by nanocarriers, greatly increasing its water solubility and allowing it to enter cells through free diffusion. At the same time, studies have shown that nanoparticles can promote cell endocytosis and tissue cell efflux and significantly improve the bioavailability of ICA [40, 41].

The results of the MTT assay and lactate dehydrogenase release experiments showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could effectively alleviate the cell damage induced by LPS, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release ICA from the particles. Furthermore, compared with the mPEG-ICA NPs, ICA-loaded mPEG-ICA NPs could load more ICA and release more easily. We also found that these nanoparticles markedly decreased apoptosis induced by LPS to alleviate the inflammatory response in H9c2 cells. Moreover, the antiapoptotic effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs was better than that of mPEG-ICA NPs and ICA. These results indicated that ICA nanoparticles could protect cardiomyocytes from inflammatory injury.

Inflammatory cytokines are the key factors involved in the development and progression of cardiovascular disease and are markers of the inflammatory response [42, 43]. Some researchers have found that TNF-α, IL-1β and IL-6 were closely related to cardiac function. The addition of these inflammatory cytokines to isolated cardiomyocytes resulted in abnormalities in cardiac function and promoted cardiomyocyte loss [44]. Our RT–qPCR results showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could significantly inhibit the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Therefore, these results implied that the protective effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs may occur through controlling inflammatory cytokines.

Conclusion

ICA-loaded mPEG-ICA NPs are a new type of nanomedicine successfully synthesized through nanotechnology (a combination of chemical synthesis and physical embedding). This process not only converts the hydrophobic drug ICA into water-soluble nanomedicine but also successfully improves the load capacity of ICA. In the weakly acidic solution, the ICA release from ICA-loaded mPEG-ICA NPs was greater than that of the neutral solution, indicating that nanoparticles are meaningful for the treatment of inflammatory cardiovascular diseases. Treatment with ICA nanoparticles effectively protected against LPS-induced H9c2 damage, promoted cell viability and inhibited cell apoptosis. Further experiments demonstrated that the new ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release inflammatory cytokine production.

Ketersediaan data dan materi

Not applicable.

Singkatan

mPEG:

Polyethylene glycol monomethyl ether

ICA:

Icariin

FT-IR:

Fourier transform infrared spectroscopy

NMR:

Nuclear magnetic resonance spectroscopy

DLS:

Dynamic light scattering

TEM:

Transmission electron microscope

TNF:

Tumor necrosis factor

EPRs:

Permeability and retention functions

SA:

Succinic anhydride

DMSO:

Dehydrated dimethyl sulfoxide

Nanomaterial cerdas dan nanokomposit dengan aktivitas agrokimia tingkat lanjut Nanopartikel Fosfor Hitam Mempromosikan Diferensiasi Osteogenik EMSC Melalui Ekspresi TG2 yang Diregulasi