Dalam studi ini, kami mengembangkan agen terapeutik ultrasound (US) multifungsi yang mengkapsulasi perfluoropentane (PFP) ke dalam ferritin (FRT) dan mengonjugasi molekul targeting tumor asam folat (FA) (FA-FRT-PFP). FA-FRT-PFP yang disiapkan memiliki diameter partikel rata-rata 42,8 ± 2,5 nm, potensial zeta − 41,1 ± 1,7 mV dan menunjukkan stabilitas yang baik dalam larutan fisiologis dan suhu. FRT adalah protein kerangka sensitif pH yang, pada pH 5,0, terurai untuk membentuk pori yang dapat memuat PFP. Penyesuaian ke pH netral menutup pori dan mengkapsulasi PFP di dalam FRT untuk membentuk nanopartikel. Pada pH 5,0, 3 menit ultrasound terfokus intensitas rendah (LIFU, 2 W/cm2) secara signifikan meningkatkan sinyal US FA-FRT-PFP melalui efek vaporisasi titik akustik (ADV). Dalam kondisi yang sama, 4 menit paparan LIFU menyebabkan gelembung yang dihasilkan oleh FA-FRT-PFP pecah. FA-FRT-PFP dapat secara efisien ditargetkan ke sel kanker ovari dan secara signifikan meningkatkan kontras US FA-FRT-PFP setelah 3 menit paparan LIFU. Setelah 4 menit paparan LIFU, kelangsungan sel secara signifikan menurun karena nekrosis, kemungkinan karena pelepasan PFP yang dimediasi FA-FRT-PFP dalam lingkungan asam lisosom setelah masuk ke sel tumor. PFP kemudian berubah menjadi gelembung yang pecah di bawah paparan LIFU, membentuk gelombang kejut fisik yang mengakibatkan kerusakan struktur sel dan nekrosis, mencapai perawatan tumor. Secara keseluruhan, ini menunjukkan bahwa FA-FRT-PFP adalah agen US teranostik baru dan menjanjikan untuk aplikasi klinis di masa depan.
Pendahuluan
Kanker ovari adalah salah satu kanker wanita paling letal di seluruh dunia [1,2,3]. Perawatan kanker ovari tetap berguna secara klinis pada terapi radiasi, kemoterapi, bedah, dan terapi pendukung lainnya [4,5,6]. Namun, kekurangan dalam strategi ini terus menghambat peningkatan tingkat kelangsungan hidup pasien. Untuk mengatasi kekurangan ini, diperlukan metode diagnosis yang lebih efektif dan aman. Dalam beberapa tahun terakhir, integrasi citra dan terapi ke dalam satu platform perawatan telah muncul sebagai topik yang hangat [7,8,9].
Teknologi ultrasound (US), karena sifatnya non-invasif, non-radiasi, biaya rendah, dan spesifik, banyak digunakan dalam diagnosis klinis dan perawatan tumor [10,11,12]. Dalam beberapa dekade terakhir, platform respons akustik (ARP) dengan kemampuan citra dan terapi US telah dikembangkan untuk diagnosis dan perawatan tumor yang efektif [13,14,15,16]. ARP terutama mencakup mikrogelembung atau nanogelembung (MB atau NB) dan platform berbasis nanopartikel (NP) [16, 17]. Di antara ARP ini, MB atau NB menunjukkan kemampuan respons akustik yang baik, tetapi karena ukurannya besar, penetrasi jaringan in vivo lemah dan stabilitas sampel buruk. NP menunjukkan permeabilitas jaringan yang lebih kuat dan siklus farmakokinetik yang lebih panjang karena ukurannya kecil. Namun, kemampuan respons akustik NP terbatas. Oleh karena itu, mendesain ARP dengan ukuran kecil, stabilitas tinggi, dan respons yang kuat adalah mendesak.
Fluorokarbon cair mengalami transisi fase cair ke gas sebagai respons terhadap stimulasi eksternal [18, 19]. Natalya dan rekan-rekannya mengembangkan nano-emulsi yang mengandung fluorokarbon cair yang menghasilkan efek vaporisasi titik akustik (ADV) di bawah ultrasound terfokus intensitas rendah (LIFU) [20,21,22]. Emulsi membentuk gelembung dan secara bersamaan memicu pelepasan obat, sehingga memungkinkan perawatan tumor. Namun, lapisan materi pengikat yang membungkus fluorokarbon cair menyebabkan peningkatan intensitas dan waktu ultrasound yang diperlukan untuk perawatan tumor, yang mengakibatkan kerusakan pada jaringan sehat di sekitarnya. Optimisasi lebih lanjut dari pembawa fluorokarbon cair sangat dibutuhkan.
Dalam studi ini, kami mengembangkan nanopartikel ferritin (FRT) yang dimuat dengan fluorokarbon cair perfluoropentane (PFP) yang kemudian digabungkan dengan molekul target tumor asam folat (FA) untuk membentuk FA-FRT-PFP. Ferritin adalah protein nanokerang endogen yang sangat biocompatibel yang menunjukkan sensitivitas pH [23,24,25]. Protein dapat terurai dalam lingkungan asam dan dapat dirakit kembali dalam lingkungan alkaline. Ini memungkinkan pemuatan dan pelepasan terkontrol ferritin sebagai respons terhadap perubahan pH [26,27,28]. PFP adalah bahan transformasi fase yang sering digunakan yang menunjukkan titik didih 29 oC. Titik didih rendah memudahkan transformasi fase oleh LIFU yang lebih aman daripada HIFU. PFP dimuat ke dalam ferritin dan FA-FRT-PFP yang dihasilkan memiliki diameter ~ 47,3 ± 2,8 nm dengan stabilitas tinggi dalam larutan fisiologis dan suhu. Menurut hasilnya, FA-FRT-PFP memiliki keuntungan berikut: (1) PFP dapat dengan mudah dimuat ke dalam FRT dengan mengubah pH dari asam ke netral; (2) di bawah ultrasound terfokus intensitas rendah (LIFU, 2 W/cm2, 3 menit) dan pH = 5,0, FA-FRT-PFP melepaskan PFP dan mengalami perubahan fase untuk meningkatkan sinyal citra US melalui vaporisasi titik akustik (ADV); 3) Di bawah paparan LIFU jangka panjang (4 menit) dan pH = 5,0, PFP yang dilepaskan dari FA-FRT-PFP meledak dan menghasilkan gelombang kejut fisik yang dapat secara efektif menghancurkan sel tumor melalui nekrosis. Sejauh yang kami ketahui, ini adalah contoh pertama pemuatan PFP ke dalam FRT sebagai teranostik tumor US. Hasil ini menunjukkan bahwa FA-FRT-PFP + LIFU adalah strategi baru untuk diagnosis dan perawatan tumor terpadu.
Bahan dan Metode
Bahan
Gel agarose, ferritin (FRT), asam folat (FA), dan perfluoropentane (C3F8, PFP) dibeli dari Sigma (St. Louis, MO, USA). NH2-PEG2000-FA dan NH2-PEG2000-COOH disuplai oleh Xi’an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (China). 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) dan N-hidroxisuksinimid (NHS) dibeli dari Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Kit perhitungan sel-8 (CCK-8) diperoleh dari Dojindo Laboratories (Kumamoto, Jepang). Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), larutan penyangkap fosfat (PBS), penicillin–streptomycin, trypsin-EDTA, dan serum sapi fetal (FBS) dibeli dari Gibco (Grand Island, NY, USA).
Budidaya Sel
Baris sel kanker ovari manusia SK-OV-3 disediakan oleh Institut Sel Biologi, Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok. Sel epitel ovari normal HUM-CELL-0088 diperoleh dari PriCells, Wuhan, Tiongkok. Sel dibudidayakan dalam media DMEM yang mengandung 10% serum sapi fetal dan 1% larutan penicillin-streptomycin. Sel dipertahankan dalam inkubator dengan atmosfer lembap yang mengandung 5% CO2 pada 37° C.
Persiapan FA-FRT-PFP
Pertama, molekul target FA dikonjugasi dengan FRT melalui reaksi esterifikasi [29]. Singkatnya, NH2-PEG2000-FA (10 mg) dan larutan FRT dicampur dengan kehadiran EDC (5 mg/mL) dan NHS (20 mg/mL). Setelah reaksi selama 3 jam pada suhu kamar dengan pengadukan ringan, campuran difilter melalui dialisis terhadap air tisu (MW cut-off = 1,2 kDa) selama 24 jam. Larutan yang dihasilkan adalah nanopartikel FA-FRT. Kedua, pemuatan PFP ke dalam ruang FRT disiapkan dengan proses denaturasi dan renaturasi protein [30]. Singkatnya, FA-FRT diencerkan menjadi 5 mL PBS menjadi 2 mg/mL dan disesuaikan pada pH = 5,0 dengan pengadukan ringan selama 30 menit pada suhu kamar untuk memastikan pemisahan lengkap FRT. Setelah itu, 500 μl PFP ditambahkan ke dalam larutan dalam mandi es dan dilemahkan ultrasonik dengan 5 s nyala dan 5 s jeda untuk total 5 menit pada 80 W dalam mandi es. Setelah ultrasonisasi, nilai pH campuran disesuaikan menjadi netral (pH = 7,4). Karena PFP dalam bentuk minyak dan tidak larut dalam air, PFP berlebih dapat dengan mudah dihilangkan melalui pemisahan cairan untuk menjadi FA-FRT-PFP. FRT-PFP disiapkan dengan metode yang sama kecuali dengan mengubah NH2-PEG2000-FA menjadi NH2-PEG2000-COOH.
Karakterisasi FA-FRT-PFP
Ukuran dan potensial zeta nanopartikel diukur dengan Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK). Morfologi FA-FRT-PFP diamati dengan mikroskop transmisi elektron (TEM, Hitachi, Jepang) dan mikroskop fluoresens terbalik (Olympus, Jepang). Struktur kimia nanopartikel dideteksi dengan spektroskopi inframerah transformasi Fourier (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Jerman). Pengambilan seluler FA-FRT-PFP dideteksi dengan mikroskop skaning laser konfokal (LEXT OLS4100, Olympus, Jepang). Sel yang diwarnai ganda FITC/PI dianalisis dengan citometrika aliran (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).
Performa Pembangkit Gas Responsif pH dan Ultrasound
FA-FRT-PFP dalam kondisi pH = 5,0 dan 7,5 diiradiasi dengan intensitas akustik yang berbeda dari LIFU (1,5 dan 2,0 W/cm2) dan untuk total waktu yang berbeda (1, 2, 3, dan 4 menit) dalam model gel agarose, kemudian citra US diamati dengan peralatan US (Esaote Mylab 90, Italia) dengan frekuensi 5–12 MHz dan indeks mekanis (MI) 0,06. Setelah itu, penampilan FA-FRT-PFP diamati dengan mikroskop cahaya seiring waktu. Intensitas US dari wilayah minat dalam citra US dianalisis dengan perangkat lunak ImageJ.
Pengambilan Seluler
Singkatnya, 1 mg FITC dilarutkan dalam 1 mL DMSO dan kemudian dicampur dengan FRT-PFP dan FA-FRT-PFP selama 30 menit dengan pengadukan lembut. Kemudian, larutan campuran dialisis selama semalam dalam air deionisasi untuk menghilangkan FITC dan DMSO bebas guna memperoleh nanopartikel yang dilabeli FITC. Selanjutnya, sel SK-OV-3 dan sel ovari normal (HUM-CELL-0088) dibudidayakan dalam media selama 24 jam, dan kemudian FITC bebas, FRT-PFP yang dilabeli FITC dan FA-FRT-PFP diinkubasi bersama sel SK-OV-3 selama 5 jam. Selain itu, FA-FRT-PFP yang dilabeli FITC diinkubasi dengan sel SK-OV-3 yang telah diobati FA selama 5 jam. Sel dicuci 3 kali dengan PBS dan diatasi dengan paraformaldehid 4% dan diwarnai dengan larutan DAPI 0,2 mg/mL selama 10 menit. Sel difoto dengan mikroskop skaning laser konfokal untuk menangkap gambar fluoresens. Sinyal fluoresens dikuantitasi dengan citometrika aliran.
Citra Ultrasound In Vitro
Sel SK-OV-3 dibudidayakan selama 24 jam dalam media bebas FA, dan kemudian PBS, FRT-PFP dan FA-FRT-PFP, dan FA-FRT-PFP + FA diinkubasi dengan sel SK-OV-3 selama 6 jam. Sel dikumpulkan dan dicampur dengan gel agarose, dan kemudian, sel diiradiasi dengan atau tanpa LIFU selama 3 menit (1 s nyala dan 1 s jeda untuk total 3 menit; 1 MHz; 2,0 W/cm2). Akhirnya, citra US ditangkap.
Efektivitas Antikanker In Vitro
Sel SK-OV-3 diisi pada piring 96-lubang dengan kepadatan 1 × 104 sel/lubang, dan diizinkan untuk menempel selama 24 jam. Untuk sitorotoksisitas FA-FRT, berbagai konsentrasi (0, 20, 40, 100, 200, dan 500 μg/mL) FA-FRT dibudidayakan dengan sel SK-OV-3. Setelah perawatan 24 jam, sel diperlakukan dengan media DMEM yang mengandung 10% CCK-8 selama 20 menit dalam inkubator. Absorbansi sel pada panjang gelombang 450 nm dideteksi dengan Pembaca Piring Multimode (Thermo Scientific) untuk mengkarakterisasi kelangsungan sel. Selain itu, sel SK-OV-3 dan sel ovari normal (HUM-CELL-0088) diperlakukan PBS, FRT-PFP, dan FA-FRT-PFP dan FA-FRT-PFP + FA selama 3 jam, dan kemudian diiradiasi oleh LIFU (1 s dengan jeda 1 s untuk total 4 menit; 1 MHz; 2,0 W/cm2). Sel yang diperlakukan diinkubasi lagi selama 21 jam. Sebagai kontrol, tanpa LIFU, sel diperlakukan PBS, FRT-PFP, dan FA-FRT-PFP dan FA-FRT-PFP + FA selama 24 jam. Setelah itu, kelangsungan sel yang diperlakukan dideteksi dengan uji CCK-8.
Analisis Kematian Sel
Untuk menilai jenis kematian sel, sel SK-OV-3 diisi pada piring 6-lubang dengan kepadatan 5 × 104 sel/mL. Setelah 24 jam, sel diperlakukan dengan PBS, FRT-PFP, dan FA-FRT-PFP dan FA-FRT-PFP + FA selama 3 jam, kemudian diiradiasi dengan LIFU (1 s, jeda selama 1 s untuk total 4 menit; 1 MHz; 2,0 W/cm2). Sel yang diperlakukan diinkubasi selama tambahan 23 jam. Sebagai kontrol, sel diperlakukan dengan PBS, FRT-PFP, dan FA-FRT-PFP dan FA-FRT-PFP + FA selama 24 jam tanpa LIFU. Sel dicerna dengan trypsin, difusensikan pada 1500×g selama 3 menit, dicuci 3 kali dengan PBS dingin, dan kemudian distribusikan kembali dalam 200 mL larutan ikatan. Kemudian, 5 μL annexin V-FITC dan 10 μL PI ditambahkan dan diinkubasi dengan sel selama 15 min dalam kegelapan. Sel yang diwarnai dianalisis menggunakan citometrika aliran.
Western Blotting
Western blotting dilakukan sesuai literatur sebelumnya. Sel diperlakukan dengan 40 μg/mL PBS (kontrol), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, dan FA-FRT-PFP bersama atau tanpa iradiasi LIFU (2,0 W/cm2, 4 menit) dan lebih lanjut diinkubasi selama 21 jam. Dan kemudian sel yang diperlakukan diurai dalam buffer RIPA (Sigma). Limapuluh mikrogram setiap protein dengan buffer sampel Laemmli direbus selama 5 menit dan dikondisikan dengan SDS–PAGE. Protein ditransfer ke membran PVDF (Bio-Rad Laboratories) menggunakan Trans-Blot semikering (Bio-Rad Laboratories). Blot pertama diinkubasi dalam buffer pemblokir TBS yang mengandung susu 2% atau BSA 2% (untuk antibodi spesifik fosfoprotein) selama 1 jam pada suhu kamar dan kemudian dengan antibodi primer yang sesuai yang diencerkan dalam TBST (mengandung Tween20 0,1% dan BSA 2%) selama malam pada 4 °C. Selanjutnya, blot dicuci dan diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai (Santa Cruz) dalam TBST dan dideteksi menggunakan Substrat Kemiluminesens SuperSignal West Pico (Thermo).
Analisis Statistik
Semua data disajikan sebagai rata-rata ± simpangan baku. Analisis statistik dilakukan menggunakan uji t Student. *P < 0,05, **P < 0,01 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil dan Diskusi
Persiapan dan Karakterisasi FA-FRT-PFP
FA-FRT-PFP disintesis dan digunakan untuk terapi tumor (Gambar 1). Titik transformasi fase dimuat ke dalam FRT melalui terurai dan rakit kembali FRT yang diinduksi pH. PFP dengan efek vaporisasi titik akustik (ADV) yang diinduksi LIFU dikirim ke sel dan bertindak sebagai agen citra ultrasound. Gambar 2a–c menunjukkan gambar TEM dari FRT, FRT-PFP, dan FA-FRT-PFP, yang berbentuk bola. Ukuran partikel rata-rata FRT, FRT-PFP, dan FA-FRT-PFP adalah 6,9 ± 0,3 nm, 43,8 ± 1,6 nm, dan 47,3 ± 2,8 nm, masing-masing, (Gambar 2d) yang menunjukkan bahwa pemuatan PFP dan konjugasi FA meningkatkan ukuran FRT. Potensial zeta rata-rata FRT dan FA-FRT-PFP adalah − 43,2 ± 3,1 mV, − 46,9 ± 2,2 mV, dan − 41,5 ± 2,7 mV, masing-masing (Gambar 2e). Selain itu, konjugasi FA dengan FRT dikarakterisasi oleh FT-IR seperti ditunjukkan pada Berkas tambahan 1: Gambar S1. Spektra FT-IR menampilkan pita absorpsi pada ~ 1110 cm−1 mungkin terkait dengan getaran C–O–C eter dari PEG; puncak absorpsi pada ~ 1601 cm−1 dan ~ 1710 cm−1 termasuk getaran C=O dari PEG dan FRT serta dari –COOH dan –CONH2 FA dan FRT; pita pada ~ 2820 cm−1, ~ 2920 cm−1, dan ~ 2950 cm−1 terkait dengan getaran stretch C–H asimetris dan simetris –CH2 dari FA dan PEG; puncak absorpsi pada ~ 1440 cm−1 terkait dengan cincin fenil FA. Hasil ini mengonfirmasi konjugasi yang berhasil FA dengan FRT. Selama periode penyimpanan 28 hari, ukuran dan PDI FA-FRT-PFP dalam air, PBS, salin, dan FBS tidak berubah secara signifikan (Gambar 3a, b), yang menunjukkan bahwa FA-FRT-PFP menunjukkan stabilitas yang baik. Gambar 3c menunjukkan perubahan ukuran FA-FRT-PFP pada berbagai suhu yang bervariasi dari 25 oC hingga 45 oC. Ukuran FA-FRT-PFP hampir tidak berubah ketika suhu diturunkan menjadi 25–40 °C, yang menunjukkan bahwa FA-FRT-PFP menunjukkan stabilitas tinggi di bawah 40 oC. Ketika suhu mencapai 45 °C, ukuran FA-FRT-PFP bervariasi dari 42,1 nm hingga 6 nm, kemungkinan karena PFP dalam FA-FRT-PFP mengalami gasifikasi yang parah, yang mengakibatkan pecahnya nanopartikel. Suhu gasifikasi FA-FRT-PFP meningkat dari 29 oC (suhu gasifikasi PFP di tekanan normal) menjadi 45 oC, kemungkinan karena penutupan cangkang FRT [21, 31,32,33].
Representasi skematis sintesis FA-FRT-PFP dan aplikasinya dalam teranostik tumor
a–c Gambar TEM FRT, FRT-PFP, dan FA-FRT-PFP. d, e Distribusi ukuran dan potensial zeta FRT, FRT-PFP, dan FA-FRT-PFP
a, b Perubahan ukuran dan PDI FA-FRT-PFP dalam air, PBS, salin, dan FBS selama 28 hari. c Perubahan ukuran FA-FRT-PFP pada berbagai suhu dari 25 oC hingga 45 oC
Peningkatan US Responsif pH dan LIFU
Eksperimen fantom US FA-FRT-PFP dilakukan pada berbagai nilai pH dan intensitas daya LIFU. Seperti ditunjukkan pada Gambar 4a, dalam kehadiran paparan LIFU (pre), sinyal US lemah dalam semua grup. Pada pH7,5 setelah 3 menit paparan LIFU, FA-FRT-PFP menunjukkan sinyal US yang rendah baik pada 1,5 dan 2,0 W/cm2, sementara pada pH = 5,0 dalam waktu paparan LIFU yang sama, FA-FRT-PFP memiliki intensitas sinyal US yang lebih kuat. Ini menunjukkan bahwa FA-FRT-PFP menunjukkan efek ADV yang bergantung pada waktu dan intensitas akustik. Ini karena pada pH = 5,0, FA-FRT-PFP terurai dan melepaskan PFP sehingga lebih mudah mengalami transformasi fase. Menariknya, ketika waktu paparan LIFU diperpanjang menjadi 4 menit, FA-FRT-PFP pada pH = 5,0 dan 2,0 W/cm2 LIFU memiliki intensitas sinyal US yang lebih rendah dibandingkan dengan pada waktu iradiasi yang lebih rendah, kemungkinan karena LIFU dalam kondisi ini terlalu kuat sehingga menyebabkan pecahnya gelembung. Hasil ini menunjukkan bahwa FA-FRT-PFP dapat melepaskan PFP, menghasilkan transformasi fase dan ledakan pada 2,0 W/cm2 paparan LIFU pada pH = 5,0. Hasil intensitas US ditunjukkan pada Gambar 4b, c. Gambar 4d–g menunjukkan morfologi larutan FA-FRT-PFP setelah 3 menit paparan LIFU (2,0 W/cm2) dan pada pH = 7,5 dan 5,0. FA-FRT-PFP pada pH = 5,0 dan 2,0 W/cm2 LIFU menghasilkan gelembung besar, yang memvalidasi temuan kami lebih lanjut.
a Citra US FA-FRT-PFP yang dicampur dengan gel agarose pada berbagai nilai pH dan diiradiasi dengan intensitas daya LIFU yang berbeda. b, c Data statistik yang sesuai dari sinyal US pada a. d–g Gambar mikroskop optik FA-FRT-PFP yang dicampur dengan gel agarose pada berbagai nilai pH dan diiradiasi dengan 2,0 W/cm2 selama 3 menit
Pengambilan Sel
Gambar 5 menunjukkan kapasitas pengambilan seluler FA-FRT-PFP. Sel yang diobati FITC bebas menunjukkan fluoresens yang tidak terlihat tetapi setelah dilabeli pada FA-FRT-PFP, sinyal fluoresens yang kuat terlihat, menunjukkan bahwa FA-FRT-PFP memiliki kapasitas pengambilan seluler yang kuat. Sel yang diobati FRT-PFP dan FA-FRT-PFP yang telah diobati FA menunjukkan fluoresens FITC yang lebih lemah. Ini lebih mendemonstrasikan bahwa FA meningkatkan targeting aktif nanopartikel. Selain itu, FA-FRT-PFP menunjukkan perilaku pengambilan yang sebanding dengan FCM (Gambar 5c, d). Tingkat pengambilan FA-FRT-PFP adalah 46,5 ± 2,8%, yang secara signifikan lebih tinggi dari FITC bebas (kontrol), FRT-PFP dan FA-FRT-PFP + FA. Selain itu, Berkas tambahan 1: Gambar S2 menunjukkan pengambilan nanopartikel sel ovari normal. Tidak ada perbedaan signifikan antara FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, dan FA-FRT-PFP dalam pengambilan seluler. Ini kemungkinan karena sel ovari normal (HUM-CELL-0088) memiliki ekspresi reseptor FA yang rendah dibandingkan sel SK-OV-3.
Pengambilan sel. a, b Gambar fluoresens konfokal sel yang diobati FITC bebas dan FRT-PFP yang dilabeli FITC, FA-FRT-PFP + FA, dan FA-FRT-PFP. Warna hijau dan biru mewakili fluoresens FITC dan DAPI, masing-masing. Skala bar = 25 μm. c, d Sinyal fluoresens FITC dan data statistik yang sesuai di dalam sel yang diobati FITC bebas dan FRT-PFP yang dilabeli FITC, FA-FRT-PFP + FA, dan FA-FRT-PFP
Citra Ultrasound In Vitro
Untuk konfirmasi bahwa FA-FRT-PFP meningkatkan citra ultrasound oleh ADV in vitro, nanopartikel diinkubasi dengan sel selama 5 jam dan diiradiasi dengan atau tanpa LIFU (2,0 W/cm2). Seperti ditunjukkan pada Gambar 6a dalam kehadiran paparan LIFU, sel dalam semua grup yang diuji tidak menunjukkan sinyal ultrasound yang ditingkatkan sementara setelah paparan LIFU, sel yang diobati FA-FRT-PFP menunjukkan intensitas US yang tinggi dibandingkan grup kontrol FRT-PFP dan FA-FRT-PFP + FA, masing-masing. Untuk citra ultrasound, analisis kuantitatif nilai abu-abu dihitung menggunakan perangkat lunak ImageJ. Hasilnya sesuai dengan data citra US (Gambar 6b) yang menunjukkan bahwa intensitas US sel yang diobati FA-FRT-PFP ditingkatkan setelah iradiasi oleh LIFU pada 2,0 W/cm2 selama 3 menit. FA-FRT-PFP masuk ke sel dan dalam lingkungan asam lisosom (pH = ~ 5,0) terurai dan melepaskan PFP ke dalam sitoroplasma [34, 35]. Setelah paparan LIFU, PFP dengan mudah mengalami transformasi fase dari titik ke gas, yang meningkatkan intensitas US.
Citra ultrasound in vitro. a Citra ultrasound dan data statistik yang sesuai (b) dari PBS (kontrol), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, dan sel yang diobati FA-FRT-PFP dengan atau tanpa iradiasi LIFU (2,0 W/cm2, 3 menit)
Efektivitas Antikanker In Vitro dan Analisis Kematian Sel
Gambar 7a menunjukkan sitorotoksisitas FA-FRT-PFP pada konsentrasi hingga 0,5 mg/mL. Dalam kehadiran paparan LIFU, FA-FRT-PFP tidak menunjukkan penahanan kelangsungan yang jelas pada sel SK-OV-3. Uji CCK-8 digunakan untuk menganalisis efektivitas antikanker FA-FRT-PFP bersama LIFU. Seperti ditunjukkan pada Gambar 7b, dalam kehadiran paparan LIFU, FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, dan FA-FRT-PFP tidak menunjukkan sitorotoksisitas yang luar biasa dibandingkan grup kontrol. Ketika digabungkan dengan 4 menit paparan LIFU, FA-FRT-PFP menunjukkan sitorotoksisitas yang signifikan yang lebih tinggi dari FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, dengan tingkat inhibisi sel puncak mendekati 90% pada 40 μg/mL. Ini mungkin karena FA-FRT-PFP lebih mudah diambil ke dalam sitoroplasma dan kemudian lisosom dibandingkan FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA. Dalam lingkungan asam lisosom, FA-FRT-PFP melepaskan PFP ke dalam sitoroplasma. Di bawah 4 menit paparan LIFU, PFP yang dilepaskan gasifikasi, menyebabkan kavitasi dan pecahan, menghasilkan serangkaian gaya kejut fisik yang secara signifikan meningkatkan efek pembunuh tumor [36,37,38]. Selain itu, Berkas tambahan 1: Gambar S3 menunjukkan sitorotoksisitas nanopartikel pada sel ovari normal. Tidak ada perbedaan signifikan antara FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, dan FA-FRT-PFP dalam sitorotoksisitas ketika mereka digabungkan dengan LIFU. Hasil ini mungkin karena sel HUM-CELL-0088 memiliki ekspresi reseptor FA yang rendah yang menunjukkan tidak ada efek targeting FA.
Efektivitas antikanker in vitro. a Kelangsungan sel SK-OV-3 setelah 24 jam inkubasi dengan berbagai konsentrasi FA-FRT-PFP. b Kelangsungan sel SK-OV-3 yang diperlakukan dengan 40 μg/mL PBS (kontrol), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, dan FA-FRT-PFP bersama atau tanpa iradiasi LIFU (2,0 W/cm2, 4 menit) dan lebih lanjut diinkubasi selama 21 jam
Seperti ditunjukkan pada Gambar 8a, b, dalam kehadiran paparan LIFU, sel menunjukkan kematian sel yang minimal dalam semua grup. Setelah 4 menit paparan LIFU, sel yang diobati FA-FRT-PFP menunjukkan nekrosis yang signifikan (~ 91,6%) dibandingkan grup lain karena gelombang kejut fisik yang dihasilkan oleh kavitasi PFP yang diinduksi LIFP atau peledakan gelembung. Selain itu, Berkas tambahan 1: Gambar S4 menunjukkan tingkat ekspresi protein TNF sel. Tanpa LIFU, sel hampir tidak mengekspresikan protein TNF. Sementara itu, dengan LIFU, sel dalam grup FA-FRT-PFP memiliki tingkat ekspresi TNF yang tinggi, dibandingkan dengan grup FRT-PFP dan FA-FRT-PFP + FA, menunjukkan bahwa protein TNF adalah protein terkait kematian yang penting yang diinduksi FA-FRT-PFP + LIFU [39]. Berdasarkan efek terapi kanker in vitro yang unggul [40,41,42], FA-FRT-PFP menjanjikan untuk terapi kanker in vivo di masa depan.
a Analisis citometrika aliran dan data statistik yang sesuai dari sel SK-OV-3 yang diperlakukan dengan 40 μg/mL PBS (kontrol), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, dan FA-FRT-PFP bersama atau tanpa iradiasi LIFU (2,0 W/cm2, 4 menit) dan lebih lanjut diinkubasi selama 23 jam
Kesimpulan
Dalam ringkasan, kami berhasil mengembangkan nanopartikel transformasi fase berbasis FRT dan dimuat PFP yang dimodifikasi dengan molekul target FA (FA-FRT-PFP). Sebagai agen teranostik US target baru, FA-FRT-PFP memiliki banyak keuntungan: (1) FA-FRT-PFP memiliki ukuran partikel skala nano; (2) FRT digunakan sebagai pembawa, yang dapat terurai dan dirakit kembali untuk memuat dan melepaskan titik PFP pada kondisi asam dan netral, masing-masing; (3) di bawah 3 menit bantuan LIFU dan kondisi asam, FA-FRT-PFP melepaskan PFP dan menghasilkan transformasi fase melalui ADV, yang dapat secara signifikan meningkatkan kontras US-nya; (4) di bawah 4 menit iradiasi oleh LIFU dan lingkungan asam, PFP yang dilepaskan dapat dengan mudah menyebabkan “efek ledakan” seluler, yang menghasilkan karakteristik antitumor fisik. Hasil ini menunjukkan bahwa FA-FRT-PFP dengan bantuan LIFU menyediakan strategi baru untuk citra molekuler ultrasound dan perawatan tumor.
Ketersediaan Data dan Bahan
Kesimpulan yang dibuat dalam naskah ini didasarkan pada data yang semuanya disajikan dan ditunjukkan dalam makalah ini.
