Perangkat Termal Plasmaron Portabel untuk Kuantifikasi Akurat Assay Aliran Samping

Abstrak

Pengujian di tempat perawatan (POCT) banyak digunakan untuk diagnosis awal dan pemantauan penyakit. Assay aliran samping (LFA) adalah alat komersial yang berhasil untuk POCT. Namun, LFA sering mengalami kurangnya kuantifikasi dan sensitivitas analitik. Untuk mengatasi kekurangan ini, kami sebelumnya telah mengembangkan LFA termal menggunakan nanopartikel emas plasmaron untuk kontras termal ke dalam perangkat portabel. Meskipun metodologi ini secara signifikan meningkatkan sensitivitas analitik dibandingkan deteksi visual konvensional, masalah kuantifikasi masih tersisa. Dalam studi ini, kami mengoptimalkan kondisi operasi perangkat menggunakan mode sensing termal konduksi dan radiasi untuk mengizinkan kuantifikasi LFA. Batas deteksi strip yang hanya mengandung nanopartikel menurun 5 kali lipat (mode konduksi) dan 12 kali lipat (mode radiasi) dibandingkan deteksi visual tradisional. Efek suhu lingkungan dipelajari untuk kedua metode deteksi yang menunjukkan bahwa mode radiasi lebih terpengaruh oleh suhu lingkungan dibandingkan mode konduksi. Untuk memvalidasi metode sensing termal, penanda biologis gonadotropin korionik manusia (HCG) dikuantifikasi menggunakan strip LFA kami, memperoleh batas deteksi 2,8 mIU/mL saat menggunakan metode deteksi radiasi.

Pendahuluan

Deteksi awal dan diagnosis cepat sangat penting untuk skrining dan pengobatan penyakit. Sebagian besar tes medis memakan waktu dan memerlukan persiapan sampel klinis yang rumit, instrumen besar, dan profesional laboratorium yang terlatih [1]. Kebutuhan ini sangat menghambat pengobatan medis di wilayah yang sumber daya terbatas. Pengujian di tempat perawatan (POCT) menggunakan peralatan sederhana dan meminimalkan waktu yang diperoleh untuk mendapatkan hasil yang relevan klinis, sehingga memungkinkan dokter dan pasien untuk membuat keputusan dengan cepat. POCT memiliki beberapa keuntungan yang jelas, seperti waktu deteksi singkat, pemrosesan sampel yang cepat, instrumen sederhana, dan persyaratan operasi yang rendah [2, 3]. Jadi, kemunculan POCT dapat membantu diagnosis awal dan cepat penyakit, terutama di wilayah yang sumber daya terbatas, sehingga meningkatkan kondisi medis. Namun, sensitivitas analitik yang rendah, prosedur operasi yang rumit, dan biaya peralatan yang tinggi biasanya menghambat aplikasi teknik ini. Oleh karena itu, diperlukan lebih banyak kerja segera untuk menemukan aplikasi POCT dengan sebagian besar karakteristik ideal, sambil meminimalkan kekurangannya.

Untuk mengatasi beberapa masalah ini, assay aliran samping (LFA) adalah kandidat yang sangat baik sebagai alat pengujian dalam POCT. LFA adalah biosensor strip berbasis kertas, di tempat perawatan, yang digunakan untuk mengidentifikasi analita target dalam sampel tertentu [4, 5]. LFA dilakukan pada strip berbasis kertas (Skema 1b), yang terdiri dari pad sampel, pad konjugat, pad penyerapan, dan membran nitrocelulosa di mana deteksi terjadi. Di antara keuntungan LFA, layak disebutkan kecepatan dan uji satu langkah, hemat biaya, operasi mudah, volume sampel kecil, dan masa simpan panjang di bawah berbagai kondisi lingkungan [6, 7]. LFA konvensional memberikan hasil "ya atau tidak" dengan memeriksa perubahan warna pada garis uji dengan mata telanjang, metode deteksi yang paling populer untuk jenis assay ini. Jadi, pendekatan ini cenderung menderita kurangnya akurasi dan penilaian subjektif [8]. Meskipun demikian, karena mudah mengintegrasikan LFA dengan perangkat elektronik, pendekatan deteksi yang layak adalah mengembangkan pembaca strip untuk mendapatkan hasil kuantitatif yang akurat. Perangkat berbasis perangkat charge-coupled (CCD) atau sensor komplementer metal-oksida semikonduktor (CMOS) biasanya digunakan untuk menangkap citra dalam pembaca strip. Perangkat lunak pengolahan citra sering digunakan untuk mencapai hasil kuantitatif. Dalam pembaca optik ini, informasi optik yang diperoleh dari refleksi, transmisi, atau pencaran cahaya dari sumber eksternal direkam untuk mengizinkan kuantifikasi [9,10,11,12]. Dalam pembaca warna, intensitas warna, seperti nilai abu-abu atau koordinat RGB, dikumpulkan dari garis uji dan kontrol untuk menganalisis strip LFA [13,14,15,16,17]. Salah satu kekurangan pendekatan ini adalah pewarna mungkin kehilangan warnanya seiring waktu karena kerusakan cahaya, mekanik, atau proses degradasi lainnya, sehingga mengakibatkan repetibilitas dan akurasi yang buruk. Dalam sistem yang menggunakan pembaca fluoresensi [18, 19], fluorofor organik diekspos pada panjang gelombang eksitasi tertentu yang menginduksi emisi fluorofor yang ada dalam strip pada panjang gelombang yang lebih panjang. Cahaya yang dihasilkan ini kemudian dikumpulkan untuk mendapatkan deteksi kuantitatif. Masalah yang tidak dapat diabaikan adalah bahwa fluorofor organik yang biasanya digunakan dalam aplikasi ini menderita pemblekakan cahaya dan degradasi kimia, yang menyebabkan penurunan sinyal seiring waktu, sehingga memerlukan penanganan khusus dan penyimpanan khusus [7].

Perangkat Termal Plasmaron Portabel untuk Kuantifikasi Akurat Assay Aliran Samping

Baru-baru ini, sensing termal secara bertahap diterapkan dalam deteksi LFA. Sensing termal terdiri dari penggunaan transduser panas di mana panas yang dihasilkan bertambah dalam kehadiran analita, yang memungkinkan mendeteksi sinyal termal ini oleh transduser tersebut. Polo et al. [20] mengeksplorasi konsep sensing yang didorong oleh pemanasan plasmaron dengan deteksi penanda biologis kanker antigen karsinoembrional (CEA) menggunakan sumber cahaya inframerah dekat (NIR) untuk menginduksi generasi panas dengan menggunakan properti plasmaron nanopartikel emas anisotropik. Qin et al. [21] mengusulkan metode menggunakan kontras termal untuk mengkuantifikasi LFA menggunakan laser hijau sebagai sumber cahaya, yang menunjukkan peningkatan sensitivitas analitik 32 kali lipat. Pada tahun 2016, pembaca kontras termal serupa [22] dikembangkan oleh Wang yang meningkatkan sensitivitas analitik 8 kali lipat dalam kuantifikasi LFA. Sumber cahaya yang digunakan untuk menginduksi generasi panas oleh transduser dapat diatur pada panjang gelombang tertentu untuk mencegahnya terpengaruh oleh kehadiran molekul lain yang tidak menyerap pada panjang gelombang tersebut, memastikan spesifisitas deteksi. Penggunaan sumber cahaya yang terletak pada wilayah NIR dari spektrum elektromagnetik memungkinkan mencegah absorpsi cahaya oleh mayoritas molekul asal biologis, terutama darah [23]. Keuntungan-keuntungan ini menunjukkan bahwa sensing termal plasmaron dengan sumber cahaya NIR adalah metode deteksi LFA yang menjanjikan. Namun, dalam penelitian sebelumnya, tidak ada perangkat POCT yang dikembangkan menggunakan strip LFA bersama dengan sumber cahaya NIR.

Di sini, kami mengembangkan perangkat portabel berbasis sensing termal plasmaron (Skema 1a) yang meningkatkan sensitivitas analitik dalam LFA tanpa modifikasi tambahan pada strip. Sinyal ditingkatkan dengan memanfaatkan resonansi plasmaron sepenuhnya pada iradiasi laser NIR. Panjang gelombang laser dalam prototipe berada di dalam puncak resonansi plasmaron permukaan terlokalisasi (LSPR) nanopartikel (yang bertindak sebagai transduser cahaya-kepanas dalam pengaturan kami), sehingga menghasilkan panas pada garis uji. Kemudian, generasi panas terdeteksi oleh sensor termal yang terletak dalam perangkat yang mengukur panas yang dihasilkan oleh emisi inframerah (radiasi) atau melalui konduksi panas. Jumlah panas yang dihasilkan proporsional dengan jumlah nanopartikel pada garis uji dan daya iradiasi [24]. Tidak diperlukan operasi tambahan.

Transfer panas memiliki tiga bentuk utama: konduksi, konveksi, dan radiasi. Untuk mempelajari kinerja deteksi dari berbagai bentuk transfer panas, kami menguji mode konduksi (kontak) dan mode radiasi (non-kontak) dengan dua jenis sensor (Skema 1a dan Berkas Tambahan 1: Gambar S1). Prototipe keseluruhan kompak dan menggunakan teknologi sistem tertanam serta komponen montasi permukaan. Faktor utama yang mempengaruhi kemampuan deteksi diselidiki untuk mengoptimalkan kondisi operasi. Untuk memverifikasi kemampuan deteksi perangkat portabel, strip LFA yang langsung dimuat dengan nanopartikel pada membran dikuantifikasi dan dibandingkan dengan deteksi visual konvensional. Karena metode deteksi kami bergantung pada suhu, efek suhu lingkungan terhadap deteksi sinyal termal juga diselidiki dan kurva kalibrasi diperoleh untuk mode konduksi. Akhirnya, penanda biologis gonadotropin korionik manusia (HCG) dikuantifikasi sebagai model untuk memverifikasi kemampuan deteksi sensing termal.

Bahan dan Metode

Bahan dan Reagen

Penyangga fosfat (PBS) dibeli dari Lonza®. N-(3-Dimetilaminopropil)-N-etilkarbodiimida hidroklorida (EDC) dan polietilen glikol heterobifungsional (HS-PEG-COOH, MW = 5000 g/mol (5 kDa)) dibeli dari SIGMA®. Tween 20, Triton X100, albumina serum sapi (BSA), trehalosa, poli-vinil-pirrolidon (PVP), N-hidroksisuksinimida sulfona (S-NHS), hidroksida natrium, klorida natrium, klorida emas(III) hidrat, dan hormon HCG dibeli dari Aladdin®. Sukrosa, tetraborat natrium dekahidrat, asam borat, iodida kalium, dan tiosulfat natrium pentahidrat dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Borohidrat natrium dibeli dari Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd. Antibodi anti-αHCG, anti-βHCG dan antibodi sekunder anti-mouse, membran nitrocelulosa (NC-a110), pad sampel (serat kaca BX108), pad konjugasi (serat kaca BX101), dan permukaan poli-vinil klorida (PVC) dibeli dari JieyYiBiotech™. Asam 4-morfolinietansulfonik (MES) dibeli dari Shanghai Majorbio. Etanol murni dibeli dari Changshu Yangyuan Chemical Co., Ltd.

Sintesis Nanopartikel (Nanoprisma Emas, AuNPrs)

Nanopartikel yang digunakan dalam studi ini diperoleh menggunakan variasi protokol yang telah kami laporkan sebelumnya [25] yang kemudian diperbaiki [26]. Secara singkat, volume 220 mL Na₂S₂O₃ 0,5 mM ditambahkan dengan 20 μL KI 0,1 M. Kemudian, 110 mL larutan di atas ditambahkan secara bertahap ke dalam larutan yang mengandung HAuCl₄ 2 mM selama 30 detik dan diinkubasi pada suhu ruangan hingga waktu total 4 menit, saat di mana larutan ditambahkan dengan 110 mL sisa larutan Na₂S₂O₃+KI selama 30 detik dan diinkubasi selama 4 menit lagi. Akhirnya, 100 mL Na₂S₂O₃ tanpa KI ditambahkan ke larutan yang dihasilkan dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruangan untuk mendapatkan nanopartikel berbentuk prisma akhir. Semua langkah inkubasi yang telah dijelaskan sebelumnya dilakukan tanpa diaduk. Setelah sintesis, nanopartikel stabilized dengan PEG (PEGylasi). Jumlah PEG yang ditambahkan ke nanopartikel disiapkan dalam rasio 1:2 (NP terhadap PEG) dari total berat emas yang digunakan dalam sintesis. PEG dicairkan dalam 1 mL air Milli-Q, dan volume tertentu NaBH₄ kemudian ditambahkan untuk mencapai rasio mol 1:1 PEG terhadap NaBH₄. Seluruh volume larutan PEG ke NaBH₄ sepenuhnya ditambahkan ke AuNPrs dan disesuaikan pH menjadi 12 dengan NaOH 2 M di bawah pengadukan halus. Akhirnya, larutan di sonikasi selama 60 menit pada 60 °C dan kemudian difugasi selama 15 menit pada 4400 G pada suhu ruangan untuk memisahkan AuNPrs dari PEG berlebih dan bahan yang tidak bereaksi. Pelet didisperapkan kembali dalam air Milli-Q dan difugasi tiga kali selama 9 menit pada 4400 G pada suhu ruangan. Sampel akhir ini dicairkan hingga satu kuartal volume aslinya untuk memungkinkan pengendapan pada suhu ruangan selama beberapa minggu. Setelah waktu ini, lapisan atas larutan (yang mengandung sebagian besar sampingan emas nano yang lebih kecil dan lebih ringan) dapat dihapus dari AuNPrs yang mengendap di dasar. Konsentrasi nanopartikel diperoleh dengan mengukur absorbansi mereka (OD) pada 400 nm dengan spektroskopi UV-Vis dan menerapkan faktor konversi (ε) sebesar 11,3 mL mg⁻¹ cm⁻¹. Nilai ini diperoleh secara eksperimental dengan mengkorespondir konsentrasi emas yang diperoleh oleh ICP dengan OD pada 400 nm dengan UV-Vis dari produk akhir sintesis.

Konjugasi Nanopartikel dengan Antibodi Anti-HCG

Secara singkat, 3 mL larutan yang mengandung 0,5 mg/mL nanopartikel yang telah di-PEGylated dicuci tiga kali dengan larutan penyangga MES 0,1 M pH 5,5 dengan difugasi selama 9 menit pada 6000 rpm dalam mikrocentrifuga mini pada suhu ruangan. Nanopartikel yang telah dicuci terakhir didisperapkan kembali dalam volume akhir 1 mL larutan penyangga yang sama (0,1 M larutan penyangga MES pH 5,5), dan 4 mg EDC dan S-NHS ditambahkan ke larutan. Sampel kemudian diinkubasi selama 20 menit di bawah pengadukan halus, difugasi selama 9 menit pada 6000 rpm, dan dicuci dengan larutan penyangga MES. Kemudian, 20 μL stok antibodi (200 μg) ditambahkan ke sampel dan diinkubasi selama 3 jam pada 37 °C diikuti oleh inkubasi kedua selama malam hari pada 4 °C (tidak diaduk). Besok hari, nanopartikel yang telah dikonjugasi difugasi (9 menit pada 6000 rpm) dan dicuci dua kali dengan larutan penyangga borat 5 mM pH 9. Kemudian, 25 mg BSA ditambahkan ke larutan. Setelah inkubasi selama 1 jam pada suhu ruangan di bawah pengadukan halus, sampel dicuci (9 menit pada 6000 rpm) dengan larutan penyangga borat yang ditambahkan Tween 20 (5 mM pH 9) dan akhirnya disimpan pada 4 °C hingga digunakan lagi untuk tidak lebih dari 4–5 hari.

Setelah persiapan nanopartikel, perakitan strip uji dilakukan (dijelaskan dalam ESI).

Pemuatan Nanopartikel pada Membran Strip

Untuk memuat nanopartikel pada membran strip, konsentrasi stok asli nanopartikel yang telah di-PEGylated (tanpa antibodi) diperoleh dan serangkaian pengenceran dilakukan dalam air Milli-Q, menghasilkan rentang konsentrasi dari 0 (air Milli-Q murni tanpa nanopartikel) hingga 10 OD/mL untuk konsentrasi maksimum, yang sesuai dengan 0,9 mg/mL menurut faktor konversi yang sebelumnya dikarakterisasi oleh ICP-AES. Untuk kesederhanan dan ekstrapolasi, nilai OD dipilih daripada konsentrasi berat. Jadi, 2 μL dari masing-masing pengenceran di atas ditambahkan dengan mikropipet secara langsung pada membran nitrocelulosa strip dan dibiarkan kering pada suhu ruangan selama sekitar 2 jam. Strip yang kering disimpan pada suhu ruangan sebelum pengujian iradiasi.

Untuk deteksi antigen HCG pada strip, serangkaian pengenceran analita (HCG) dilakukan dalam PBS. Setiap strip dijalankan dengan memuat 5 μL AuNPr yang dikonjugasi dengan antibodi anti-HCG ke dalam pad konjugat, dan 50 μL pengenceran yang diperlukan yang mengandung HCG. Strip dikeringkan dengan cara yang sama seperti pengujian sebelumnya.

Pengembangan Perangkat Portabel

Perangkat portabel (Gambar 1a dan Berkas Tambahan 1: Gambar S1) dirangka menggunakan teknologi sistem tertanam dan komponen montasi permukaan, karena mereka berukuran kecil dan hemat biaya. Komposisi prototipe ditunjukkan dalam Gambar 1b. Papan induk (Berkas Tambahan 1: Gambar S1) adalah modul inti perangkat, fungsinya untuk memproses data dan mengontrol sisa komponen. Modul ini terutama terdiri dari MCU STM32F407, yang memiliki memori besar dan operasi hemat daya. Rangkaian konversi tegangan dirancang pada papan induk untuk menyediakan pasokan tegangan yang benar untuk setiap modul dalam perangkat.

Lima antarmuka diterapkan pada papan induk untuk koneksi dengan modul lain. Sensor suhu terhubung ke papan induk melalui antarmuka IIC untuk menerima sinyal suhu yang ditransmisikan oleh sensor. Untuk pengukuran suhu yang akurat, kami memilih sensor suhu dengan output digital. Sensor untuk mode konduksi adalah sensor semikonduktor (ADT7420, Analog Devices) dengan resolusi suhu 16-bit (0,0078 °C) dan konsumsi daya rendah (700 μW). Dalam mode radiasi, kami menggunakan termometer inframerah (MLX90614, Melexis) dengan resolusi suhu 17-bit dan konsumsi daya 3,9 mW. Antarmuka antara modul kontrol laser dan papan induk terdiri dari rangkaian kontrol relai untuk memastikan manajemen yang akurat dioda laser sambil melindungi papan induk dari arus tinggi. Modul laser terdiri dari tiga komponen: (1) komponen kontrol laser (Berkas Tambahan 1: Gambar S1), (2) dioda laser (Thorlabs, M9-A64-0200) yang menyediakan sumber cahaya dengan panjang gelombang 1064 nm dan daya optik maksimum 200 mW, dan (3) lensa asferik (Thorlabs, 354330-C) yang dipasang dalam modul laser untuk mengarahkan cahaya yang dipancarkan oleh dioda laser ke area 1 mm × 2,5 mm. Komponen-komponen ini memungkinkan untuk menerangi garis uji pada strip dengan akurat. Layar sentuh LCD (TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN, 480 × 272 piksel) digunakan untuk menyediakan antarmuka pengguna grafis. Antarmuka 4 papan ditinggalkan untuk unduhan program dan debug. Antarmuka USB dirangka dalam perangkat, yang berfungsi sebagai port pengisian daya baterai dan port komunikasi antara perangkat dan komputer eksternal opsional. Prototipe diberdayakan oleh baterai litium 10.000 mAh. Program dalam MCU dikompilasi oleh perangkat lunak IAR (versi 7.50.2.10505). Antarmuka pengguna grafis dirancang menggunakan perangkat lunak USART HMI.

Desain Kasus Prototipe dan Kartrid Strip Uji

Untuk memastikan perangkat ramah pengguna dan portabel, casing 3D-cetak dan kartrid dirancang, meningkatkan kemampuan anti-gangguan dan stabilitas perangkat. Resin berwarna putih digunakan sebagai bahan untuk kasus dan kartrid. Perangkat lunak Solidworks 2018 digunakan untuk desain.

Kotak kubus (Berkas Tambahan 1: Gambar S2a) dan piring dasar persegi panjang (Berkas Tambahan 1: Gambar S2b) dirancang untuk perangkat sesuai dengan bentuk komponen internal. Casing kubus menyediakan posisi pemasangan yang tetap untuk layar LCD dan modul kontrol dioda laser. Slot persegi panjang pada sisi perumahan digunakan untuk memasukkan kartrid strip uji. Piring dasar disediakan dengan baterai dan basis pemasangan papan induk, yang memungkinkan komponen untuk dipasang ke piring dasar tanpa bergerak. Semua bagian deteksi dipasang di piring dasar. Rangka penopang untuk sensor dan kartrid strip disediakan di piring dasar, yang membawa mereka menjadi kontak erat. Lajur penyesuaian halus disediakan untuk dioda laser dan lensa yang memungkinkan pemasangan dan penyesuaian jarak. Ukuran seluruh perumahan adalah 133 mm × 108 mm × 73 mm.

Kartrid khusus (Gambar 1c, 15 mm × 4 mm × 70 mm) dirancang untuk perlindungan strip uji. Kartrid memiliki tiga jendela, satu untuk pemuatan sampel dan dua lagi untuk visualisasi garis uji dan garis kontrol, masing-masing. Jendela garis uji dirancang sedikit lebih kecil dari lebar strip uji untuk memastikan laser tidak dapat melewati strip uji dan mempengaruhi deteksi sensor. Cetakan penyangga dibuat di bagian belakang kartrid yang memungkinkan sensor konduktif untuk menyentuh sepenuhnya bagian belakang strip pada posisi garis uji sambil memastikan sensor radiasi dapat mendeteksi suhu dengan benar.

Algoritma untuk Sensing Termal dan Perhitungan Parameter

Sejak laser menerangi nanopartikel, panas dihasilkan pada garis uji yang menyebabkan perubahan suhu yang terdeteksi. Generasi panas ini (Q, W/m³) bergantung pada konsentrasi nanopartikel (C, OD/mL), area penerangan (A, m²), dan intensitas laser (I, W/m²) [22], menurut rumus berikut:

$$ Q= CIA $$ (1)

Sinyal termal (suhu) dikumpulkan ketika laser menerangi strip. Karena area penerangan dan intensitas laser tetap konstan, sinyal termal berubah dengan jumlah nanopartikel yang terikat pada garis uji. Untuk kuantifikasi generasi panas, dua metode dibandingkan. Yang pertama menggunakan perubahan suhu (Berkas Tambahan 1: Gambar S3) untuk mengkuantifikasi sinyal termal. Variasi suhu (∆T) dihitung untuk penentuan:

$$ \Delta T={T}_{\mathrm{end}}-{T}_0 $$ (2)

di mana T_end adalah suhu akhir (maksimum) yang tercapai pada akhir iradiasi dan T₀ adalah suhu lingkungan awal yang tercatat oleh sensor sebelum mulai iradiasi. Metode lain menggunakan perhitungan kuantitatif area di bawah kurva (AUC, Berkas Tambahan 1: Gambar S3). Metode ini membagi kurva menjadi trapesium menurut frekuensi sampling 10 Hz diikuti oleh komputasi penjumlahan semua trapesium. Sinyal termal dicapai dengan membagi area dengan waktu deteksi (t_det):

$$ \mathrm{AUC}=\sum \limits_{i=1}^n\left(\Delta {T}_i+\Delta {T}_{i-1}\right)\times 0.1\div 2 $$ (3) $$ {T}_{\mathrm{auc}}= AUC\div {t}_{\mathrm{det}} $$ (4)

Saat menerapkan kedua metode dalam deteksi, analisis AUC memberikan repetibilitas yang lebih baik untuk kuantifikasi (Berkas Tambahan 1: Gambar S4). Oleh karena itu, analisis AUC dipilih untuk penggunaan dalam kuantifikasi panas akhir.

Untuk mengevaluasi performa berbagai metode deteksi, kami menilai LOD kuantifikasi. Dalam setiap eksperimen, kami mengukur satu konsentrasi untuk empat sampel (empat strip, n = 4). Dengan mempertimbangkan deviasi standar (σ₀) dari kelompok kosong dan sensitivitas (S) yang merupakan kemiringan kurva standar dalam rentang linier, kami mengevaluasi LOD sebagai berikut:

$$ \mathrm{LOD}=\frac{3{\sigma}_0}{s} $$ (5)

Prosedur Assay

Seluruh prosedur assay terdiri dari tiga langkah utama: (1) pengumpulan data, (2) deteksi dan perolehan hasil, dan (3) tampilan dan penyimpanan hasil. Pertama, strip uji dimuat dalam kartrid dan dimasukkan ke dalam perangkat. Pengukuran dilakukan dengan cukup mengetuk tombol deteksi dan mengetik informasi pasien (secara opsional, kode anonim dapat dimasukkan sebagai gantinya). Informasi ditransmisikan ke unit kontrol mikro (MCU) dan disimpan. Kemudian, MCU mengaktifkan sensor suhu dan dioda laser untuk memulai tes. Sementara itu, data suhu yang diterima oleh MCU dikirim ke LCD untuk tampilan dan plotting secara real-time. Setelah deteksi, MCU menghitung nilai AUC dan mewakili hasil pada layar.

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi Nanopartikel

Spektra UV-Vis nanoprisma yang dikonjugasi ditunjukkan dalam Gambar 2a, yang menunjukkan bahwa puncak maksimum berada pada 1130 nm. Absorbansi AuNPr pada panjang gelombang laser (1064 nm) adalah 92 persen dari absorbansi maksimum pada 1130 nm. Gambar SEM dan TEM (Gambar 2b, c) dikumpulkan untuk memvisualisasikan morfologi nanopartikel, yang mengonfirmasi mayoritas segi tiga.

Optimisasi Kondisi Pengukuran dalam Perangkat

Dalam sensing termal, waktu deteksi dan jarak dari dioda laser ke garis uji adalah faktor utama yang mempengaruhi respons sinyal [27, 28]. Kedua faktor ini diselidiki untuk mengoptimalkan kondisi pengukuran. Untuk optimasi waktu iradiasi, kami mengiradiasi strip selama 10 menit dan mencatat perubahan suhu oleh kedua sensor masing-masing. Seperti yang dapat dilihat dari Gambar 3a, suhu terus naik selama 10 menit, tetapi kenaikan suhu mulai mencapai platuda setelah 120 detik. Hasil ini cocok dengan penelitian sebelumnya di mana tren yang serupa diamati dalam perubahan sinyal termal seiring waktu [28]. Dengan mempertimbangkan kebutuhan POCT dan konsumsi daya, waktu deteksi perangkat diatur menjadi 120 detik.

Optimisasi jarak kemudian dilakukan. Gambar 3b menunjukkan bahwa sinyal termal menurun seiring meningkatnya jarak antara dioda laser dan garis uji. Alasannya mungkin karena daya laser yang mencapai garis uji direduksi seiring meningkatnya jarak area iradiasi efektif. Untuk mendapatkan respons sinyal maksimum, jarak diatur menjadi 7 mm.

Efek Suhu Lingkungan terhadap Sensing Termal

Karena sensing termal berkaitan erat dengan suhu, diperlukan untuk meneliti bagaimana suhu lingkungan mempengaruhi sensing termal. Suhu lingkungan bervariasi dari 27,5 hingga 40 °C menggunakan inkubator. Secara total 4 sampel diukur pada setiap titik suhu dengan interval 2,5 °C. Kurva suhu lingkungan terhadap sinyal termal diukur untuk strip kosong dan 1 OD/mL masing-masing oleh kedua metode sensing termal. Parameter kurva pasang dari suhu lingkungan ditunjukkan dalam Tabel 1. Gambar 4a menunjukkan bahwa dalam mode konduksi, kemiringan kurva umumnya konsisten untuk konsentrasi yang berbeda, menunjukkan bahwa perubahan suhu lingkungan memiliki efek yang sama pada konsentrasi yang berbeda. Akibatnya, kurva efek lingkungan dapat digunakan untuk mengkalibrasi hasil kuantitatif. Dalam mode radiasi, kemiringan kurva (Gambar 4b) yang sesuai dengan kedua konsentrasi konsisten satu sama lain, tetapi kedua kurva menunjukkan tren menurun. Hasil ini menunjukkan bahwa mode konduksi lebih andal saat mengukur sampel dalam kondisi dengan variabilitas suhu tinggi.

Kuantifikasi Nanopartikel

Deteksi Sensing Termal

Untuk mendapatkan kurva kuantifikasi standar, kedua metode sensing termal (Berkas Tambahan 1: Gambar S5) digunakan masing-masing untuk mendeteksi strip uji yang mengandung nanopartikel dalam rentang 0 hingga 10 OD/mL. Strip tersebut (Berkas Tambahan 1: Gambar S6a) yang mengandung berbagai konsentrasi nanopartikel diukur oleh perangkat portabel yang disebutkan (lihat bagian "Bahan dan Metode"). Pengaturan kedua sensor dalam perangkat ditunjukkan dalam Berkas Tambahan 1: Gambar S5a dan S5b. Empat sampel diuji untuk setiap konsentrasi pada suhu lingkungan 27,5 °C. Perangkat menerapkan metode AUC untuk menghitung sinyal termal pada garis uji. Oleh karena itu, kuantifikasi sinyal termal proporsional dengan jumlah nanopartikel pada garis uji. Kurva kuantifikasi (Gambar 5a) dibuat dengan regresi linier dari data yang diperoleh dari sinyal termal terhadap konsentrasi nanopartikel dan direpresentasikan oleh rumus dalam Tabel 2.

Tabel 2 menunjukkan bahwa sensitivitas mode radiasi 15 kali lipat lebih tinggi dari mode konduksi. LOD mode konduksi dan radiasi masing-masing 0,053 OD/mL dan 0,023 OD/mL. Dalam sensing termal, mode radiasi meningkatkan batas deteksi (LOD) sebesar 2 kali lipat dibandingkan mode konduksi. Stabilitas strip LFA juga diuji seperti yang digambarkan dalam Berkas Tambahan 1: Gambar S7. Mode sensing termal konduktif memerlukan transfer panas antara dua padat. Ketika suhu garis uji naik dengan cepat, membutuhkan waktu (waktu relaksasi) bagi sensor untuk mencapai suhu yang sama dengan garis uji. Akibatnya, suhu sensor lebih rendah dari suhu aktual di garis uji pada akhir deteksi. Di sisi lain, mode radiasi tidak memerlukan transfer panas ke sensor, karena sensor secara langsung mendeteksi gelombang IR yang diiradiasi oleh garis uji untuk mendapatkan suhu saat ini. Dalam mode deteksi konduksi, sebagian panas terbuang karena kehadiran konduktor panas yang baik yang berfungsi sebagai penyerap panas, sementara dalam deteksi radiasi, hanya udara dan strip itu sendiri yang campur dalam penyerapan panas. Alasan-alasan ini dapat menjelaskan mengapa sensitivitas metode konduksi lebih rendah dari metode radiasi.

Saat menguji strip dengan konsentrasi 10 OD/mL, kami menemukan bahwa ada bekas terbakar menggunakan mode sensing radiasi (non-kontak). Satu kemungkinan alasan fenomena ini adalah bahwa dalam pengukuran non-kontak, konduktivitas termal rendah dari udara memungkinkan panas untuk ditahan di garis uji dan dissiptasikan kurang efisien, meningkatkan suhu lokal efektif dan akhirnya menyebabkan pembakaran membran.

Dalam mode deteksi kontak, sensor dengan konduktivitas termal besar bertindak sebagai medium dan penyerap panas. Dengan cara ini, panas dipindahkan ke sensor sehingga tidak terjadi pembakaran di garis uji.

Perbandingan Antara Sensing Termal dan Deteksi Visual

Karena popularitasnya untuk perangkat portabel dan penggunaan luas, kami membandingkan sensing termal dengan deteksi visual untuk kemampuan deteksinya. Untuk deteksi visual, citra strip diambil oleh kamera mikroskop digital konvensional. Strip uji dipasang dalam kartrid untuk memastikan konsistensi posisi analisis citra dengan cara yang serupa dengan sensing termal. Perangkat lunak Image J digunakan untuk menganalisis nilai abu-abu pada garis uji untuk berbagai konsentrasi nanopartikel. Kurva standar (Gambar 5a) dari metode deteksi visual dibuat berdasarkan hasil analisis ini. Rentang linier antara nilai abu-abu dan konsentrasi nanopartikel adalah 0,2–10 OD/mL (R² adalah 0,770 untuk rentang 0–0,2 OD/mL, jadi mereka dikecualikan dari analisis lebih lanjut). Batas deteksi adalah 0,268 OD/mL. Hasilnya menunjukkan bahwa sensing termal dapat mengurangi LOD sebesar 5- hingga 12 kali lipat dibandingkan deteksi visual. Dalam penelitian Qin, mereka menemukan bahwa LOD untuk analisis visual 100 kali lipat lebih tinggi dari kontras termal [21]. Karena mereka menggunakan daya laser tinggi dan kamera inframerah, mereka mendapatkan perbedaan LOD yang lebih besar. Salah satu penjelasan yang wajar untuk peningkatan LOD adalah bahwa sensing termal dapat mengukur nanopartikel di atas dan di bawah permukaan membran. Keuntungan lain dari sensing termal adalah ia memiliki stabilitas yang lebih tinggi dari deteksi visual. Sensing termal menghasilkan panas oleh nanopartikel pada seluruh garis uji. Deteksi visual hanya bergantung pada reaksi warna nanopartikel di permukaan garis uji. Bahkan jika konsentrasi analita dari dua strip uji sama, distribusi nanopartikel pada garis uji di bidang tangen berbeda; sehingga pemeriksaan visual akan menghasilkan perbedaan dalam hasil deteksi sementara sensing termal lebih stabil dan dapat direproduksi. Di sisi lain, sensitivitas deteksi visual 2 kali lipat lebih tinggi dari sensing termal. Deteksi visual adalah metode langsung untuk mengkuantifikasi nanopartikel, sementara sensing termal adalah pengukuran tidak langsung konsentrasi nanopartikel dengan mengukur perubahan suhu, yang mungkin sebagian menjelaskan kurangnya sensitivitas. Gambar 5b menunjukkan bahwa rentang deteksi linier untuk sensing termal dapat se rendah 0 OD/mL, dengan R² sebesar 0,972 (konduksi) dan 0,987 (radiasi), yang menunjukkan bahwa sensing termal memiliki potensi yang lebih baik untuk aplikasinya dalam deteksi awal di POCT dibandingkan kuantifikasi warna, karena analita target ada pada konsentrasi yang lebih rendah.

Deteksi Kuantitatif HCG

Akhirnya, penanda biologis HCG dikuantifikasi menggunakan sistem kami untuk memvalidasi sensing termal. Kedua mode konduksi dan radiasi diterapkan untuk mengkuantifikasi HCG. Daya optik diturunkan menjadi 150 mW, mencegah strip terbakar. Strip (Berkas Tambahan 1: Gambar S6b) dengan empat konsentrasi berbeda diuji. Gambar 6a dan b menunjukkan bahwa sinyal termal linier terhadap konsentrasi HCG dari 35 hingga 700 mUI/mL. Ketika konsentrasi diperluas ke rentang 35–7000 mUI/mL, linearitas berada antara logaritma konsentrasi dan sinyal termal seperti dalam Gambar 6c, d. Dalam mode konduksi, LOD adalah 64,2 mIU/mL yang berada dalam rentang yang serupa dengan deteksi visual. Namun, LOD ideal dari mode radiasi adalah 2,8 mIU/mL. Data cocok dengan kuantifikasi nanopartikel. Dibandingkan dengan perangkat lain yang menerapkan efek fototermal (LOD = 5,5 mIU/mL) [27], perangkat kami dalam mode radiasi mengurangi LOD hampir 2 kali lipat. Hasil ini membuktikan bahwa sensing termal adalah cara yang efektif dalam deteksi dan kuantifikasi LFA.

Kesimpulan

Sebuah metode sensing termal plasmaron untuk deteksi LFA telah ditetapkan. Sebuah perangkat portabel berdasarkan metode ini dikembangkan dengan menerapkan berbagai sensor suhu (mode konduksi dan radiasi). Studi pengaruh suhu lingkungan menunjukkan bahwa ia memiliki dampak negatif pada sensing termal dan mode konduksi kurang terpengaruh daripada mode radiasi. Dalam mode radiasi, dampaknya lebih signifikan pada konsentrasi tinggi. Kedua mode juga diuji untuk membandingkan kemampuan kuantifikasi. Ketika dibandingkan dengan deteksi visual tradisional, metode sensing termal menunjukkan peningkatan LOD sebesar 5- hingga 12 kali lipat untuk kuantifikasi nanopartikel. Mode radiasi menunjukkan performa yang lebih baik dari mode konduksi baik dalam sensitivitas maupun LOD. Dalam validasi sensing termal, strip LFA untuk deteksi HCG diuji dan hasilnya menunjukkan bahwa mode radiasi jauh lebih sensitif daripada mode konduksi. Dengan cara ini, kami telah membuktikan bahwa sensing termal adalah cara yang layak dan efektif untuk deteksi awal di platform LFA.

Kesimpulannya, sensing termal plasmaron benar-benar dapat meningkatkan sensitivitas analitik dan menunjukkan masa depan yang menjanjikan dalam deteksi LFA untuk aplikasi diagnosis awal. Perangkat portabel yang dijelaskan di sini menyediakan dua pendekatan sensing untuk memenuhi persyaratan yang berbeda.

Ketersediaan Data dan Bahan

Data yang digunakan dan/atau dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis yang sesuai atas permintaan yang wajar.

Singkatan

AUC:: Area di bawah kurva
AuNPrs:: Nanoprisma emas
BSA:: Albumina serum sapi
CCD:: Perangkat charge-coupled
CMOS:: Komplementer metal oksida semikonduktor
HCG:: Gonadotropin korionik manusia
LFA:: Assay aliran samping
LOD:: Batas deteksi
LSPR:: Resonansi plasmaron permukaan terlokalisasi
MCU:: Unit kontrol mikro
MES:: Asam 4-morfolinietansulfonik
NIR:: Inframerah dekat
PBS:: Penyangga fosfat
POCT:: Pengujian di tempat perawatan
PVC:: Poli-vinil klorida
PVP:: Poli-vinil-pirrolidon
S-NHS:: N-hidroksisuksinimida sulfona

Dampak Pemanasan Joule pada Pergantian Resistensi pada Sel Memori AlOx yang Dióksidasi Termal Array Titik Nano Skalabel dan Berpola pada ITO melalui Elektrolisis untuk SERS Berkinerja Tinggi

bahan nano