Deteksi Mioglobin Ultra-Sensitif di Titik Pelayanan dengan ELISA Plamonik Berbasis Smartphone

Abstrak

Seringnya mioglobin serum naik dalam 1–2 jam setelah infark miokard akut (AMI), menjadikannya biomarker awal yang kritis. Kami menyajikan imunoassay plamonik yang memanfaatkan perubahan resonansi plasmon lokal permukaan (LSPR) nanoroda emas (AuNRs) yang diinduksi enzim untuk mengukur mioglobin dengan rentang linier 0,1–1000 ng mL⁻¹ dan batas deteksi (LOD) 0,057 ng mL⁻¹. Pembaca baru, yang dibangun dari sensor cahaya lingkungan (ALS) smartphone dan aksesori cetak 3D, menterjemahkan pergeseran LSPR menjadi output yang sederhana dan murah (~$2) yang cocok untuk lingkungan dengan sumber terbatas. Konsentrasi mioglobin yang diukur dengan metode ini berkorelasi kuat dengan hasil ELISA konvensional, menekankan relevansi klinisnya untuk triase AMI yang cepat.

Pendahuluan

AMI masih merupakan penyebab utama kematian di seluruh dunia, dengan 1,5 juta kasus AS dan 500.000 kasus China setiap tahun. Deteksi awal bergantung pada biomarker yang naik dengan cepat; serum mioglobin puncak 6–9 jam setelah infark dan dapat terdeteksi secepat 1–2 jam [3–5]. ELISA konvensional, sambil andal, memerlukan infrastruktur laboratorium dan personel terampil, yang membatasi kegunaannya dalam skenario titik pelayanan (POC).

Imunoassay plamonik menggabungkan spesifisitas ELISA dengan amplifikasi optik dari nanostruktur logam, memungkinkan pembaca mata dan sensitivitas tinggi. Nanoroda emas, dengan LSPR yang dapat diatur, sangat menarik untuk transmisi sinyal dalam biosensing. Namun, interpretasi kuantitatif tradisional memerlukan spektrometer atau pembaca mikropiring, yang membatasi penerapan lapangan. Di sini, kami mengembangkan ELISA plamonik berbasis AuNRs untuk mioglobin, dipasangkan dengan pembaca berbasis smartphone yang memanfaatkan ALS ponsel untuk menangkap intensitas cahaya yang ditransmisikan, menawarkan alat diagnostik portabel dan murah.

Bahan dan Metode

Bahan

Mioglobin manusia (Abcam, UK), antibodi monoklon anti-mioglobin (mAb1, mAb2, produksi internal), nanoroda emas (AuNRs), glukosa oksidase (GOx), peroksidase peroksida (HRP), dan reagen lain diperoleh dari pemasok standar. Sampel serum dikumpulkan dari Rumah Sakit Guangzhou Overseas Chinese.

Apparatus

Spektrum LSPR direkam dengan pembaca mikropiring Synergy H1; absorbansi ELISA diukur pada 450 nm pada pembaca MK3. AuNRs dikarakterisasi oleh TEM PHILIPS TECNAI-10. Pembaca smartphone dirakit pada chassis cetak 3D (bagian 1: 100 × 40 × 40 mm, bagian 2: 76 × 13 × 12 mm) dan dipancarkan oleh dua baterai 1,5 V. LED 850 nm yang selaras dengan ALS mengaktifkan pengukuran cahaya yang ditransmisikan melalui aplikasi Light Meter (Android; kompatibel dengan iOS).

Sintesis AuNRs

Pertumbuhan berbintik menghasilkan AuNRs dengan aspek rasio yang diatur oleh konsentrasi AgNO₃ dan CTAB. Rod akhir diinkubasi 12 jam di bawah pengadukan sebelum digunakan.

Protokol Imunoassay Plamonik

Papan 96-lubang dilapisi selama malam dengan mAb1, diblokir dengan BSA, dan disimpan pada –20 °C. GOx-mAb2 (GOx-Ab2) ditambahkan ke lubang yang mengandung konsentrasi mioglobin yang bervariasi, diikuti oleh glukosa dan AuNRs dalam kehadiran HRP dan CTAB. Etching AuNRs oleh H₂O₂ menghasilkan blue shift dalam puncak LSPR dan mengurangi absorbansi pada 850 nm, yang proporsional dengan jumlah mioglobin. Intensitas cahaya yang ditransmisikan direkam oleh pembaca smartphone, menghasilkan kurva kalibrasi. Sampel serum dicairkan sepuluh kali dan diproses secara identik.

Analisis Data

Regresi linier dilakukan menggunakan Origin 9.0; semua assay dilakukan tiga kali untuk memastikan reproduktivitas.

Hasil dan Pembahasan

Prinsip Assay

GOx pada mAb2 mengubah glukosa menjadi asit gluconik dan H₂O₂. H₂O₂, dalam kehadiran HRP dan Br⁻, meng-etch AuNRs, menggeser puncak LSPR ke panjang gelombang lebih pendek dan mengurangi absorbansi pada 850 nm. Tingkat geser atau kehilangan intensitas secara langsung mencerminkan konsentrasi mioglobin.

Optimasi

Konsentrasi HRP (1,5 µM) dan CTAB (6,25 µM) optimal memaksimalkan geser LSPR. Waktu etching 30 menit dengan 100 µM H₂O₂ menghasilkan sinyal yang stabil. Tingkat H₂O₂ yang lebih tinggi menginduksi blue shift yang jelas dan perubahan morfologi dari batang persegi panjang menjadi elips, yang mengonfirmasi mekanisme etching.

Performa Pembaca Smartphone

Pembaca berbasis ALS mengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan pada 850 nm dengan variansi <1 persen relatif terhadap pembaca mikropiring komersial, mencapai korelasi 99,1 persen (R² = 0,991). Biaya seluruh aksesori sekitar $2.

Sensitivitas Analitik

Menggunakan geser LSPR, assay mengukur mioglobin dari 0,1 hingga 1000 ng mL⁻¹ dengan LOD 57,8 pg mL⁻¹. Saat dibaca oleh smartphone, rentang linier tetap sama, dengan LOD 64,1 pg mL⁻¹. Pengukuran serum klinis menunjukkan persetujuan yang kuat dengan ELISA (R² = 0,98), memvalidasi potensi diagnostik metode ini.

Perbandingan dengan ELISA

ELISA tradisional menghasilkan rentang linier 25–1000 ng mL⁻¹ dan LOD 22,7 ng mL⁻¹. Assay plamonik ini menawarkan LOD sekitar 400 kali lebih rendah dan rentang dinamis yang lebih luas, sehingga unggul untuk deteksi AMI dini.

Kesimpulan

Kami telah menunjukkan imunoassay ELISA plamonik nanoroda emas yang mendeteksi mioglobin serum dengan sensitivitas yang belum pernah ada (LOD = 0,057 ng mL⁻¹) dan pembaca smartphone yang sederhana. Platform ini melewati instrumen yang kompleks, menawarkan solusi yang layak dan murah untuk diagnosis AMI di POC di lingkungan dengan sumber terbatas.

Singkatan

• Ab1: Anti-mioglobin antibody
• Ab2: Anti-mioglobin antibody 2
• ALS: Ambient light sensor
• AMI: Acute myocardial infarction
• AuNRs: Gold nanorods
• ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
• GOx: Glucose oxidase
• HRP: Horseradish peroxidase
• H₂O₂: Hydrogen peroxide
• LSPR: Localized surface plasmon resonance
• Myo: Serum myoglobin
• POCT: Point-of-care testing