Kompleks PAMAM-Titik Kuantum Canggih untuk Imunoassay Klinis Cepat

Abstrak

Kami melaporkan sekelompok kompleks yang digunakan dalam imunoassay klinis. Kompleks ini meliputi anti-IgG kambing exposrabbit yang dikonjugasi PAMAM dan anti-IgG kambing exposmouse yang dikonjugasi QDs. Ketika anti-antigen exposrabbit dan anti-antigen exposmouse ditambahkan, antigen yang sesuai akan terdeteksi. Eksperimen menggunakan kompleks ini sederhana, nyaman, singkat waktu, dan singkat langkah. Ia juga dapat diterapkan pada berbagai metode eksperimen, seperti untuk digunakan dengan FCM (sitometri aliran), ICC (imunositokimia), dan IHC (imunohistokimia) untuk mendeteksi berbagai jenis antigen.

Pendahuluan

Titik kuantum (QDs) banyak digunakan sebagai luminarium karena rendemen kuantum fluoresensi tinggi, fotostabilitas tinggi, dan properti fotobleaching rendah. Mereka juga banyak digunakan sebagai fluorofor organik dalam citra sel dan aplikasi bioteknologi. Khususnya, QDs yang mengandung kadmium (misalnya, CdSe dan CdTe) memiliki keuntungan signifikan karena di bawah iradiasi panjang gelombang yang sama dalam rentang 430–660 nm, mereka memiliki spektrum elektromagnetik emisi yang bergantung pada ukuran [1, 2]. Oleh karena it, QDs yang dikonjugasi anti adalah sond yang paling menjanjikan untuk citra molekuler.

Dendrimer poliamidoamin (PAMAM), sebagai salah satu makromolekul dendritik yang paling luas dan dalam dipelajari, memiliki karakteristik berikut: sejumlah besar kelompok fungsional permukaan, sejumlah besar rongga di dalam molekul, ukuran skala nano, dan biokompatibilitas tinggi. Ketika dikonjugasi dengan obat dan anti, dendrimer ini dapat meningkatkan keterlarutan obat dan sirkulasi sistemik tetapi tidak menghambat aktivitas biologis obat [3]. Oleh karena it, anti yang dimodifikasi dengan PAMAM sering digunakan dalam imunisasi klinis.

Imunoassay klinis mencakup banyak metode, seperti WB, ELISA, IHC (imunohistokimia), ICC (imunositokimia), dan FCM (sitometri aliran). Di antaranya, FCM menggunakan sonda anti spesifik melakukan analisis cepat sel tunggal atau partikel biologis lain pada tingkat seluler dan molekuler. Oleh karena it, FCM adalah salah satu imunoassay yang paling banyak digunakan. Jika penyaringan sel dilakukan, penggunaan sonda anti yang sesuai sudah cukup; namun, jika penyaringan molekül biologis kecil diinginkan, seperti protein kecil, virus, atau sitokin, metode CBA (cytometric bead array) harus diadopsi karena FCM tidak dapat langsung mendeteksi sitokin kecil. Metode CBA menggunakan manikam yang dilabeli pewarna yang dibangun dengan anti penangkap spesifik pada permukaan. Ketika manikam CBA dicampur dengan sampel dan anti yang sesuai yang dilabeli pewarna, kompleks sandwich akan terbentuk seperti dalam ELISA, dan antigen kecil dapat terdeteksi oleh FCM.

Dalam penelitian ini, kami menyajikan sekelompok kompleks termasuk anti-IgG kambing exposrabbit yang dikonjugasi PAMAM dan anti-IgG kambing exposmouse yang dikonjugasi QDs. Kelompok kompleks ini dapat digunakan untuk FCM, ICC, dan IHC. Ketika anti-antigen exposrabbit dan anti-antigen exposmouse ditambahkan, antigen yang sesuai akan terdeteksi. Model ini dapat mendeteksi banyak jenis antigen, termasuk protein kecil, virus, dan sitokin ketika anti exposmouse dan exposrabbit yang sesuai ada. Scheme 1 menunjukkan kompleks yang digunakan dalam FCM, kami mengambil HSP27 sebagai contoh. HSP27 juga dikenal sebagai HSPB1 (protein famil heat shock B nomor 1) dan merupakan protein penting yang terlibat dalam resistensi obat, pertumbuhan sel, apoptosis, kejadian tumor, dan metastasis, dll [4, 5]. Dalam model ini, anti-IgG kambing exposrabbit yang dikonjugasi PAMAM bertindak sebagai pengangkut dan penangkap, mirip dengan manikam CBA (cytometric bead array), yang memungkinkan antigen molekül kecil terdeteksi oleh FCM. Anti-IgG kambing exposmouse yang dikonjugasi QDs bertindak sebagai sond fluoresensi. Jika antigen adalah protein membran atau protein seluler, kita dapat menggunakan metode FCM tradisional untuk mendeteksi antigen. Kami hanya perlu menambahkan QDs dan tidak perlu bagian PAMAM. Untuk protein seluler dan membran, sel dapat dianggap sebagai target yang dapat langsung terdeteksi oleh metode FCM; mereka tidak memerlukan bagian PAMAM untuk membentuk pseudosel. Oleh karena it, kita dapat memisahkan kompleks dan menggunakannya secara terpisah.

Kompleks PAMAM-Titik Kuantum Canggih untuk Imunoassay Klinis Cepat

Hasil dan Pembahasan

Kelompok kompleks ini terdiri dari dua bagian, bagian PAMAM dan bagian QDs. Bagian PAMAM adalah anti-IgG kambing exposrabbit yang dikonjugasi PAMAM. Kami menggunakan dendrimer PAMAM amino G5 (G5 PAMAM) sebagai agen penstabil permukaan untuk menyediakan karakteristik keterlarutan yang ideal untuk lingkungan air, namun dendrimer ini memiliki muatan positif kuat yang berbahaya untuk pengikatan anti. Untuk menutralisir muatan positif, kami melarutkan PAMAM dalam DMSO dan menambahkan anhidrid suksinat (dihidro-2,5-dikettotetrahydrofuran) untuk menutralisir kelompok amino PAMAM. Kelompok amino dalam PAMAM bereaksi dengan anhidrid suksinat untuk membentuk ikatan amida [6,7,8,9,10]. Setelah reaksi, produk didialisis, dilyofilisasi, ditimbang, dan dilarutkan ulang, produk hampir netral dan kami menamai produk “N-PAMAM,” yang mampu dikonjugasi dengan anti-IgG kambing exposrabbit. PAMAM, terutama G5 PAMAM, mengandung sejumlah besar rongga, dan IgG dapat dikapsulasi dalam ruang kosong G5 PAMAM [11]. Anti-IgG kambing exposrabbit pertama kali dilarutkan dalam larutan MES (0,1 mol/L, pH 6,0), kemudian EDC dan sulfo-NHS (pada rasio mol 1:1) ditambahkan, dan campuran diinkubasi selama 15 menit. Akhirnya, N-PAMAM (PAMAM netral) ditambahkan diikuti oleh inkubasi pada 4 °C dalam penggerak saring selama semalaman. Polimer ini self-assemble dalam larutan air untuk membentuk mikel polimer yang mengkapsulasi tamu berat molekül rendah yang tidak larut [12]; setelah reaksi, dialisis diperlukan untuk menghilangkan bahan yang tidak bereaksi. Kemudian, produk dilyofilisasi, ditimbang, dan dilarutkan ulang dalam larutan pelindung, dan akhirnya, anti-IgG kambing exposrabbit yang dikonjugasi N-PAMAM dibuat.

Spektrum fluoresensi dan UV-vis N-PAMAM-IgG (anti-IgG kambing exposrabbit) dalam MES ditunjukkan pada Gambar 1. Dibandingkan dengan N-PAMAM (PAMAM netral) dan IgG, puncak emisi fluoresensi N-PAMAM-IgG memiliki intensitas terendah. Spektrum UV-vis menunjukkan bahwa dibandingkan dengan IgG, larutan MES, PAMAM, dan N-PAMAM, hanya N-PAMAM-IgG yang memiliki puncak penyerapan pada panjang gelombang 200 nm. Baik spektrum fluoresensi maupun spektrum UV-vis, N-PAMAM-IgG menunjukkan karakteristik yang berbeda dibandingkan dengan N-PAMAM dan IgG, yang secara tidak langsung membuktikan bahwa N-PAMAM dan IgG telah tergabung bukan sekadar dicampur. Untuk mendeteksi aktivitas anti N-PAMAM-IgG, ELISA dilakukan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, resistensi anti IgG (anti-IgG kambing exposrabbit) tidak hilang saat dikonjugasi dengan N-PAMAM.

Bagian QDs adalah anti-IgG kambing exposmouse yang dikonjugasi QDs. Anti yang dikonjugasi QDs biasanya terbentuk melalui reaksi cross-coupling, di mana molekul anti terikat pada kelompok fungsional seperti kelompok karboksil atau amino pada permukaan QDs [13, 14]. Dalam penelitian ini, kami menggunakan titik kuantum air larut CdSe/ZnS core/shell yang stabil dengan ligan karboksil dan reaksi coupling karbodiimida menggunakan EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimida hidroklorida). Metode ini adalah salah satu metode paling populer untuk mengonjugasi anti ke permukaan QDs [15,16,17]. Mikel CdSe/ZnS QDs pertama kali diinkubasi dalam kehadiran EDC dan sulfo-NHS dalam larutan borat (5 mM BS, pH 7,2). Kemudian, anti-IgG kambing exposmouse ditambahkan, dan campuran diinkubasi pada 4 °C dalam penggerak saring selama semalaman dalam kegelapan. Akhirnya, 10% BSA (serum albumin sapi) ditambahkan untuk memblokir QDs yang tidak bereaksi, dan produk difurnirkan melalui sentrifugasi berurutan dan pelarutan ulang untuk menghilangkan bahan yang tidak bereaksi. Aktivitas anti anti-IgG (anti-IgG kambing exposmouse) yang dikonjugasi QDs dapat bertahan selama 3 bulan setelah disimpan pada 4 °C dalam kegelapan.

Ukuran partikel QDs-IgG (anti-IgG kambing exposmouse) dan QDs dalam larutan pelindung (2,5 mM BS, pH 8,0, 0,1% BSA) ditunjukkan pada Gambar 3a. Setelah reaksi coupling, diameter produk secara jelas meningkat, dan produk memiliki homogenitas dan stabilitas yang baik. Karakteristik ini adalah kunci untuk penggunaan mereka sebagai sond deteksi. Spektrum fluoresensi QDs-IgG dan QDs ditunjukkan pada Gambar 3b, dan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3a, peningkatan diameter produk menunjukkan bahwa IgG tergabung dengan QDs, namun puncak emisi fluoresensi QDs-IgG sama dengan QDs. Hasil ini berarti bahwa coupling IgG dan QDs tidak mengubah karakteristik optik QDs, yang berguna untuk aplikasi mereka dalam imunoassay. Untuk mendeteksi aktivitas anti QDs-IgG, kami menggunakan metode ELISA dengan membran PVDF. Anti-AKT exposmouse diencerkan ke konsentrasi 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml, dan 200 μg/ml, dan empat gradien konsentrasi antigen dihibridkan dengan QDs-IgG (anti-IgG kambing exposmouse) pada konsentrasi yang sama 0,1 mg/ml. Setelah hibridisasi selama 40 menit pada 37 °C dalam kegelapan, membran PVDF dicuci dengan PBST (pH 6,0, 0,1% Tween 20) 3 kali, dan membran PVDF diiradiasi dengan cahaya UV. Intensitas fluoresensi ditunjukkan pada Gambar 3c, intensitas fluoresensi meningkat dengan meningkatnya konsentrasi antigen, menunjukkan bahwa QDs-IgG memiliki aktivitas anti yang tinggi.

Bagian ini memperkenalkan cara menggunakan kelompok kompleks ini dalam FCM. Seperti yang disebutkan di atas, kami dapat mendeteksi banyak jenis antigen, seperti protein kecil, virus, dan sitokin [18], dan kami menggunakan protein HSP27 sebagai contoh, sekarang mari kita tinjau prosesnya secara rinci. HSP27 terletak dalam sitoplasma dan dikeluarkan dalam jumlah besar dalam sel tumor, terutama dalam kanker paru, kanker pankreas, kanker epitel salur kemih, kanker ginjal, kanker payudara, dan melanoma kulit. Karena sebagian kecil HSP27 diekskresi ke luar sel, kita perlu melisis sel untuk mengekstrak protein. Dalam eksperimen ini, kami memilih dua baris sel, MCF-7 (sel kanker payudara manusia) sebagai kelompok uji dan L02 (sel hati manusia normal) sebagai kelompok kontrol. Sel dilisis untuk mengekstrak protein seluler. Total protein dikumpulkan kemudian anti-HSP27 exposrabbit dan anti-HSP27 exposmouse ditambahkan sesuai konsentrasi protein, diikuti oleh inkubasi pada 37 °C selama 50 menit. Kemudian N-PAMAM-IgG ditambahkan ke campuran, campuran diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit, kemudian dibagi menjadi dua grup yang sama: grup uji dan grup PAMAM. Akhirnya, QDs-IgG ditambahkan ke grup uji dan diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit dalam kegelapan. Gambar 4 menunjukkan analisis fluoresensi untuk dua grup sel oleh sitometri aliran. Intensitas fluoresensi kurva uji jauh lebih tinggi daripada kurva PAMAM dalam grup MCF-7, sementara dalam grup L02, dua kurva hampir tumpang tindih. Ketika HSP27 ada dalam ekstrak sel, N-PAMAM-IgG dan QDs-IgG akan secara tidak langsung terikat bersama untuk membentuk kombinasi sandwich dalam kehadiran anti-HSP27 exposrabbit dan anti-HSP27 exposmouse. Jika HSP27 tidak ada, hanya sejumlah kecil QDs-IgG yang akan terikat dengan N-PAMAM-IgG melalui adsorpsi non-spesifik. Oleh karena it, jika intensitas fluoresensi kurva uji lebih tinggi daripada kurva kontrol PAMAM, HSP27 terkandung dalam sampel. Gambar 4 menunjukkan bahwa sel MCF-7 mengeluarkan lebih banyak protein HSP27 dibandingkan sel L02.

Seperti yang disebutkan di atas, kompleks ini dapat mendeteksi protein seluler yang diekskresi oleh FCM; dalam prinsipnya, kompleks ini dapat diterapkan pada jenis antigen apa pun. Selain itu, dua bagian kombinasi dapat digunakan secara terpisah. Jika antigen yang ingin kita deteksi terletak dalam sel atau pada permukaan sel, kita hanya dapat menggunakan bagian QDs. Misalnya, β-aktin adalah salah satu komponen utama sitoskeleton yang terletak dalam sel dan banyak terdapat dalam sel eukaryot. Gambar 5a menunjukkan analisis fluoresensi hanya menggunakan bagian QD untuk β-aktin dalam sel HeLa oleh FCM. Sel HeLa dicuci dan diobati dengan metanol untuk meningkatkan penetrasi membran sel kemudian dibagi menjadi dua grup yang sama. Grup β-aktin diinkubasi dengan anti-β-aktin exposmouse pada 37 °C selama 30 menit, dan grup kontrol diinkubasi dengan BSA. Setelah dicuci dengan PBS, kedua grup diinkubasi dengan QDs-IgG (anti-IgG kambing exposmouse) pada 37 °C selama 30 menit. Setelah dicuci dengan PBS dua kali, kedua grup terdeteksi oleh FCM. Intensitas fluoresensi kurva β-aktin jauh lebih tinggi daripada kurva kontrol, yang menunjukkan bahwa sel HeLa mengandung protein β-aktin.

Selain itu, kompleks ini juga dapat diterapkan pada ICC. Namun, untuk ICC, diperlukan antigen target terletak dalam sel atau pada permukaan sel dan hadir dalam jumlah besar [19]; jika tidak, target eksperimen akan sulit dibedakan dari latar belakang. Kami mengambil protein β-aktin sebagai contoh dan menanam sel HeLa pada piring sel 10 cm dan menempatkan cakram mikroskop di dalamnya, menggunakan metanol untuk mengimobilkan sel. Sel kemudian diinkubasi dengan anti-β-aktin exposmouse (PBS, 1% BSA) pada 37 °C selama 1 jam, dicuci dua kali dengan PBST, dan diinkubasi dengan QDs-IgG (anti-IgG kambing exposmouse) pada 37 °C dalam kegelapan selama 1 jam. Setelah dicuci dua kali dengan PBST dan mewarnai inti sel dengan DAPI, fluoresensi terdeteksi dengan mikroskop fluoresensi [20, 21]. Gambar 5b menunjukkan citra mikroskop fluoresensi sel HeLa. Keunggulan QDs sebagai pewarna fluoresens adalah sinyal QDs dan sinyal DAPI dapat diamati secara bersamaan di bawah iradiasi saluran ultraviolet; oleh karena it, berdasarkan inti, target dapat dengan jelas dilokasikan. Dalam eksperimen ini, β-aktin adalah protein sitoskeleton di sekitar inti sel dan dapat diamati secara jelas.

Kesimpulan

Secara kesimpulan, kami telah menunjukkan aplikasi kompleks yang digunakan dalam imunoassay klinis, seperti FCM dan ICC. Kelompok kompleks ini meliputi anti-IgG kambing exposrabbit yang dikonjugasi PAMAM dan anti-IgG kambing exposmouse yang dikonjugasi QDs. Ketika anti-antigen exposrabbit dan anti-antigen exposmouse ditambahkan, antigen yang sesuai terdeteksi. Kompleks ini menguntungkan karena spektrum luas, biokompatibilitas tinggi, stabilitas cahaya tinggi, dan toksisitas biologis rendah. Kompleks ini adalah model universal yang hanya memerlukan anti primer yang sesuai untuk diubah. Dalam artikel ini, kami menggunakan kompleks untuk mendeteksi HSP27 dan β-aktin, tetapi dalam teori, proses ini dapat diterapkan pada jenis antigen apa pun. Selain itu, kita dapat memilih metode deteksi sesuai karakteristik antigen, dan kita juga dapat memisahkan kompleks dan menggunakannya secara terpisah sesuai kebutuhan aktual. Metode ini juga memungkinkan molekül kecil, seperti protein kecil dan virus, untuk terdeteksi oleh sitometri aliran. Kami yakin bahwa dengan perbaikan yang sesuai, ini juga dapat diterapkan pada metode lain, seperti imunofluoresensi (IF), western blot (WB), dan strip imunokromatografi aliran lateral (LCS).

Metode/Eksperimen

Bahan

Titik kuantum CdSe/ZnS (QDs air larut dengan kelompok karboksil, no. kas. N/A) dibeli dari NEPQD, China. PAMAM (generasi kelima amino terakhiri, Lot no. CYD-150A) dibeli dari CYD, China. Anti-IgG kambing exposrabbit (ab6702) dan anti-β-aktin exposmouse (ab8226) dibeli dari Abcam, Inggris; anti-HSP27 exposmouse (BF0624) dan anti-HSP27 exposrabbit (AF6082) dibeli dari Affinity, AS; anti-IgG kambing exposmouse (bs0296G) dibeli dari Bioss, China; EDC dan sulfo-NHS dibeli dari Thermo Fisher; DMEM dan serum sapi fetal dibeli dari Gibco; dan membran PVDF (0,2 μm) dibeli dari Millipore. Semua reagen kimia lainnya adalah kelas reagen analitik.

Persiapan N-PAMAM-IgG (anti-IgG kambing exposrabbit)

Persiapan N-PAMAM (PAMAM netral): PAMAM (amino terakhiri G5, MW rata-rata 28826) (60 mg, 2,081 mM) dilarutkan dalam DMSO (2 ml) dan anhidrid suksinat (dihidro-2,5-dikettotetrahydrofuran) (0,266 g, 2,66 mM) ditambahkan untuk menutralisir kelompok amino. Karena satu mol makromolekul G5 PAMAM memiliki 128 mol kelompok amino, 60 mg PAMAM mengandung 0,266 mM kelompok amino, dan rasio mol kelompok amino PAMAM dan anhidrid suksinat sekitar 1:10. Kemudian, campuran diaduk dalam penggerak saring pada 100 rpm selama 4 jam, setelah itu larutan didialisis melalui membran dialisis 3500 MWCO selama 24 jam, dan N-PAMAM diperoleh setelah dilyofilisasi.
Persiapan N-PAMAM-IgG (anti-IgG kambing exposrabbit): formulasi larutan MES (100 mM, pH 6,0), kemudian ambil 100 μl larutan MES ke dalam tabung, tambahkan 20 μM EDC dan 20 μM sulfo-NHS kemudian gelembungkan dengan vortex pada kecepatan rendah. Tambahkan 35,7 μl IgG (pH, 0,5 μM) dan gelembungkan dengan vortex, setelah itu tambahkan 19 μg N-PAMAM dan inkubasi pada 4 °C selama semalaman, akhirnya larutan didialisis melalui membran dialisis 3500MWCO dan 8000MWCO selama 3 hari, setelah dilyofilisasi N-PAMAM-IgG akan diperoleh.

Persiapan QDs-IgG (anti-IgG kambing exposmouse)

Formulasi larutan BS:

Persiapkan larutan boraks (50 mM): timbang 19,07 g boraks dan larutkan dalam 1 L air ultrapure.
Persiapkan larutan asam borat (50 mM): timbang 3,09 g asam borat dan larutkan dalam 1 L air ultrapure.
Larutan BS pH 8,0 dan pH 7,2 disiapkan dengan mencampur dua larutan di atas.
Larutan cuci, juga digunakan sebagai larutan pelindung, disiapkan dengan mencairkan larutan BS pH 8,0 ke konsentrasi 5 mM dan menambahkan 0,1% Tween 20.
Larutan aktivasi disiapkan dengan mencairkan larutan BS pH 7,2 ke konsentrasi 5 mM dan menambahkan 0,1% Tween 20.
Larutan EDC dibuat dengan mencairkan 0,27 g EDC dalam 5 ml larutan aktivasi, dan larutan sulfo-NHS dibuat dengan mencairkan 0,378 g sulfo-NHS dalam 5 ml larutan aktivasi.

Persiapan QDs-IgG (anti-IgG kambing exposmouse):

Pertama, 450 μl QDs (CdSe/ZnS, 5 mg/ml) dilarutkan dalam 2,25 ml larutan aktivasi, kemudian 150 μl larutan EDC dan 150 μl larutan sulfo-NHS ditambahkan, dan larutan diultrasonik pada es selama 5 menit. Kedua, larutan disentrifuga pada 12.000 rpm selama 5 menit untuk mengeluarkan supernatant, dan endapan dilarutkan dalam 1,2 ml larutan cuci. Setelah 30 menit pengadukan ultrasonik, 100 μg anti IgG ditambahkan, kemudian larutan diinkubasi selama semalaman dalam penggerak saring pada suhu 4 °C. Ketiga, 150 μl 10% BSA ditambahkan diikuti oleh inkubasi pada 30 °C selama 30 menit dan sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 2 menit untuk mengeluarkan supernatant. Endapan dilarutkan ulang dalam 1 ml larutan cuci kemudian disentrifuga pada 12.000 rpm selama 2 menit, langkah ini diulang dan akhirnya endapan dilarutkan dalam 1 ml larutan pelindung. Pada akhirnya, 10% BSA ditambahkan; campuran dicampur dengan getaran ultrasonik penuh dan disentrifuga pada 820 g/min untuk mengeluarkan endapan, dengan supernatant yang mengandung QDs-IgG. QDs-IgG harus disimpan pada 4 °C dalam kegelapan selama 3 bulan. Perlu dicatat bahwa sampel hanya dapat disimpan pada 4 °C, dan tidak dapat beku bahkan dengan gliserin; jika tidak, akan menyebabkan sejumlah besar titik kuantum berkumpul dalam klaster, membentuk endapan yang tidak dapat dicuci dengan PBST, ini mengakibatkan fluoresensi latar belakang yang serius.

Analisis FCM untuk Protein HSP27

HSP27 terletak dalam sitoplasma dan dikeluarkan dalam jumlah besar dalam sel tumor. Dalam eksperimen ini, kami memilih dua baris sel, MCF-7 (sel kanker payudara manusia) sebagai kelompok uji dan L02 (sel hati manusia normal) sebagai kelompok kontrol. Kedua grup sel ditanam dalam piring budidaya 10 cm dan diinkubasi dalam medium Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM) dengan 10% serum sapi fetal (FBS) pada 37 °C. Ketika sel menutupi 80% piring, sel diambil dengan tripsin dan dicuci dua kali dengan PBS. Kemudian, sel distir dalam 1 ml PBS. Hitung sel dengan hemositometer, larutan lysis sel T-PER ditambahkan sesuai konsentrasi sel, setelah itu protein seluler diekstrak dari lisat sel. Kemudian, lisat sel disentrifuga pada 14000 rpm selama 10 menit untuk mengumpulkan supernatant, dan konsentrasi protein diukur oleh metode BCA, sesuai konsentrasi protein, anti-HSP27 exposrabbit dan anti-HSP27 exposmouse ditambahkan dan diinkubasi pada 37 °C selama 50 menit. Dalam eksperimen ini, konsentrasi protein L02 sekitar 0,2 mg/ml dan MCF-7 adalah 0,25 mg/ml, dan volume keduanya 500 μl. Kedua anti, anti-HSP27 exposrabbit dan anti-HSP27 exposmouse, ditambahkan ke sel (0,625 μl ke MCF-7 dan 0,5 μl ke sel L02).

Kemudian, 1 mg/ml N-PAMAM-IgG ditambahkan ke campuran diikuti oleh inkubasi pada 37 °C selama 30 menit; 6,25 μl ditambahkan ke grup MCF-7, dan 5 μl ditambahkan ke grup L02. Setelah inkubasi, produksi dibagi menjadi dua grup yang sama, grup uji dan grup PAMAM. Akhirnya, QDs-IgG ditambahkan ke grup uji, yang diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit dalam kegelapan. Kemudian, kedua grup sel dianalisis oleh sitometri aliran.

Analisis FCM untuk Protein β-aktin

β-aktin adalah protein seluler yang merupakan salah satu komponen utama sitoskeleton dan banyak terdapat dalam sel eukaryot. Sel HeLa ditanam dalam piring budidaya 10 cm dan diinkubasi dalam DMEM dengan 10% FBS pada 37 °C selama 2 hari, kemudian supernatant dihilangkan dan sel dicuci dua kali dengan PBS. Sel diambil dengan tripsin, setelah itu sel disentrifuga pada 800 rpm selama 3 menit untuk mengeluarkan supernatant, dan 1 ml metanol dingin ditambahkan untuk mendistir ulang sel. Setelah 5 menit, sel disentrifuga pada 800 rpm selama 3 menit untuk mengeluarkan supernatant, dan sel distir ulang dalam 1 ml PBS. Langkah ini diulang, dan sel HeLa dibagi menjadi dua grup yang sama. Grup uji diinkubasi dengan anti-β-aktin exposmouse pada 37 °C selama 30 menit, dan grup kontrol diinkubasi dengan BSA (serum albumin sapi). Dalam eksperimen ini, anti-β-aktin exposmouse dilarutkan dalam PBST (1% BSA, 5 μg/ml), dan 100 μl IgG ditambahkan ke 300 μl grup uji, dan jumlah BSA yang setara ditambahkan ke grup kontrol. Setelah setengah jam inkubasi, kedua grup diinkubasi dengan QDs-IgG (anti-IgG kambing exposmouse) pada 37 °C selama 30 menit. Setelah dicuci dua kali dengan PBS, kedua grup dievaluasi oleh FCM.

Analisis ICC untuk Protein β-aktin

Sel HeLa ditanam dalam piring budidaya 10 cm dan diinkubasi dalam DMEM dengan 10% FBS pada 37 °C selama 1 hari. Kemudian, beberapa cakram sterilisasi ditempatkan ke dalam piring sel, dan sel kemudian dibudidayakan selama 2 hari. Cakram diangkat dan dicuci dua kali dengan PBS, kemudian cakram diinkubasi dalam 400 μl metanol selama 20 menit pada suhu ruangan. Cakram dicuci 3 kali dengan PBS. Kemudian, larutan blokir disiapkan dengan PBST (0,1% Tween 20), 22,52 mg/ml glisin, dan 10% BSA. Sebuah cakram ditempatkan ke dalam larutan blokir dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan. Kemudian, larutan blokir dihilangkan, dan cakram diinkubasi dengan anti-β-aktin exposmouse (PBS, 1% BSA) pada 37 °C selama 1 jam, dicuci dua kali dengan PBST, dan diinkubasi dengan QDs-IgG (anti-IgG kambing exposmouse) pada 37 °C selama 1 jam dalam kegelapan. Setelah dicuci dua kali dengan PBST dan mewarnai inti sel dengan DAPI selama 2 menit, cakram dicuci sekali dengan PBS dan sekali dengan air untuk divisualisasikan di bawah mikroskop fluoresensi.

Ketersediaan Data dan Bahan

Semua data sepenuhnya tersedia tanpa pembatasan.

Singkatan

CBA:: Cytometric bead array
DMEM:: Medium Dulbecco’s modified Eagle’s
FBS:: Serum sapi fetal
FCM:: Sitometri aliran
ICC:: Imunositokimia
N-PAMAM:: PAMAM netral
PAMAM:: Dendrimer poliamidoamin
QDs:: Titik kuantum

Prakursor Menentukan Performa Ferroelektrik pada Tipis Hf0.5Zr0.5O2 ALD: TEMA vs. TDMA Sensor Tekanan Wearable Ultra-Sensitif Menggunakan Kain Dilapisi Nanowawa Perak

bahan nano