Sekelompok Kompleks Berdasarkan PAMAM dan Quantum Dots Digunakan dalam Clinical Immunoassays
Abstrak
Kami melaporkan sekelompok kompleks yang digunakan dalam immunoassay klinis. Kompleks tersebut termasuk IgG anti-kelinci kambing terkonjugasi PAMAM dan IgG anti-tikus kambing terkonjugasi QDs. Ketika anti-antigen kelinci dan anti-antigen tikus ditambahkan, antigen yang sesuai akan terdeteksi. Percobaan, menggunakan kompleks, sederhana, nyaman, singkat dalam waktu, dan singkat dalam langkah. Hal ini juga berlaku untuk metode eksperimen yang berbeda, seperti digunakan dengan FCM (flow cytometry), ICC (imunocytochemistry), dan IHC (imunohistokimia) untuk mendeteksi berbagai jenis antigen.
Pengantar
Titik kuantum (QD) banyak digunakan sebagai luminer karena hasil kuantum fluoresensinya yang tinggi, fotostabilitas yang tinggi, dan sifat pemutihan foto yang rendah. Mereka juga banyak digunakan sebagai fluorofor organik dalam pencitraan seluler dan aplikasi bioteknologi. Secara khusus, QDs yang mengandung kadmium (yaitu, CdSe dan CdTe) memiliki keuntungan yang signifikan karena di bawah iradiasi panjang gelombang yang sama dalam kisaran 430-660 nm, mereka memiliki spektrum elektromagnetik emisi yang bergantung pada ukuran [1, 2]. Oleh karena itu, QD terkonjugasi antibodi adalah probe yang paling menjanjikan untuk pencitraan molekuler.
Polyamidoamine dendrimer (PAMAM), sebagai salah satu makromolekul dendritik yang paling banyak dipelajari dan dipelajari, memiliki karakteristik sebagai berikut:sejumlah besar gugus fungsi permukaan, sejumlah besar rongga di dalam molekul, ukuran skala nano, dan biokompatibilitas tinggi. Ketika terkonjugasi dengan obat dan antibodi, dendrimer ini dapat meningkatkan kelarutan obat dan sirkulasi sistemik tetapi tidak menghambat aktivitas biologis obat [3]. Oleh karena itu, antibodi yang dimodifikasi dengan PAMAM sering digunakan dalam imunisasi klinis.
Imunoassay klinis mencakup banyak metode, seperti WB, ELISA, IHC (imunohistokimia), ICC (imunositokimia), dan FCM (flow cytometry). Di antara mereka, FCM yang menggunakan probe antibodi spesifik melakukan analisis cepat sel tunggal atau partikel biologis lainnya pada tingkat seluler dan molekuler. Oleh karena itu, FCM adalah salah satu immunoassay yang paling banyak digunakan. Jika skrining sel dilakukan, penggunaan probe antibodi yang sesuai sudah cukup; namun, jika skrining molekul biologis kecil diinginkan, seperti protein kecil, virus, atau sitokin, metode CBA (cytometric bead array) harus diadopsi karena FCM tidak dapat secara langsung mendeteksi sitokin kecil. Metode CBA menggunakan manik-manik berlabel pewarna yang dibuat dengan antibodi penangkap spesifik di permukaan. Ketika manik-manik CBA dicampur dengan sampel dan antibodi berlabel pewarna yang sesuai, kompleks sandwich akan terbentuk seperti pada ELISA, dan antigen kecil dapat dideteksi oleh FCM.
Dalam penelitian ini, kami menyajikan sekelompok kompleks termasuk IgG anti-kelinci kambing terkonjugasi PAMAM dan IgG anti-tikus kambing terkonjugasi QDs. Kelompok kompleks ini dapat digunakan untuk FCM, ICC, dan IHC. Ketika anti-antigen kelinci dan anti-antigen tikus ditambahkan, antigen yang sesuai akan terdeteksi. Model ini dapat mendeteksi banyak jenis antigen, termasuk protein kecil, virus, dan sitokin ketika antibodi tikus dan kelinci yang sesuai hadir. Skema 1 menunjukkan kompleks yang digunakan dalam FCM, kami mengambil HSP27 sebagai contoh. HSP27 juga dikenal sebagai HSPB1 (heat shock protein keluarga B nomor 1) dan merupakan protein penting yang terlibat dalam resistensi obat, pertumbuhan sel, apoptosis, terjadinya tumor, dan metastasis, dll [4, 5]. Dalam model ini, IgG anti-kelinci kambing terkonjugasi PAMAM bertindak sebagai pembawa dan penangkap, mirip dengan manik-manik CBA (sitometrik bead array), memungkinkan antigen molekul kecil dideteksi oleh FCM. IgG anti-tikus kambing terkonjugasi QDs bertindak sebagai probe fluoresen. Jika antigen adalah protein membran atau protein intraseluler, kita dapat menggunakan metode FCM tradisional untuk mendeteksi antigen. Kita hanya perlu menambahkan QD dan bukan bagian PAMAM. Untuk protein intraseluler dan protein membran, sel dapat dianggap sebagai target yang dapat dideteksi secara langsung dengan metode FCM; mereka tidak membutuhkan bagian PAMAM untuk membentuk sel semu. Oleh karena itu, kita dapat membagi kompleks dan menggunakannya satu per satu.
Representasi bagaimana kompleks terbentuk dan digunakan oleh FCM untuk mendeteksi HSP27. Pertama, PAMAM amino G5 harus bereaksi dengan suksinat anhidrida untuk membentuk PAMAM netral
Hasil dan Diskusi
Kelompok kompleks mencakup dua bagian, bagian PAMAM dan bagian QDs. Bagian PAMAM adalah IgG anti-kelinci kambing terkonjugasi PAMAM. Kami menggunakan dendrimer PAMAM generasi kelima yang diakhiri amino (G5 PAMAM) sebagai zat penstabil permukaan untuk memberikan karakteristik kelarutan yang ideal untuk lingkungan berair, tetapi dendrimer ini memiliki muatan positif kuat yang berbahaya bagi pengikatan antibodi. Untuk menetralkan muatan positif, kami melarutkan PAMAM dalam DMSO dan menambahkan suksinat anhidrida (dihydro-2,5-diketotetrahydrofuran) untuk menetralkan gugus amino PAMAM. Gugus amino pada PAMAM bereaksi dengan suksinat anhidrida membentuk ikatan amida [6,7,8,9,10]. Setelah reaksi, produk didialisis, diliofilisasi, ditimbang, dan dilarutkan kembali, produksinya hampir netral dan kami menamai produk tersebut “N-PAMAM,” yang mampu berkonjugasi dengan IgG anti-kelinci kambing. PAMAM, terutama G5 PAMAM, mengandung sejumlah besar rongga, dan IgG dapat dienkapsulasi dalam ruang kosong G5 PAMAM [11]. IgG anti-kelinci kambing pertama dilarutkan dalam buffer MES (0,1 mol/L, pH 6.0), kemudian EDC dan sulfo-NHS (pada rasio molar 1:1) ditambahkan, dan campuran diinkubasi selama 15 min. Terakhir, ditambahkan N-PAMAM (PAMAM netral) diikuti dengan inkubasi pada suhu 4 °C dalam shaker bed semalaman. Polimer ini dirakit sendiri dalam larutan berair untuk membentuk misel polimer yang merangkum tamu dengan berat molekul rendah yang tidak larut [12]; setelah reaksi, dialisis diperlukan untuk menghilangkan bahan yang tidak bereaksi. Kemudian, produksi diliofilisasi, ditimbang, dan dilarutkan kembali dalam buffer pengawet, dan akhirnya dibuat IgG anti-kelinci kambing terkonjugasi N-PAMAM.
Fluoresensi dan spektrum UV-vis N-PAMAM-IgG (anti-kelinci kambing) di MES ditunjukkan pada Gambar. 1. Dibandingkan dengan N-PAMAM (PAMAM netral) dan IgG, puncak emisi fluoresensi N-PAMAM-IgG adalah intensitas terendah. Spektrum UV-vis menunjukkan bahwa dibandingkan dengan IgG, buffer MES, PAMAM, dan N-PAMAM, hanya N-PAMAM-IgG yang memiliki puncak serapan pada panjang gelombang 200 nm. Baik spektrum fluoresensi atau spektrum UV-vis, N-PAMAM-IgG menunjukkan karakteristik yang berbeda dibandingkan dengan N-PAMAM dan IgG, yang secara tidak langsung membuktikan bahwa N-PAMAM dan IgG telah digabungkan daripada hanya dicampur. Untuk mendeteksi aktivitas antibodi N-PAMAM-IgG, dilakukan ELISA. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2, resistensi antibodi IgG (kambing anti-kelinci) tidak hilang saat digabungkan dengan N-PAMAM.
a Spektrum fluoresensi PAMAM-IgG (anti-kelinci kambing) di MES. Panjang gelombang eksitasi adalah 548 nm. b Spektrum UV-vis PAMAM-IgG (anti-kelinci kambing) di MES dan spektrum emisi pada rentang panjang gelombang
Metode ELISA untuk mendeteksi resistensi antibodi N-PAMAM-IgG (anti-kelinci kambing). N-PAMAM-IgG digunakan sebagai antigen dan diencerkan dengan konsentrasi yang berbeda. IgG-HRP kelinci digunakan sebagai probe antibodi untuk mendeteksi resistensi N-PAMAM-IgG. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 450 nm
Bagian QDs adalah IgG anti-tikus kambing terkonjugasi QDs. QD terkonjugasi antibodi biasanya dibentuk oleh reaksi cross-coupling, di mana molekul antibodi berikatan dengan gugus fungsional seperti gugus karboksil atau gugus amino pada permukaan QD [13, 14]. Dalam penelitian ini, digunakan titik kuantum inti/kulit CdSe/ZnS larut dalam air yang distabilisasi dengan ligan karboksil dan reaksi kopling karbodiimida menggunakan EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimida hidroklorida). Metode ini adalah salah satu metode yang paling populer untuk konjugasi antibodi ke permukaan QDs [15,16,17]. Misel CdSe/ZnS QDs pertama kali diinkubasi dengan adanya EDC dan sulfo-NHS dalam buffer borat (5 mM BS, pH 7.2). Kemudian ditambahkan IgG anti-tikus kambing, dan campuran tersebut diinkubasi pada suhu 4 °C dalam shaker bed semalaman dalam keadaan gelap. Akhirnya, 10% BSA (albumin serum sapi) ditambahkan untuk memblokir QD yang tidak bereaksi, dan produksi dimurnikan dengan sentrifugasi berturut-turut dan pelarutan kembali untuk menghilangkan bahan yang tidak bereaksi. Aktivitas antibodi dari IgG terkonjugasi QD (anti-tikus kambing) dapat bertahan selama 3 bulan setelah disimpan pada suhu 4 °C di tempat gelap.
Ukuran partikel QDs-IgG (anti-tikus kambing) dan QDs dalam buffer pengawet (2.5 mM BS, pH 8.0, 0.1% BSA) ditunjukkan pada Gambar. 3 a. Setelah reaksi kopling, diameter produk jelas meningkat, dan produk memiliki homogenitas dan stabilitas yang baik. Karakteristik ini adalah kunci untuk penggunaannya sebagai probe deteksi. Spektrum fluoresensi QDs-IgG dan QDs ditunjukkan pada Gambar. 3b, dan seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, diameter produksi meningkat menunjukkan bahwa IgG digabungkan dengan QDs, tetapi puncak emisi fluoresensi QDs-IgG adalah sama sebagai QD. Hasil ini berarti bahwa penggabungan IgG dan QD tidak mengubah karakteristik optik QD, yang berguna untuk penerapannya dalam immunoassay. Untuk mendeteksi aktivitas antibodi QDs-IgG, kami menggunakan metode ELISA dengan membran PVDF. Antibodi anti-AKT tikus diencerkan menjadi konsentrasi 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml, dan 200 μg/ml, dan empat antigen gradien konsentrasi dihibridisasi dengan QDs-IgG (anti-tikus kambing) pada konsentrasi yang sama 0.1 mg/ml. Setelah hibridisasi selama 40 menit pada suhu 37 °C dalam gelap, membran PVDF dicuci dengan PBST (pH 6.0, 0,1% Tween 20) 3 kali, dan membran PVDF disinari dengan sinar UV. Intensitas fluoresensi ditunjukkan pada Gambar. 3c, intensitas fluoresensi meningkat dengan meningkatnya konsentrasi antigen, menunjukkan bahwa QDs-IgG memiliki aktivitas antibodi yang tinggi.
a Distribusi diameter hidrodinamik QDs dan IgG terkonjugasi QDs (anti-tikus kambing). (a ) diameter QD dan (b ) IgG terkonjugasi QDs (anti-tikus kambing). Diameter rata-rata QD adalah 64,87 nm, dan diameter QDs-IgG adalah 211,4 nm, dideteksi oleh DLS. b Spektrum fluoresensi QDs-IgG (anti-tikus kambing), QDs dan buffer pengawet (2.5 mM BS, pH 8.0, 0.1% BSA). Puncak emisi fluoresensi QDs-IgG sama dengan QD, menunjukkan bahwa penggabungan IgG ke QD tidak mengubah karakteristik optik QD. c Metode ELISA untuk mendeteksi resistensi antibodi QDs-IgG (anti-tikus kambing), membran PVDF dinilai dengan UV
Bagian ini memperkenalkan cara memanfaatkan kelompok kompleks ini di FCM. Seperti disebutkan di atas, kami dapat mendeteksi banyak jenis antigen, seperti protein kecil, virus, dan sitokin [18], dan kami menggunakan protein HSP27 sebagai contoh, sekarang mari kita bahas prosesnya secara rinci. HSP27 terletak di sitoplasma dan disekresikan dalam jumlah besar di sel tumor, terutama pada kanker paru-paru, kanker pankreas, kanker epitel saluran kemih, kanker ginjal, kanker payudara, dan kanker kulit melanoma. Karena sebagian kecil dari HSP27 disekresikan ekstraseluler, kita perlu melisiskan sel untuk mengekstrak protein. Dalam percobaan ini, kami memilih dua garis sel, MCF-7 (sel kanker payudara manusia) sebagai kelompok uji dan L02 (sel hati manusia normal) sebagai kelompok kontrol. Sel-sel dilisiskan untuk mengekstrak protein intraseluler. Protein total dikumpulkan kemudian kelinci anti-HSP27 dan anti-HSP27 tikus ditambahkan sesuai dengan konsentrasi protein, diikuti dengan inkubasi pada 37 °C selama 50 min. Kemudian N-PAMAM-IgG ditambahkan ke dalam campuran, campuran diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit, kemudian dibagi menjadi dua kelompok yang sama:kelompok uji dan kelompok PAMAM. Akhirnya, QDs-IgG ditambahkan ke kelompok uji dan diinkubasi pada 37 °C selama 30 menit dalam gelap. Gambar 4 menunjukkan analisis fluoresensi untuk dua kelompok sel dengan flow cytometry. Intensitas fluoresensi kurva uji jauh lebih tinggi daripada kurva PAMAM pada kelompok MCF-7, sedangkan pada kelompok L02, kedua kurva hampir tumpang tindih. Ketika HSP27 ada dalam ekstrak sel, N-PAMAM-IgG dan QDs-IgG secara tidak langsung akan mengikat bersama untuk membentuk kombinasi sandwich dengan adanya anti-HSP27 kelinci dan anti-HSP27 tikus. Jika HSP27 tidak ada, hanya sejumlah kecil QDs-IgG yang akan berikatan dengan N-PAMAM-IgG melalui adsorpsi nonspesifik. Oleh karena itu, jika intensitas fluoresensi kurva uji lebih tinggi daripada kurva PAMAM kontrol, HSP27 terkandung dalam sampel. Gambar 4 menunjukkan bahwa sel MCF-7 mengeluarkan lebih banyak protein HSP27 daripada sel L02.
Analisis fluoresensi HSP27 dengan flow cytometry. a sel L02. b sel MCF-7. Kelompok uji diinkubasi dengan N-PAMAM-IgG dan QDs-IgG, kelompok PAMAM sebagai kontrol, yang hanya diinkubasi dengan N-PAMAM-IgG untuk membentuk pseudocell untuk protein mikromolekul yang dideteksi oleh FCM. Ketika dua kurva hampir tumpang tindih, dapat ditentukan bahwa tidak ada HSP27 dalam sampel; oleh karena itu, apakah QDs-IgG ditambahkan atau tidak, intensitas fluoresensi tidak akan berubah
Seperti disebutkan di atas, kompleks ini dapat mendeteksi protein intraseluler yang disekresikan oleh FCM; pada prinsipnya, kompleks ini dapat diterapkan pada semua jenis antigen. Selanjutnya, kedua bagian dari kombinasi tersebut dapat digunakan secara terpisah. Jika antigen yang ingin kita deteksi terletak di dalam sel atau di permukaan sel, kita hanya bisa menggunakan bagian QDs. Misalnya, -aktin adalah salah satu komponen utama sitoskeleton yang terletak di dalam sel dan banyak terdapat di sel eukariotik. Gambar 5a menunjukkan analisis fluoresensi hanya menggunakan bagian QD untuk -aktin dalam sel HeLa oleh FCM. Sel HeLa dicuci dan diperlakukan dengan metanol untuk meningkatkan penetrasi membran sel dan kemudian dibagi menjadi dua kelompok yang sama. Kelompok -aktin diinkubasi dengan anti-β-aktin tikus pada suhu 37 °C selama 30 menit, dan kelompok kontrol diinkubasi dengan BSA. Setelah dicuci dengan PBS, kedua kelompok diinkubasi dengan QDs-IgG (anti-tikus kambing) pada suhu 37 °C selama 30 menit. Setelah dicuci dengan PBS dua kali, kedua kelompok dideteksi oleh FCM. Intensitas fluoresensi kurva -aktin jauh lebih tinggi daripada kurva kontrol, yang menunjukkan bahwa sel HeLa mengandung protein -aktin.
a Analisis fluoresensi untuk -aktin dalam sel HeLa. Kelompok -aktin diinkubasi dengan anti-β-aktin tikus dan QDs-IgG (anti-tikus kambing), dan kelompok kontrol diinkubasi dengan BSA dan QDs-IgG. Kelompok kontrol dapat memungkinkan untuk mengesampingkan fluoresensi latar belakang yang disebabkan oleh adsorpsi QDs-IgG yang tidak spesifik. b Gambar mikroskop fluoresensi sel HeLa di bawah iradiasi UV-vis. DAPI menodai inti sel dan memancarkan fluoresensi biru; QDs-IgG secara tidak langsung dikombinasikan dengan -aktin dan memancarkan fluoresensi merah. Bilah skala 20 μm
Selain itu, kompleks ini juga dapat diterapkan pada ICC. Namun, untuk ICC, antigen target harus berada di dalam sel atau di permukaan sel dan ada dalam jumlah besar [19]; jika tidak, target eksperimen akan sulit dibedakan dari latar belakang. Kami mengambil protein -aktin misalnya dan menyemai sel HeLa dalam pelat sel 10 cm dan menempatkan kaca penutup mikroskop di dalamnya, menggunakan metanol untuk melumpuhkan sel. Sel-sel tersebut kemudian diinkubasi dengan anti-β-aktin tikus (PBS, 1% BSA) pada suhu 37 °C selama 1 jam, dicuci dua kali dengan PBST, dan diinkubasi dengan QDs-IgG (anti-tikus kambing) pada suhu 37 °C di gelap selama 1 jam. Setelah dicuci dua kali dengan PBST dan pewarnaan inti sel dengan DAPI, fluoresensi dideteksi dengan mikroskop fluoresensi [20, 21]. Gambar 5b menunjukkan gambar mikroskop fluoresensi sel HeLa. Keuntungan QD sebagai pewarna fluoresen adalah bahwa sinyal QD dan sinyal DAPI dapat diamati secara bersamaan di bawah penyinaran saluran ultraviolet; oleh karena itu, menurut nukleus, target dapat ditemukan dengan jelas. Dalam percobaan ini, -aktin adalah protein sitoskeleton di sekitar inti sel dan dapat diamati dengan jelas.
Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, kami mendemonstrasikan penerapan kompleks yang digunakan dalam uji imun klinis, seperti FCM dan ICC. Kelompok kompleks termasuk IgG anti-kelinci kambing terkonjugasi PAMAM dan IgG anti-tikus kambing terkonjugasi QDs. Ketika anti-antigen kelinci dan anti-antigen tikus ditambahkan, antigen yang sesuai terdeteksi. Kompleks ini menguntungkan karena spektrumnya yang luas, biokompatibilitas yang tinggi, stabilitas cahaya yang tinggi, dan toksisitas biologis yang rendah. Kompleks ini adalah model universal yang hanya membutuhkan antibodi primer yang sesuai untuk diubah. Pada artikel ini, kami menggunakan kompleks untuk mendeteksi HSP27 dan -aktin, tetapi secara teori, proses ini dapat diterapkan pada semua jenis antigen. Selanjutnya, kita dapat memilih metode deteksi sesuai dengan karakteristik antigen, dan kita juga dapat membagi kompleks dan menggunakannya secara individual sesuai dengan kebutuhan aktual. Metode ini juga memungkinkan molekul kecil, seperti protein kecil dan virus, dideteksi dengan flow cytometry. Kami yakin bahwa dengan peningkatan yang tepat, metode ini juga dapat diterapkan pada metode lain, seperti imunofluoresensi (IF), western blot (WB), dan strip imunokromatografi aliran lateral (LCS).
Metode/Eksperimental
Materi
Titik kuantum CdSe/ZnS (QD yang larut dalam air dengan gugus karboksil, no. cas N/A) dibeli dari NEPQD, Cina. PAMAM (amino generasi kelima diakhiri, Lot no. CYD-150A) dibeli dari CYD, Cina. IgG anti-kelinci kambing (ab6702) dan anti-β-aktin tikus (ab8226) dibeli dari Abcam, Inggris; anti-HSP27 tikus (BF0624) dan anti-HSP27 kelinci (AF6082) dibeli dari Affinity, AS; IgG anti-tikus kambing (bs0296G) dibeli dari Bioss, China; EDC dan sulfo-NHS dibeli dari Thermo Fisher; DMEM dan serum janin sapi dibeli dari Gibco; dan membran PVDF (0,2 μm) dibeli dari Millipore. Semua reagen kimia lainnya memiliki tingkat reagen analitis.
Persiapan N-PAMAM-IgG (anti-kelinci kambing)
a)
Persiapan N-PAMAM (PAMAM netral):PAMAM (G5 amino-terminated, rata-rata MW 28826) (60 mg, 2.081 mM) dilarutkan dalam DMSO (2 ml) dan suksinat anhidrida (dihydro-2,5-diketotetrahydrofuran) (0,266 g, 2.66 mM) ditambahkan untuk menetralkan gugus amino. Karena satu mol makromolekul G5 PAMAM memiliki 128 mol gugus amino, 60 mg PAMAM mengandung 0,266 mM gugus amino, dan rasio molar untuk gugus amino PAMAM dan anhidrida suksinat kira-kira 1:10. Kemudian, campuran dicampur dalam shaker bed pada 100 rpm selama 4 h, setelah itu larutan didialisis melalui membran dialisis 3500 MWCO selama 24h, dan N-PAMAM diperoleh setelah liofilisasi.
b)
Pembuatan N-PAMAM-IgG (antikelinci kambing):diformulasi buffer MES (100 mM, pH 6.0), kemudian dimasukkan 100 μl buffer MES ke dalam tabung, tambahkan 20 μM EDC, dan 20 μM sulfo-NHS kemudian diaduk menggunakan vortex dengan kecepatan rendah. Tambahkan 35,7 μl IgG (pH, 0,5 μM) dan agitasi dengan vortex, setelah itu tambahkan 19 μg N-PAMAM dan inkubasi pada suhu 4 °C selama semalam, akhirnya larutan akan didialisis melalui membran dialisis 3500MWCO dan 8000MWCO selama 3 hari, setelah liofilisasi, N-PAMAM-IgG akan diperoleh.
Persiapan QDs-IgG (anti-tikus kambing)
a)
Formulasi buffer BS:
1.
Siapkan buffer boraks (50 mM):timbang 19,07 g boraks dan larutkan dalam 1 L air ultra murni.
2.
Siapkan buffer asam borat (50 mM):timbang 3,09 g asam borat dan larutkan dalam 1 L air ultra murni.
3.
Buffer pH 8.0 BS dan buffer pH 7.2 BS disiapkan dengan mencampur dua larutan di atas.
4.
Buffer pencuci, juga digunakan sebagai buffer pengawet, dibuat dengan mengencerkan buffer pH 8.0 BS hingga konsentrasi 5 mM dan menambahkan 0,1% Tween 20.
5.
Larutan aktivasi dibuat dengan mengencerkan buffer pH 7.2 BS hingga konsentrasi 5 mM dan menambahkan 0,1% Tween 20.
6.
Buffer EDC dibuat dengan melarutkan 0,27 g EDC dalam 5 ml larutan aktivasi, dan buffer sulfo-NHS dibuat dengan melarutkan 0,27g sulfo-NHS dalam 5 ml larutan aktivasi.
b)
Persiapan QDs-IgG (anti-tikus kambing):
Pertama, 450 μl QDs (CdSe/ZnS, 5 mg/ml) dilarutkan dalam larutan aktivasi 2,25 ml, kemudian ditambahkan 150 μl buffer EDC dan 150 μl buffer sulfo-NHS, dan larutan disonikasi di atas es selama 5 l. menit Kedua, larutan disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit untuk menghilangkan supernatan, dan endapan dilarutkan dalam 1,2 ml buffer pencuci. Setelah 30 menit pencampuran ultrasonik, 100 μg antibodi IgG ditambahkan, kemudian larutan diinkubasi semalaman di shaker bed pada suhu 4 °C. Ketiga, 150 μl 10% BSA ditambahkan diikuti dengan inkubasi pada 30 C selama 30min dan sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 2 min untuk menghilangkan supernatan. Endapan dilarutkan kembali dalam 1 ml buffer pencuci kemudian disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 2 min, langkah ini diulangi dan akhirnya mengendapkan endapan dalam 1 ml buffer pengawet. Pada akhirnya, 10% BSA ditambahkan; campuran dicampur dengan pencampuran kejut ultrasonik penuh dan disentrifugasi pada 820 g/menit untuk menghilangkan endapan, dengan supernatan yang mengandung QDs-IgG. QDs-IgG harus disimpan pada suhu 4 °C dalam gelap selama 3 bulan. Perlu dicatat bahwa sampel hanya dapat disimpan pada suhu 4 °C, dan tidak dapat dibekukan bahkan dengan gliserin; jika tidak, akan menyebabkan sejumlah besar titik kuantum berkumpul menjadi kelompok, membentuk presipitasi yang tidak dapat disapu bersih dengan PBST, hal ini menyebabkan fluoresensi latar belakang yang serius.
Analisis FCM untuk Protein HSP27
HSP27 terletak di sitoplasma dan disekresikan dalam jumlah besar di sel tumor. Dalam percobaan ini, kami memilih dua garis sel, MCF-7 (sel kanker payudara manusia) sebagai kelompok uji dan L02 (sel hati manusia normal) sebagai kelompok kontrol. Kedua kelompok sel diunggulkan dalam cawan kultur 10 cm dan diinkubasi dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) dengan 10% serum janin sapi (FBS) pada 37 °C. Ketika sel menutupi 80% pelat, sel dicerna dengan tripsin dan dicuci dua kali dengan PBS. Kemudian, sel-sel disuspensikan kembali dalam 1 ml PBS. Menghitung sel dengan hemositometer, ditambahkan buffer lisis sel T-PER sesuai dengan konsentrasi sel, setelah itu protein intraseluler diekstraksi dari lisat sel. Kemudian lisat sel disentrifugasi pada 14000 rpm selama 10 min untuk mengumpulkan supernatan, dan konsentrasi protein diukur dengan metode BCA, sesuai dengan konsentrasi protein, kelinci anti-HSP27 dan anti-HSP27 tikus ditambahkan dan diinkubasi pada 37 °C selama 50 menit. Dalam percobaan ini, konsentrasi protein L02 adalah sekitar 0,2 mg/ml dan MCF-7 adalah 0,25 mg/ml, dan volume keduanya adalah 500 μl. Dua antibodi, kelinci anti-HSP27 dan anti-HSP27 tikus, ditambahkan ke sel (0,625 μl ke MCF-7 dan 0,5 μl ke sel L02).
Kemudian, 1 mg/ml N-PAMAM-IgG ditambahkan ke dalam campuran diikuti dengan inkubasi pada 37 °C selama 30 min; 6.25 μl ditambahkan ke grup MCF-7, dan 5 μl ditambahkan ke grup L02. Setelah inkubasi, produksi dibagi menjadi dua kelompok yang sama, kelompok uji dan kelompok PAMAM. Akhirnya, QDs-IgG ditambahkan ke kelompok uji, yang diinkubasi pada 37 °C selama 30 min dalam gelap. Kemudian, kedua kelompok sel tersebut dianalisis dengan flow cytometry.
Analisis FCM untuk Protein -aktin
-aktin merupakan protein intraseluler yang merupakan salah satu komponen utama sitoskeleton dan banyak terdapat pada sel eukariotik. Sel-sel HeLa diunggulkan dalam cawan kultur 10 cm dan diinkubasi dalam DMEM dengan 10% FBS pada 37 °C selama 2 hari, kemudian supernatan dibuang dan sel dicuci dua kali dengan PBS. Sel-sel dicerna dengan tripsin, setelah itu sel-sel disentrifugasi pada 800 rpm selama 3 min untuk menghilangkan supernatan, dan 1 ml metanol dingin ditambahkan untuk meresuspensi sel. Setelah 5 menit, sel disentrifugasi pada 800 rpm selama 3 menit untuk menghilangkan supernatan, dan sel disuspensi kembali dalam 1 ml PBS. Langkah ini diulang, dan sel HeLa dibagi menjadi dua kelompok yang sama. Kelompok uji diinkubasi dengan anti-β-aktin tikus pada suhu 37 °C selama 30 menit, dan kelompok kontrol diinkubasi dengan BSA (bovine serum albumin). Dalam percobaan ini, anti-β-aktin tikus dilarutkan dalam PBST (1% BSA, 5 μg/ml), dan 100 μl IgG ditambahkan ke 300 μl kelompok uji, dan jumlah BSA yang setara ditambahkan ke kelompok kontrol. Setelah setengah jam inkubasi, kedua kelompok diinkubasi dengan QDs-IgG (anti-tikus kambing) pada suhu 37 °C selama 30 menit. Setelah dicuci dua kali dengan PBS, kedua kelompok dinilai dengan FCM.
Analisis ICC untuk Protein -aktin
Sel HeLa diunggulkan dalam cawan kultur 10 cm dan diinkubasi dalam DMEM dengan 10% FBS pada 37 °C selama 1 hari. Kemudian, beberapa kaca penutup yang telah disterilkan ditempatkan ke dalam cawan sel, dan sel-sel dikultur lebih lanjut selama 2 hari. Kaca penutup dilepas dan dicuci dua kali dengan PBS, kemudian kaca penutup diinkubasi dalam 400 l metanol selama 20 menit pada suhu kamar. Coverslips dicuci 3 kali dengan PBS. Kemudian, buffer pemblokiran dibuat dengan PBST (0,1% Tween 20), 22,52 mg/ml glisin, dan 10% BSA. Sebuah kaca penutup ditempatkan ke dalam buffer pemblokiran dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Kemudian, buffer pemblokiran dihilangkan, dan kaca penutup diinkubasi dengan anti-β-aktin tikus (PBS, 1% BSA) pada suhu 37 °C selama 1 jam, dicuci dua kali dengan PBST, dan diinkubasi dengan QDs-IgG (anti-kambing). mouse) pada 37 °C selama 1 jam dalam gelap. Setelah dicuci dua kali dengan PBST dan pewarnaan inti sel dengan DAPI selama 2 menit, kaca penutup dibilas sekali dengan PBS dan sekali dengan air untuk visualisasi di bawah mikroskop fluoresensi.
