HDAC1-Mediated MicroRNA-124-5p Mengatur NPY untuk Mempengaruhi Kemampuan Belajar dan Memori pada Tikus dengan Depresi
Abstrak
Penelitian yang berfokus pada histone deacetylases (HDACs) dalam depresi telah dilakukan secara berlebihan, tetapi tidak banyak pada HDAC1. Di dalamnya, penelitian ini diluncurkan untuk mengungkapkan mekanisme sumbu HDAC1/microRNA (miR)-124-5p/neuropeptida Y (NPY) dalam depresi. Tikus Sprague Dawley dirangsang oleh stres ringan kronis yang tidak dapat diprediksi untuk membangun model depresi. Tikus yang tertekan disuntik dengan HDAC1 yang dihambat atau miR-124-5p yang ditekan untuk mengeksplorasi peran mereka dalam berat badan, kemampuan belajar dan memori, stres oksidatif dan peradangan dalam serum dan ekspresi neurotransmitter di jaringan hipokampus. Ekspresi MiR-124-5p, HDAC1 dan NPY di hipokampus diuji. Interaksi ekspresi miR-124-5p, HDAC1 dan NPY juga dikonfirmasi. miR-124-5p dan HDAC1 yang lebih tinggi dan tingkat ekspresi NPY yang lebih rendah ditemukan di hipokampus tikus yang mengalami depresi. Menghambat miR-124-5p atau HDAC1 yang ditekan melemahkan kemampuan belajar dan memori dan meningkatkan berat badan tikus yang depresi. Knockdown miR-124-5p atau penghambatan HDAC1 menekan stres oksidatif dan peradangan dan mempromosikan ekspresi neurotransmitter dari tikus yang tertekan. HDAC1 memediasi miR-124-5p untuk mengatur NPY. Knockdown NPY menghapuskan efek perlindungan dari miR-124-5p yang dihambat pada tikus yang depresi. Studi kami menggambarkan bahwa penekanan miR-124-5p atau HDAC1 mengatur NPY untuk meningkatkan memori dan kemampuan belajar pada tikus yang depresi, yang dapat memperbarui pengetahuan tentang depresi yang ada dan memberikan referensi baru untuk pengobatan depresi.
Pengantar
Depresi mengacu pada psikosis melumpuhkan parah yang menyebabkan beban ekonomi yang parah dan konsekuensi sosial secara global [1]. Depresi ditandai dengan perubahan fisiologis, kognitif dan perilaku yang mengancam kesehatan pasien secara keseluruhan [2]. Perawatan yang dapat diakses untuk depresi telah dikembangkan dengan penerapan ketamin sebagai antidepresan kerja cepat dan penyempurnaan peralatan yang mampu secara selektif melayani aktivitas populasi subtipe neuron [3]. Selain itu, nanoarsitektur serbaguna seperti titik karbon berlaku untuk gangguan neurologis [4]. Namun, pengobatan yang tidak memadai untuk depresi dapat mengakibatkan kinerja yang buruk, disfungsi perilaku, penyakit fisik, penyalahgunaan zat dan bahkan bunuh diri [5]. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk menemukan agen inovatif dalam pengobatan depresi.
Sebelumnya didokumentasikan bahwa tingkat microRNA (miR)-124 meningkat dalam plasma dengan depresi dan antidepresan [6]. Selama depresi yang diinduksi stres ringan kronis yang tidak dapat diprediksi (CUMS), ekspresi miR-124 di hipokampus menunjukkan variasi dinamis, yang menunjukkan berbagai perubahan patologis pada berbagai tahap depresi [7]. Selain itu, miR-124 adalah kandidat untuk memperbaiki perilaku seperti depresi pada gangguan depresi mayor [8]. Juga, supresi miR-124 berfungsi sebagai antidepresan di korteks prefrontal, sebagaimana tercermin dari perilaku seperti depresi yang dilemahkan pada tikus [9]. Histone deacetylase 1 (HDAC1) adalah mediator miR-124 [10] yang membentuk kompleks multi-protein untuk regulasi transkripsi dan modifikasi epigenetik [11]. Sepengetahuan kami, penurunan aktivitas HDAC1 meningkatkan ketahanan pada gangguan depresi mayor [12]. Selain itu, penekanan HDAC1 di otak dapat meningkatkan gangguan mood dan penyakit otak yang diubah secara neuroplastik lainnya [13]. Inhibitor HDAC dapat melemahkan perilaku seperti kecemasan dan perilaku minum alkohol, dan dapat meningkatkan ekspresi neuropeptida Y (NPY) [14]. Selain itu, gangguan aktivitas HDAC dapat menyebabkan peningkatan ekspresi NPY di nukleus pusat amigdala dan nukleus medial amigdala [15]. NPY adalah neuropeptida orexigenic hipotalamus yang cukup untuk mencegah kecemasan, gangguan sosial dan gejala depresi [16]. Selain itu, NPY dan reseptornya telah terbukti memberikan efek anti-inflamasi dan antidepresan pada model tikus depresi yang diinduksi lipopolisakarida [17]. Secara bersama-sama, interaksi gabungan sumbu HDAC1/miR-124-5p/NPY dalam depresi berada dalam ambiguitas. Dengan demikian, penelitian ini bermaksud untuk menggali mekanisme sumbu ini untuk menyelidiki kandidat kuratif untuk terapi depresi.
Bahan dan Metode
Pernyataan Etika
Hewan percobaan yang terlibat dalam penelitian ini mematuhi persyaratan etika hewan percobaan dari Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Kedokteran Harbin. Eksperimen dioptimalkan untuk meningkatkan kondisi pemberian makan hewan percobaan, mengurangi jumlah hewan yang digunakan, dan meringankan penderitaan hewan.
Hewan Eksperimen
Tikus jantan Sprague–Dawley (SD) dengan tingkat bebas patogen spesifik (SPF), dengan berat 200–220 g, disediakan oleh Pusat Penelitian Hewan, Rumah Sakit Afiliasi Pertama Universitas Kedokteran Harbin (Harbin, Cina). Tikus-tikus itu disimpan di lingkungan tingkat SPF (22-24 ° C, kelembaban 60-64%, siklus terang dan gelap 12 jam). Kecuali periode selama pemodelan dan titik waktu tertentu lainnya, tikus bebas mendapatkan air dan makanan.
Pengelompokan tikus dan Pembentukan Model
Tikus yang dimodelkan secara acak dibagi menjadi 8 kelompok (n = 10):kelompok normal (tikus tanpa pengobatan apa pun), kelompok CUMS (tikus depresi yang diinduksi CUMS), kelompok kontrol negatif-sh (NC) (tikus depresi yang diinduksi CUMS yang disuntik dengan sh-HDAC1 lentivirus NC), kelompok sh-HDAC1 (Tikus depresi yang diinduksi CUMS yang disuntik dengan sh-HDAC1 lentivirus), kelompok anti-miR-NC (tikus depresi yang diinduksi CUMS yang disuntik dengan anti-miR-124-5p lentivirus NC), kelompok anti-miR-124-5p (CUMS- tikus depresi yang diinduksi yang disuntik dengan anti-miR-124-5p lentivirus), kelompok anti-miR-124-5p + sh-NC (tikus depresi yang diinduksi CUMS yang disuntik dengan anti-miR-124-5p lentivirus dan sh-NPY lentivirus NC) , dan kelompok anti-miR-124-5p + sh-NPY (tikus depresi yang diinduksi CUMS yang disuntik dengan anti-miR-124-5p lentivirus dan sh-NPY lentivirus).
Model tikus depresi yang diinduksi CUMS dibuat dengan metode Willner [18]. Tikus-tikus pada kelompok normal diberi makan dan minum tanpa stimulus apapun, sedangkan tikus pada 7 kelompok lainnya diberikan CUMS selama 35 hari di kandang mandiri. Tikus-tikus ini distimulasi dengan berenang di air es pada suhu 4 °C selama 5 menit dalam wadah (kedalaman air 30 cm), pembalikan siang dan malam (tikus tinggal di tempat gelap selama 12 jam pada siang hari dan di ruang terang yang diterangi oleh cahaya matahari). lampu pijar selama 12 jam pada malam hari), penjepitan ekor dengan penjepit ekor burung walet selama 30 detik, gemetar 1 menit, puasa 24 jam dan kekurangan air, stimulasi ultrasonik 30 menit (50 Hz), bantalan basah, dan AC pada 17. Tikus dirangsang secara acak oleh salah satu rangsangan ini setiap hari, dan rangsangan yang sama diterapkan tidak lebih dari 5 kali secara total.
Tikus dibius dengan natrium pentobarbital 2% (50 mg/kg) dan hippocampus bilateral (diameter anteroposterior = 4,8 mm, jarak mediolateral = ± 2,5 mm, jarak antara rongga belakang dan ubun-ubun anterior = − 3,5 mm) disuntik dengan lentivirus pada 1 L/mnt dengan jarum suntik mikro Hamilton dengan jarum 26-G. Jarum disimpan di tempat suntikan selama 5 menit untuk mencegah refluks. Tengkorak disegel dengan lilin tulang dan sayatan dijahit, dan tikus dipulihkan selama 7 hari [19]. sh-HDAC1 lentivirus dan NC-nya, anti-miR-124-5p lentivirus dan NC-nya, serta sh-NPY dan NC-nya (titer:10
8
TU/mL) dibeli dari GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).
Tes Fungsi Perilaku
Tikus ditimbang sehari sebelum pemodelan CUMS (hari ke-0), setelah pemodelan CUMS (hari ke-36), dan setelah interferensi lentivirus (hari ke-52).
Uji lapangan terbuka (OFT) dapat mendeteksi perilaku otonom dan eksplorasi tikus di lingkungan baru, yang biasanya digunakan untuk mengevaluasi perilaku depresi. Pengujian ini dilakukan dalam kotak kayu hitam lapangan terbuka (100 cm × 100 cm × 50 cm) dengan sistem pelacakan video yang ditempatkan di atas kotak lapangan terbuka untuk merekam aktivitas tikus. Bagian bawah kotak yang terbuka dibagi menjadi 25 kisi (20 cm × 20 cm) dengan garis putih. Tikus ditempatkan di kotak pusat dalam urutan acak yang telah ditentukan sebelumnya dan jumlah melintasi kotak (tikus memasuki kotak dengan anggota badan atau kaki depan ganda dengan satu tungkai belakang) dan insiden pemeliharaan (tikus mengangkat kaki depan dan berdiri tegak dengan satu kaki depan). tungkai belakang) direkam oleh sistem pelacakan video. Pengujian ini dilakukan di lingkungan dalam ruangan yang tenang dan redup. Setelah setiap pengujian, kotak lapangan terbuka dibersihkan dengan alkohol 75% untuk menghilangkan bau.
Anhedonia adalah salah satu gejala penting dari depresi. Tes preferensi sukrosa (SPT) dapat mengevaluasi perilaku tikus yang mirip depresi. Sebelum SPT, setiap tikus diberi 2 botol air gula (1% sukrosa, b/b) selama 24 jam, dan dengan 1 botol air steril dan 1 botol air gula selama 24 jam. Setelah itu, persentase preferensi sukrosa (SPP) tikus terdeteksi sebagai berikut:setelah 23 jam puasa dan deprivasi air, tikus dibiarkan 1 botol air steril dan 1 botol air gula (1% sukrosa) selama 30 menit. Setelah 1 jam, lokasi kedua botol dibalik dan tikus bebas menggunakan kedua botol ini selama 30 menit. Selama 1 jam ini, konsumsi (mL) dari dua botol air steril dan air gula (1% sukrosa) diukur dan SPP dihitung. SPP = konsumsi air gula/(konsumsi air gula + konsumsi air steril) × 100%.
Tes labirin air Morris (MWM) diterapkan secara luas untuk mengevaluasi pembelajaran spasial dan kemampuan memori tikus. Pengujian MWM dilakukan dalam tangki air berbentuk lingkaran (diameter 150 cm dan tinggi 60 cm) dengan kedalaman air 40 cm. Suhu air dipertahankan pada 22 ± 1 °C dan air diwarnai menjadi hitam dengan pewarna yang tidak beracun dan mudah dibersihkan. Tangki dan permukaan air dibagi menjadi 4 kuadran (kuadran SE, SW, NW dan NE) dengan masing-masing kuadran dihiasi dengan ikon yang sesuai dengan warna cerah dan bentuk khusus di dinding bagian dalam. Platform target adalah platform transparan melingkar (diameter 11 cm), terletak di tengah kuadran NE dan terbenam 1,5 cm di bawah permukaan air. Sistem pelacakan video dipasang di atas bagian tengah tangki untuk merekam kecepatan berenang, jalur, dan waktu yang dihabiskan tikus untuk masuk ke platform target dan berenang di kuadran. Tikus ditempatkan ke dalam air dari 4 kuadran secara acak dan mereka diizinkan untuk menjelajahi dan menaiki platform target dalam waktu 60 detik. Waktu yang dibutuhkan tikus untuk naik ke platform dicatat sebagai latensi pelarian. Jika tikus gagal naik ke platform target dalam 60 detik, mereka dipandu dan latensi pelarian dicatat sebagai 60 detik. Setelah setiap tes, tikus diizinkan untuk tetap berada di platform target selama 15 detik dan tikus dilatih 4 kali sehari selama 5 hari. Latensi escape terakhir adalah rata-rata latensi escape pada tanggal 3-5. Pada hari ke-6 uji MWM, dilakukan uji eksplorasi luar angkasa. Platform target dikeluarkan dari tangki air, dan tikus memasuki air dari kuadran SW. Waktu tikus berenang di kuadran NE dalam waktu 60 detik dicatat sebagai waktu eksplorasi ruang angkasa.
Garis waktu percobaan ini ditunjukkan pada Gambar. 1.
Kronologi penelitian ini
Koleksi Spesimen
Satu hari setelah tes MWM terakhir, tikus di-eutanasia dan disuntik secara intraperitoneal dengan natrium pentobarbital 2% (50 mg/kg). Rongga dada dibuka untuk mendapatkan darah jantung dengan jarum suntik, yang disentrifugasi 3 kali pada 3500 r/min selama 15 menit, dan supernatan disimpan pada 20 °C. Setelah pengambilan darah, kateter dimasukkan dari ventrikel kiri ke aorta, dan 500 mL salin normal diperfusi untuk membilas seluruh darah. Jaringan hipokampus dipisahkan dan ditempatkan dalam tabung sentrifus 1,5 mL, ditimbang dan disimpan pada suhu -80 °C. Bagian dari hippocampus difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 2 jam, didehidrasi dengan sukrosa gradien dan tertanam dalam parafin.
Deteksi Indeks Peradangan dan Terkait Stres Oksidatif
Serum dihangatkan kembali untuk mendeteksi konsentrasi superoxide dismutase (SOD), malondialchehyche (MDA), glutathione (GSH), interleukin(IL)-β, tumor necrosis factor-α (TNF-α), dan nitric oxide (NO). Kit untuk mendeteksi SOD, MDA dan GSH disediakan oleh Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China), sedangkan kit enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) untuk mendeteksi IL-β, TNF-α dan NO oleh NanJing JianCheng Bioengineering Institute ( Nanjing, Tiongkok).
Pewarnaan Hematoksilin–Eosin (HE)
Bagian parafin didewax, dihidrasi dengan etanol, dibilas dengan air suling dan diwarnai dengan larutan pewarnaan hematoxylin selama 20 menit. Setelah itu, bagian-bagian tersebut dibilas dengan air kran sampai bagian-bagian tersebut membiru. Kemudian, potongan ditempatkan dalam larutan asam klorida etanol 1% selama 10 detik, dibilas dengan air keran dan didehidrasi dengan etanol, yang diikuti dengan pewarnaan dalam eosin selama 2 menit, dehidrasi dengan alkohol konsentrasi tinggi dan permeabilisasi dalam xilena. Akhirnya, bagian-bagian itu disegel dan diamati di bawah mikroskop biologis.
Deteksi Ekspresi Neurotransmitter
Jaringan hipokampus ditimbang dan dihomogenisasi dengan ultrasound dalam saline normal (100 L/10 mg). Homogenat disimpan pada suhu 4 °C selama 30 menit, disentrifugasi pada 12.000 rpm (4 °C) selama 3 menit untuk mengumpulkan supernatan. Konsentrasi protein supernatan dideteksi dengan kit deteksi protein asam bicinchoninic (BCA) (CWBIO, Beijing, Cina) dan tingkat ekspresi norepinefrin (NE), serotonin (5-HT), dan dopamin (DA) dengan kit ELISA. Kit ELISA NE, 5-HT, dan DA disediakan oleh Liweiping Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China).
RNA diekstraksi dari jaringan hipokampus dengan kit ekstraksi RNA (Promega, Madison, WI, USA), dan konsentrasi serta kemurnian RNA dideteksi oleh spektrofotometer ultraviolet. Diikuti oleh instruksi kit transkripsi terbalik (DRR047S, Takara, Dalian, China), transkripsi balik RNA menjadi DNA komplementer (cDNA) dilakukan. mRNA ditranskripsikan secara terbalik menjadi cDNA oleh GoldScript one-step RT-PCR Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) sementara miRNA oleh Hairpin-it™ miRNA kit deteksi kuantitatif (GenePharma). Kit deteksi RT-qPCR (Promega) diterapkan untuk mendeteksi ekspresi HDAC1, miR-124-5p dan NPY dalam jaringan. U6 diindikasikan sebagai kontrol internal untuk miR-124-5p sedangkan -aktin untuk HDAC1 dan NPY. Primer PCR diperoleh dari Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) (Tabel 1). Ekspresi relatif gen target dihitung dengan 2
−△△
Metode Ct.
Analisis Western Blot
Jaringan hipokampus dipotong-potong di atas es dan dilisiskan oleh lisat uji radio-imunopresipitasi (Beijing Solarbio Science &Technology Co. Ltd., Beijing, China) untuk mengekstrak protein. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode BCA. Total protein (50 g) ditambahkan dengan 5 × sodium dodecyl sulfate (SDS) loading buffer pada 1:4 dan dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 5 menit. Kemudian, protein menjadi sasaran elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida, disedot ke membran dan diblokir dengan susu 5% selama 1 jam. Setelah itu, protein diperiksa dengan antibodi utama terhadap HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), NPY (1:800, NeoMakers, Fremont, California, USA) dan -aktin (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, UK) semalaman, dan diulang dengan antibodi sekunder berlabel peroksidase lobak. Membran dikembangkan dengan chemiluminescence yang ditingkatkan, dan kepadatan optik dihitung dengan perangkat lunak analisis abu-abu Quantity One. Ekspresi protein gen target dinyatakan sebagai rasio nilai keabuan terhadap nilai keabuan -aktin.
Uji Imunopresipitasi Kromatin (ChIP)
Uji ChIP dilakukan sesuai dengan instruksi kit EZ-ChIP (Millipore, Bedford, MA, USA). Sel HEK293T diinkubasi dengan formaldehida 1% selama 10 menit dan diakhiri dengan glisin. Kemudian, sel disentrifugasi pada 2000 rpm selama 5 menit, dan ditambahkan dengan SDS Lysis Buffer untuk ultrasonikasi. Disentrifugasi pada 10.000 g pada 4℃ selama 10 menit, sel (100 L) direaksikan dengan 900 L ChIP Dilution Buffer, 20 L 50 × PIC dan 60 L ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA pada 4℃ selama 1 jam, dan dibiarkan selama 10 menit. Endapan disentrifugasi pada 700 rpm selama 1 menit dengan 20 L sebagai masukan. Sebuah tabung ditambahkan dengan antibodi HDAC1 (1 L) dan antibodi imunoglobulin G dan tabung lainnya ditambahkan tanpa antibodi. Sampel dalam dua tabung diinkubasi semalaman, dielusi dan de-crosslinked. Setelah pengambilan DNA, sampel diuji dengan RT-qPCR.
Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda
Situs web bioinformatika (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) menganalisis situs pengikatan miR-124-5p dan NPY. Plasmid NPY-wild type (WT) dan NPY-mutant (MUT) dihasilkan oleh Huayueyang Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China). Dikombinasikan dengan mimik NC atau miR-124-5p mimik, plasmid ditransfusikan ke dalam sel HEK293T. Aktivitas luciferase sel ditentukan oleh kit deteksi luciferase (BioVision) dan luminometer Glomax20/20 (Promega).
Analisis Statistik
Perangkat lunak statistik SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) digunakan untuk analisis data. Hasilnya dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Perbandingan antara dua kelompok diuji dengan t tes. Perbandingan di antara beberapa kelompok dievaluasi dengan analisis varians satu arah (ANOVA), setelah itu perbandingan berpasangan dengan uji post hoc Tukey. P mewakili tes dua sisi dan P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Penghambatan Baik HDAC1 atau miR-124-5p Meningkatkan Berat Tikus yang Depresi
Tikus ditimbang 1 hari sebelum pemodelan CUMS (hari 0), 1 hari setelah penghentian pemodelan (hari 36), dan 7 hari setelah gangguan lentivirus (hari 52). Tidak ada perbedaan yang terdeteksi pada berat badan tikus di setiap kelompok sebelum pemodelan (semua P> 0,05). Setelah pemodelan, berat tikus menurun pada kelompok CUMS, kelompok sh-NC, kelompok sh-HDAC1, kelompok anti-miR-NC dan kelompok anti-miR-124-5p versus kelompok normal (semua P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang terlihat pada berat tikus pada kelompok CUMS, kelompok sh-NC, kelompok sh-HDAC1, kelompok anti-miR-NC dan kelompok anti-miR-124-5p (semua P> 0,05). Setelah gangguan, berat tikus menurun pada kelompok CUMS versus kelompok normal (semua P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang terlihat pada berat tikus pada kelompok CUMS, kelompok sh-NC, dan kelompok anti-miR-NC (semua P> 0,05). Berat tikus meningkat pada kelompok sh-HDAC1 dan kelompok anti-miR-124-5p relatif terhadap kelompok NC mereka (keduanya P < 0,05), menunjukkan bahwa penghambatan HDAC1 atau miR-124-5p meningkatkan berat tikus yang mengalami depresi (Gbr. 2a).
Penghambatan baik HDAC1 atau miR-124-5p meningkatkan berat badan dan meningkatkan kemampuan belajar dan memori tikus depresi. a Efek penghambatan dengan HDAC1 atau miR-124-5p pada berat badan tikus depresi; b SPP sebelum dan sesudah inhibisi dengan HDAC1 atau miR-124-5p; c Frekuensi melintasi gird di OFT sebelum dan sesudah penghambatan dengan HDAC1 atau miR-124-5p; d Insiden pembesaran di OFT sebelum dan sesudah inhibisi dengan HDAC1 atau miR-124-5p; e Melarikan diri dari latensi dalam uji MWM sebelum dan sesudah inhibisi dengan HDAC1 atau miR-124-5p; f Waktu eksplorasi ruang dalam uji MWM sebelum dan sesudah inhibisi dengan HDAC1 atau miR-124-5p; n = 10; sebuah P <0,05 dibandingkan dengan kelompok normal; b P <0,05 dibandingkan dengan kelompok sh-NC; c P <0,05 dibandingkan dengan kelompok anti-miR-NC. Perbandingan di antara beberapa kelompok dievaluasi dengan ANOVA satu arah, dan perbandingan berpasangan dengan uji post hoc Tukey
Penghambatan BAIK HDAC1 atau miR-124-5p Meningkatkan Kemampuan Belajar dan Memori pada Tikus yang Depresi
Uji SPT, OFT dan MWM diterapkan untuk mendeteksi SPP, frekuensi persilangan grid dan insiden pemeliharaan, serta latensi lepas dan waktu eksplorasi ruang angkasa. Dijelaskan bahwa (Gbr. 2b-f) sebelum gangguan, dibandingkan dengan kelompok normal, SPP, frekuensi melintasi grid, insiden pemeliharaan dan waktu eksplorasi ruang berkurang, sedangkan latensi pelepasan memanjang pada kelompok CUMS, sh-NC grup, grup sh-HDAC1, grup anti-miR-NC, dan grup anti-miR-124-5p (semua P < 0,05), menunjukkan perkembangan perilaku seperti depresi pada tikus. Tidak ada perbedaan pada SPP, frekuensi persilangan grid, kejadian pembesaran, waktu eksplorasi ruang dan latensi lepas antara kelompok CUMS, kelompok sh-NC, kelompok sh-HDAC1, kelompok anti-miR-NC dan anti-miR-124 Grup -5p (semua P> 0,05). Setelah interferensi, versus kelompok sh-NC dan kelompok anti-miR-NC, SPP, frekuensi melintasi grid, insiden pemeliharaan dan waktu eksplorasi ruang meningkat sementara latensi pelepasan dipersingkat pada kelompok sh-HDAC1 dan anti-miR-124- Grup 5p (semua P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang diamati pada SPP, frekuensi melintasi grid, insiden pemeliharaan, waktu eksplorasi ruang angkasa dan latensi lepas antara kelompok CUMS, kelompok sh-NC dan kelompok anti-miR-NC (semua P> 0.05), menunjukkan bahwa pembungkaman HDAC1 atau penekanan miR-124-5p dapat melemahkan perilaku seperti depresi dan meningkatkan kemampuan belajar dan memori pada tikus.
Penghambatan Baik HDAC1 atau miR-124-5p Melemahkan Kerusakan Neuron Patologis pada Tikus yang Depresi
Pengamatan lesi hipokampus dengan pewarnaan HE (Gbr. 3a) mengungkapkan bahwa neuron yang tersusun rapi di hipokampus tikus pada kelompok normal menunjukkan morfologi yang jelas, struktur normal, lapisan padat, inti sel yang jelas, dan nukleolus yang jelas. Neuron tikus pada kelompok CUMS menyusut, berkurang jumlahnya dan tersusun longgar dengan kromatin yang tidak merata dan lapisan yang menipis. Tikus pada kelompok sh-NC dan anti-miR-NC menunjukkan situasi yang sama dengan kelompok CUMS. Tikus dalam kelompok sh-HDAC1 dan anti-miR-124-5p menunjukkan peningkatan neuron secara berurutan dan mengurangi kerusakan dibandingkan dengan kelompok NC mereka. Diindikasikan bahwa knockdown HDAC1 atau penghambatan miR-124-5p mengurangi lesi hipokampus pada tikus yang mengalami depresi.
Penghambatan HDAC1 atau miR-124-5p melemahkan kerusakan hipokampus patologis dan meningkatkan ekspresi neurotransmitter pada tikus yang depresi. a Pewarnaan HE pada lesi hipokampus pada tikus yang mengalami depresi; b ELISA ekspresi NE dalam jaringan hipokampus; c ELISA ekspresi 5-HT di jaringan hipokampus; d ELISA ekspresi DA di jaringan hipokampus; n = 6; sebuah P <0,05 dibandingkan dengan kelompok normal; b P <0,05 dibandingkan dengan kelompok sh-NC; c P <0,05 dibandingkan dengan kelompok anti-miR-NC. Perbandingan di antara beberapa kelompok dievaluasi dengan ANOVA satu arah, dan perbandingan berpasangan dengan uji post hoc Tukey
Penghambatan HDAC1 atau miR-124-5p up-Mengatur Ekspresi Neurotransmitter pada Tikus yang Depresi
Depresi berhubungan dengan gangguan neurotransmiter otak. Oleh karena itu, kadar neurotransmiter DA, NE, dan 5-HT pada hipokampus tikus diukur dengan ELISA. Hasilnya menunjukkan bahwa (Gbr. 3b-d) dengan kelompok normal sebaliknya, penurunan kadar DA, NE dan 5-HT ditemukan pada tikus dari kelompok CUMS, kelompok sh-NC, kelompok sh-HDAC1, anti-miR Grup -NC dan grup anti-miR-124-5p (semua P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang terlihat pada ekspresi neurotransmitter pada kelompok CUMS, kelompok sh-NC dan kelompok anti-miR-NC (semua P> 0,05). Dibandingkan dengan kelompok sh-NC dan anti-miR-NC, tingkat DA, NE dan 5-HT meningkat pada tikus dari kelompok sh-HDAC1 dan anti-miR-124-5p (semua P < 0.05), menyiratkan bahwa down-regulasi HDAC1 atau pengurangan miR-124-5p dapat meningkatkan level DA, NE dan 5-HT di hipokampus tikus yang depresi.
Penghambatan HDAC1 atau miR-124-5p Menekan Stres Oksidatif dan Peradangan pada Tikus yang Depresi
Stres oksidatif dan ekspresi faktor inflamasi dalam serum diukur. Sehubungan dengan kelompok normal, aktivitas SOD dan GSH terganggu, sementara kadar MDA, IL-1β, TNF-α dan NO meningkat pada kelompok model depresi lainnya (semua P < 0,05). Aktivitas SOD dan GSH, dan kadar MDA, IL-1β, TNF-α dan NO antara kelompok CUMS, kelompok sh-NC dan kelompok anti-miR-NC tidak menunjukkan perbedaan (semua P> 0,05). Sehubungan dengan kelompok sh-NC dan kelompok anti-miR-NC, peningkatan terlihat pada aktivitas SOD dan GSH dan penurunan diamati pada kadar MDA, IL-1β, TNF-α, dan NO pada sh- Grup HDAC1 dan grup anti-miR-124-5p (semua P < 0,05) (Gbr. 4a-f), menunjukkan bahwa penipisan HDAC1 atau penurunan regulasi miR-124-5p dapat mengurangi stres oksidatif dan peradangan pada tikus yang mengalami depresi.
Penghambatan HDAC1 atau miR-124-5p menekan stres oksidatif dan peradangan pada tikus yang depresi. a –c Pengaruh penghambatan baik HDAC1 atau miR-124-5p pada konsentrasi SOD, MDA dan GSH dalam serum tikus yang mengalami depresi; d –f Pengaruh penghambatan baik HDAC1 atau miR-124-5p pada konsentrasi IL-1β, TNF-α, dan NO dalam serum tikus yang mengalami depresi; n = 10; sebuah P <0,05 dibandingkan dengan kelompok normal; b P <0,05 dibandingkan dengan kelompok sh-NC; c P <0,05 dibandingkan dengan kelompok anti-miR-NC. Perbandingan di antara beberapa kelompok dievaluasi dengan ANOVA satu arah, dan perbandingan berpasangan dengan uji post hoc Tukey
HDAC1 Memediasi miR-124-5p untuk Mengatur NPY
RT-qPCR dan analisis western blot diadopsi untuk mendeteksi HDAC1, miR-124-5p dan NPY di hippocampus. Dijelaskan bahwa (Gbr. 5a, b) dibandingkan kelompok normal, HDAC1 dan miR-124-5p meningkat dan NPY menurun pada kelompok CUMS (semua P < 0,05). Ekspresi HDAC1, miR-124-5p, dan NPY tidak menunjukkan variasi pada grup CUMS dan grup sh-NC (semua P> 0,05). Dibandingkan dengan grup sh-NC, grup sh-HDAC1 dicerminkan oleh penurunan HDAC1 dan miR-124-5p dan peningkatan level ekspresi NPY (semua P < 0,05). Temuan di atas menunjukkan interferensi lentivirus yang berhasil dan hubungan positif antara miR-124-5p dan ekspresi HDAC1.
HDAC1 memediasi miR-124-5p untuk mengatur NPY. a Ekspresi HDAC1, miR-124-5p dan NPY mRNA dalam jaringan hipokampus setelah penghambatan HDAC1 oleh RT-qPCR (n = 6); b Ekspresi protein HDAC1 dan NPY dalam jaringan hipokampus setelah penghambatan HDAC1 dengan analisis western blot (n = 6); c Ekspresi mRNA MiR-124-5p dan NPY dalam jaringan hipokampus setelah penghambatan miR-124-5p oleh RT-qPCR (n = 6); d Ekspresi protein NPY dalam jaringan hipokampus setelah penghambatan miR-124-5p dengan analisis western blot (n = 6); sebuah P <0,05 dibandingkan dengan kelompok normal; c P <0,05 dibandingkan dengan kelompok sh-NC. Perbandingan di antara beberapa kelompok dievaluasi dengan ANOVA satu arah, dan perbandingan berpasangan dengan uji post hoc Tukey
Juga, ekspresi miR-124-5p dan NPY setelah penekanan miR-124-5p terdeteksi dengan hasil (Gbr. 5c, d) yang menunjukkan bahwa dalam kaitannya dengan kelompok normal, peningkatan miR-124-5p dan penurunan NPY disajikan dalam grup CUMS (keduanya P < 0,05). Sebaliknya, kelompok anti-miR-124-5p cenderung mengalami penurunan miR-124-5p dan peningkatan NPY dalam kaitannya dengan kelompok anti-miR-NC (keduanya P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang dikenali pada ekspresi miR-124-5p dan NPY pada grup CUMS dan grup anti-miR-NC (keduanya P> 0,05). Hasilnya menunjukkan interferensi lentivirus yang berhasil dan hubungan negatif antara NPY dan miR-124-5p.
Uji ChIP adalah untuk menguji apakah HDAC1 dapat mengikat promotor miR-124-5p, dan hasilnya menggambarkan bahwa (Gbr. 6a, b) HDAD1 hanya terkait dengan promotor miR-124-5p (P < 0.001), menunjukkan bahwa HDAC1 dapat mengatur miR-124-5p secara langsung.
HDAC1 mengikat promotor miR-124-5p. a Kelimpahan pengikatan wilayah promotor HDAC1 dan miR-124-5p dalam sel HEK293T dengan uji ChIP (n = 3); b Kelimpahan mengikat HDAC1 dan daerah intergenik yang tidak terkait dalam sel HEK293T dengan uji ChIP (n = 3); c Situs pengikatan MiR-124-5p dan NPY oleh situs web perangkat lunak informasi biologis; d Hubungan penargetan antara miR-124-5p dan NPY dengan uji gen reporter luciferase ganda (n = 3); Perbandingan antara dua kelompok diuji dengan t tes
Hubungan penargetan antara miR-124-5p dan NPY diprediksi dan diverifikasi melalui alat RNA22 dan uji gen reporter luciferase ganda (Gbr. 6c, d). Sehubungan dengan ko-transfeksi sel dengan NPY-3′UTR-WT dan meniru NC, sel-sel dengan ko-transfeksi NPY-3′UTR-WT dan miR-124-5p mimik menunjukkan gangguan aktivitas luciferase (P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang dikenali dalam aktivitas luciferase dalam sel yang ditransfeksi bersama dengan NPY-3′UTR-MUT dan meniru NC, dan sel-sel yang ditransfeksi bersama dengan NPY-3′UTR-MUT dan miR-124-5p meniru (P> 0,05).
Knockdown of NPY Abolishes the Protective Effects of Inhibited miR-124-5p on Depressed Rats
Spontaneous depletion of NPY and miR-124-5p was programmed to explore their interplay in depressed rats. It was exhibited that (Fig. 7a, b) lower NPY expression level was noticed in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (P < 0,05). Body weight and behavioral function tests illustrated that (Fig. 7c–f) by comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group presented reduced weight, SPP, frequency of crossing the grid, incidence of rearing and space exploration time with increased escape latency (all P < 0,05). HE staining of the hippocampal lesions pictured that (Fig. 8a) in comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the number of hippocampal neurons was reduced, and hippocampal neurons were darkly stained, sparsely and disorderly arranged in an irregular shape with reduced cell layers in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group. Moreover, versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group was accompanied by reduced DA, NE and 5-HT (all P < 0.05) (Fig. 8b). Besides, impaired SOD and GSH activities, and increased MDA, IL-1β, TNF-α and NO levels existed in the rats of the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (all P < 0.05) (Fig. 8c, d). Collectively, knockdown of NPY abolished the protective effects of repressed miR-124-5p on depressed rat.
Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on body weight and behavioral function of depressed rats. a MiR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by RT-qPCR (n = 6); b NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by western blot analysis (n = 6); c Body weight of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); d SPP of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); e Frequency of crossing the grid and incidence of rearing after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); f Escape latency and space exploration time after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); Comparisons between two groups were tested by t tes
Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on hippocampal damages of depressed rats. a HE staining of hippocampal lesions of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); b ELISA of NE, 5-HT and DA expression in hippocampal tissues of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); C. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on SOD, MDA and GSH concentration in serum (n = 10); D. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on IL-1β, TNF-α and NO concentration in serum (n = 10). Comparisons between two groups were tested by t tes
Discussion
Depression is a type of psychiatric disorder comprising a variety of conditions with diverse symptoms [20]. Though emerging studies have implied the role of miRNAs in depression, the precise action of miR-124-5p has been rarely investigated. Hence, the present study is projected for better comprehension of the mechanism of miR-124-5p/HDAC1/NPY axis in depression with the major outcome elaborating that silencing of either HDAC1 or miR-124-5p up-regulated NPY to improve memory and learning abilities of depressed rats.
To begin with, this study discovered HDAC1 expression in hippocampal tissues with the findings suggesting the elevation in the HDAC1 expression. Subsequently, with the purpose to decipher the functional roles of HDAC1 in depressed rats, loss-of-function assays were performed and it was disclosed that knockdown of HDAC1 increased the body weight, improved learning and memory abilities, attenuated pathological damage, up-regulated neurotransmitter expression, and suppressed oxidative stress and inflammation in depressed rats. Currently, a study has implied an increment in the expression of HDAC1 in depressive-like and anxiety-like phenotypes resulted by stress-offspring [21]. Moreover, the expression of HDAC1 is documented to up-regulate in penumbra in photothrombotic stroke [22]. Besides that, the incremental HDAC1 mRNA expression is found in granule and pyramidal cells in temporal lobe epilepsy [23]. As to the functional role of HDAC1, it has been reported that virus-mediated overexpression of neuronal HDAC1 in the hippocampus of mice imposes influences on loss of contextual fear memory in particular [24]. Mechanically, HDAC inhibitors reverse cognitive deficits found in neurodegenerative diseases and age-related memory loss [25]. Actually, it is accepted that the HDAC1 suppression by tianeptinaline has advanced neuroplasticity and reinforced memory [26]. As mentioned in a prior study, it is concluded that repression of HDAC1 inhibits the pathogenic processes that lead to motor neuron degeneration in mitochondrial diseases [27]. Experimentally, the silencing of HDAC1 by 5-thienyl-substituted 2-aminobenzamide-type is partially involved in the prevention of neuronal cell death in Parkinson's disease models [28]. Further supported by those researches, the protective effects of silenced HDAC1 have been witnessed in brain diseases, including but not limited to depression.
Then, our study discovered a targeting relationship between HDAC1 and miR-124-5p, which was supported by a prior study which suggests miR-124 transcription is in the charge of EVI1, acting by connection with the deacetylase HDAC1 [29]. miR-124-5p was the overexpressed gene in depressed rats and knockdown of miR-124-5p had the similar functions of silenced HDAC1 in depressed rats. In fact, there is a study indicating that the expression of miR-124 in the hippocampus is up-regulated from 5 to 6 weeks in depression-like behavior phenotypes [7]. Another study has identified the increase in the miR-124 expression in female with cocaine use disorder [30]. Also, it is previously described that miR-124-3p is highly expressed in stressed rodents in major depressive disorder [31]. Regarding to the effects, knockdown of miR-124 in the prefrontal cortex is reported to attenuate depression-like behavior of mice [9]. Besides that, miR-124 knockdown is believed to serve as an antidepressant agent of chronic corticosterone-induced gypenosides in mice [32]. Drawn from a prior study, knockdown of miR-124 can result in improved behavioral susceptibility to a milder stress paradigm [33]. It is reported that suppression of miR-124 by lentivirus transfection in the hippocampus can protect ketamine-induced neurodegeneration in vivo and in vitro [34]. Anyway, miR-124-5p suppression is an active actor to attenuate depression.
Furthermore, NPY expression was verified to be regulated by HDAC1 and miR-124-5p. The deteriorated deficits associated with HDAC2 in histone acetylation may be related to the decreased expression of NPY and can used to control anxiety-like and drinking behaviors [14]. NPY was down-regulated in depressed rats and up-regulation of NPY promoted learning and memory ability recovery in depressed rats. In the development of depressive-like behaviors, the rat models are manifested with reduced NPY expression [17]. Academically, the expression of NPY is evidenced to decline in mice with depression [35]. Consistently, the above-mentioned study findings are as same as the previous literature to some extent.
The novel findings of study suggested that inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities and increased body weight of depressed rats. In addition, knockdown of miR-124-5p or inhibition of HDAC1 suppressed oxidative stress and inflammation and promoted neurotransmitter expression of depressed rats. Moreover, HDAC1 mediated miR-124-5p to regulate NPY. In the rescue experiments, knockdown of NPY abolished the protective effects of inhibited miR-124-5p on depressed rats.
Conclusion
In summary, this study highlighted the effect of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression with the major findings suggesting inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities, increased body weight, suppressed oxidative stress and inflammation, as well as promoted neurotransmitter expression in depressed rats. HDAC1/miR-124-5p/NPY axis may provide a reference to treat neurological disorder, which may also update the existed knowledge of depression. However, further studies are still required for thorough comprehension of the complex mechanism of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression.
