HDAC1 Mengatur miR-124-5p dan NPY untuk Memodulasi Pembelajaran dan Memori pada Model Tikus Depresi

Abstrak

Penelitian yang berpusat pada deasetilase histon (HDAC) dalam depresi telah terlalu banyak dilakukan, tetapi belum banyak mengenai HDAC1. Oleh karena itu, studi ini diluncurkan untuk mengungkap mekanisme asa HDAC1/microRNA (miR)-124-5p/neuropeptida Y (NPY) dalam depresi. Tikus Sprague Dawley dipicu oleh stres ringan tak terduga kronis untuk membentuk model depresi. Tikus depresi diuntaskan dengan HDAC1 yang dihindari atau miR-124-5p yang ditekan untuk menjelajahi peran mereka terhadap berat badan, kemampuan pembelajaran dan memori, stres oksidatif dan inflamasi dalam serum, serta ekspresi neurotransmitter dalam jaringan hipokampus. Ekspresi miR-124-5p, HDAC1 dan NPY dalam hipokampus diuji. Interaksi ekspresi miR-124-5p, HDAC1 dan NPY juga dikonfirmasi. Tingkat ekspresi miR-124-5p dan HDAC1 yang lebih tinggi serta NPY yang lebih rendah ditemukan dalam hipokampus tikus depresi. Penahanan miR-124-5p atau penindasan HDAC1 mengurangi kemampuan pembelajaran dan memori serta meningkatkan berat badan tikus depresi. Penurunan miR-124-5p atau inhibisi HDAC1 menekan stres oksidatif dan inflamasi dan mempromosikan ekspresi neurotransmitter tikus depresi. HDAC1 memediasi miR-124-5p untuk mengatur NPY. Penurunan NPY menghilangkan efek pelindung dari penahanan miR-124-5p pada tikus depresi. Studi kami menggambarkan bahwa penindasan miR-124-5p atau HDAC1 meningkatkan NPY untuk meningkatkan memori dan kemampuan pembelajaran pada tikus depresi, yang mungkin memperbarui pengetahuan yang ada tentang depresi dan memberikan referensi baru untuk pengobatan depresi.

Pendahuluan

Depresi merujuk pada gangguan psikiatrik parah yang menyebabkan beban ekonomi dan konsekuensi sosial secara global [1]. Depresi ditandai oleh perubahan fisiologis, kognitif dan perilaku yang mengancam kesehatan keseluruhan pasien [2]. Perlakuan yang tersedia untuk depresi telah berkembang dengan aplikasi ketamin sebagai antidepressan yang bekerja cepat dan penyempurnaan peralatan yang mampu secara selektif menargetkan aktivitas populasi subtipe neuron [3]. Selain itu, nanoarsitektur serbaguna seperti titik karbon berlaku untuk gangguan neurologis [4]. Namun, perlakuan yang tidak memadai untuk depresi dapat menghasilkan kinerja buruk, disfungsi perilaku, penyakit fisik, penyalahgunaan zat dan bahkan bunuh diri [5]. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk menemukan agen inovatif dalam pengobatan depresi.

Dokumentasi sebelumnya menunjukkan bahwa tingkat microRNA (miR)-124 meningkat dalam plasma dengan depresi dan antidepressan [6]. Selama depresi yang diinduksi oleh stres ringan tak terduga kronis (CUMS), ekspresi miR-124 dalam hipokampus menunjukkan variasi dinamis, yang menunjukkan perubahan patologis yang berbeda pada berbagai tahap depresi [7]. Selain itu, miR-124 adalah kandidat untuk meredam perilaku seperti depresi dalam gangguan depresi mayor [8]. Juga, penindasan miR-124 berfungsi sebagai antidepressan dalam korteks prefrontal, seperti yang tercermin oleh penurunan perilaku seperti depresi pada tikus [9]. Deasetilase histon 1 (HDAC1) adalah mediat dari miR-124 [10] yang membentuk kompleks multi-protein untuk regulasi transkripsi dan modifikasi epigenetik [11]. Se pengetahuan kami, gangguan aktivitas HDAC1 mempromosikan ketahanan dalam gangguan depresi mayor [12]. Selain itu, penindasan HDAC1 dalam otak dapat memperbaiki gangguan mood dan penyakit otak lain yang diubah neuroplastis [13]. Inhibitor HDAC dapat meredam perilaku seperti kecemasan dan perilaku minum alkohol, dan dapat meningkatkan ekspresi neuropeptida Y (NPY) [14]. Juga, gangguan aktivitas HDAC dapat menyebabkan peningkatan ekspresi NPY dalam inti pusat amigdala dan inti medial amigdala [15]. NPY adalah neuropeptida oreksigenik hipotalamus yang cukup untuk mencegah kecemasan, gangguan sosial dan gejala depresi [16]. Selain itu, NPY dan reseptornya telah terbukti memberikan efek anti-inflamasi dan antidepressan pada model tikus depresi yang diinduksi oleh lipopolisakarida [17]. Bersama-sama, interaksi gabungan asa HDAC1/miR-124-5p/NPY dalam depresi masih ambigu. Oleh karena itu, studi ini bertujuan untuk mengungkap mekanisme asa ini untuk menyelidiki kandidat pengobatan untuk terapi depresi.

Bahan dan Metode

Pernyataan Etika

Eksperimen hewan dalam studi ini mengikuti persyaratan etika hewan eksperimental di Rumah Sakit Umum Pusat Universitas Medis Harbin. Eksperimen dioptimalkan untuk meningkatkan kondisi pemeliharaan hewan eksperimental, mengurangi jumlah hewan yang digunakan, dan mengurangi penderitaan hewan.

Hewan Eksperimental

Tikus jantan Sprague–Dawley (SD) grade bebas patogen spesifik (SPF), berat 200–220 g, disediakan oleh Pusat Penelitian Hewan, Rumah Sakit Umum Pusat Universitas Medis Harbin (Harbin, China). Tikus dipertahankan dalam lingkungan grade SPF (22–24 °C, kelembaban 60–64%, siklus cahaya dan gelap 12 jam). Selama periode pemodelan dan titik waktu spesifik lainnya, tikus bebas mendapatkan air dan makanan.

Pengelompokan Tikus dan Pembentukan Model

Tikus yang dimodel secara acak dibagi menjadi 8 grup (n = 10): grup normal (tikus tanpa perlakuan apa pun), grup CUMS (tikus depresi yang diinduksi CUMS), grup sh-kontrol negatif (NC) (tikus depresi yang diinduksi CUMS diuntaskan dengan lentivirus sh-HDAC1 NC), grup sh-HDAC1 (tikus depresi yang diinduksi CUMS diuntaskan dengan lentivirus sh-HDAC1), grup anti-miR-NC (tikus depresi yang diinduksi CUMS diuntaskan dengan lentivirus anti-miR-124-5p NC), grup anti-miR-124-5p (tikus depresi yang diinduksi CUMS diuntaskan dengan lentivirus anti-miR-124-5p), grup anti-miR-124-5p + sh-NC (tikus depresi yang diinduksi CUMS diuntaskan dengan lentivirus anti-miR-124-5p dan lentivirus sh-NPY NC), dan grup anti-miR-124-5p + sh-NPY (tikus depresi yang diinduksi CUMS diuntaskan dengan lentivirus anti-miR-124-5p dan lentivirus sh-NPY).

Model tikus depresi yang diinduksi CUMS dibentuk dengan metode Willner [18]. Tikus dalam grup normal diberi makanan dan air tanpa rangsangan apa pun sementara tikus dalam 7 grup lainnya menerima 35 hari CUMS dalam kandang terpisah. Tikus ini dipicu dengan berenang air es pada 4 °C selama 5 menit dalam wadah (kedalaman air 30 cm), inversi siang dan malam (tikus tinggal dalam gelap selama 12 jam siang hari dan dalam ruang terang yang diilumini lampu pijar selama 12 jam malam hari), penegakan ekor dengan klip ekor telur selama 30 detik, getungan 1 menit, puasa 24 jam dan kehabisan air, stimulasi ultrasonik 30 menit (50 Hz), bracing basah, dan pendingin udara pada 17℃. Tikus dipicu secara acak oleh salah satu rangsangan ini setiap hari, dan rangsangan yang sama diterapkan tidak lebih dari 5 kali secara keseluruhan.

Tikus dianestesi dengan natrium pentobarbital 2% (50 mg/kg) dan hipokampus bilateral (diameter anteroposterior = 4,8 mm, jarak mediolateral = ± 2,5 mm, jarak antara ruang belakang dan fontanel depan = − 3,5 mm) diuntaskan dengan lentivirus pada 1 μL/min oleh mikro-siring Hamilton dengan jarum 26-G. Jarum dijaga di lokasi untasan selama 5 menit untuk mencegah refluks. Tengkorak ditutupi dengan luluh tulang dan luka dijahit, dan tikus dipulihkan selama 7 hari [19]. Lentivirus sh-HDAC1 dan NC-nya, lentivirus anti-miR-124-5p dan NC-nya, serta sh-NPY dan NC-nya (titer: 10⁸ TU/mL) dibeli dari GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Uji Fungsi Perilaku

Tikus ditimbang pada hari sebelum pemodelan CUMS (hari ke-0), setelah pemodelan CUMS (hari ke-36), dan setelah interferensi lentivirus (hari ke-52).

Uji lapangan terbuka (OFT) dapat mendeteksi perilaku otonom dan eksploratif tikus dalam lingkungan baru, yang biasanya digunakan untuk mengevaluasi perilaku depresi. Uji ini dilakukan dalam kotak lapangan terbuka kayu hitam (100 cm × 100 cm × 50 cm) dengan sistem pelacakan video yang ditempatkan di atas kotak lapangan terbuka untuk merekam aktivitas tikus. Lantai kotak terbuka dibagi menjadi 25 grid (20 cm × 20 cm) dengan garis putih. Tikus ditempatkan dalam grid tengah dalam urutan acak yang telah ditentukan sebelumnya dan jumlah lintasan grid (tikus memasuki grid dengan anggota badan atau lengan depan ganda dengan satu kaki belakang) dan insidensi berdiri (tikus mengangkat lengan depan dan berdiri tegak dengan satu kaki belakang) dicatat oleh sistem pelacakan video. Uji ini dilakukan dalam lingkungan ruangan yang tenang dan redup. Setelah setiap uji, kotak lapangan terbuka dibersihkan dengan alkohol 75% untuk menghilangkan bau.

Anhedonia adalah salah satu gejala penting dari depresi. Uji preferensi sukrosa (SPT) dapat mengevaluasi perilaku seperti depresi tikus. Sebelum SPT, setiap tikus disediakan dengan 2 botol air gula (1% sukrosa, b/b) selama 24 jam, dan dengan 1 botol air steril dan 1 botol air gula selama 24 jam lainnya. Setelah itu, persentase preferensi sukrosa (SPP) tikus dideteksi sebagai berikut: setelah puasa 23 jam dan kehabisan air, tikus diizinkan dengan 1 botol air steril dan 1 botol air gula (1% sukrosa) selama 30 menit. Setelah 1 jam, lokasi kedua botol dibalik dan tikus bebas pada kedua botol untuk 30 menit lainnya. Selama 1 jam ini, konsumsi (mL) kedua botol air steril dan air gula (1% sukrosa) diukur dan SPP dihitung. SPP = konsumsi air gula/(konsumsi air gula + konsumsi air steril) × 100%.

Uji labirin air Morris (MWM) secara luas diterapkan untuk mengevaluasi kemampuan pembelajaran spasial dan memori tikus. Uji MWM dilakukan dalam tangki air lingkaran (diameter 150 cm dan tinggi 60 cm) dengan kedalaman air 40 cm. Suhu air dipertahankan pada 22 ± 1 °C dan air diwarnai hitam dengan pewarna non-toksik dan mudah dibersihkan. Tangki dan permukaan air dibagi menjadi 4 kuadran (kuadran SE, SW, NW dan NE) dengan setiap kuadran dihiasi dengan ikon yang sesuai dengan warna cerah dan bentuk khusus pada dinding dalam. Platform target adalah platform transparan lingkaran (diameter 11 cm), terletak di pusat kuadran NE dan direndam 1,5 cm di bawah permukaan air. Sistem pelacakan video diinstal di atas pusat tangki untuk mencatat kecepatan berenang, jalur, dan waktu yang dihabiskan tikus untuk memasuki platform target dan berenang di kuadran. Tikus ditempatkan ke dalam air dari 4 kuadran dalam urutan acak dan mereka diizinkan untuk menjelajahi dan naik ke platform target dalam 60 detik. Waktu yang dihabiskan tikus untuk naik ke platform dicatat sebagai latensi pelarian. Jika tikus gagal naik ke platform target dalam 60 detik, mereka dibimbing dan latensi pelarian dicatat sebagai 60 detik. Setelah setiap uji, tikus diizinkan untuk tinggal di platform target selama 15 detik dan tikus dilatih 4 kali sehari selama 5 hari. Latensi pelarian akhir adalah rata-rata latensi pelarian pada hari ke-3 hingga ke-5. Pada hari ke-6 uji MWM, uji eksplorasi spasial dilakukan. Platform target dihilangkan dari tangki air, dan tikus memasuki air dari kuadran SW. Waktu tikus berenang di kuadran NE dalam 60 detik dicatat sebagai waktu eksplorasi spasial.

Timeline eksperimen ini ditunjukkan dalam Gambar 1.

Pengumpulan Sampel

Satu hari setelah uji MWM terakhir, tikus diutanasi dan diuntaskan intraperitonealmente dengan natrium pentobarbital 2% (50 mg/kg). Ruang dada dibuka untuk mendapatkan darah jantung dengan siring, yang di-sentrifugasi 3 kali pada 3500 r/min selama 15 menit, dan supernatant disimpan pada − 20 °C. Setelah pengambilan darah, kateter dimasukkan dari ventrikel kiri ke aorta, dan 500 mL larutan garam normal difusikan untuk membuang seluruh darah. Jaringan hipokampus dipisahkan dan ditempatkan dalam tabung sentrifuga 1,5 mL, ditimbang dan disimpan pada − 80 °C. Sebagian hipokampus diperbaiki dengan paraformaldehida 4% selama 2 jam, dihidrasi dengan sukrosa gradien dan diembeded dalam parafin.

Deteksi Indeks Terkait Stres Oksidatif dan Inflamasi

Serum direhangkan untuk deteksi superoxide dismutase (SOD), malondialdehide (MDA), glutation (GSH), interleukin(IL)-β, faktor nekrosis tumor-α (TNF-α), dan konsentrasi oksida nitrik (NO). Kit untuk deteksi SOD, MDA dan GSH disediakan oleh Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China), sementara kit imunoensay terikat enzim (ELISA) untuk deteksi IL-β, TNF-α dan NO oleh NanJing JianCheng Bioengineering Institute (Nanjing, China).

Pewarnaan Hematoksin–Eosin (HE)

Seksi parafin dicairkan, dihidrasi dengan etanol, dicuci dengan air tisu dan diwarnai dengan larutan pewarnaan hematoksin selama 20 menit. Setelah itu, seksi dicuci dengan air ledak hingga seksi berwarna biru. Kemudian, seksi ditempatkan dalam larutan asam klorida etanol 1% selama 10 detik, dicuci dengan air ledak dan dihidrasi dengan etanol, diikuti dengan pewarnaan dalam eosin selama 2 menit, dehidrasi dengan alkohol konsentrasi tinggi dan permeabilisasi dalam xilena. Terakhir, seksi diikatkan dan diamati di bawah mikroskop biologis.

Deteksi Ekspresi Neurotransmitter

Jaringan hipokampus ditimbang dan homogenis dengan ultrasonik dalam larutan garam normal (100 μL/10 mg). Homogenat disimpan pada 4 °C selama 30 menit, di-sentrifugasi pada 12.000 rpm (4 °C) selama 3 menit untuk mengumpulkan supernatant. Konsentrasi protein supernatant dideteksi dengan kit deteksi protein asam biksoninik (BCA) (CWBIO, Beijing, China) dan tingkat ekspresi norepinefrin (NE), serotonin (5-HT), dan dopamin (DA) dengan kit ELISA. Kit ELISA NE, 5-HT dan DA disediakan oleh Liweiping Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China).

Transkripsi Terbalik Rantai Polimerase Kuantitatif (RT-qPCR)

RNA diekstraksi dari jaringan hipokampus dengan kit ekstraksi RNA (Promega, Madison, WI, USA), dan konsentrasi dan kemurnian RNA dideteksi dengan spektrofotometer ultravioleth. Mengikuti petunjuk kit transkripsi terbalik (DRR047S, Takara, Dalian, China), RNA ditranskripsi terbalik menjadi DNA komplementer (cDNA). mRNA ditranskripsi terbalik menjadi cDNA dengan Kit RT-PCR One-Step GoldScript (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) sementara miRNA dengan kit deteksi kuantitatif miRNA Hairpin-it™ (GenePharma). Kit deteksi RT-qPCR (Promega) diterapkan untuk mendeteksi ekspresi HDAC1, miR-124-5p dan NPY dalam jaringan. U6 ditunjukkan sebagai kontrol internal untuk miR-124-5p sementara β-aktin untuk HDAC1 dan NPY. Primer PCR diperoleh dari Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) (Tabel 1). Ekspresi relatif gen target dihitung dengan metode 2^−△△Ct.

Analis Western Blot

Jaringan hipokampus dipotong menjadi potongan pada es dan diurai dengan lisat pengujian imunopendapatan radio (Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd., Beijing, China) untuk mengekstrak protein. Konsentrasi protein ditentukan dengan metode BCA. Protein total (50 μg) ditambahkan dengan 5 × buffer pemuatan natrium dodeksil sulfat (SDS) pada 1:4 dan dipanaskan dalam mandi air mendidih selama 5 menit. Kemudian, protein dijalankan pada elektroforesis gel akrilamida natrium dodeksil sulfat poliamida, dialirkan elektro ke membran dan diblokir dengan 5% susu selama 1 jam. Setelah itu, protein diurai dengan antibodi primer terhadap HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), NPY (1:800, NeoMakers, Fremont, California, USA) dan β-aktin (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, UK) selama malam hari, dan diurai ulang dengan antibodi sekunder berlabel peroksidase peroksidase. Membran dikembangkan dengan kemiluminesensi yang ditingkatkan, dan kepadatan optik dihitung dengan perangkat lunak analisis abu-abu Quantity One. Ekspresi protein gen target diekspresikan sebagai rasio nilai abu-abu terhadap nilai abu-abu β-aktin.

Uji Imunopendapatan Kromatin (ChIP)

Uji ChIP dilakukan sesuai dengan petunjuk kit EZ-ChIP (Millipore, Bedford, MA, USA). Sel HEK293T diinkubasi dengan formaldehida 1% selama 10 menit dan diakhiri dengan glisin. Kemudian, sel di-sentrifugasi pada 2000 rpm selama 5 menit, dan ditambahkan dengan Buffer Lisis SDS untuk sonikasi. Di-sentrifugasi pada 10.000 g pada 4℃ selama 10 menit, sel (100 μL) bereaksi dengan 900 μL Buffer Pengenceran ChIP, 20 μL dari 50 × PIC dan 60 μL ProteinA Agarus/DNA Sperma Salmon pada 4℃ selama 1 jam, dan diizinkan untuk berdiri selama 10 menit. Hasil endapan di-sentrifugasi pada 700 rpm selama 1 menit dengan 20 μL sebagai input. Sebuah tabung ditambahkan dengan antibodi HDAC1 (1 μL) dan antibodi immunoglobulin G dan tabung lainnya ditambahkan tanpa antibodi. Sampel dalam kedua tabung diinkubasi selama malam hari, dielusi dan di-de-crosslinking. Setelah pengambilan DNA, sampel diuji dengan RT-qPCR.

Uji Gen Laporan Ganda Luciferase

Situs web bioinformatika (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) menganalisis situs pengikatan miR-124-5p dan NPY. Plasmid NPY-tipe liar (WT) dan NPY-mutan (MUT) dibuat oleh Huayueyang Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China). Digabungkan dengan mimic NC atau miR-124-5p mimic, plasmid ditransfeksi ke dalam sel HEK293T. Aktivitas luciferase sel ditentukan dengan kit deteksi luciferase (BioVision) dan luminometer Glomax20/20 (Promega).

Analisis Statistik

Perangkat lunak statistik SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) digunakan untuk analisis data. Hasil diekspresikan sebagai rata-rata ± deviasi standar. Perbandingan antara dua grup diuji dengan uji t. Perbandingan antar beberapa grup dievaluasi dengan analisis variansi satu arah (ANOVA), diikuti oleh perbandingan pasangan dengan uji pasca uji Tukey. P mewakili uji dua arah dan P < 0,05 dianggap memiliki signifikansi statistik.

Hasil

Penghambatan Entah HDAC1 atau miR-124-5p Meningkatkan Berat Badan Tikus Depresi

Tikus ditimbang 1 hari sebelum pemodelan CUMS (hari 0), 1 hari setelah pengakhiran pemodelan (hari 36), dan 7 hari setelah interferensi lentivirus (hari 52). Tidak ada perbedaan yang terdeteksi dalam berat badan tikus di setiap grup sebelum pemodelan (semua P > 0,05). Setelah pemodelan, berat tikus menurun dalam grup CUMS, grup sh-NC, grup sh-HDAC1, grup anti-miR-NC dan grup anti-miR-124-5p dibandingkan dengan grup normal (semua P < 0,05). Tidak ada ketidakcocokan yang diperhatikan mengenai berat tikus dalam grup CUMS, grup sh-NC, grup sh-HDAC1, grup anti-miR-NC dan grup anti-miR-124-5p (semua P > 0,05). Setelah interferensi, berat tikus menurun dalam grup CUMS dibandingkan dengan grup normal (semua P < 0,05). Tidak ada ketidakcocokan yang diperhatikan mengenai berat tikus dalam grup CUMS, grup sh-NC, dan grup anti-miR-NC (semua P > 0,05). Berat tikus meningkat dalam grup sh-HDAC1 dan grup anti-miR-124-5p relatif terhadap grup NC masing-masing (kedua P < 0,05), yang menunjukkan bahwa inhibisi HDAC1 atau miR-124-5p meningkatkan berat tikus depresi (Gambar 2a).

Penghambatan Entah HDAC1 atau miR-124-5p Meningkatkan Kemampuan Pembelajaran dan Memori pada Tikus Depresi

SPT, OFT dan uji MWM diterapkan untuk mendeteksi SPP, frekuensi lintasan grid dan insidensi berdiri, serta latensi pelarian dan waktu eksplorasi spasial. Garis besarnya (Gambar 2b–f) sebelum interferensi, dibandingkan dengan grup normal, SPP, frekuensi lintasan grid, insidensi berdiri dan waktu eksplorasi spasial berkurang, sedangkan latensi pelarian panjang dalam grup CUMS, grup sh-NC, grup sh-HDAC1, grup anti-miR-NC dan grup anti-miR-124-5p (semua P < 0,05), yang menunjukkan perkembangan perilaku seperti depresi pada tikus. Tidak ada ketidakcocokan dalam SPP, frekuensi lintasan grid, insidensi berdiri, waktu eksplorasi spasial dan latensi pelarian antara grup CUMS, grup sh-NC, grup sh-HDAC1, grup anti-miR-NC dan grup anti-miR-124-5p (semua P > 0,05). Setelah interferensi, dibandingkan dengan grup sh-NC dan grup anti-miR-NC, SPP, frekuensi lintasan grid, insidensi berdiri dan waktu eksplorasi spasial meningkat sedangkan latensi pelarian pendek dalam grup sh-HDAC1 dan grup anti-miR-124-5p (semua P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang diamati dalam SPP, frekuensi lintasan grid, insidensi berdiri, waktu eksplorasi spasial dan latensi pelarian antara grup CUMS, grup sh-NC dan grup anti-miR-NC (semua P > 0,05), yang menunjukkan bahwa penggenjotan HDAC1 atau penindasan miR-124-5p dapat meredam perilaku seperti depresi dan meningkatkan kemampuan pembelajaran dan memori pada tikus.

Penghambatan Entah HDAC1 atau miR-124-5p Meredam Kerusakan Neuron Patologis pada Tikus Depresi

Pengamatan lesi hipokampus dengan pewarnaan HE (Gambar 3a) menunjukkan bahwa neuron yang teratur di hipokampus tikus dalam grup normal memiliki morfologi yang jelas, struktur normal, lapisan padat, inti sel yang jelas dan nukleolus yang nyata. Neuron tikus dalam grup CUMS menyusut, berkurang jumlahnya dan longgar dengan cromatin yang tidak merata dan lapisan tipis. Tikus dalam grup sh-NC dan anti-miR-NC menunjukkan situasi yang sama dengan grup CUMS. Tikus dalam grup sh-HDAC1 dan anti-miR-124-5p menampilkan neuron yang lebih teratur dan kerusakan yang meredam dibandingkan dengan grup NC masing-masing. Ini menunjukkan bahwa penurunan HDAC1 atau inhibisi miR-124-5p meredam lesi hipokampus pada tikus depresi.

Penghambatan Entah HDAC1 atau miR-124-5p Menaikkan Ekspresi Neurotransmitter pada Tikus Depresi

Depresi terkait dengan gangguan neurotransmitter otak. Oleh karena itu, tingkat neurotransmitter DA, NE dan 5-HT dalam hipokampus tikus diukur dengan ELISA. Hasilnya menunjukkan bahwa (Gambar 3b–d) dibandingkan dengan grup normal, tingkat DA, NE dan 5-HT yang berkurang ditemukan pada tikus dari grup CUMS, grup sh-NC, grup sh-HDAC1, grup anti-miR-NC dan grup anti-miR-124-5p (semua P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang ditemukan dalam ekspresi neurotransmitter dalam grup CUMS, grup sh-NC dan grup anti-miR-NC (semua P > 0,05). Relatif terhadap grup sh-NC dan anti-miR-NC, tingkat DA, NE dan 5-HT meningkat pada tikus dari grup sh-HDAC1 dan anti-miR-124-5p (semua P < 0,05), yang menunjukkan bahwa penurunan regulasi HDAC1 atau pengurangan miR-124-5p dapat menaikkan tingkat DA, NE dan 5-HT dalam hipokampus tikus depresi.

Penghambatan Entah HDAC1 atau miR-124-5p Menekan Stres Oksidatif dan Inflamasi pada Tikus Depresi

Ekspresi faktor terkait stres oksidatif dan inflamasi dalam serum diukur. Dibandingkan dengan grup normal, aktivitas SOD dan GSH terganggu, sementara tingkat MDA, IL-1β, TNF-α dan NO meningkat dalam grup model depresi lainnya (semua P < 0,05). Aktivitas SOD dan GSH, serta tingkat MDA, IL-1β, TNF-α dan NO di antara grup CUMS, grup sh-NC dan grup anti-miR-NC tidak menunjukkan perbedaan (semua P > 0,05). Relatif terhadap grup sh-NC dan anti-miR-NC, peningkatan diperhatikan dalam aktivitas SOD dan GSH dan penurunan diperhatikan dalam tingkat MDA, IL-1β, TNF-α, dan NO dalam grup sh-HDAC1 dan anti-miR-124-5p (semua P < 0,05) (Gambar 4a–f), yang menunjukkan bahwa pengurasan HDAC1 atau penurunan regulasi miR-124-5p dapat meredam stres oksidatif dan inflamasi pada tikus depresi.

HDAC1 Memediasi miR-124-5p untuk Mengatur NPY

RT-qPCR dan analis western blot digunakan untuk mendeteksi HDAC1, miR-124-5p dan NPY dalam hipokampus. Garis besarnya (Gambar 5a, b) dibandingkan dengan grup normal, HDAC1 dan miR-124-5p meningkat dan NPY menurun dalam grup CUMS (semua P < 0,05). Ekspresi HDAC1, miR-124-5p, dan NPY tidak menunjukkan variasi dalam grup CUMS dan grup sh-NC (semua P > 0,05). Relatif terhadap grup sh-NC, grup sh-HDAC1 tercermin oleh penurunan HDAC1 dan miR-124-5p serta peningkatan tingkat ekspresi NPY (semua P < 0,05). Temuan di atas menunjukkan interferensi lentivirus yang berhasil dan hubungan positif antara ekspresi miR-124-5p dan HDAC1.

Juga, ekspresi miR-124-5p dan NPY setelah penindasan miR-124-5p dideteksi dengan hasilnya (Gambar 5c, d) menunjukkan bahwa dibandingkan dengan grup normal, miR-124-5p yang meningkat dan NPY yang berkurang ditampilkan dalam grup CUMS (kedua P < 0,05). Sebaliknya, grup anti-miR-124-5p cenderung menunjukkan miR-124-5p yang menurun dan NPY yang meningkat dibandingkan dengan grup anti-miR-NC (kedua P < 0,05). Tidak ada ketidakcocokan yang dikenali dalam ekspresi miR-124-5p dan NPY dalam grup CUMS dan grup anti-miR-NC (kedua P > 0,05). Hasilnya menunjukkan interferensi lentivirus yang berhasil dan hubungan negatif antara NPY dan miR-124-5p.

Uji ChIP dilakukan untuk menguji apakah HDAC1 dapat terikat pada promotor miR-124-5p, dan hasilnya menggambarkan bahwa (Gambar 6a, b) HDAC1 hanya terkait dengan promotor miR-124-5p (P < 0,001), yang menunjukkan bahwa HDAC1 dapat secara langsung mengatur miR-124-5p.

Hubungan target antara miR-124-5p dan NPY diprediksi dan diverifikasi melalui alat RNA22 dan uji gen laporan ganda luciferase (Gambar 6c, d). Dibandingkan dengan sel yang ditransfeksi bersama dengan NPY-3′UTR-WT dan mimic NC, sel dengan transfeksi bersama dengan NPY-3′UTR-WT dan miR-124-5p mimic menunjukkan aktivitas luciferase yang terganggu (P < 0,05). Tidak ada perbedaan yang dikenali dalam aktivitas luciferase dalam sel yang ditransfeksi bersama dengan NPY-3′UTR-MUT dan mimic NC, dan sel yang ditransfeksi bersama dengan NPY-3′UTR-MUT dan miR-124-5p mimic (P > 0,05).

Penurunan NPY Menghilangkan Efek Pelindung dari Penindasan miR-124-5p pada Tikus Depresi

Pengurasan spontan NPY dan miR-124-5p diprogram untuk menjelajahi interaksi mereka pada tikus depresi. Ditunjukkan bahwa (Gambar 7a, b) tingkat ekspresi NPY yang lebih rendah diperhatikan dalam grup anti-miR-124-5p + sh-NPY dibandingkan dengan grup anti-miR-124-5p + sh-NC (P < 0,05). Berat badan dan uji fungsi perilaku menggambarkan bahwa (Gambar 7c–f) dibandingkan dengan grup anti-miR-124-5p + sh-NC, tikus dalam grup anti-miR-124-5p + sh-NPY menunjukkan berat badan, SPP, frekuensi lintasan grid, insidensi berdiri dan waktu eksplorasi spasial yang berkurang dengan latensi pelarian yang meningkat (semua P < 0,05). Pewarnaan HE lesi hipokampus menggambarkan bahwa (Gambar 8a) dibandingkan dengan grup anti-miR-124-5p + sh-NC, jumlah neuron hipokampus berkurang, dan neuron hipokampus berwarna gelap, longgar dan tidak teratur dalam bentuk tidak teratur dengan lapisan sel yang berkurang dalam grup anti-miR-124-5p + sh-NPY. Selain itu, dibandingkan dengan grup anti-miR-124-5p + sh-NC, tikus dalam grup anti-miR-124-5p + sh-NPY disertai dengan DA, NE dan 5-HT yang berkurang (semua P < 0,05) (Gambar 8b). Selain itu, aktivitas SOD dan GSH yang terganggu, serta tingkat MDA, IL-1β, TNF-α dan NO yang meningkat ada pada tikus dari grup anti-miR-124-5p + sh-NPY dibandingkan dengan grup anti-miR-124-5p + sh-NC (semua P < 0,05) (Gambar 8c, d). Secara keseluruhan, penurunan NPY menghilangkan efek pelindung dari penindasan miR-124-5p pada tikus depresi.

Pembahasan

Depresi adalah jenis gangguan psikiatrik yang terdiri dari berbagai kondisi dengan gejala yang beragam [20]. Meskipun studi baru-baru ini telah menyiratkan peran miRNA dalam depresi, aksi yang tepat dari miR-124-5p jarang diteliti. Oleh karena itu, studi saat ini dirancang untuk pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme asa miR-124-5p/HDAC1/NPY dalam depresi dengan hasil utama yang menjelaskan bahwa penggenjotan entah HDAC1 atau miR-124-5p menaikkan NPY untuk meningkatkan memori dan kemampuan pembelajaran tikus depresi.

Untuk memulai, studi ini menemukan ekspresi HDAC1 dalam jaringan hipokampus dengan temuan yang menunjukkan peningkatan dalam ekspresi HDAC1. Selanjutnya, dengan tujuan untuk mengeksplorasi peran fungsional HDAC1 pada tikus depresi, uji kehilangan-fungsi dilakukan dan terungkap bahwa penurunan HDAC1 meningkatkan berat badan, meningkatkan kemampuan pembelajaran dan memori, meredam kerusakan patologis, menaikkan ekspresi neurotransmitter, dan menekan stres oksidatif dan inflamasi pada tikus depresi. Saat ini, sebuah studi telah menyiratkan kenaikan dalam ekspresi HDAC1 pada fenotip seperti depresi dan seperti kecemasan yang dihasilkan oleh keturunan stres [21]. Selain itu, ekspresi HDAC1 didokumentasikan menaikkan di daerah penumbuhan dalam stroke trombotik foto [22]. Selain itu, ekspresi mRNA HDAC1 yang meningkat ditemukan pada sel granule dan piramidal dalam epilepsi lob temporal [23]. Seperti yang disebutkan dalam studi sebelumnya, disimpulkan bahwa penindasan HDAC1 menghambat proses patogenik yang menyebabkan degenerasi neuron motor dalam penyakit mitokondria [27]. Secara eksperimental, penggenjotan HDAC1 oleh 2-aminobenzamida jenis 5-tienil terlibat secara parsial dalam pencegahan kematian sel neuron dalam model penyakit Parkinson [28]. Didukung lebih lanjut oleh penelitian tersebut, efek pelindung dari HDAC1 yang di-genjot telah disaksikan dalam penyakit otak, termasuk namun tidak terbatas pada depresi.

Kemudian, studi kami menemukan hubungan target antara HDAC1 dan miR-124-5p, yang didukung oleh studi sebelumnya yang menyatakan bahwa transkripsi miR-124 berada di bawah tanggung jawab EVI1, bertindak dengan terhubung dengan deasetilase HDAC1 [29]. miR-124-5p adalah gen yang overexpressed pada tikus depresi dan penurunan miR-124-5p memiliki fungsi yang mirip dengan HDAC1 yang di-genjot pada tikus depresi. Faktanya, ada studi yang menunjukkan bahwa ekspresi miR-124 dalam hipokampus meningkat dari 5 hingga 6 minggu dalam fenotip perilaku seperti depresi [7]. Studi lain telah mengidentifikasi peningkatan ekspresi miR-124 pada perempuan dengan gangguan penggunaan kokain [30]. Juga, sebelumnya dijelaskan bahwa miR-124-3p sangat diekspresikan pada rodent yang stres dalam gangguan depresi mayor [31]. Sehubungan dengan efek, penurunan miR-124 dalam korteks prefrontal dilaporkan meredam perilaku seperti depresi pada tikus [9]. Selain itu, penurunan miR-124 dipercaya berfungsi sebagai agen antidepressan gypenosida yang diinduksi kortikosteron kronis pada tikus [32]. Dari studi sebelumnya, penurunan miR-124 dapat menghasilkan perilaku yang lebih rentan terhadap paradigma stres yang lebih ringan [33]. Dilaporkan bahwa penindasan miR-124 oleh transfeksi lentivirus dalam hipokampus dapat melindungi neurodegenerasi yang diinduksi ketamin in vivo dan in vitro [34]. Bagaimanapun, penindasan miR-124-5p adalah pemain aktif untuk meredam depresi.

Selanjutnya, ekspresi NPY diverifikasi diatur oleh HDAC1 dan miR-124-5p. Defisit yang memburuk terkait HDAC2 dalam asetilisasi histon mungkin terkait dengan penurunan ekspresi NPY dan dapat digunakan untuk mengontrol perilaku seperti kecemasan dan minuman [14]. NPY down-regulat pada tikus depresi dan up-regulasi NPY mempromosikan pemulihan kemampuan pembelajaran dan memori pada tikus depresi. Dalam perkembangan perilaku seperti depresi, model tikus ditunjukkan dengan ekspresi NPY yang berkurang [17]. Secara akademis, ekspresi NPY terbukti menurun pada tikus dengan depresi [35]. Secara konsisten, temuan studi di atas sejajar dengan literatur sebelumnya hingga beberapa derajat.

Temuan baru studi ini menunjukkan bahwa penindasan miR-124-5p atau penindasan HDAC1 meredam kemampuan pembelajaran dan memori serta meningkatkan berat badan tikus depresi. Selain itu, penurunan miR-124-5p atau inhibisi HDAC1 menekan stres oksidatif dan inflamasi dan mempromosikan ekspresi neurotransmitter pada tikus depresi. Selain itu, HDAC1 memediasi miR-124-5p untuk mengatur NPY. Dalam eksperimen penyelamatan, penurunan NPY menghilangkan efek pelindung dari penindasan miR-124-5p pada tikus depresi.

Kesimpulan

Secara ringkas, studi ini menyoroti efek asa HDAC1/miR-124-5p/NPY dalam depresi dengan temuan utama yang menunjukkan bahwa penindasan miR-124-5p atau penindasan HDAC1 meredam kemampuan pembelajaran dan memori, meningkatkan berat badan, menekan stres oksidatif dan inflamasi, serta mempromosikan ekspresi neurotransmitter pada tikus depresi. Asa HDAC1/miR-124-5p/NPY mungkin memberikan referensi untuk mengobati gangguan neurologis, yang juga dapat memperbarui pengetahuan yang ada tentang depresi. Namun, studi lebih lanjut masih diperlukan untuk pemahaman yang menyeluruh tentang mekanisme kompleks asa HDAC1/miR-124-5p/NPY dalam depresi.

Ketersediaan Data dan Bahan

Tidak berlaku.

Singkatan

miR-124-5p:

MicroRNA-124-5p

HDAC1:

Deasetilase histon 1

NPY:

Neuropeptida Y

CUMS:

Stres ringan tak terduga kronis

SD:

Sprague–Dawley

SPF:

Bebas patogen spesifik

NC:

Kontrol negatif

OFT:

Uji lapangan terbuka

SPT:

Uji preferensi sukrosa

SPP:

Persentase preferensi sukrosa

MWM:

Uji labirin air Morris

SOD:

Superoksida dismutase

MDA:

Malondialdehide

GSH:

Glutation

IL-β:

Interleukin-β

TNF-α:

Faktor nekrosis tumor-α

NO:

Oksida nitrik

ELISA:

Imunoensay terikat enzim

HE:

Hematoksin–eosin

BCA:

Asam biksoninik

NE:

Norepinefrin

5-HT:

Serotonin

DA:

Dopamin

RT-qPCR:

Transkripsi terbalik rantai polimerase kuantitatif

cDNA:

DNA komplementer

SDS:

Natrium dodeksil sulfat

ChIP:

Imunopendapatan kromatin

UTR:

Wilayah tidak diterjemahkan

MUT:

Tipe mutan

WT:

Tipe liar

ANOVA:

Analisis variansi satu arah