Nanopartikel Albumin yang Dimuat Resveratrol dengan Sirkulasi Darah yang Berkepanjangan dan Peningkatan Biokompatibilitas untuk Terapi Tumor Pankreas Target yang Sangat Efektif
Abstrak
Albumin serum manusia (HSA) adalah protein intrinsik dan pembawa penting yang mengangkut zat endogen maupun eksogen melintasi membran sel. Di sini, kami telah merancang dan menyiapkan nanopartikel HSA yang memuat resveratrol (RV) yang mengkonjugasikan RGD (arginine-glycine-aspartate) melalui "jembatan" polietilen glikol (PEG) (HRP-RGD NPs) untuk terapi tumor pankreas bertarget yang sangat efektif. NP HRP–RGD memiliki ukuran rata-rata 120 ± 2,6 nm dengan distribusi sempit, bentuk sferis homodispersi, efisiensi enkapsulasi RV 62,5 ± 4,21%, dan rasio pelepasan RV maksimum 58,4.2 ± 2,8% pada pH 5,0 dan 37 °C. Biokompatibilitas in vitro RV ditingkatkan setelah dilapisi dengan HSA dan PEG. Gambar fluoresensi confocal menunjukkan bahwa NP HRP–RGD memiliki rasio serapan seluler tertinggi 47,3 ± 4,6% dibandingkan dengan NP HRP dan NP HRP–RGD dengan pemblokiran RGD gratis, yang dikaitkan dengan efek yang dimediasi RGD. Uji sel menghitung kit-8 (CCK-8) menunjukkan bahwa NP HRP-RGD tanpa RV (HP-RGD NPs) hampir tidak memiliki sitotoksisitas, tetapi NP HRP-RGD secara signifikan lebih sitotoksik terhadap sel PANC-1 dibandingkan dengan RV dan NP HRP dengan cara yang bergantung pada konsentrasi, menunjukkan morfologi apoptosis. Selanjutnya, dengan lapisan PEG dan HSA yang diformulasikan, NP HRP–RGD memperpanjang sirkulasi darah RV, meningkat sekitar 5,43 kali lipat (t1/2 ). Setelah injeksi intravena ke tikus yang mengandung tumor, kandungan NP HRP-RGD dalam jaringan tumor terbukti masing-masing sekitar 3,01 dan 8,1 kali lipat lebih tinggi daripada NP HRP dan RV bebas. Berdasarkan hasil ini, NP HRP–RGD digunakan dalam studi anti-kanker in vivo dan menunjukkan efek penekanan pertumbuhan tumor terbaik dari semua obat yang diuji tanpa kekambuhan, biokompatibilitas in vivo yang tinggi, dan tidak ada toksisitas sistemik yang signifikan selama 35 hari pengobatan. Hasil ini menunjukkan bahwa NP HRP–RGD dengan sirkulasi darah yang berkepanjangan dan peningkatan biokompatibilitas memiliki efek anti-kanker yang tinggi dengan aplikasi masa depan yang menjanjikan dalam terapi kanker.
Latar Belakang
Kanker pankreas merupakan penyakit yang menghancurkan dengan median kelangsungan hidup kurang dari 6 bulan dan hanya tingkat kelangsungan hidup 5 tahun sebesar 6% [1]. Pengobatan klinis tradisional untuk kanker pankreas adalah eksisi bedah, radioterapi, dan kemoterapi [2, 3]. Namun, metode ini mungkin dibatasi oleh efek samping yang serius, seperti penyebaran sel kanker setelah eksisi yang tidak lengkap, toksisitas serius pada sel normal selama radioterapi, dan tingkat kelangsungan hidup yang buruk [4]. Meskipun efek target rendah dan efek samping yang tinggi juga membatasi penggunaan obat anti kanker dalam kemoterapi, semakin banyak agen kemoterapi baru yang dikembangkan. Terlepas dari obat-obatan sintetis, banyak ekstrak ramuan Cina terbukti efektif melawan jenis kanker tertentu. Resveratrol (RV), ekstraktif alami dari tumbuh-tumbuhan seperti anggur dan kacang kedelai [5], telah banyak bertindak dalam agregasi trombosit dan menghambat vasodilatasi, dan mengurangi viskositas darah [6, 7]. Dan dalam beberapa dekade terakhir, juga ditemukan memiliki efek anti-kanker yang hebat pada beberapa jenis kanker, seperti kanker hati, payudara, dan ovarium [8, 9]. Namun, pemanfaatan RV sebagai obat anti kanker yang potensial memiliki beberapa kelemahan untuk aplikasi klinis lebih lanjut, seperti kelarutan yang buruk, sirkulasi darah yang rendah, dan kurangnya selektivitas [4, 10].
Di bawah premis melindungi integritas struktural obat, strategi enkapsulasi telah menarik minat banyak peneliti, yang telah terbukti efektif dalam mengatasi beberapa kelemahan yang disebutkan di atas dibandingkan dengan obat "bebas" konvensional [11]. Misalnya, dapat meningkatkan kelarutan yang buruk dan bioavailabilitas yang rendah, pembersihan ginjal yang lebih cepat, serta meningkatkan selektivitas sel [12]. Saat ini, banyak metode enkapsulasi seperti dengan liposom, nanopartikel berbasis polimer, hidrogel, dan albumin serum digunakan [13,14,15,16]. Di antara metode ini, penggunaan albumin serum telah menjadi salah satu pembawa yang paling menarik untuk memberikan obat anti-kanker yang tidak larut. Albumin serum manusia (HSA), protein endogen tidak beracun, menunjukkan non-imunogenisitas dan memiliki biokompatibilitas yang besar [17]. Ini telah banyak digunakan sebagai pembawa protein makromolekul untuk pengiriman obat [18]. Dengan demikian, HSA mampu meningkatkan kelarutan obat lipofilik. Selain itu, keberadaan gugus karboksilat dan amino fungsional pada permukaan memfasilitasi fungsionalisasi permukaan untuk nanopartikel albumin [19, 20]. Misalnya, melalui ikatan kovalen, permukaan nanopartikel albumin dapat didekorasi dengan pewarna fluoresensi, molekul target, dan RNA fungsional [21, 22]. Selain itu, dapat dengan mudah difungsikan dengan polimer hidrofilik, seperti PEG, untuk memperpanjang sirkulasi darah [23].
Dalam penelitian ini, HSA digunakan untuk mengenkapsulasi RV lipofilik sebagai nanodrug yang permukaannya difungsikan dengan molekul penargetan tumor, arginine-glycine-aspartate (RGD) melalui "jembatan" PEG (HRP-RGD NPs). NP HRP-RGD yang disiapkan menunjukkan biokompatibilitas in vitro dan in vivo yang hebat, dan sirkulasi darah yang berkepanjangan. Serapan sel dan biodistribusi tumor in vivo juga dievaluasi untuk memvalidasi potensi penargetannya dalam sel PANC-1. Selain itu, kemanjuran anti-kanker yang ditargetkan dari NP HRP-RGD diselidiki secara in vitro dan in vivo. Hasil ini menunjukkan bahwa NP HRP–RGD mungkin merupakan platform nano serbaguna untuk agen terapi tumor potensial untuk aplikasi kemoterapi yang ditargetkan.
Metode
Materi
Albumin serum manusia (HSA, bubuk lyophilized, 96%), resveratrol (RV, 99%), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), fluorescein isothiocyanate (FITC), Arg–Gly–Asp (RGD, 97%), 3-(2-pyridylditio) asam propionat N -hydroxysuccinimide ester (SPDP), pewarna Hoechst 33258, dan 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diperoleh dari Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). NH2 –PEG2000 –COOH dibeli dari Seebio Biotech Inc. (Shanghai, Cina). T -Succinimidyl S -acetylthioacetate (SATA) dibeli dari Pierce Biotech Inc. (Rockford, IL, USA). DMSO, larutan Trypsin-EDTA, buffer fosfat (PBS), serum janin sapi (FBS), larutan penisilin-streptomisin, dan media DMEM dibeli dari Sigma.
Sintesis Nanopartikel HSA–RV
Nanopartikel HSA-RV disintesis dengan metode desolvasi sederhana [24]. Secara rinci, 6 mg RV dilarutkan dalam DMSO menjadi 1 mg/mL dan dicampur dengan 10 mg HSA dalam 1 mL air dengan sedikit pengadukan, membentuk koaservat yang mengeras setelah diaduk selama 6 jam pada suhu kamar, kemudian diproses secara silang. -menghubungkan dengan 0,5% glutaraldehid (100 μL). Setelah itu, pelarut organik dihilangkan dengan dialisa dalam air selama 1 hari, menghasilkan nanopartikel HSA-RV. Nanopartikel HSA kosong disiapkan seperti yang disebutkan di atas, kecuali DMSO tanpa RV dicampur dengan larutan HSA selama 6 jam.
Sintesis dan Karakterisasi NP HRP–RGD
Nanopartikel HSA-RV terkonjugasi dengan HS-PEG-RGD oleh SPDP cross-linker tradisional seperti yang dijelaskan dalam literatur [25]. Singkatnya, 20 mg NH2 –PEG2000 –COOH diperlakukan dengan 2 mg SATA selama 3 jam dan dimurnikan dengan menghilangkan garam. SATA–PEG yang dihasilkan ditambahkan ke dalam peptida RGD 10 mg dan EDC 8 mg selama 3 jam. PEG–RGD yang dilindungi SATA kemudian direaksikan dengan 1 mL hidroksilamin dalam natrium fosfat selama 3 jam. Setelah dimurnikan dengan desalting, diberi HS-PEG-RGD. Selanjutnya, HS-PEG-RGD yang diperoleh dikonjugasi dengan nanopartikel HSA-RV melalui hubungan disulfida. Secara singkat, gugus amino dari nanopartikel HSA–RV pertama kali diaktifkan oleh SPDP dan kemudian disuspensikan kembali dalam 10 mL PBS dan direaksikan dengan kelebihan HS–PEG–RGD atau HS–PEG selama 24 jam. Solusi yang dihasilkan diulangi dicuci dengan PBS dan disaring melalui filter Millipore (100 kDa) untuk menghilangkan PEG-RGD yang tersisa dan pelarut organik lainnya, menghasilkan NP HRP-RGD. Morfologi dan ukuran nanopartikel dideteksi dengan memindai mikroskop elektron (SEM, Philips XL-30 FEG, Eindhoven, Belanda) dan sistem Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). Spektrum serapan diperoleh dengan spektrofotometer UV-Vis (UV1800, Shimadzu, Jepang). Spektrum fluoresensi direkam oleh spektrometer fluoresensi (F-4500, Hitachi, Jepang).
Pemuatan dan Pelepasan Obat
Enam miligram RV dilarutkan dalam DMSO menjadi 1 mg/mL dan dicampur dengan 10 mg HSA dalam 1 mL air dengan sedikit pengadukan, membentuk koaservat yang mengeras setelah diaduk selama 6 jam pada suhu kamar, dan kemudian diproses dengan ikatan silang dengan 0,5% glutaraldehid (100 L). Setelah itu, pelarut organik dan RV bebas dihilangkan dengan cara dialisis dalam air selama 1 hari. Dialisat digunakan untuk mengukur RV bebas dengan spektrometer UV-Vis pada 306 nm menurut kurva kalibrasi. Jumlah obat dalam NP HRP–RGD adalah total RV yang ditambahkan dikurangi jumlah RV gratis.
Pelepasan RV dari NP HRP–RGD dideteksi melalui teknik dialisis dinamis (kantong dialisis dengan batas Mw 8–12 kDa) pada pH 5,0, 7,4 dan 9,0 PBS, masing-masing, pada 37 °C. Konsentrasi obat dihitung menggunakan kurva kalibrasi standar. Efisiensi enkapsulasi = W1 /A2 × 100%, di mana A1 mewakili bobot RV dalam NP HRP–RGD, dan W2 adalah berat RV ditambahkan. Rilis kumulatif = Aa /Ab × 100%, di mana Aa mewakili jumlah RV yang dilepaskan, dan Wb adalah total RV yang ada di NP HRP–RGD.
Uji Hemolisis In Vitro
Uji hemolisis in vitro dilakukan seperti yang dijelaskan dalam pekerjaan sebelumnya [26]. Secara rinci, 0,2 mL sel darah merah (sel darah merah, dalam PBS) dicampur dengan 0,8 mL HRP–RGD NP (dalam PBS) pada konsentrasi yang telah ditentukan (10, 50, 100, dan 200 g/mL). Sel darah merah diinkubasi dengan air deionisasi atau PBS ditetapkan sebagai kontrol positif atau negatif, masing-masing. Setelah diinkubasi pada 37 °C selama 3 jam, kumpulan suspensi di atas disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 1 menit dan absorbansi supernatan pada 541 nm dipantau dengan spektrometer UV-Vis. Rasio hemolitik = (ODt ODnc )/(ODpc ODnc ) × 100%, di mana ODt , ODpc , dan ODnc adalah absorbansi supernatan sampel uji, kontrol positif dan negatif.
Budaya Sel
Sel PANC-1 tumor pankreas manusia dibeli dari Cell Bank of Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) dan dikultur dalam media DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin pada inkubator yang dilembabkan (5% CO2 ) pada 37 °C.
Serapan Seluler
Untuk penyerapan seluler, FITC digunakan untuk memberi label pada NP HRP-RGD. Sel PANC-1 menempel pada slide kaca dalam pelat 6-sumur dan diinkubasi dengan NP HRP, NP HRP-RGD + pemblokiran RGD gratis, dan NP HRP-RGD pada konsentrasi yang sama dari FITC berlabel selama 5 jam, masing-masing. Kemudian, sel dicuci dengan PBS tiga kali dan difiksasi dengan 0,2 mL glutaraldehid, diikuti dengan pewarnaan dengan DAPI selama 10 menit. Gambar fluoresensi sel ditangkap oleh mikroskop confocal pemindaian laser (Leica TCS SP8 CARS, Wetzlar, Jerman).
Selain itu, rasio penyerapan NP HRP, NP HRP-RGD + pemblokiran RGD gratis, dan NP HRP-RGD pada konsentrasi yang sama dari FITC berlabel oleh sel PNAC-1 dianalisis dengan menggunakan flow cytometry (FCM, FACSCalibur, FACSCanto II) melalui pengukuran fluoresensi FITC. Sepuluh ribu sel dicatat untuk setiap analisis FCM. Fluoresensi FITC dirangsang menggunakan laser 488 nm.
Sitotoksisitas In Vitro
Sitotoksisitas NP HP-RGD, pembawa RV, dilakukan dengan menggunakan uji penghitungan sel standar kit-8 (CCK-8) (Bestbio, Cina). Sel PNAC-1 (1 × 10
5
sel/mL, 0,5 mL) diunggulkan di piring 96-sumur dan dikultur selama 24 jam. Setelah membuang media lama, media baru yang mengandung 10, 50, 100 dan 200 g/mL NP HRP–RGD diinkubasi dengan sel PNAC-1 selama 24 jam. PBS digunakan untuk sedikit mencuci sel tiga kali. Larutan kerja 100 μL CCK-8 (10% CCK-8 + 90% DMEM) kemudian ditambahkan ke setiap sumur, diikuti dengan inkubasi pada suhu 37 °C selama 0,5 jam. Nilai absorbansi pada 450 nm dideteksi menggunakan pembaca pelat mikro (Infinite 200 Pro, Tecan, Austria). Lebih lanjut, kemanjuran anti-kanker in vitro dari RV (dilarutkan dalam DMSO), NP HRP, dan NP HRP-RGD dengan konsentrasi RV yang sama terhadap sel PNAC-1 dievaluasi dengan uji CCK-8 yang disebutkan di atas. Semua percobaan dilakukan dalam empat kali kesempatan. Selain itu, pemeriksaan morfologi untuk apoptosis dideteksi dengan pewarnaan Hoechst 33258. Fluoresensi Hoechst 33258 dalam sel diamati dan direkam dengan mikroskop confocal pemindaian laser.
Model Hewan
Tikus telanjang Balb/c, 4-5 minggu, dibeli dari Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, China). Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dan disetujui oleh Kantor Administrasi Hewan Laboratorium Universitas Kedokteran Taishan. Model xenograft tumor subkutan dibuat di daerah punggung kanan tikus dengan menyuntikkan 1 × 10
6
PNAC-1 sel per tikus, dan saat tumor menunjukkan volume sekitar 80 mm
3
, tikus-tikus ini secara acak dibagi menjadi beberapa kelompok (n = 5) untuk digunakan lebih lanjut.
Sirkulasi Darah dan Biodistribusi Tumor
Tikus normal disuntik secara intravena dengan RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD. Setelah itu, sampel darah dikumpulkan pada waktu yang berbeda dari pleksus orbital. Setiap sampel darah dilarutkan dalam 900 L buffer lisis. Konsentrasi RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD dalam darah ditentukan oleh spektrum absorbansi RV dari setiap sampel darah terlarut dengan spektrometer UV-Vis. Konsentrasi sampel didefinisikan sebagai persentase dosis yang disuntikkan per gram jaringan (ID%/g).
Biodistribusi dalam tumor dilakukan pada tikus yang mengandung tumor. Jaringan tumor ditimbang dan dicerna dengan larutan aqua regia semalaman pada 24 jam pasca injeksi intravena masing-masing RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD. Konsentrasi RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD dalam tumor ditentukan oleh spektrum absorbansi RV dari setiap jaringan tumor terlarut dengan spektrometer UV-Vis. Konsentrasi sampel didefinisikan sebagai persentase dosis yang disuntikkan per gram jaringan (ID%/g).
Kemanjuran Anti-kanker Di Vivo
Tikus dari kelompok yang berbeda disuntik secara intravena dengan saline, RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD (dosis sama dengan RV, n = 5, 10 mg/kg). Selama perawatan, ukuran tumor dan berat badan tikus pembawa tumor dipantau setiap 3 hari. Volume tumor dihitung menggunakan rumus:V = (panjang × lebar
2
)/2. Volume tumor relatif = V /V0 , di mana V0 adalah volume tumor sebelum pengobatan awal.
Pemeriksaan Histologi
Tikus telanjang Balb/c sehat dari kelompok yang berbeda disuntik secara intravena dengan saline (kontrol), RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD (dosis sama dengan RV, n = 5, 5 mg/kg). Setelah 35 hari, tikus dikorbankan dan jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal dikumpulkan. Organ utama yang diperoleh difiksasi dengan paraformaldehyde 4% semalaman. Setelah itu, organ-organ ini didehidrasi dalam sukrosa 25%, dipotong menjadi irisan 5 m, dan diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E). Bagian yang diwarnai dicitrakan di bawah mikroskop kontras fase terbalik.
Hasil dan Diskusi
Sintesis dan Karakterisasi NP HRP–RGD
Menurut metode desolvasi sederhana [24], RV dienkapsulasi oleh HSA, menghasilkan nanopartikel HSA-RV. Setelah itu, permukaan nanopartikel HSA-RV berfungsi secara kovalen dengan HS-PEG-RGD oleh SPDP cross-linker tradisional [25], membentuk nanokomposit HRP-RGD NPs. NP HRP dan NP HRP-RGD menunjukkan distribusi ukuran partikel unimodal dan sempit (Gbr. 1a, b). Setelah mengkonjugasikan RGD pada permukaan NP HRP, ukuran rata-rata nanopartikel meningkat dari 113 ± 3,1 nm menjadi 120 ± 2,6 nm. Selanjutnya, NP HRP dan NP HRP–RGD menunjukkan morfologi berbentuk bola homodispersi (Gbr. 1c, d).
Distribusi ukuran partikel NP HRP (a ) dan NP HRP–RGD (b ). Gambar SEM dari NP HRP (c ) dan NP HRP–RGD (d )
UV-Vis dan spektrum fluoresensi diambil untuk mengkonfirmasi keberadaan RV di NP HRP-RGD. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, NP HRP dan NP HRP–RGD menampilkan puncak absorbansi untuk RV pada 304 nm, yang menunjukkan adanya RV di kedua nanopartikel. Selain itu, NP HRP dan NP HRP-RGD menunjukkan sinyal fluoresensi RV pada panjang gelombang eksitasi 325 nm, yang konsisten dengan spektrum fluoresensi RV (Gbr. 2b). Hasil ini menunjukkan bahwa RV mempertahankan sifat optiknya setelah konjugasi ke NP HRP dan NP HRP–RGD.
a Spektrum absorbansi RV bebas, NP HRP, dan NP HRP-RGD. b Spektrum fluoresensi RV, NP HRP, dan NP HRP–RGD gratis
Pemuatan dan Pelepasan RV
Gambar 3a menunjukkan kurva perubahan efisiensi enkapsulasi RV di NP HRP–RGD saat konsentrasi RV meningkat. RV EE maksimum dari NP HRP–RGD yang diperoleh adalah 62,5 ± 4,21%. Selain itu, seperti terlihat pada Gbr. 3b, NP HRP–RGD menunjukkan laju pelepasan RV tertinggi sebesar 58.4.2 ± 2.8% setelah 60 jam pada 37 °C dan pH 5,0 dibandingkan dengan laju pelepasan yang diperoleh pada pH 6.5, pH 7.4, dan pH 9.0 pada 37 °C. Telah dilaporkan bahwa pH darah normal adalah 7,4, sedangkan jaringan tumor sedikit asam [27]. Ini terbukti menjadi fitur yang bermanfaat menggunakan NP HRP–RGD dalam terapi tumor.
a Efisiensi enkapsulasi RV sebagai fungsi penambahan konsentrasi RV. b Profil pelepasan RV in vitro dari NP HRP–RGD pada pH 5,0, 6,5, 7,4 dan 9,0 pada 37°C
Biokompatibilitas In Vitro
Gambar 4a, b menunjukkan gambar DMSO RV terlarut dan NP HRP–RGD di PBS pada 4°C setelah 7 hari. Yang pertama menunjukkan materi padat seperti kristal acicular, sedangkan yang terakhir memiliki banyak partikel bola mikro dan homodisperse, menunjukkan peningkatan stabilitas RV setelah enkapsulasi oleh nanopartikel HSA. Lebih lanjut, ukuran rata-rata NP HRP–RGD dalam air, DMEM, PBS, dan FBS menunjukkan hampir tidak ada variasi selama 4 minggu (Gbr. 4c), menunjukkan stabilitas koloid yang tinggi dari NP HRP-RGD, kemungkinan besar berasal dari PEG dan Enkapsulasi HSA.
Gambar mikroskop a RV gratis (dilarutkan dalam DMSO) di PBS dan b NP HRP–RGD di PBS setelah 7 hari. c Uji stabilitas koloid NP HRP-RGD pada media yang berbeda (air, DMEM, PBS, dan FBS). d Stabilitas fluoresensi RV dalam NP HRP–RGD setelah 4 minggu. e Rasio hemolisis sel darah merah setelah inkubasi 1 jam dengan NP HRP-RGD pada konsentrasi yang berbeda. sisipan menunjukkan foto sel darah merah yang terpapar air suling, PBS, dan NP HRP–RGD dengan konsentrasi berbeda diikuti dengan sentrifugasi
Gambar 4d menunjukkan stabilitas fluoresen NP RV dan HRP–RGD dalam larutan berair pada 4°C. Setelah 4 minggu penyimpanan, intensitas fluoresensi RV dari NP HRP–RGD tetap lebih dari 96,8% dari intensitas awalnya; namun, fluoresensi RV turun dengan cepat menjadi 12,1% dari intensitas awalnya kemungkinan karena presipitasi RV keluar dari larutan [10], selanjutnya menunjukkan stabilitas NP HRP-RGD dibandingkan dengan RV gratis. Selain itu, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4e, tidak ada fenomena hemolisis signifikan yang terdeteksi untuk sel darah merah yang diobati dengan HRP-RGD NPs di bawah 200 g/mL, mirip dengan kelompok yang diobati dengan PBS kontrol negatif, yang menggambarkan hemokompatibilitas yang sangat baik dari NP HRP-RGD . Hasil ini menunjukkan bahwa enkapsulasi HSA meningkatkan stabilitas dan biokompatibilitas in vitro RV, yang bermanfaat untuk aplikasi biomedis.
Serapan Seluler
NP HRP dan NP HRP-RGD diberi label oleh FITC. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, inti menunjukkan fluoresensi biru, yang diwarnai oleh DAPI. Fluoresensi hijau intens (sinyal FITC) diamati di wilayah perinuklear sel PANC-1 yang diobati dengan NP HRP-RGD, menunjukkan bahwa sejumlah NP HRP-RGD yang cukup memasuki sitoplasma. Sebaliknya, sangat sedikit fluoresensi hijau yang ditunjukkan dalam sel PANC-1 yang diperlakukan dengan NP HRP. Selain itu, sel PANC-1 yang dirawat sebelumnya dengan RGD gratis juga menunjukkan fluoresensi hijau ringan, kemungkinan dikaitkan dengan reseptor RGD pada permukaan PANC-1 yang diblokir oleh RGD gratis. Rasio serapan seluler nanopartikel terdeteksi oleh FCM, yaitu 16,2 ± 4,9%, 7,1 ± 5,1%, dan 58,5 ± 3,5% untuk NP HRP, NP HRP–RGD dengan pemblokiran RGD, dan PANC- yang diobati dengan NP HRP–RGD. 1 sel, masing-masing (Gbr. 5b). Hasil ini menunjukkan bahwa molekul target RGD dapat memfasilitasi penyerapan NP HRP-RGD dengan efisiensi tinggi oleh sel PANC-1 [28, 29].
a Gambar fluoresensi confocal sel PANC-1 setelah inkubasi dengan NP HRP, NP HRP-RGD dengan pemblokiran RGD, dan NP HRP-RGD yang diberi label oleh FITC. Hijau dan warna biru masing-masing mewakili fluoresensi FITC dan inti sel bernoda DAPI. Bilah skala = 20 μm. b Serapan seluler kuantitatif sel PANC-1 menuju NP HRP, NP HRP-RGD dengan pemblokiran RGD, dan NP HRP-RGD dengan flow cytometry
Sitotoksisitas In Vitro
Gambar 6a menunjukkan sitotoksisitas NP HP–RGD dengan kisaran konsentrasi 0–200 g/mL dengan uji CCK-8, di mana viabilitas sel PANC-1 dipertahankan di atas 90%. Disarankan bahwa kadar NP pembawa RV HP-RGD di bawah 200 g/mL tidak memiliki sitotoksisitas yang signifikan. Selain itu, efek anti-kanker dari NP HRP-RGD in vitro juga dievaluasi. Gambar 6b menunjukkan bahwa RV RV, NP HRP, dan NP HRP–RGD gratis pada konsentrasi RV berkisar antara 0 dan 50 g/mL menginduksi penurunan viabilitas sel melalui cara yang bergantung pada dosis. Jika dibandingkan dengan NP RV dan HRP gratis, NP HRP-RGD dapat menghasilkan penurunan terbesar dalam viabilitas sel di bawah semua konsentrasi uji, kemungkinan karena stabilitas dan efek penargetan RGD dari NP HRP-RGD ke sel PANC-1 [30, 31] . Selain itu, inti sel PANC-1 yang dirawat dengan RV bebas, NP HRP, dan NP HRP-RGD (semuanya pada 30 μg/mL RV) diwarnai dengan Hoechst 33258 dan diamati di bawah mikroskop fluoresensi confocal. Sel-sel yang diobati dengan NP-HRP NPs dan HRP–RGD menunjukkan adanya inti piknotik, konsisten dengan sel-sel yang diobati dengan RV (Gbr. 6c-f), yang menunjukkan bahwa jenis kematian sel kemungkinan besar adalah apoptosis [32].
a Viabilitas sel sel PANC-1 setelah perawatan dengan NP HP–RGD selama 24 jam. b Viabilitas sel sel PANC-1 setelah inkubasi dengan konsentrasi RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD yang berbeda. Inti sel PANC-1 yang diobati dengan PBS (c ), RV (d ), NP HRP (e ), NP HRP–RGD (f ) diwarnai oleh Hoechst 33258 setelah perawatan selama 24 jam. Gambar direkam menggunakan kamera digital. Bilah skala = 20 μm. Panah merah mewakili inti sel piknotik
Sirkulasi Darah dan Biodistribusi Tumor
Gambar 7a menunjukkan waktu sirkulasi darah dari RV bebas, NP HRP, dan NP HRP–RGD setelah disuntikkan secara intravena ke tikus. Dapat dilihat bahwa NP HRP dan NP HRP–RGD memiliki waktu paruh yang hampir sama (t1/2 ) dari 7,5 ± 0,5 jam dan t1/2 = 6,57 ± 0,9 jam, masing-masing. Sementara RV gratis dengan cepat dikeluarkan dari sistem sirkulasi darah dan t1/2 = 1,21 ± 0,09 jam. NP HRP–RGD memperpanjang waktu sirkulasi darah RV, kira-kira meningkat 5,43 kali lipat (t1/2 ). Selanjutnya, 24 jam pasca injeksi dengan nanopartikel, kandungan RV dalam jaringan tumor kelompok yang diobati dengan NP-HRP–RGD kira-kira 3,01 dan 8,1 kali lipat lebih tinggi daripada kelompok yang diobati dengan NP HRP dan RV gratis. , masing-masing (Gbr. 7b). Hasil ini menunjukkan bahwa enkapsulasi HSA dan PEG dapat memperpanjang waktu sirkulasi untuk mengurangi eliminasi RV dan menunjukkan kinerja akumulasi selektif yang signifikan dalam jaringan tumor [33, 34], kemungkinan karena peningkatan permeabilitas dan retensi (EPR) dan penargetan RGD efek [35].
a Kurva sirkulasi darah RV bebas, NP HRP, dan NP HRP-RGD pada tikus setelah injeksi intravena ditentukan oleh absorbansi RV dari lisat jaringan yang diencerkan. b Kandungan RV dalam tumor pada 24 jam pasca perawatan dengan RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD. c Volume tumor relatif dari tikus yang mengandung tumor setelah injeksi intravena dengan saline (kontrol), RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD. d Berat badan tikus yang mengandung tumor setelah injeksi intravena dengan saline (kontrol), RV, NP HRP, dan NP HRP-RGD
Kemanjuran Anti-kanker Di Vivo
Gambar 7c menunjukkan efisiensi anti-kanker dari RV, NP HRP, dan NP HRP–RGD gratis pada konsentrasi RV yang sama setelah injeksi ekor intravena. Sebagai kontrol, tikus diperlakukan dengan saline. Tikus yang diobati dengan HRP–RGD NP menunjukkan pertumbuhan tumor yang ditekan secara signifikan dan tidak kambuh setelah 35 hari pengobatan. Sementara kelompok perlakuan RV bebas, NP HRP, serupa dengan kelompok kontrol, menunjukkan pertumbuhan tumor yang terus meningkat. Seperti yang diharapkan, berat badan tikus di semua kelompok tidak menurun secara signifikan selama 35 hari pengobatan (Gbr. 7d). Selain itu, toksisitas sistemik in vivo dievaluasi lebih lanjut dengan pewarnaan H&E pada organ utama (jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal) setelah 35 hari perawatan (Gbr. 8). Tidak ada toksisitas atau kelainan jaringan yang nyata yang ditemukan pada gambar pewarnaan H&E jaringan yang sesuai dari semua kelompok yang diuji, yang selanjutnya menjamin keamanan in vivo NP HRP–RGD untuk aplikasi biomedis.
Gambar pewarnaan HE representatif dari jantung, hati, limpa, ginjal, dan paru-paru. Bilah skala = 100 μm
Kesimpulan
Singkatnya, kami telah mengilustrasikan bagaimana NP HRP-RGD dapat digunakan sebagai agen terapi penargetan tumor pankreas yang sangat efektif. Ditunjukkan bahwa NP HRP-RGD menunjukkan peningkatan stabilitas koloid dan biokompatibilitas in vitro dibandingkan dengan RV bebas. RGD sebagai molekul target mempromosikan penyerapan sel yang sangat efisien dari NP HRP-RGD. Dengan adanya PEG dan HSA, HRP-RGD NPs menunjukkan waktu sirkulasi yang memanjang secara signifikan yang dapat mengatasi pendeknya sirkulasi darah RV bebas. Berdasarkan penargetan RGD, kandungan NP HRP-RGD dalam jaringan tumor lebih banyak daripada NP RV dan HRP gratis. Selain itu, studi in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa dibandingkan dengan NP RV dan HRP gratis, NP HRP-RGD memiliki efek anti-kanker yang sangat baik yang kemungkinan disebabkan oleh apoptosis. Akhirnya, NP HRP–RGD menunjukkan biokompatibilitas tinggi dan tidak ada toksisitas sistemik yang signifikan secara in vivo selama 35 hari pengobatan. Hasil ini menunjukkan bahwa NP HRP–RGD dapat menjadi agen kemoterapi tumor yang menjanjikan dalam aplikasi biomedis di masa depan.
