Nanopartikel Albumin Serum Manusia yang Dimuat Resveratrol dengan Targeting PEG–RGD: Sirkulasi Diperpanjang, Biokompatibilitas Ditingkatkan, dan Penekanan Tumor Pankreas yang Kuat

Abstrak

Albumin serum manusia (HSA) adalah pengawa alami, non‑imunogenik yang dapat mengenkapsulasi obat lipofilik dan meningkatkan farmakokinetik mereka. Kami merancang nanopartikel HSA dimuat resveratrol (RV) yang dikonjugasi dengan asam amino–glisin–aspartat (RGD) melalui penghubung polietilena glikol (PEG) (NP HRP–RGD) untuk mencapai pengiriman terarah ke tumor pankreas. Nanopartikel ini menunjukkan diameter seragam 120 ± 2,6 nm, efisiensi enkapsulasi RV 62,5 ± 4,21 %, dan pelepasan sensitif pH sebesar 58,4 ± 2,8 % pada pH 5,0 dan 37 °C. Lapisan PEG dan HSA secara signifikan meningkatkan biokompatibilitas RV. Citra konfokal menunjukkan penyerapan NP HRP–RGD sebesar 47,3 ± 4,6 % pada sel PANC‑1, unggul dibandingkan kontrol tidak terarah. In vivo, NP HRP–RGD memperpanjang setengah umur plasma RV 5,43 kali, mencapai akumulasi tumor 3,01‑ dan 8,1 kali lebih tinggi dibandingkan NP HRP dan RV bebas, masing-masing. Pengobatan tikus yang terkena tumor dengan NP HRP–RGD sepenuhnya menekan pertumbuhan tumor selama 35 hari, tanpa toksis sistemik. Data ini menunjukkan bahwa NP HRP–RGD menyediakan platform yang kuat dan biokompatibel untuk terapi kanker pankreas yang ditargetkan.

Latar Belakang

Kanker pankreas tetap salah satu malignitas paling mematikan, dengan kelangsungan median kurang dari enam bulan dan tingkat kelangsungan 5 tahun di bawah 6 %. Pengobatan konvensional—bedah, radioterapi, dan kemoterapi konvensional—terhambat oleh efek samping parah dan efektivitas terbatas. Resveratrol (RV), polifenol alami dari anggur dan kedelai, menunjukkan aktivitas antikanker di berbagai jenis tumor tetapi menderita disolusi yang buruk, pengosongan cepat, dan distribusi non‑spesifik. Strategi enkapsulasi, khususnya menggunakan pengawa endogen seperti HSA, dapat meningkatkan disolusi obat, memperpanjang sirkulasi, dan memungkinkan fungsionalisasi untuk targeting aktif. HSA tidak beracun, tidak imunogenik, dan memiliki grup karboksil dan amino reaktif untuk konjugasi. PEGylation lebih lanjut memperpanjang waktu tinggal dalam darah.

Metode

Bahan

Semua reagen diperoleh dari Sigma Aldrich, Seebio Biotech, dan Pierce Biotech. Albumin serum manusia (≥96 % kesucian), resveratrol (≥99 %), dan peptida RGD (≥97 %) digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.

Sintesis Nanopartikel HSA–RV

Resveratrol (6 mg dalam 1 mg mL⁻¹ DMSO) dicampur dengan HSA (10 mg mL⁻¹) dan diaduk selama 6 jam pada suhu kamar untuk membentuk koaservat. Pencatkatan dengan gluteraldehida 0,5 % (100 µL) diikuti dengan difusi menghasilkan NP HSA–RV. NP kosong disiapkan secara identik tanpa RV.

Konjugasi PEG–RGD dan Pembentukan NP HRP–RGD

PEG‑2000‑COOH diaktifkan dengan SATA dan dikonjugasi dengan RGD dalam kehadiran EDC, membentuk SATA‑PEG‑RGD. Setelah reduksi dengan hidroksilamina, produk difilter dan bereaksi dengan NP HSA–RV yang diaktifkan SPDP untuk menghasilkan NP HRP–RGD. Reagen berlebih dikeluarkan melalui difusi dan filtasi.

Karakterisasi

• Ukuran dan polidispersitas: Pencaharan cahaya dinamis (DLS) dan SEM.
• Pemuatan obat: Spektrofotometri UV–Vis pada 306 nm.
• Kinetika pelepasan: Kantong difusi (8–12 kDa MWCO) dalam PBS pada pH 5,0, 6,5, 7,4, 9,0, 37 °C.

Biokompatibilitas dan Hemolisis

Sel darah merah diinkubasi dengan NP HRP–RGD (10–200 µg mL⁻¹) selama 3 jam pada 37 °C. Rasio hemolisis dihitung terhadap PBS (negatif) dan air deionis (positif) kontrol.

Studi Seluler

Sel PANC‑1 dibudidayakan dalam DMEM dengan 10 % FBS. NP HRP–RGD yang dilabeli FITC diinkubasi selama 5 jam, diikuti dengan citra konfokal dan sitometrika alur untuk menilai penyerapan. Toksisitas sel dievaluasi dengan uji CCK‑8 pada konsentrasi 0–200 µg mL⁻¹. Morfologi apoptosis dikonfirmasi dengan pewarnaan Hoechst 33258.

Eksperimen Hewan

Tikus Balb/c nude diinjeksi subkutan dengan 1 × 10⁶ sel PANC‑1. Saat tumor mencapai ~80 mm³, tikus diacak (n = 5) ke dalam kelompok fisiologis, RV, NP HRP, atau NP HRP–RGD (10 mg kg⁻¹ ekivalen RV). Volume tumor dan berat badan dipantau setiap 3 hari selama 35 hari. Distribusi biodaya dievaluasi pada 24 jam melalui analisis UV–Vis jaringan tumor. Histopatologi organ utama dilakukan pasca‑mortem.

Hasil dan Pembahasan

Pembuatan Nanopartikel dan Sifat Fisikokimia

NP HRP–RGD menunjukkan distribusi ukuran sempit, unimodal (120 ± 2,6 nm) dengan morfologi bola homogen. Spektra UV–Vis mengonfirmasi enkapsulasi RV, sementara emisi fluoresensi pada 325 nm membenarkan retensi RV di dalam partikel.

Pemuatan Obat dan Pelepasan Responsif pH

Efisiensi enkapsulasi mencapai puncak 62,5 ± 4,21 %. Studi pelepasan menunjukkan kumulatif pelepasan 58,4 ± 2,8 % setelah 60 jam pada pH 5,0, dibandingkan dengan tingkat yang jauh lebih rendah pada pH fisiologis, yang menunjukkan pelepasan spesifik tumor.

Stabilitas dan Biokompatibilitas Ditingkatkan

Berbeda dengan RV kristal bebas, NP HRP–RGD tetap stabil koloid dalam PBS, DMEM, dan FBS selama 4 minggu. Intensitas fluoresensi tetap >96 % setelah 4 minggu, sedangkan RV bebas turun ke 12 %. Uji hemolisis menunjukkan <5 % hemolisis hingga 200 µg mL⁻¹, cocok dengan kontrol PBS.

Penyerapan Selular yang Ditargetkan

Sitometrika alur mengukur penyerapan 58,5 ± 3,5 % NP HRP–RGD oleh sel PANC‑1, jauh lebih tinggi daripada NP HRP tidak terarah (16,2 ± 4,9 %) dan kontrol yang diblokir RGD (7,1 ± 5,1 %). Citra konfokal membenarkan pengiriman intrakelular yang efisien.

Aktivitas Antitumor Potent In Vitro

NP HRP–RGD menunjukkan sitorotoksisitas bergantung pada dosis, mengurangi vitalitas sel PANC‑1 menjadi <30 % pada 50 µg mL⁻¹, unggul dibandingkan RV bebas dan NP HRP. Pewarnaan Hoechst mengungkapkan kondensasi nukleus apoptosis yang khas.

Sirkulasi Diperpanjang dan Akumulasi Tumor

NP HRP–RGD memperpanjang setengah umur plasma RV menjadi 6,57 ± 0,9 j (vs. 1,21 ± 0,09 j untuk RV bebas). Pada 24 jam, kandungan RV dalam tumor kelompok HRP–RGD 3,01‑ dan 8,1 kali lebih tinggi daripada NP HRP dan RV bebas, masing-masing, yang menunjukkan targeting EPR dan RGD yang efektif.

Penekanan Tumor In Vivo dan Keamanan

Pengobatan NP HRP–RGD sepenuhnya menghentikan pertumbuhan tumor selama 35 hari, tanpa residiv. Berat badan tetap stabil di semua kelompok. Histologi jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal tidak menunjukkan perubahan patologis, yang mengonfirmasi keamanan sistemik.

Kesimpulan

NP HRP–RGD mewakili platform yang relevan klinis yang mengatasi keterbatasan disolusi, farmakokinetik, dan targeting RV bebas. Dengan menggabungkan enkapsulasi HSA, PEGylation, dan targeting RGD, nanopartikel ini mencapai sirkulasi berkelanjutan, akumulasi spesifik tumor, dan efektivitas antitumor yang kuat dengan toksisitas minimal. Studi ini mendukung pengembangan lebih lanjut sebagai modalitas terapi yang kuat untuk kanker pankreas.

Singkatan

• CCK‑8: Cell Counting Kit‑8
• FBS: Fetal Bovine Serum
• FITC: Fluorescein Isothiocyanate
• HSA: Human Serum Albumin
• PEG: Polyethylene Glycol
• RGD: Arginine–Glycine–Aspartate
• RV: Resveratrol
• PBS: Phosphate‑Buffered Saline