Fe(II) dan Tannic Acid-Cloaked MOF sebagai Pembawa Artemisinin untuk Pasokan Ion Ferrous untuk Meningkatkan Pengobatan Kanker Payudara Triple-Negative
Abstrak
Penekanan perkembangan tumor dengan menginduksi ferroptosis dapat memberikan obat potensial untuk kanker payudara triple-negatif, yang sensitif terhadap ketidakseimbangan oksidatif intraseluler. Baru-baru ini, artemisinin (ART) dan turunannya telah diselidiki sebagai agen antikanker potensial untuk pengobatan kanker yang sangat agresif melalui induksi ferroptosis oleh pembelahan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi. Karena kelarutan airnya yang buruk dan kandungan besi intraseluler yang terbatas, ini menantang untuk aplikasi lebih lanjut dalam terapi antitumor. Di sini, kami mengembangkan pembawa nano pasokan besi untuk ART berdasarkan asam tanat (TA) dan ion besi (Fe(II)) yang dilapisi pada kerangka zeolitik imidazolat-8 (ZIF) dengan ART yang dienkapsulasi (TA-Fe/ART@ZIF ) melalui perakitan mandiri yang digerakkan oleh koordinasi. Eksperimen pelepasan obat menunjukkan bahwa ART hampir tidak dilepaskan pada pH 7,4, sedangkan 59% ART dilepaskan pada pH 5,0 setelah 10 jam, menunjukkan pelepasan yang dipicu oleh pH yang sangat baik. Sementara itu, tingkat tinggi ROS dan MDA intraseluler, disertai dengan penurunan GSH dan GPX4, menunjukkan sistem obat nano yang baru dikembangkan yang menunjukkan peningkatan ferroptosis yang nyata. Dibandingkan dengan monoterapi, percobaan penghambatan tumor in vitro dan vivo menunjukkan efisiensi penekanan tumor TA-Fe/ART@ZIF yang lebih tinggi. Karya ini memberikan pendekatan baru untuk meningkatkan potensi obat nano ferroptotik dan arah baru untuk terapi TBNC.
Pengantar
Ferroptosis, subtipe kematian sel yang baru ditemukan, dapat mengakibatkan akumulasi hidroperoksida lipid yang bergantung pada besi (LPO), yang menyebabkan kerusakan struktur dan integritas sel [1,2,3]. Bukti yang muncul menyiratkan bahwa aktivasi ferroptosis oleh beberapa molekul kecil merupakan pendekatan yang efektif untuk supresi tumor dalam berbagai model kanker eksperimental dan menciptakan harapan yang tinggi untuk potensi ferroptosis sebagai terapi antikanker baru [4,5,6]. Kanker payudara triple-negatif (TNBC) adalah subtipe paling agresif dari kanker payudara yang tidak memiliki terapi bertarget dan sering dikaitkan dengan kekambuhan tumor, metastasis jauh, dan resistensi terhadap terapi [7]. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa xCT sistin/glutamat antiporter sangat diekspresikan dalam banyak sel TNBC, memainkan peran penting dalam menjaga tingkat glutathione (GSH) dan keseimbangan redoks [8]. Pengurangan kandungan GSH intraseluler dapat membuat sel TNBC sensitif terhadap ferroptosis, sehingga membunuh sel tumor [8]. Khususnya, ferroptosis juga dapat melewati resistensi TNBC terhadap apoptosis terprogram rutin [9]. Oleh karena itu, strategi atau obat berdasarkan menginduksi ferroptosis mungkin memiliki potensi terapeutik untuk pengobatan klinis TNBC refrakter.
Artemisinin (ART), seskuiterpen lakton yang mengandung gugus peroksida, diisolasi dari tanaman tradisional Cina Artemisia annua dan telah menunjukkan aktivitas antitumor yang diinginkan dalam beberapa baris sel kanker [10, 11]. Semakin banyak bukti yang menunjukkan bahwa sel kanker mengandung lebih banyak kumpulan besi intraseluler secara signifikan daripada sel normal, sementara pembelahan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi memungkinkan ART untuk secara selektif menyebabkan kematian sel pada beberapa lini sel kanker [12, 13]. Aktivitas antitumor yang bergantung pada ion besi telah menarik perhatian yang meningkat pada ferroptosis yang diatur oleh ART [13]. Secara mekanis, ART dapat menginduksi degradasi lisosom feritin secara autophagy-independen, meningkatkan tingkat seluler ion besi dan membuat sel peka terhadap ferroptosis [11].
Namun, apakah ART menginduksi ferroptosis di TNBC masih belum jelas. Selain itu, serangkaian faktor, seperti kelarutan air yang buruk dan ketersediaan ion besi intraseluler yang tidak mencukupi, membatasi penerapan ART lebih lanjut dalam terapi antitumor [13]. Kompleks nano ART diharapkan berhasil digunakan sebagai sistem pengiriman obat nano prospektif untuk obat anti tumor berbasis ART [14,15,16]. Dalam beberapa tahun terakhir, kerangka logam-organik (MOFs), kelas bahan polimer berpori, menarik perhatian karena demonstrasi ukuran pori yang besar, luas permukaan yang tampak tinggi, dan penyerapan selektif molekul kecil [17,18,19]. Sebagai perwakilan dari material tipe MOF, kerangka zeolitik imidazolat (ZIF-8) banyak digunakan dalam pengembangan obat-nano dengan karakteristik responsif terhadap pH, pemuatan obat yang tinggi, dan biokompatibilitas yang baik [20,21,22,23] ]. Selain itu, kemampuan untuk menggabungkan permukaan yang dapat disesuaikan pada MOF memungkinkan kontrol sifat permukaan dan kemampuannya dengan multifungsi [24, 25]. Perakitan supramolekul dari mantel koordinasi logam-fenolik pada permukaan MOF baru-baru ini menarik minat karena sifat yang diinginkan, seperti pembongkaran yang responsif terhadap rangsangan, stabilitas koloid, dan biokompatibilitas [26, 27]. Bahan koordinasi logam-fenolik pada MOF bisa menjadi kendaraan yang ideal untuk memberikan ART hidrofobik.
Terinspirasi oleh hal ini, kami mengembangkan ART enkapsulasi sistem-nano ZIF-8 terselubung ion besi-asam tanat (TA-Fe/ART@ZIF) untuk mengatur ferroptosis dalam sel TNBC, yang ditunjukkan pada Gambar. 1. ZIF-8 adalah dipilih sebagai pembawa nano untuk merangkum ART karena bio-kompatibilitasnya yang baik dan pelepasan yang responsif terhadap pH. Lapisan koordinasi ion besi-TA diimobilisasi ke permukaan ART@ZIF untuk tujuan stabilitas dispersi dan pasokan ion besi (Fe(II)). Setelah internalisasi sistem nano yang disiapkan dalam sel, degradasi asam pembawa akan memfasilitasi pelepasan ART dan akumulasi Fe(II). Peningkatan kadar Fe(II) dalam sel akan menguraikan ART menjadi radikal melalui pembelahan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi, secara nyata meningkatkan efek ferroptosis. Secara meyakinkan, penemuan ferroptosis yang dimediasi TA-Fe/ART@ZIF dapat menawarkan perspektif baru untuk pengembangan pengobatan baru terhadap TNBC.
Representasi skema dari preparasi nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF dan induksi sinergis dari apoptosis/ferroptosis dalam sel tumor
Materi dan Metode
Reagen
Artemisinin (99%), 2-methylimidazole (98%), seng nitrat (ZnNO3; 98%), Ta (98%), besi sulfat (FeSO4; 98%), dan metanol anhidrat disediakan oleh Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Cina).
Fabrikasi Nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF
Untuk persiapan nanopartikel ART@ZIF, 200 mg ART dilarutkan dalam 1 mL metanol anhidrat, dan 2 g 2-methylimidazole (pelarutnya adalah 8 mL metanol absolut) perlahan ditambahkan ke larutan ART yang diperoleh. Di bawah pengadukan magnetik, 0,2 g seng nitrat (pelarutnya adalah 1 mL metanol absolut) ditambahkan perlahan. Terakhir, volume larutan diatur menjadi 15 mL dan diaduk selama 10 menit untuk mendapatkan larutan berwarna putih terang. Setelah sentrifugasi pada 10.000 rpm, sampel dicuci tiga kali dengan metanol. Supernatannya adalah untuk mengukur kandungan ART, sedangkan pengendapnya dibekukan-kering untuk mendapatkan keadaan padat untuk digunakan lebih lanjut.
Untuk persiapan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF, larutan TA (40 mg/mL dalam air deionisasi, 2 mL) ditambahkan perlahan ke dalam larutan ART@ZIF (10 mg/mL, 4 mL). Setelah diaduk selama 20 menit, 5 mg/mL FeSO4 ditambahkan perlahan-lahan ke dalam larutan di atas. Setelah diaduk berulang kali selama 30 menit, diperoleh larutan berwarna ungu tua. Akhirnya, endapan dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 10.000 rpm. Endapan dicuci tiga kali dengan air deionisasi dan dikeringkan-beku untuk mendapatkan TA-Fe/ART@ZIF untuk digunakan lebih lanjut.
Karakterisasi
TEM (JEM-1230; JEOL, Tokyo, Jepang) digunakan untuk menentukan komposisi morfologi dan unsur dari setiap bagian nanopartikel. Hamburan cahaya dinamis dan potensi zeta (DLS; Zetasizer Nano system Malvern Instruments, Malvern, UK) digunakan untuk mengevaluasi ukuran partikel dan stabilitas listrik nanopartikel. Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (VERTEX 70; Bruker, Bremen, Jerman) dan analisis termogravimetri digunakan untuk menganalisis komposisi konstituen nanopartikel. Pengukuran spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dilakukan menggunakan PHI 5000 Versa Probe III (Elektronik Fisik). Komposisi unsur bahan TA-Fe/ART@ZIF dilakukan dengan menggunakan EDX (Model Carl Zeiss:Neon-40).
Pengukuran Efisiensi Enkapsulasi dan Kapasitas Pemuatan
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) (Agilent 1200; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) digunakan untuk mengukur jumlah ART dalam supernatan. Tingkat pemuatan obat dan enkapsulasi ART dapat dihitung sebagai berikut:
Pelepasan In Vitro dan Respon pH Nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF
Membran dialisis yang diberi perlakuan dibungkus dengan 2 mg nanopartikel ditempatkan dalam 50 mL phosphate-buffered saline (PBS) dengan pH masing-masing 7,4 dan 5,0, dan dikocok terus menerus pada suhu 37 °C. Larutan di luar membran dialisis diambil sampelnya pada 15 menit, 30 menit, 45 menit, 1 jam, 2 jam, 4 jam, 6 jam, 8 jam, dan 10 jam setelah percobaan dimulai. Kandungan ART dalam larutan buffer diukur menggunakan HPLC.
Budaya Sel
Garis sel MDA-MB-231 dan L929 diperoleh dari Koleksi Budaya Tipe Amerika (Koleksi Budaya Tipe Amerika, Manassas, VA, USA). Sel dikultur pada suhu 37 °C dan 5% CO2 kelembaban dalam media RPMI-1640 (Solarbio, Beijing, China), yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (Cyclone, Utah, USA), 100 g/mL natrium piruvat, penisilin, dan streptomisin (Solarbio Beijing, China).
Uji Toksisitas Seluler In Vitro
Viabilitas sel ditentukan dengan menggunakan uji 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) sesuai dengan prosedur literatur [28, 29].
Sel MDA-MB-231 dan sel L929 dikultur dalam media sel standar dalam pelat 96-sumur (5.000 sel per sumur) dan diinkubasi dalam 5% CO2 pada 37 °C selama 24 jam. Cairan di dalam sumur dibuang, dan 100 L per sumur media bebas serum dengan PBS dan konsentrasi ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, deferoxamine yang berbeda (DFO, MedChemExpress, Shanghai, China) ), N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluoromethyl ketone (Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Shanghai, China), dan ferrostatin-1 (Fer1, MedChemExpress, Shanghai, China) ditambahkan ke 96 -piring sumur. Setelah 48 jam, 10 μL MTT (5 mg/mL) ditambahkan dan diinkubasi selama 4 jam lagi. Akhirnya, penanda enzim otomatis (BioTek Instruments Inc., USA) digunakan untuk mengukur absorbansi di setiap sumur. Hasil dinyatakan sebagai persentase viabilitas sel.
Uji Pewarnaan Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM)
Sel MDA-MB-231 dikultur dalam pelat 24-sumur (2 × 10
4
sel per sumur) dan diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya, sel diperlakukan dengan konsentrasi nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF yang berbeda selama 24 jam. Setelah membuang media, sel diwarnai dengan Calcein-AM (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) dalam gelap pada 4 °C selama 20 menit dan diamati di bawah mikroskop fluoresensi terbalik (Olympus, Tokyo, Jepang).
Alur Sitometri untuk Apoptosis
Sel MDA-MB-231 ditempatkan dalam pelat enam sumur dengan kepadatan 2,5 × 10
5
sel per sumur di bawah kondisi yang sama. Setelah pengobatan dengan PBS, ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF diterapkan selama 24 jam. Selanjutnya, sel-sel disentrifugasi dan dikumpulkan dari pelat enam sumur. Setelah propidium iodide dan pewarnaan ganda Annexin-V (Annexin V-FITC Kit; Beckman Coulter, Marseille, Prancis), flow cytometry digunakan untuk mendeteksi.
Uji Penentuan Spesies Oksigen Reaktif (ROS) in vitro
Kandungan ROS dalam sel dilakukan menggunakan probe fluoresensi ROS (dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China).Sel MDA-MB-231 dikultur dalam pelat enam sumur (2,5 × 10
5
sel per sumur) dan diinkubasi dalam 5% CO2 pada 37 °C selama 24 jam. Cairan dari sumur dibuang, dan sel diperlakukan sebagai berikut:kelompok kontrol kosong (media bebas serum), kelompok kontrol positif, dan kelompok eksperimen (konsentrasi nanopartikel yang berbeda). Setelah inkubasi selama 8 jam pada 37°C, 0,1% DCFH-DA ditambahkan ke setiap sumur dan sel diinkubasi selama 30 menit. Sel yang tidak responsif terhadap DCFH-DA dihilangkan dengan PBS dan diamati di bawah mikroskop fluoresensi terbalik (Olympus, Tokyo, Jepang).
Penentuan Kandungan Malondialdehid (MDA) dan GSH
Kit assay MDA (metode TBA; Jiancheng Bioengineering, Nanjing, China) dan kit assay GSH (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) digunakan untuk mengukur level intraseluler MDA dan GSH. Setelah pengobatan dengan PBS, ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF, sel MDA-MB-231 dikumpulkan dan dihitung. Konten intraseluler MDA dan GSH ditentukan sesuai dengan instruksi yang diberikan dalam kit.
Analisis Western Blot
Sel MDA-MB-231, yang diperlakukan dengan nanopartikel berbeda, dilisiskan dengan buffer lisis RIPA. Setelah konsentrasi protein ditentukan, protein dari sampel yang berbeda dipisahkan menggunakan gel SDS-PAGE 10% dan dipindahkan ke membran nitroselulosa. Membran nitroselulosa yang diisi dengan protein sampel diblokir oleh larutan protein BSA 0,5% selama 1 jam, dan membran nitroselulosa serta antibodi primer diinkubasi selama 24 jam pada 4°C. Kami membilas antibodi primer dari membran nitroselulosa dengan TBST dan melanjutkan menempatkannya dengan antibodi sekunder yang sesuai pada suhu biasa selama 2 jam. Setelah mencuci antibodi sekunder pada membran selulosa, membran nitroselulosa digunakan larutan chemiluminescent dan diamati di bawah sistem pencitraan gel.
Eksperimen Antitumor Dalam Vivo
Semua percobaan hewan telah disetujui oleh Komite Etika Universitas Kedokteran Weifang. Tikus telanjang betina yang sehat (usia:4 minggu; berat:13–17 g; Vital River, Beijing, China) diberi 5 × 10
6
Sel MDA-MB-231 dalam 150 l saline buffer fosfat. Saat volume tumor meningkat menjadi 70–120 mm
3
, mencit secara acak dibagi menjadi empat kelompok. Setiap kelompok tikus diperlakukan secara terpisah dengan PBS, ART (20 mg/kg), TA-Fe/ZIF (80 mg/kg), dan TA-Fe/ART@ZIF (100 mg/kg). Setiap tikus diperlakukan dengan injeksi intraperitoneal setiap tiga hari. Setelah 14 hari, semua tikus dibunuh. Jaringan tumor dan organ penting dikumpulkan untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin.
Analisis Statistik
Semua percobaan diulang setidaknya tiga kali. Semua data dianalisis secara statistik menggunakan perangkat lunak SPSS versi 22.0 (IBM Corp., Armonk, USA). Hasilnya dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. P nilai < 0,05 menunjukkan signifikansi statistik.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi Nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF
Pertama, nanopartikel ART@ZIF disintesis pada suhu kamar dari metanol, seng asetat, 2-methylimidazole, dan ART menurut prosedur literatur [30]. Film supramolekul logam-polifenol yang stabil kemudian dengan cepat dibentuk di sekitar templat ART@ZIF dengan mengaduk TA dan ion besi. Dibandingkan dengan nanopartikel magnetik yang dilaporkan [31,32,33], TA-Fe/ART@ZIF dibuat melalui metode perakitan mandiri yang memformat membran TA-Fe pada permukaan MOF tanpa melibatkan reaksi kimia atau hidrotermal yang keras. Lebih penting lagi, pembawa nano TA-Fe/ART@ZIF dapat dipicu oleh pH rendah, untuk melepaskan ART dan Fe(II), yang selanjutnya dikatalisis oleh endoperoksida ART untuk menghasilkan radikal bebas yang berpusat pada C, meningkatkan ferroptosis secara nyata. . Efisiensi enkapsulasi, yang diukur dengan HPLC menggunakan supernatan dari sentrifugasi pertama, adalah 66,7%. Supernatan diperoleh dengan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF, dan beban obat ART yang dihitung adalah 11,4%. Menurut spektroskopi FTIR (Gbr. 2a), puncak serapan karakteristik ART, yaitu ikatan karbonil pada 1.738 cm
−1
dan jembatan peroksi pada 724 cm
−1
[34], diamati pada nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF, menunjukkan bahwa ART berhasil dienkapsulasi dalam nanopartikel. Selanjutnya, hasil analisis termogravimetri mengungkapkan bahwa ART benar-benar hilang ketika suhu dinaikkan menjadi sekitar 400 °C (Gbr. 2b). Dibandingkan dengan nanopartikel TA-Fe/ZIF, ditemukan bahwa ART menyumbang 7,1% dari total berat nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF, yang pada dasarnya konsisten dengan hasil analisis HPLC.
a FTIR ART, ZIF-8, dan TA-Fe/ART@ZIF; b Analisis termogravimetri (TGA) dari ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF
Hasil TEM menunjukkan bahwa ZIF-8 dan ART@ZIF menunjukkan konfigurasi segi enam seragam yang serupa, dan distribusi ukuran partikel ditentukan pada sekitar 100 nm (Gbr. 3a, b). Nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF menunjukkan konfigurasi bola, dan distribusi ukuran partikel adalah 150 nm. Dibandingkan dengan ART@ZIF lengkap, TA-Fe/ART@ZIF yang dilapisi dengan Fe(II) dan TA menunjukkan struktur cangkang inti konvensional yang jelas, dan ukuran membran TA-Fe kira-kira 30 nm (Gbr. 3a). Selain itu, kami melakukan analisis pemetaan elemen area dari nanopartikel yang terbentuk. Pemetaan area-elemen mengkonfirmasi bahwa pinggiran nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF dikelilingi oleh elemen Fe, menunjukkan bahwa Fe(II) dan TA berhasil diselubungi (Gbr. 3b). Pengukuran XPS dilakukan untuk menyelidiki komposisi dan interaksi elemen permukaan dalam komposit TA-Fe/ART@ZIF. Spektrum XPS pemindaian lebar TA-Fe/ART@ZIF digambarkan dalam File tambahan 1:Gbr. 1s. Puncak utama yang muncul di sekitar 285, 408, 531, 737, dan 1036 eV terkait dengan C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p, dan Zn 2p, masing-masing, menunjukkan pembentukan nanokomposit TA-Fe/ART@ZIF . Selanjutnya, gambar pemetaan EDS dari TA-Fe/ART@ZIF ditampilkan dalam File tambahan 1:Gbr. 2s. Ditemukan dengan jelas bahwa puncak yang sesuai dengan unsur-unsur seperti karbon (C), nitrogen (N), oksigen (O), besi (Fe), dan seng (Zn), sesuai dengan spektrum XPS. Dengan meningkatkan jumlah Fe(II), kami menemukan bahwa diameter hidrodinamik nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF meningkat (File tambahan 1:Gbr. 3s). Untuk mengkonfirmasi lebih lanjut pelapisan, kami mengukur potensi zeta dari berbagai nanopartikel. Pembentukan lapisan TA–Fe(II) pada partikel ART@ZIF menggeser zeta permukaan dari potensial + 21 mV menjadi 19,5 mV karena sifat asam dari TA (File tambahan 1:Gbr. 4s). Seperti yang dilaporkan literatur sebelumnya [30], kelompok polifenol yang melimpah dalam struktur TA tidak hanya memberikan kemampuan pelapisan substrat, tetapi juga mampu berkoordinasi dengan ion logam transisi (Fe, Zn) untuk membentuk kompleks logam-fenolik. Saat Zn
2+
dan Hmim dicampur untuk membentuk larutan, massa Zn
2+
ion akan berkoordinasi pada permukaan partikel ART@ZIF; dengan demikian, potensi zeta ART@ZIF adalah + 21 mV. Gugus fenolik TA (pKa 8.5) terdeprotonasi secara negatif dan oleh karena itu dapat berinteraksi dengan Zn yang bermuatan positif
2+
, mempromosikan pertumbuhan film TA–Fe pada permukaan ART@ZIF. Karena penghantaran obat lebih disukai pembawa, stabilitas merupakan faktor penting untuk aplikasi obatnya. Kestabilan nanopartikel ditunjukkan dengan pendispersian dalam PBS selama satu minggu. Seperti yang ditunjukkan dalam File tambahan 1:Gbr. 5s, ukuran partikel menunjukkan ukuran dan stabilitas yang diinginkan dari waktu studi.
a Gambar TEM dan distribusi ukuran partikel nano ZIF-8, ART@ZIF, dan TA-Fe/ ART@ZIF. Bilah skala:100 nm; b distribusi unsur karbon dan besi dalam nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF. Bilah skala:100 nm
a Pelepasan ART secara in vitro dari nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF pada pH 7,4 dan 5,0. b Sitotoksisitas nanopartikel ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF dalam sel MDA-MB-231 pada 0, 12,5, 25, 50, dan 100 μg/mL. c Viabilitas sel L929 yang diobati dengan TA-Fe/ART@ZIF pada konsentrasi yang berbeda. d Pewarnaan Calcein-AM pada sel MDA-MB-231 yang diobati dengan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF pada konsentrasi 0, 25, 50, dan 100 μg/mL
Produksi ROS terdeteksi oleh fluoresensi DCFH-DA dalam sel MDA-MB-231 yang diobati dengan nanopartikel ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF
Pelepasan dan Sitotoksisitas TA-Fe/ART@ZIF In Vitro
Selanjutnya, untuk mempelajari apakah TA-Fe/ART@ZIF memiliki perilaku dekomposisi yang responsif terhadap pH, kami memeriksa pelepasan ART dari nanopartikel dalam kondisi netral dan asam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, dalam kondisi asam, nanopartikel dapat dengan cepat melepaskan sekitar 58% ART dalam 1 jam. Namun, dalam kondisi netral, nanopartikel hanya dapat secara perlahan melepaskan sejumlah kecil ART. Selain itu, selama perlakuan larutan luar membran dialisis dengan natrium hidroksida, larutan golongan pH = 5,0 direaksikan dengan natrium hidroksida untuk menghasilkan endapan putih yang cukup banyak. Namun, fenomena ini tidak diamati pada kelompok pH = 7.4.
Menurut hipotesis kami, endapan putih adalah endapan seng hidroksida yang dibentuk oleh disosiasi ion seng dan alkali dari nanopartikel dalam kondisi asam. Secara kolektif, bukti ini berhasil menunjukkan bahwa nanopartikel kami memiliki kemampuan untuk berdisosiasi dalam kondisi asam.
Dalam desain sistem nano TA-Fe/ART@ZIF, struktur TA-Fe(II) dan ZIF diablasi untuk melepaskan ART dan Fe(II) yang terbungkus dalam kondisi asam dari lingkungan mikro tumor. Peningkatan kadar Fe(II) dalam sel akan menguraikan ART menjadi radikal melalui pembelahan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi, secara nyata meningkatkan efek ferroptosis. Oleh karena itu, uji MTT dilakukan untuk mempelajari sitotoksisitas sistem nano terhadap sel MDA-MB-231 dan sel L929. Dibandingkan dengan ART, nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF menunjukkan sitotoksisitas yang lebih besar pada sel MDA-MB-231 (Gbr. 4b) dan sitotoksisitas rendah pada sel normal (Gbr. 4c). Nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF menghambat aktivitas sel MDA-MB-231 sebesar 53,9%, sedangkan ART pada konsentrasi yang sama hanya menghambat 24,1% dari keseluruhan sel. Hasil eksperimen pewarnaan calcein-AM mengkonfirmasi bahwa jumlah sel MDA-MB-231 yang layak secara bertahap turun dengan meningkatnya konsentrasi nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF (Gbr. 4d).
TA-Fe/ART@ZIF Peningkatan Generasi ROS dalam Sel MDA-MB-231
ART diketahui mengerahkan aktivitas antikankernya melalui generasi ROS yang dihasilkan oleh pembelahan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi [35, 36]. Oleh karena itu, kami telah memeriksa efisiensi TA-Fe/ART@ZIF untuk menginduksi pembentukan ROS dengan probe 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCHF-DA) [37]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, sinyal fluoresensi yang sedikit lebih kuat diamati pada sel yang diobati dengan ART dan TA-Fe/ZIF dibandingkan dengan kelompok yang tidak diobati, menunjukkan bahwa ion ART dan Fe(II) dapat menginduksi pembentukan ROS. Sebaliknya, paparan sinyal fluoresensi yang kuat terhadap obat nano TA-Fe/ART@ZIF ditemukan dalam sel sebagai bukti hasil ROS yang diinginkan, yang dihasilkan oleh pembelahan endoperoksida ART yang dimediasi Fe(II). Sistem nano yang disiapkan dalam sel akan terdegradasi dan membuat akumulasi Fe(II), sangat meningkatkan generasi ROS. Efek antikanker dari ART dan turunannya telah dikaitkan dengan kemampuannya untuk menginduksi apoptosis oleh berbagai proses seluler, mulai dari respon kerusakan DNA, proses katabolik makroautofagi yang dimediasi lisosom, dan stres oksidatif [13, 35, 38]. Dan juga dilaporkan bahwa pembelahan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi dalam ART dapat mempengaruhi keseimbangan oksidatif intraseluler menjadi ferroptosis pada banyak jenis sel kanker [11]. Induksi ferroptosis berdasarkan ketidakseimbangan oksidatif ini dapat diperkuat lebih lanjut dengan penambahan Fe(II). Sementara Fe(II) mengaktifkan ART, Fe(II) juga dapat bereaksi dengan hidrogen peroksida intraseluler untuk menghasilkan radikal bebas hidroksil melalui reaksi Fenton, yang meningkatkan efek ART yang menginduksi apoptosis pada sel tumor.
TA-Fe/ART@ZIF Terinduksi Apoptosis dan Ferroptosis pada Sel MDA-MB-231
Sementara itu, untuk menyelidiki kematian sel dan peran Fe(II), kami menggunakan chelator besi deferoxamine, inhibitor apoptosis Z-VAD-FMK, dan inhibitor ferroptosis ferrostatin-1 untuk menyelamatkan sel-sel ini. Seperti yang diperkirakan, deferoxamine, pemulung Fe(II), jelas dapat memblokir kematian sel, menunjukkan peran penting Fe(II). Selain itu, tingkat kelangsungan hidup sel MDA-MB-231 secara signifikan ditingkatkan oleh apoptosis dan inhibitor ferroptosis dari masing-masing 31,4% menjadi 56,3% dan 76,0% (Gbr. 6a), menyoroti pentingnya apoptosis dan ferroptosis pada TA-Fe/ART @ZIF nanopartikel memediasi kematian sel. Selain itu, kami menggunakan uji berbasis Annexin V-FITC melalui flow cytometry, untuk menentukan secara kuantitatif derajat apoptosis. Hasilnya menyatakan bahwa nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF dapat menginduksi apoptosis pada 21,8% sel MDA-MB-231 (File tambahan 1:Gbr. 6s). Persentase ini lebih tinggi daripada yang tercatat untuk ART, menyiratkan bahwa apoptosis terlibat dalam nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF yang dimediasi, tetapi itu bukan penyebab utama.
a Inhibitor DFO (deferoxamine), Fer-1 (Ferrostatin-1) dan Z-VAD-FMK menyelamatkan viabilitas sel MDA-MB-231 yang dirawat dengan masing-masing 100 g/mL TA-Fe/ART@ZIF nanopartikel. b Nanopartikel ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF berkontribusi pada MDA berlebihan dalam sel MDA-MB-231. c Nanopartikel ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF mengkonsumsi GSH intraseluler. d Tingkat ekspresi protein GPX4 dalam sel MDA-MB-231 yang diobati dengan nanopartikel ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF
Sebuah fitur umum dari ferroptosis adalah peroksidasi lipid endogen [39]. MDA, produk peroksidasi lipid [40], diselidiki untuk menilai tingkat ferroptosis. Hasil menunjukkan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF memiliki kadar MDA sekitar 2,5 kali lebih tinggi daripada kelompok kontrol (Gbr. 6b). Hal ini diduga karena adanya Fe(II) yang diperkaya nanocarrier dan peningkatan kadar radikal lipid yang sesuai. Sebagai salah satu komponen antioksidan utama dalam sel, GSH intraseluler menurun disertai dengan ferroptosis [41]. Mempertimbangkan peran impor GSH dalam ferroptosis, kami mengevaluasi tingkat GSH intraseluler setelah perawatan dengan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF. GSH menurun secara signifikan dibandingkan dengan sel yang dirawat dengan kendaraan (Gbr. 6c). Ini memberikan bukti kuat untuk penipisan GSH dan ketidakseimbangan oksidasi, yang berpusat pada aktivasi ART yang dimediasi Fe(II) oleh nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF. Selanjutnya, western blotting dilakukan untuk memahami dampak nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF pada aktivitas GPX4 [42]. Kami mengamati bahwa nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF menyebabkan penghambatan aktivitas GPX4 yang lebih signifikan daripada ART (Gbr. 6d). Data ini juga sesuai dengan tingkat penipisan GSH tertinggi.
Eksperimen Antitumor Dalam Vivo
Kami mengevaluasi kemanjuran antitumor nanopartikel kami ke sel MDA-MB-231 in vivo dengan penghambatan tumor xenograft subkutan pada tikus telanjang yang mengandung tumor. Selama perawatan 14 hari, relatif terhadap kelompok lain, nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF dapat secara signifikan menghambat pertumbuhan tumor xenograft MDA-MB-231 sebagai hasil dari pembentukan ROS yang melimpah melalui reaksi Fe(II)-ART (Gbr. . 7a). Selain itu, tidak ada perbedaan berat badan yang signifikan pada semua kelompok eksperimen (Gbr. 7b), yang menunjukkan bahwa TA-Fe/ART@ZIF memiliki efek samping yang dapat diabaikan. Untuk mempelajari lebih lanjut efek terapeutik, tumor dan jaringan normal lainnya diperiksa dengan pewarnaan H&E setelah dirawat selama 14 hari. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8, TA-Fe/ART@ZIF menyebabkan wilayah kematian sel terbesar di jaringan tumor, sementara tidak ada kerusakan dan apoptosis yang jelas pada jaringan normal. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa terapi yang dimediasi TA-Fe/ART@ZIF tidak hanya menyebabkan kemanjuran antikanker, tetapi juga memiliki tingkat toksisitas sistematis akut yang rendah dalam terapi yang dimediasi SFT-MB.
a Relative tumor volume after treated with treated with PBS, ART, TA-Fe/ZIF, and TA-Fe/ART@ZIF nanoparticles. b Relative mice body weight of various groups
H&E stains of organs and tumors from various mice groups. Scale bar:50 μm
Conclusion
In summary, ferroptosis provides a potential remedy for TNBC treatments, since it has exclusive advantages to overcome inevitable barriers of the currently prevalent therapy. Here, we designed a ferrous-supply nanocarrier for ART based on TA–Fe(II) coated on the ZIF nanoparticles with ART encapsulated via coordination-driven self-assembly for enhanced ferroptosis. The nano-carrier could be dissolved in the weak acidic microenvironment to release ART and Fe(II), which is further caused a high level of intracellular ROS and MDA, accompanied with decreasing of GSH and GPX4, leading to potent tumor growth inhibition and anticancer efficacy in vitro and in vivo. This work provides a novel approach to enhance the potency of ferroptotic nano-medicine and new directions for TBNC therapy. Biocompatibility and comprehensive mechanisms of TA-Fe/ART@ZIF-induced ferroptosis should be ensured for further investigation.
Ketersediaan data dan materi
Semua data tersedia sepenuhnya tanpa batasan.
Singkatan
MOF:
Metal–organic frameworks
TNBC:
Triple-negative breast cancer
ART:
Artemisinin
TA:
Tannic acid
ZIF:
Zeolitic imidazolate framework-8
TA-Fe/ART@ZIF:
Tannic acid and ferrous ion coated on the zeolitic imidazolate framework-8 with artemisinin encapsulated
