Pengiriman Terkait Artemisinin melalui MOF Terselubungi Fe(II)-Asam Tanin Meningkatkan Ferroptosis pada Kanker Payudara Triple-Negatif
Abstrak
Penindasan perkembangan tumor dengan menginduksi ferroptosis mungkin menyediakan obat potensial untuk kanker payudara triple-negatif, yang sensitif terhadap ketidakseimbangan oksidasi intrakelular. Baru-baru ini, artemisinin (ART) dan turunannya telah diselidiki sebagai agen antikanker potensial untuk pengobatan kanker yang sangat agresif melalui induksi ferroptosis oleh pemotongan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi. Karena keacaran air yang buruk dan konten besi intrakelular yang terbatas, tantang untuk aplikasi lebih lanjut dalam terapi antitumor. Di sini, kami mengembangkan nanokarier penyedia besi ferrous untuk ART berdasarkan asam tanin (TA) dan ion besi ferrous (Fe(II)) yang dilapisi pada kerangka imidazolat zeolit-8 (ZIF) dengan ART terenkapsulasi (TA-Fe/ART@ZIF) melalui self-assembly yang didorong koordinasi. Eksperimen pelepasan obat menunjukkan bahwa ART hampir tidak dilepaskan pada pH 7,4, sementara 59% ART dilepaskan pada pH 5,0 setelah 10 jam, menunjukkan pelepasan yang dirangsang pH yang luar biasa. Sementara itu, tingkat ROS dan MDA intrakelular yang tinggi, dituruninya GSH dan GPX4, menunjukkan bahwa sistem nanobatuk baru ini secara signifikan meningkatkan ferroptosis. Membandingkan dengan monoterapi, eksperimen penindasan tumor in vitro dan in vivo menunjukkan efisiensi penindasan tumor yang lebih tinggi untuk TA-Fe/ART@ZIF. Karya ini menyediakan pendekatan baru untuk meningkatkan potensi nanobatuk ferroptotik dan arah baru untuk terapi TBNC.
Pendahuluan
Ferroptosis, subtipe kematian sel yang baru ditemukan, dapat mengakibatkan acumulasi hidroperoksida lipid yang bergantung besi (LPO), yang mengakibatkan kerusakan struktur dan integritas sel [1,2,3]. Bukti yang muncul menyiratkan bahwa aktivasi ferroptosis oleh beberapa molekul kecil adalah pendekatan efektif untuk penindasan tumor dalam berbagai model kanker eksperimental dan menciptakan harapan tinggi bagi potensi ferroptosis sebagai terapi antikanker baru [4,5,6]. Kanker payudara triple-negatif (TNBC) adalah subtipe kanker payudara yang paling agresif yang kurang memiliki terapi target dan sering terkait dengan rekuren tumor, metastase jarak jauh, dan resistensi terhadap terapi [7]. Studi sebelumnya telah menyingkatkan bahwa antiporter cystine/glutamate xCT sangat diekspresi dalam banyak sel TNBC, memerankan peran penting dalam mempertahankan tingkat glutation (GSH) dan keseimbangan redoks [8]. Pengurangan konten GSH intrakelular dapat membuat sel TNBC sensitif terhadap ferroptosis, sehingga membunuh sel tumor [8]. Secara menonjol, ferroptosis juga dapat melewati resistensi TNBC terhadap apoptosis terprogram rutin [9]. Oleh karena itu, strategi atau obat berdasarkan induksi ferroptosis mungkin memiliki potensi terapeutik untuk pengobatan klinis TNBC yang sulit diobati.
Artemisinin (ART), lakton seskiterpena yang mengandung grup peroksida, diisolir dari tumbuhan tradisional Tiongkok Artemisia annua dan telah menunjukkan aktivitas antitumor yang diinginkan pada berbagai baris sel kanker [10, 11]. Bukti yang meningkat menunjukkan bahwa sel kanker mengandung significantly lebih banyak pool besi intrakelular daripada sel normal, sementara pemotongan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi memungkinkan ART untuk secara selektif menyebabkan kematian sel pada berbagai baris sel kanker [12, 13]. Aktivitas antitumor yang bergantung ion besi telah menarik perhatian yang meningkat pada ferroptosis yang diatur oleh ART [13]. Secara mekanisme, ART dapat menginduksi degradasi lisosom ferritin dengan cara independen otophagi, meningkatkan kadar besi ferrous seluler dan sensibilisasi sel terhadap ferroptosis [11].
Namun, apakah ART menginduksi ferroptosis pada TNBC masih belum jelas. Selain itu, serangkaian faktor, seperti keacaran air yang buruk dan ketersediaan besi ferrous intrakelular yang tidak cukup, membatasi aplikasi lebih lanjut ART dalam terapi antitumor [13]. Nanokompleks ART diharapkan dapat digunakan dengan sukses sebagai sistem pengiriman nanobatuk calon untuk obat antitumor berbasis ART [14,15,16]. Dalam beberapa tahun terakhir, kerangka logam-organik (MOF), kelas material polimerik berlubang, menarik perhatian karena demonstrasi pori yang luas, luas permukaan tampak yang tinggi, dan penyerapan selektif molekul kecil [17,18,19]. Sebagai perwakilan material tipe MOF, kerangka imidazolat zeolit (ZIF-8) banyak digunakan dalam pengembangan nanobatuk dengan karakteristik responsif pH, pemuatan obat yang tinggi, dan kompatibilitas biologis yang baik [20,21,22,23]. Selain itu, kemampuan untuk menggabungkan permukaan yang dapat disesuaikan pada MOF memungkinkan kontrol properti permukaan dan pemberinya multifungsi [24, 25]. Assembly supramolekuler lapisan koordinasi logam-fenol pada permukaan MOF baru-baru ini menarik perhatian karena properti yang diinginkan, seperti desassembly yang dirangsang rangsang, stabilitas koloidal, dan kompatibilitas biologis [26, 27]. Material koordinasi logam-fenol pada MOF bisa menjadi kendaraan ideal untuk mengirimi ART yang hidrofobik.
Terinspirasi oleh ini, kami mengembangkan sistem nano ZIF-8 yang dilapisi koordinasi ion besi ferrous–asam tanin mengenkapsulasi ART (TA-Fe/ART@ZIF) untuk mengatur ferroptosis pada sel TNBC, yang divisualisasikan pada Gambar 1. ZIF-8 dipilih sebagai nanokarier untuk mengenkapsulasi ART karena kompatibilitas biologis yang baik dan pelepasan responsif pH. Lapisan koordinasi ion besi ferrous–TA diimobilkan pada permukaan ART@ZIF untuk tujuan stabilitas dispersi dan penyediaan ion besi ferrous (Fe(II)). Setelah internalisasi sistem nano yang disiapkan dalam sel, degradasi asam kendaraan akan memfasilitasi pelepasan ART dan akuumulasi Fe(II). Pengaturan tingkat Fe(II) dalam sel akan memecah ART menjadi radikal melalui pemotongan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi, secara signifikan meningkatkan efek ferroptosis. Secara kesimpulan, penemuan ferroptosis yang diinduksi oleh TA-Fe/ART@ZIF mungkin menawarkan perspektif baru untuk pengembangan pengobatan baru terhadap TNBC.
Representasi skematis persiapan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF dan induksi sinergis apoptosis/ferroptosis pada sel tumor
Bahan dan Metode
Reagen
Artemisinin (99%), 2-metilimidazol (98%), nitrat sengk (ZnNO3; 98%), Ta (98%), sulfat besi ferrous (FeSO4; 98%), dan metanol anhydra disediakan oleh Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Tiongkok).
Pembuatan Nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF
Untuk persiapan nanopartikel ART@ZIF, 200 mg ART dilarutkan dalam 1 mL metanol anhydra, dan 2 g 2-metilimidazol (pelarutnya 8 mL metanol murni) ditambahkan perlahan ke dalam larutan ART yang diperoleh. Di bawah pengadukan magnetik, 0,2 g nitrat sengk (pelarutnya 1 mL metanol murni) ditambahkan perlahan. Akhirnya, volume larutan disesuaikan menjadi 15 mL dan diaduk selama 10 menit untuk mendapatkan larutan putih kekuningan. Setelah sentrifugasi pada 10.000 rpm, sampel dicuci tiga kali dengan metanol. Supernatan digunakan untuk mengukur kandungan ART, sedangkan endapan di-freeze-drying untuk mendapatkan bentuk padat untuk penggunaan lebih lanjut.
Untuk persiapan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF, larutan TA (40 mg/mL dalam air tisu, 2 mL) ditambahkan perlahan ke dalam larutan ART@ZIF (10 mg/mL, 4 mL). Setelah diaduk selama 20 menit, 5 mg/mL FeSO4 ditambahkan perlahan ke dalam larutan di atas. Setelah diaduk berulang selama 30 menit, larutan ungu tua diperoleh. Akhirnya, endapan dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 10.000 rpm. Endapan dicuci tiga kali dengan air tisu dan di-freeze-drying untuk mendapatkan TA-Fe/ART@ZIF untuk penggunaan lebih lanjut.
Karakterisasi
TEM (JEM-1230; JEOL, Tokyo, Jepang) digunakan untuk menentukan morfologi dan komposisi elemen setiap bagian nanopartikel. Pencaran cahaya dinamis dan potensial zeta (DLS; sistem Zetasizer Nano Malvern Instruments, Malvern, Inggris) digunakan untuk mengevaluasi ukuran partikel dan stabilitas listrik nanopartikel. Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (VERTEX 70; Bruker, Bremen, Jerman) dan analisis termogravimetri digunakan untuk menganalisis komposisi konstituen nanopartikel. Pengukuran spektroskopi fotoelektroni X-ray (XPS) dilakukan menggunakan PHI 5000 Versa Probe III (Physical Electronics). Komposisi elemen material TA-Fe/ART@ZIF dilakukan dengan menggunakan EDX (Carl Zeiss Model: Neon-40).
Pengukuran Efisiensi Enkapsulasi dan Kapasitas Pemuatan
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) (Agilent 1200; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) digunakan untuk mengukur jumlah ART dalam supernatant. Pemuatan obat dan laju enkapsulasi ART dapat dihitung sebagai berikut: $${\text{Drug}}\,{\text{loading}}\,(\%) = \frac{{{\text{Actual}}\,{\text{amount}}\,{\text{of}}\,{\text{drug}}\,{\text{encapsulated}}\,{\text{in}}\,{\text{NPs}}}}{{{\text{Amount}}\,{\text{of}}\,{\text{NPs}}}} \times 100\%$$$${\text{Entrapment}}\,{\text{efficiency}}\,\% = \frac{{{\text{Actual}}\,{\text{amount}}\,{\text{of}}\,{\text{drug}}\,{\text{encapsulated}}\,{\text{in}}\,{\text{NPs}}}}{{{\text{Initial}}\,{\text{of}}\,{\text{amount}}\,{\text{of}}\,{\text{drug}}\,{\text{used}}}} \times 100\%$$
Pelepasan In Vitro dan Respons pH Nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF
Membran dialysis yang dibungkus dengan 2 mg nanopartikel ditempatkan dalam 50 mL larutan buffered fosfat (PBS) dengan pH 7,4 dan 5,0, masing-masing, dan diaduk terus-menerus pada 37 °C. Larutan di luar membran dialysis diambil pada 15 menit, 30 menit, 45 menit, 1 jam, 2 jam, 4 jam, 6 jam, 8 jam, dan 10 jam setelah awal eksperimen. Kandungan ART dalam larutan buffer diukur menggunakan HPLC.
Kultur Sel
Baris sel MDA‐MB‐231 dan L929 diperoleh dari American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, Manassas, VA, Amerika Serikat). Sel dikultur pada 37 °C dan 5% CO2 kelembaban dalam medium RPMI-1640 (Solarbio, Beijing, Tiongkok), yang dilengkapi dengan 10% serum bayi sapi (Cyclone, Utah, AS), 100 µg/mL natrium piruvat, penisilin, dan streptomisin (Solarbio Beijing, Tiongkok).
Uji Toksisitas Sel In Vitro
Viabilitas sel ditentukan menggunakan uji 3-(4, 5-dimetilthiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) sesuai prosedur literatur [28, 29].
Sel MDA-MB-231 dan L929 dikultur dalam medium sel standar di piring 96 lubang (5.000 sel per lubang) dan diinkubasi dalam 5% CO2 pada 37 °C selama 24 jam. Cairan di lubang dibuang, dan 100 µL per lubang medium bebas serum dengan PBS dan berbagai konsentrasi ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, deferoxamine (DFO, MedChemExpress, Shanghai, Tiongkok), N-benzyloksikarbonil-Val-Ala-Asp(O-Me) fluorometil ketone (Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Shanghai, Tiongkok), dan ferrostatin-1 (Fer1, MedChemExpress, Shanghai, Tiongkok) ditambahkan ke piring 96 lubang. Setelah 48 jam, 10 µL MTT (5 mg/mL) ditambahkan dan diinkubasi selama 4 jam lagi. Akhirnya, penanda enzim otomatis (BioTek Instruments Inc., AS) digunakan untuk mengukur serapan di setiap lubang. Hasil dinyatakan sebagai persentase viabilitas sel.
Uji Pewarnaan Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM)
Sel MDA-MB-231 dikultur di piring 24 lubang (2 × 104 sel per lubang) dan diinkubasi selama 24 jam. Kemudian, sel diberi perawatan dengan berbagai konsentrasi nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF selama 24 jam. Setelah membuang medium, sel divarnai dengan Calcein-AM (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Tiongkok) dalam kegelapan pada 4 °C selama 20 menit dan diamati di bawah mikroskop terbalik fluoresensi (Olympus, Tokyo, Jepang).
Sitometria Aliran untuk Apoptosis
Sel MDA-MB-231 ditempatkan di piring enam lubang dengan kepadatan 2,5 × 105 sel per lubang dalam kondisi yang sama. Setelah perawatan dengan PBS, ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF diberikan selama 24 jam. Kemudian, sel diusentrifugasi dan dikumpulkan dari piring enam lubang. Setelah pewarnaan ganda iodida propidium dan Annexin-V (Kit Annexin V‐FITC; Beckman Coulter, Marseille, Prancis), sitometria aliran digunakan untuk mendeteksi.
Uji Penetapan Reaktif Oksigen (ROS) In Vitro
Kandungan ROS dalam sel dilakukan menggunakan sonda fluoresensi ROS (dikloro-dihidro-fluoresin diasetat (DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Tiongkok). Sel MDA-MB-231 dikultur di piring enam lubang (2,5 × 105 sel per lubang) dan diinkubasi dalam 5% CO2 pada 37 °C selama 24 jam. Cairan dari lubang dibuang, dan sel diberi perawatan sebagai berikut: grup kontrol kosong (medium bebas serum), grup kontrol positif, dan grup eksperimen (berbagai konsentrasi nanopartikel). Setelah diinkubasi selama 8 jam pada 37 °C, 0,1% DCFH-DA ditambahkan ke setiap lubang dan sel diinkubasi selama 30 menit. Sel yang tidak responsif terhadap DCFH-DA dibuang dengan PBS dan diamati di bawah mikroskop terbalik fluoresensi (Olympus, Tokyo, Jepang).
Penetapan Kandungan Malondialdehid (MDA) dan GSH
Kit uji MDA (metode TBA; Jiancheng Bioengineering, Nanjing, Tiongkok) dan kit uji GSH (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Tiongkok) digunakan untuk mengukur tingkat intrakelular MDA dan GSH. Setelah perawatan dengan PBS, ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF, sel MDA-MB-231 dikumpulkan dan dihitung. Kandungan intrakelular MDA dan GSH ditentukan sesuai petunjuk yang tersedia dalam kit.
Analisis Western Blot
Sel MDA-MB-231 yang diberi perawatan berbagai nanopartikel, dilisis dengan buffer lisis RIPA. Setelah konsentrasi protein ditentukan, protein dari sampel berbeda dipisahkan menggunakan gel SDS-PAGE 10% dan ditransfer ke membran nitroselulosa. Membran nitroselulosa yang dimuat protein sampel diblokir dengan larutan protein BSA 0,5% selama 1 jam, dan membran nitroselulosa dan antibodi primer diinkubasi selama 24 jam pada 4 °C. Kami mencuci antibodi primer dari membran nitroselulosa dengan TBST dan terus menempatkannya dengan antibodi sekunder yang sesuai pada suhu ruang selama 2 jam. Setelah mencuci antibodi sekunder pada membran selulosa, membran nitroselulosa digunakan larutan kemiluminesensi dan diamati di bawah sistem citra gel.
Eksperimen Antitumor In Vivo
Semua eksperimen hewan disetujui oleh Komite Etika Universitas Medis Weifang. Tikus nude wanita sehat (usia: 4 minggu; berat badan: 13–17 g; Vital River, Beijing, Tiongkok) diberi administrasi 5 × 106 sel MDA-MB-231 dalam 150 µl larutan buffered fosfat. Ketika volume tumor meningkat menjadi 70–120 mm3, tikus dibagi secara acak ke dalam empat grup. Setiap grup tikus diberi perawatan terpisah dengan PBS, ART (20 mg/kg), TA-Fe/ZIF (80 mg/kg), dan TA-Fe/ART@ZIF (100 mg/kg). Setiap tikus diperlakukan dengan injeksi intraperitoneal setiap tiga hari. Setelah 14 hari, semua tikus dibunuh. Jaringan tumor dan organ penting dikumpulkan untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin.
Analisis Statistik
Semua eksperimen diulang paling tidak tiga kali. Semua data dianalisis statistik menggunakan perangkat lunak SPSS versi 22,0 (IBM Corp., Armonk, AS). Hasil dinyatakan sebagai rata-rata ± simpangan baku. Nilai P < 0,05 menunjukkan signifikansi statistik.
Hasil dan Pembahasan
Karakterisasi Nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF
Pertama, nanopartikel ART@ZIF disintesis pada suhu ruang dari metanol, asetat sengk, 2-metilimidazol, dan ART sesuai prosedur literatur [30]. Film supramolekuler logam-polifenol stabil kemudian terbentuk dengan cepat di sekitar templat ART@ZIF dengan mengaduk TA dan ion besi ferrous. Membandingkan dengan nanopartikel magnetik yang dilaporkan [31,32,33], TA-Fe/ART@ZIF disiapkan melalui metode self-assembly yang membentuk membran TA-Fe pada permukaan MOF tanpa melibatkan reaksi kimia atau hidrotermal yang kasar. Yang lebih penting, nanokarier TA-Fe/ART@ZIF dapat dirangsang oleh pH rendah, untuk melepaskan ART dan Fe(II), yang kemudian dikatalisis oleh endoperoksida ART untuk menghasilkan radikal berpusat C, secara signifikan meningkatkan ferroptosis. Efisiensi enkapsulasi, yang diukur oleh HPLC menggunakan supernatant dari sentrifugasi pertama, adalah 66,7%. Supernatan diperoleh dari nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF, dan beban obat ART yang dihitung adalah 11,4%. Menurut spektroskopi FTIR (Gambar 2a), puncak serapan karakteristik ART, yaitu ikatan karbonil pada 1.738 cm−1 dan jembatan peroksida pada 724 cm−1 [34], diamati dalam nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF, menunjukkan bahwa ART berhasil terenkapsulasi dalam nanopartikel. Selanjutnya, hasil analisis termogravimetri menunjukkan bahwa ART hilang sepenuhnya ketika suhu meningkat menjadi sekitar 400 °C (Gambar 2b). Membandingkan dengan nanopartikel TA-Fe/ZIF, ditemukan bahwa ART menyumbang 7,1% dari total berat nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF, yang pada dasarnya konsisten dengan hasil analisis HPLC.
a FTIR dari ART, ZIF-8, dan TA-Fe/ART@ZIF; b Analisis termogravimetri (TGA) dari ART, TA-Fe/ZIF, dan TA-Fe/ART@ZIF
Hasil TEM menunjukkan bahwa ZIF-8 dan ART@ZIF menunjukkan konfigurasi heksagon seragam yang sama, dan distribusi ukuran partikel ditentukan sekitar 100 nm (Gambar 3a, b). Nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF menunjukkan konfigurasi bola, dan distribusi ukuran partikel adalah 150 nm. Membandingkan dengan ART@ZIF lengkap, TA-Fe/ART@ZIF yang dilapisi Fe(II) dan TA menunjukkan struktur inti-konvensional yang jelas, dan ukuran membran TA-Fe sekitar 30 nm (Gambar 3a). Selain itu, kami melakukan analisis pemetaan elemen area dari nanopartikel yang terbentuk. Analisis pemetaan elemen area mengonfirmasi bahwa periferi nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF dikelilingi oleh elemen Fe, menunjukkan bahwa Fe(II) dan TA berhasil terselubungi (Gambar 3b). Pengukuran XPS dilakukan untuk menyelidiki komposisi elemen permukaan dan interaksi dalam komposit TA-Fe/ART@ZIF. Spektra XPS wide-scan TA-Fe/ART@ZIF digambarkan dalam File tambahan 1: Fig. 1s. Puncak utama yang muncul sekitar 285, 408, 531, 737, dan 1036 eV berkaitan dengan C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p, dan Zn 2p, masing-masing, menunjukkan pembentukan nanokomposit TA-Fe/ART@ZIF. Selanjutnya, citra pemetaan EDS TA-Fe/ART@ZIF ditunjukkan dalam File tambahan 1: Fig. 2s. Dapat terlihat jelas bahwa puncak yang sesuai dengan elemen seperti karbon (C), nitrogen (N), oksigen (O), besi (Fe), dan sengk (Zn), sesuai dengan spektra XPS. Dengan menambahkan jumlah Fe(II), kami menemukan bahwa diameter hidrodinamis nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF meningkat (File tambahan 1: Fig. 3s). Untuk mengonfirmasi pelapisan lebih lanjut, kami mengukur potensial zeta berbagai nanopartikel. Pembentukan lapisan TA–Fe(II) pada partikel ART@ZIF menggeser potensial zeta permukaan dari + 21 mV menjadi − 19,5 mV karena sifat asam TA (File tambahan 1: Fig. 4s). Seperti yang dilaporkan dalam literatur sebelumnya [30], grup polifenol yang melimpah dalam struktur TA tidak hanya memberi kemampuan pelapisan substrat, tetapi juga mampu berkoordinasi dengan ion logam transisi (Fe, Zn) untuk membentuk kompleks logam-fenol. Ketika Zn2+ dan Hmim dicampur untuk membentuk larutan, banyak ion Zn2+ akan berkoordinasi pada permukaan partikel ART@ZIF; sehingga potensial zeta ART@ZIF adalah + 21 mV. Grup fenol TA (pKa 8,5) dideprotonasi secara negatif dan oleh karena itu dapat berinteraksi dengan Zn2+> yang bermuatan positif, mempromosikan pertumbuhan film TA–Fe pada permukaan ART@ZIF. Karena pengiriman obat mengedepankan kendaraan, stabilitas adalah faktor penting untuk aplikasi medisnya. Stabilitas nanopartikel ditunjukkan dengan mendisperdi dalam PBS selama satu minggu. Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1: Fig. 5s, ukuran partikel menunjukkan ukuran dan stabilitas yang diinginkan dari waktu ke waktu studi.
a Citra TEM dan distribusi ukuran ZIF-8, ART@ZIF, dan nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF. Skala bar: 100 nm; b distribusi elemen karbon dan besi dalam nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF. Skala bar: 100 nm
a Pelepasan ART in vitro dari nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF pada pH 7,4 dan 5,0. b Sitotoksisitas ART, TA-Fe/ZIF, dan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF pada sel MDA-MB-231 pada 0, 12,5, 25, 50, dan 100 μg/mL. c Viabilitas sel L929 yang diperlakukan dengan TA-Fe/ART@ZIF pada berbagai konsentrasi. d Pewarnaan Calcein-AM sel MDA-MB-231 yang diperlakukan dengan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF pada konsentrasi 0, 25, 50, dan 100 μg/mL
Produksi ROS terdeteksi oleh fluoresensi DCFH-DA pada sel MDA-MB-231 yang diperlakukan dengan ART, TA-Fe/ZIF, dan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF
Pelepasan dan Sitotoksisitas TA-Fe/ART@ZIF In Vitro
Selanjutnya, untuk meneliti apakah TA-Fe/ART@ZIF memiliki perilaku dekomposisi responsif pH, kami memeriksa pelepasan ART dari nanopartikel dalam kondisi netral dan asam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4a, dalam kondisi asam, nanopartikel dapat dengan cepat melepaskan sekitar 58% ART dalam 1 jam. Namun, dalam kondisi netral, nanopartikel hanya dapat melepaskan jumlah ART yang sangat kecil secara lambat. Selain itu, selama pengolahan larutan luar membran dialysis dengan natrium hidroksida, larutan grup pH = 5,0 bereaksi dengan natrium hidroksida untuk menghasilkan endapan putih yang besar. Namun, fenomena ini tidak diamati pada grup pH = 7,4.
Menurut hipotesis kami, endapan putih adalah endapan hidroksida sengk yang terbentuk dari disosiasi ion sengk dan alkali dari nanopartikel dalam kondisi asam. Secara kolektif, bukti ini berhasil menunjukkan bahwa nanopartikel kami memiliki kemampuan untuk disosiasi dalam kondisi asam.
Dalam desain sistem nano TA-Fe/ART@ZIF, struktur TA-Fe(II) dan ZIF diablasi untuk melepaskan ART dan Fe(II) yang tertutup dalam kondisi asam mikroenvironment tumor. Pengaturan tingkat Fe(II) dalam sel akan memecah ART menjadi radikal melalui pemotongan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi, secara signifikan meningkatkan efek ferroptosis. Oleh karena itu, uji MTT dilakukan untuk mempelajari sitotoksisitas sistem nano terhadap sel MDA-MB-231 dan L929. Membandingkan dengan ART, nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF menunjukkan sitotoksisitas yang lebih besar terhadap sel MDA-MB-231 (Gambar 4b) dan sitotoksisitas rendah terhadap sel normal (Gambar 4c). Nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF menghambat aktivitas sel MDA-MB-231 sebesar 53,9%, sementara ART pada konsentrasi yang sama hanya menghambat 24,1% dari seluruh sel. Hasil eksperimen pewarnaan calcein-AM mengonfirmasi bahwa jumlah sel MDA-MB-231 yang hidup berturun secara bertahap seiring meningkatnya konsentrasi nanopartikel TA-Fe/ ART@ZIF (Gambar 4d).
TA-Fe/ART@ZIF Meningkatkan Generasi ROS pada Sel MDA-MB-231
ART dikenal menghasilkan aktivitas antikankernya melalui generasi ROS yang dihasilkan oleh pemotongan jembatan endoperoksida yang dimediasi besi [35, 36]. Oleh karena itu, kami telah memeriksa efisiensi TA-Fe/ ART@ZIF untuk menginduksi generasi ROS dengan sonda dikloro-dihidro-fluoresin diasetat (DCHF-DA) [37]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5, sinyal fluoresensi yang sedikit lebih kuat diamati pada sel yang diperlakukan dengan ART dan TA-Fe/ZIF dibandingkan grup yang tidak diberi perawatan, menunjukkan bahwa ion ART dan Fe(II) dapat menginduksi generasi ROS. Sebaliknya, sinyal fluoresensi yang kuat terpapar pada nano-obat TA-Fe/ ART@ZIF ditemukan dalam sel sebagai bukti hasil ROS yang diinginkan, yang dihasilkan oleh pemotongan endoperoksida ART yang dimediasi Fe(II). Sistem nano yang disiapkan dalam sel akan terdegradasi dan membuat akuumulasi Fe(II), secara luar biasa meningkatkan generasi ROS. Efek antikanker ART dan turunannya telah diatribusikan pada kemampuan mereka untuk menginduksi apoptosis melalui berbagai proses seluler, berkisar dari respons kerusakan DNA, proses katabolik lisosom makrootophagi, dan stres oksidatif [13, 35, 38]. Dan juga telah dilaporkan bahwa pemotongan jembatan endoperoksida dalam ART yang dimediasi besi dapat mempengaruhi keseimbangan oksidasi intrakelular menjadi ferroptosis pada banyak jenis sel kanker [11]. Induksi ferroptosis ini berdasarkan ketidakseimbangan oksidatif dapat diperluas lebih lanjut dengan penambahan Fe(II). Sementara Fe(II) mengaktifkan ART, itu juga dapat bereaksi dengan peroksida hidrogen intrakelular untuk menghasilkan radikal hidroksil melalui reaksi Fenton, yang meningkatkan efek penginduksi apoptosis ART pada sel tumor.
TA-Fe/ART@ZIF Menginduksi Apoptosis dan Ferroptosis pada Sel MDA-MB-231
Sementara itu, untuk menyelidiki kematian sel dan peran Fe(II), kami menggunakan chelator besi deferoxamine, inhibitor apoptosis Z-VAD-FMK, dan inhibitor ferroptosis ferrostatin-1 untuk menyelamatkan sel ini. Seperti yang diprediksi, deferoxamine, pengedar Fe(II), dapat dengan jelas mencegah kematian sel, menunjukkan peran penting Fe(II). Selain itu, tingkat kelangsungan hidup sel MDA-MB-231 secara signifikan meningkat oleh inhibitor apoptosis dan ferroptosis dari 31,4% menjadi 56,3% dan 76,0%, masing-masing (Gambar 6a), menyoroti pentingnya apoptosis dan ferroptosis dalam kematian sel yang diinduksi oleh nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF. Selain itu, kami menggunakan tes berbasis Annexin V- FITC melalui sitometria aliran, untuk menentukan secara kuantitatif tingkat apoptosis. Hasilnya menyatakan bahwa nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF dapat menginduksi apoptosis pada 21,8% sel MDA-MB-231 (File tambahan 1: Fig. 6s). Persentase ini lebih tinggi dari yang dicatat untuk ART, yang menyiratkan bahwa apoptosis terlibat dalam nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF yang diinduksi, tetapi bukan penyebab utama.
a Inhibitor DFO (deferoxamine), Fer-1 (Ferrostatin-1) dan Z-VAD-FMK menyelamatkan kelangsungan hidup sel MDA-MB-231 di bawah perawatan dengan 100 μg/mL nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF, masing-masing. b ART, TA-Fe/ZIF, dan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF berkontribusi pada MDA berlebihan pada sel MDA-MB-231. c ART, TA-Fe/ZIF, dan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF mengkonsumsi GSH intrakelular. d Tingkat ekspresi protein GPX4 pada sel MDA‐MB‐231 yang diperlakukan dengan ART, TA-Fe/ZIF, dan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF
Ciri umum ferroptosis adalah peroksidasi lipid endogen [39]. MDA, produk peroksidasi lipid [40], diselidiki untuk menilai tingkat ferroptosis. Hasil menunjukkan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF memiliki tingkat MDA sekitar 2,5 kali lebih tinggi dari grup kontrol (Gambar 6b). Ini diduga karena kehadiran Fe(II) yang diperkaya nanokarier dan ketinggian yang sesuai dari tingkat radikal lipid. Sebagai salah satu komponen antioksidan utama dalam sel, GSH intrakelular berkurang disertai ferroptosis [41]. Mempertahankan peran penting GSH dalam ferroptosis, kami mengevaluasi tingkat GSH intrakelular setelah perawatan dengan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF. GSH berkurang secara signifikan dibandingkan sel yang diberi kendaraan (Gambar 6c). Ini memberikan bukti kuat untuk depleksi GSH dan ketidakseimbangan oksidasi, yang berpusat pada aktivasi ART yang dimediasi Fe(II) oleh nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF. Selanjutnya, western blotting dilakukan untuk memahami dampak nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF terhadap aktivitas GPX4 [42]. Kami mengamati bahwa nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF menyebabkan inhibisi yang lebih signifikan pada aktivitas GPX4 daripada ART (Gambar 6d). Data ini juga sangat sesuai dengan tingkat depleksi GSH yang tertinggi.
Eksperimen Antitumor In Vivo
Kami mengevaluasi efikasi antitumor nanopartikel kami terhadap sel MDA-MB-231 in vivo dengan penindasan tumor xenograft subkutan pada tikus nude yang membawa tumor. Selama pengobatan 14 hari, relatif terhadap grup lain, nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF dapat secara signifikan menghambat pertumbuhan tumor xenograft MDA-MB-231 sebagai hasil dari generasi ROS yang melimpah melalui reaksi Fe(II)-ART (Gambar 7a). Selain itu, tidak ada perbedaan yang signifikan pada berat badan tikus di semua grup eksperimen (Gambar 7b), menunjukkan bahwa TA-Fe/ART@ZIF memiliki efek samping sistemik akut yang tidak signifikan. Untuk mempelajari lebih lanjut efek terapeutik, tumor dan jaringan normal lainnya diperiksa dengan pewarnaan H&E setelah diperlakukan selama 14 hari. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8, TA-Fe/ART@ZIF menyebabkan wilayah kematian sel terbesar dalam jaringan tumor, sementara tidak ada kerusakan dan apoptosis yang jelas pada jaringan normal. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa terapi yang diinduksi oleh TA-Fe/ART@ZIF tidak hanya mengarah pada efikasi antikanker, tetapi juga memiliki tingkat toksisitas sistemik akut yang rendah dalam terapi SFT-MB.
a Volume tumor relatif setelah diperlakukan dengan PBS, ART, TA-Fe/ZIF, dan nanopartikel TA-Fe/ART@ZIF. b Berat badan tikus relatif dari berbagai grup
Pewarnaan H&E organ dan tumor dari berbagai grup tikus. Skala bar: 50 μm
Kesimpulan
Secara ringkas, ferroptosis menyediakan obat potensial untuk perawatan TNBC, karena memiliki keunggulan eksklusif untuk mengatasi hambatan yang tidak terhindarkan dari terapi yang saat ini prevalen. Di sini, kami merancang nanokarier penyedia besi ferrous untuk ART berdasarkan pelapisan TA–Fe(II) pada nanopartikel ZIF dengan ART terenkapsulasi melalui self-assembly yang didorong koordinasi untuk ferroptosis yang ditingkatkan. Nanokarier dapat terlarut dalam mikroenvironment asam lemah untuk melepaskan ART dan Fe(II), yang kemudian menyebabkan tingkat ROS dan MDA intrakelular yang tinggi, dituruninya GSH dan GPX4, yang mengarah pada penindasan pertumbuhan tumor yang kuat dan efikasi antikanker in vitro dan in vivo. Karya ini menyediakan pendekatan baru untuk meningkatkan potensi nanobatuk ferroptotik dan arah baru untuk terapi TBNC. Kompatibilitas biologis dan mekanisme komprehensif TA-Fe/ART@ZIF yang diinduksi ferroptosis harus dipastikan untuk penelitian lebih lanjut.
Ketersediaan Data dan Bahan
Semua data sepenuhnya tersedia tanpa pembatasan.
Singkatan
MOF:
Kerangka Logam-Organik
TNBC:
Kanker Payudara Triple-Negatif
ART:
Artemisinin
TA:
Asam Tanin
ZIF:
Kerangka Imidazolat Zeolit-8
TA-Fe/ART@ZIF:
Asam Tanin dan Ion Besi Ferrous Dilapisi pada Kerangka Imidazolat Zeolit-8 dengan Artemisinin Terenkapsulasi
