Sintesis DNA

Latar Belakang

Sintesis asam deoksiribonukleat (DNA) adalah proses di mana salinan untai asam nukleat dibuat. Di alam, sintesis DNA terjadi dalam sel dengan mekanisme yang dikenal sebagai replikasi DNA. Menggunakan rekayasa genetika dan kimia enzim, para ilmuwan telah mengembangkan metode buatan manusia untuk mensintesis DNA. Yang paling penting adalah reaksi berantai polimerase (PCR). Pertama kali dikembangkan pada awal 1980-an, PCR telah menjadi industri multi-miliar dolar dengan paten asli dijual seharga $300 juta dolar.

Sejarah

DNA ditemukan pada tahun 1951 oleh Francis Crick, James Watson, dan Maurice Wilkins. Menggunakan data kristalografi sinar-x yang dihasilkan oleh Rosalind Franklin, Watson dan Crick menentukan bahwa struktur DNA adalah heliks ganda. Untuk pekerjaan ini, Watson, Crick, dan Wilkins menerima Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Kedokteran pada tahun 1962. Selama bertahun-tahun, para ilmuwan bekerja dengan DNA mencoba untuk mencari tahu "kode kehidupan." Mereka menemukan bahwa DNA berfungsi sebagai kode instruksi untuk urutan protein. Mereka juga menemukan bahwa setiap organisme memiliki urutan DNA yang unik dan dapat digunakan untuk tujuan skrining, diagnostik, dan identifikasi. Satu hal yang terbukti membatasi dalam penelitian ini adalah jumlah DNA yang tersedia dari satu sumber.

Setelah sifat DNA ditentukan, para ilmuwan dapat memeriksa komposisi gen seluler. Gen adalah urutan spesifik pasangan basa DNA yang menyediakan kode untuk konstruksi protein. Protein ini menentukan ciri-ciri suatu organisme, seperti warna mata atau golongan darah. Ketika gen tertentu diisolasi, menjadi diinginkan untuk mensintesis salinan molekul itu. Salah satu cara pertama di mana sejumlah besar DNA spesifik disintesis adalah melalui rekayasa genetika.

Rekayasa genetika dimulai dengan menggabungkan gen yang diinginkan dengan plasmid bakteri. Plasmid adalah bagian kecil DNA yang ditemukan di banyak bakteri. DNA hibrid yang dihasilkan disebut DNA rekombinan. Plasmid DNA rekombinan baru ini kemudian disuntikkan ke dalam sel bakteri. Sel-sel tersebut kemudian dikloning dengan membiarkannya tumbuh dan berkembang biak dalam suatu kultur. Saat sel berkembang biak, begitu juga salinan gen yang disisipkan. Ketika bakteri telah cukup berkembang biak, banyak salinan dari gen yang dimasukkan kemudian dapat diisolasi. Metode sintesis DNA ini dapat menghasilkan miliaran salinan gen dalam beberapa minggu.

Pada tahun 1983, waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan salinan DNA berkurang secara signifikan ketika Kary Mullis mengembangkan proses untuk mensintesis DNA yang disebut reaksi berantai polimerase (PCR). Metode ini jauh lebih cepat daripada metode yang diketahui sebelumnya yang menghasilkan miliaran salinan untai DNA hanya dalam beberapa jam. Ini dimulai dengan menempatkan bagian kecil dari DNA beruntai ganda dalam larutan yang mengandung DNA polimerase, nukleotida dan primer. Solusinya dipanaskan untuk memisahkan untaian DNA. Ketika didinginkan, polimerase membuat salinan dari setiap untai. Proses ini diulang setiap lima menit sampai jumlah DNA yang diinginkan dihasilkan. Pada tahun 1993, pengembangan PCR Mullis membuatnya mendapatkan Hadiah Nobel dalam Kimia. Saat ini, PCR telah merevolusi bidang diagnostik medis, forensik, dan mikrobiologi. Dikatakan sebagai salah satu perkembangan terpenting dalam penelitian genetik.

Latar Belakang

Kunci untuk memahami sintesis DNA adalah memahami strukturnya. DNA adalah polimer rantai panjang yang terdiri dari unit kimia yang disebut nukleotida. Juga dikenal sebagai materi genetik, DNA adalah molekul yang membawa informasi yang menentukan sintesis protein di sebagian besar organisme hidup. Biasanya, DNA ada sebagai dua rantai nukleotida yang terkait secara kimia. Tautan ini mengikuti pola spesifik yang ditentukan oleh aturan pemasangan dasar. Setiap nukleotida terdiri dari molekul gula deoksiribosa, gugus fosfat, dan satu dari empat basa yang mengandung nitrogen. Basa termasuk pirimidin timin (T) dan sitosin (C) dan purin adenin (A) dan guanin (G). Dalam DNA, adenin umumnya terkait dengan timin dan guanin dengan sitosin. Molekul disusun dalam struktur yang disebut heliks ganda yang dapat dibayangkan dengan membayangkan tangga bengkok atau tangga spiral. Basis membentuk anak tangga sedangkan bagian gula dan fosfat membentuk sisi tangga. Urutan di mana nukleotida dihubungkan, disebut sekuens, ditentukan oleh proses yang dikenal sebagai sekuensing DNA.

Dalam sel eukariotik, sintesis DNA terjadi sesaat sebelum pembelahan sel melalui proses yang disebut replikasi. Ketika replikasi dimulai, dua untai DNA dipisahkan oleh berbagai enzim. Dengan demikian dibuka, setiap untai berfungsi sebagai cetakan untuk menghasilkan untaian baru. Seluruh proses ini dikatalisis oleh enzim yang disebut DNA polimerase. Molekul ini membawa nukleotida yang sesuai, atau komplementer, sejalan dengan masing-masing untai DNA. Nukleotida kemudian secara kimiawi terkait untuk membentuk untai DNA baru yang merupakan salinan persis dari untai asli. Salinan ini, yang disebut untai anak, mengandung setengah dari molekul DNA induk dan setengah dari molekul baru. Replikasi dengan metode ini dikenal sebagai replikasi semikonservatif. Proses replikasi penting karena menyediakan metode bagi sel untuk mentransfer duplikat yang tepat dari materi genetik mereka dari satu generasi sel ke generasi berikutnya.

Bahan Baku

Bahan baku utama yang digunakan untuk sintesis DNA meliputi bahan awal DNA, taq DNA polimerase, primer, nukleotida, dan larutan buffer. Masing-masing memainkan peran penting dalam produksi jutaan molekul DNA.

Sintesis DNA terkontrol dimulai dengan mengidentifikasi segmen kecil DNA untuk disalin. Ini biasanya urutan spesifik DNA yang berisi kode untuk protein yang diinginkan. Disebut DNA template, bahan ini dibutuhkan dalam konsentrasi sekitar 0,1-1 mikrogram. Itu harus sangat murni karena bahkan sejumlah kecil senyawa yang digunakan dalam pemurnian DNA dapat menghambat proses PCR. Salah satu metode untuk memurnikan untai DNA adalah memperlakukannya dengan etanol 70%.

Sementara proses replikasi DNA diketahui sebelum tahun 1980, PCR tidak dimungkinkan karena tidak ada polimerase DNA yang stabil terhadap panas. DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi yang terlibat dalam sintesis DNA. Pada awal 1980-an, para ilmuwan menemukan bakteri yang hidup di sekitar lubang uap alami. Ternyata organisme ini, yang disebut thermus aquaticus, memiliki DNA polimerase yang stabil dan berfungsi pada tingkat panas yang ekstrim. Ini taq DNA polimerase menjadi landasan untuk teknik sintesis DNA modern. Selama proses PCR yang khas, 2-3 mikrogram taq DNA polimerase diperlukan. Namun, jika terlalu banyak digunakan, urutan DNA nonspesifik yang tidak diinginkan dapat terjadi.

Polimerase membangun untai DNA dengan menggabungkan nukleotida yang sesuai pada setiap untai DNA. Secara kimia, nukleotida terdiri dari tiga jenis gugus molekul termasuk struktur gula, gugus fosfat, dan basa siklik. Bagian gula menyediakan struktur utama untuk semua nukleotida. Secara umum, gula tersusun dari lima atom karbon dengan sejumlah gugus hidroksi (-OH) yang terikat. Untuk DNA, gulanya adalah 2-deoksi-D-ribosa. Bagian yang menentukan dari nukleotida adalah basa heterosiklik yang terikat secara kovalen dengan gula. Basa-basa ini adalah gugus pirimidin atau purin, dan mereka membentuk dasar untuk kode asam nukleat. Dua jenis basa purin ditemukan termasuk adenin dan guanin. Dalam DNA, ada dua jenis basa pirimidin, timin dan sitosin. Gugus fosfat membentuk bagian akhir nukleotida. Gugus ini berasal dari asam fosfat dan terikat secara kovalen dengan struktur gula pada karbon kelima.

Tahap pertama reaksi berantai polimerase (PCR) melibatkan denaturasi DNA. "Pembukaan" molekul DNA ini menyediakan cetakan untuk molekul DNA berikutnya yang akan diproduksi. Dengan DNA terbelah menjadi untaian terpisah, suhu diturunkan—langkah anil primer. Selama fase berikutnya, DNA polimerase berinteraksi dengan untaian dan menambahkan nukleotida komplementer sepanjang keseluruhan. Waktu yang dibutuhkan pada fase ini adalah sekitar satu menit untuk setiap 1.000 pasangan basa.

Untuk memulai sintesis DNA, bagian primer pendek DNA harus digunakan. Bagian primer ini, yang disebut fragmen oligo, panjangnya sekitar 18-25 nukleotida dan sesuai dengan bagian pada DNA cetakan. Mereka biasanya memiliki konsentrasi nukleotida C dan G sekitar 60% dengan distribusi yang merata. Ini memberikan efisiensi maksimum dalam proses sintesis.

Solusi buffer menyediakan media di mana sintesis DNA dapat terjadi. Ini adalah larutan berair yang mengandung MgCl2, HCI, EDTA, dan KCI. Konsentrasi MgCl2 penting karena ion Mg2+ berinteraksi dengan DNA dan primer menciptakan kompleks penting untuk sintesis DNA. Konsentrasi yang direkomendasikan adalah satu hingga empat mikromol. PH sistem ini sangat penting sehingga dapat juga disangga dengan amonium sulfat. Untuk memberi energi reaksi, berbagai molekul energi ditambahkan seperti ATP, GTP, dan NTP. Senyawa ini adalah senyawa yang sama yang digunakan organisme hidup untuk menggerakkan reaksi metabolisme.

Bahan lain yang dapat digunakan dalam proses termasuk minyak mineral atau lilin parafin. Setelah sintesis DNA selesai, DNA biasanya diisolasi dan dimurnikan. Beberapa reagen umum yang digunakan dalam proses ini termasuk fenol, EDTA dan Proteinase K.

Proses Pembuatan

Sintesis DNA biasanya dilakukan dalam skala kecil di laboratorium. Ini melibatkan tiga proses yang berbeda termasuk persiapan sampel, siklus reaksi sintesis DNA dan isolasi DNA. Langkah-langkah pembuatan ini biasanya dilakukan di area terpisah untuk menghindari kontaminasi. Mengikuti prosedur ini, para ilmuwan dapat mengubah beberapa untai DNA menjadi jutaan dan jutaan salinan persis.

Persiapan sampel

• 1 Untuk memulai sintesis DNA, berbagai larutan disiapkan. Ini biasanya dilakukan dalam lemari aliran laminar yang dilengkapi dengan lampu UV untuk meminimalkan kontaminasi. Para ilmuwan menggunakan sarung tangan baru selama setiap langkah produksi untuk alasan yang sama. Biasanya, semua larutan awal kecuali primer, polimerase, dan dNTP dimasukkan ke dalam autoklaf untuk membunuh organisme kontaminan. Dua solusi terpisah dibuat. Satu berisi buffer, primer dan polimerase. Yang lain berisi MgCl2 dan DNA template. Semua larutan ini dimasukkan ke dalam tabung kecil untuk memulai reaksi.

Kary Banks Muilis.

Kary Banks Muilis lahir di Lenoir, Carolina Utara, pada tahun 1944. Setelah lulus dari Georgia Tech pada tahun 1966 dengan gelar B.S. di bidang kimia, Muilis memasuki program doktor biokimia di University of California, Berkeley. Meraih gelar Ph.D. pada tahun 1973, ia menerima posisi mengajar di University of Kansas Medical School di Kansas City. Pada tahun 1977, ia mengambil beasiswa postdoctoral di University of California, San Francisco.

Muilis menerima posisi sebagai ilmuwan penelitian pada tahun 1979 di perusahaan biotek yang sedang berkembang—Cetus Corporation, di Emeryville, California—yang mensintesis bahan kimia yang digunakan oleh ilmuwan lain dalam kloning genetik. Selama di sana, ia merancang reaksi berantai polimerase (PCR), teknik yang cepat dan efektif untuk mereproduksi gen atau fragmen DNA (asam deoksiribonukleat) tertentu yang dapat membuat miliaran salinan dalam beberapa jam. Cara paling efektif untuk mereproduksi DNA adalah dengan kloning, tetapi itu bermasalah. Butuh waktu untuk meyakinkan rekan Mullis tentang pentingnya penemuan ini tetapi segera PCR menjadi fokus penelitian intensif. Para ilmuwan di Cetus mengembangkan versi komersial dari proses dan mesin yang disebut Thermal Cycler (dengan penambahan blok bangunan kimia DNA [nukleotida] dan katalis biokimia [polimerase], mesin akan melakukan proses secara otomatis pada bagian target dari DNA).

Cetus menghadiahkan Muilis $10.000 untuk mengembangkan paten PCR, lalu menjualnya seharga $300 juta. Meninggalkan Cetus pada 1986, Muilis menjadi konsultan riset biokimia swasta dan dianugerahi Hadiah Nobel pada 1993.

siklus sintesis DNA

• 2 Setelah larutan pereaksi disiapkan, siklus PCR dimulai. Fase pertama melibatkan denaturasi DNA. Salah satu langkah awal yang paling penting adalah denaturasi lengkap template DNA. Denaturasi DNA pada dasarnya berarti pemecahan untaian ikatan rangkap. "Pembukaan" molekul DNA ini menyediakan cetakan untuk molekul DNA berikutnya yang akan diproduksi. Denaturasi yang tidak sempurna akan menghasilkan salinan yang tidak efisien pada siklus pertama yang berdampak negatif pada setiap siklus berikutnya. Denaturasi awal dilakukan dengan memanaskan larutan template DNA hingga 203°F (95°C) selama satu hingga tiga menit. Total waktu tergantung pada komposisi template. Dalam siklus berulang, langkah denaturasi berlangsung sekitar dua menit dan melibatkan pemanasan larutan hingga 201PF (94°C). Bahan tambahan dapat ditambahkan ke larutan untuk memfasilitasi denaturasi DNA seperti gliserol, DMSO, atau formamida.
• 3 Dengan DNA terbelah menjadi untaian terpisah, suhu diturunkan menjadi 122-149°F (50-65°C). Ini dikenal sebagai langkah anil primer dan berlangsung selama sekitar dua menit. Pada titik ini, primer kiri dan kanan cocok dan terhubung secara kimiawi dengan basa komplementernya pada DNA cetakan.
• 4 Tahap selanjutnya adalah tahap perpanjangan. Bagian dari reaksi ini adalah ketika sebagian besar untai DNA disalin. Suhu sistem dipanaskan hingga sekitar 162°F (72°C) dan ditahan di sana tergantung pada panjang DNA yang akan disalin. Pada tahap ini, DNA polimerase berinteraksi dengan untaian dan menambahkan nukleotida komplementer sepanjang keseluruhan. Waktu yang dibutuhkan pada fase ini adalah sekitar satu menit untuk setiap 1.000 pasangan basa.
• 5 Setelah siklus pertama ini, siklus sintesis DNA diulang. Jumlah siklus tergantung dari jumlah DNA awal dan jumlah DNA yang diinginkan. Jika kurang dari 10 salinan DNA template yang tersedia, 40 siklus diperlukan. Dengan lebih banyak DNA awal, 25-30 siklus sudah cukup.
• 6 Selama siklus terakhir sampel ditahan pada suhu 162°F (72°C) selama sekitar 15 menit. Hal ini memungkinkan pengisian (dengan nukleotida) dari setiap ujung yang menonjol dari untai DNA baru. Pada tahap ini, polimerase menambahkan nukleotida A ekstra pada salah satu ujung untai DNA.

Isolasi DNA

• 7 Setelah reaksi selesai, DNA diisolasi dari bahan pereaksi PCR seperti DNA polimerase, MgCl2 dan primer. Hal ini dilakukan dengan menambahkan senyawa seperti fenol, EDTA dan Proteinase K. Sentrifugasi juga membantu dalam hal ini.

Masa Depan

Sementara para ilmuwan menggunakan PCR untuk sintesis DNA secara teratur, masih banyak yang tidak dipahami tentang replikasi DNA. Di masa depan, penelitian harus menjelaskan rincian beberapa langkah penting dari proses, seperti komponen dan intermediet yang terlibat. Selain itu, polimerase yang ditingkatkan dapat dikembangkan, sehingga memungkinkan untuk membuat lebih banyak DNA dari sampel awal yang lebih kecil. Diharapkan suatu hari sintesis DNA akan membantu membuka beberapa aspek kunci dari organisme hidup dan mengarah pada pengembangan obat-obatan yang akan menyembuhkan berbagai kanker, infeksi virus dan bakteri.