Nanopartikel Fosfor Hitam Mempromosikan Diferensiasi Osteogenik EMSC Melalui Ekspresi TG2 yang Diregulasi

Bahan dan Metode

Nanopartikel Fosfor Hitam

BP massal dibeli dari oleh Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd. Dimetil sulfoksida (DMSO), natrium hidroksida (NaOH), dan N -methyl-2pyrrolidone (NMP) disediakan oleh Aladdin Industrial Co., Ltd. Phosphate-buffered saline (PBS) diperoleh dari Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. Campuran medium/nutrisi Eagle yang dimodifikasi Dulbecco F12 (DMEM/F12; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences), streptomisin, penisilin, serum janin sapi (FBS), diperoleh dari BI Science and Technology Co., Ltd.

Sintesis BP mirip dengan laporan sebelumnya dengan sedikit modifikasi [24]. Pertama, 20 mg BP massal direndam dalam larutan NaOH/NMP jenuh dan dimurnikan dengan metode mekanis penggilingan. Campuran kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada 1500 rpm setelah itu endapan dibuang. Setelah itu, campuran disonikasi selama 6 jam dalam penangas es/air, dan campuran tersebut kemudian disaring melalui filter BD Falcon 100 μm (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Terakhir, sentrifugasi suspensi lebih lanjut (10 menit pada 13.000 rpm, 4 °C) dilakukan, dan endapan dikumpulkan.

Pewarnaan imunofluoresensi EMSCs di Mukosa Hidung

Untuk menunjukkan EMSC in vivo, mukosa pernapasan septum hidung dibedah dan kemudian difiksasi dalam 4% PFA semalam untuk pewarnaan imunofluoresensi. Jaringan dicuci dengan PBS dan kemudian didehidrasi dengan larutan sukrosa gradien. Jaringan tertanam dalam OCT (Sakura Finetek, Jepang) untuk cryosection dan dipotong menjadi bagian serial koronal dengan ketebalan 25 mm menggunakan cryo-microtome Leica. Bagian ini dicuci dalam PBS selama 10 menit dan ditembus dengan 1% albumin serum sapi dan 0,1% Triton-X 100 dalam PBS. EMSC di mukosa hidung diwarnai dengan imunofluoresensi dengan antibodi primer anti-nestin dan antibodi sekunder terkonjugasi Cy3. Kontrol negatif paralel menjadi sasaran prosedur yang sama tanpa antibodi primer. Jaringan yang diwarnai diamati di bawah mikroskop imunofluoresensi (AxioObserver, ZEISS, Jerman).

Budaya Sel

Semua prosedur hewan telah disetujui oleh Komite Etik dan Perawatan Hewan Universitas Jiangnan, dan Pedoman Internasional untuk Penelitian Hewan diikuti secara ketat dalam penelitian ini. Sel induk ekto-mesenkim primer diisolasi dari mukosa pernapasan tikus menurut penelitian kami sebelumnya [17, 25]. Secara singkat, 100 g tikus dewasa Sprague Dawley (SD) dibius dengan injeksi natrium pentobarbital intraperitoneal (0,05 g/kg). Sepertiga tengah septum hidung dicincang dan kemudian diinkubasi dalam larutan tripsin 0,25% (Hyclone; GE Healthcare Life Sciences) pada suhu 37°C selama 25 menit setelah itu mukosa septum hidung dilucuti dengan hati-hati. Akhirnya, jaringan mukosa septum hidung dipotong-potong. Suspensi jaringan yang dihasilkan dilewatkan melalui saringan mesh nilon 100-um, disentrifugasi pada 1000 g selama 5 menit dan kemudian dicuci dua kali dengan phosphate-buffered saline (PBS). Suspensi jaringan ditempatkan ke dalam labu kultur sel dalam media pertumbuhan (DMEM/12 mengandung 10% FBS, 100 U/ml penisilin, dan 100 g/ml streptomisin) dan dikultur pada 37 °C dalam 5% CO₂ dan 95% udara dengan kelembaban jenuh. Media diganti setiap tiga hari, dan sel-sel dilewatkan setiap minggu. Sel di bagian ketiga mereka digunakan untuk semua studi karakterisasi. Imunofluoresensi dilakukan untuk mengkarakterisasi sel yang dikultur dengan antibodi terhadap penanda sel induk termasuk vimentin dan nestin [26].

Identifikasi Kemampuan Diferensiasi Multiarah EMSC

EMSC diunggulkan dalam pelat 6-sumur dan dikultur dengan media DEME/F12 selama 24 jam hingga pertemuan 70%. Media kemudian diubah dengan media diferensiasi osteogenik (DMEM dilengkapi dengan 10% FBS, 0,1 mM deksametason, 10 mM -gliserofosfat dinatrium, dan 0,2 mM l-asam askorbat) untuk menginduksi osteogenesis. Media diganti setiap tujuh hari dan pewarnaan Alizarin Red S dilakukan dengan 0,5% Alizarin Red S (Sigma-Aldrich) pada hari ke 28. EMSC yang tumbuh menjadi pertemuan 90% dikultur dalam media diferensiasi adipogenik untuk menginduksi adipogenesis selama 21 hari. Pewarnaan merah minyak dilakukan dengan Kit pewarnaan merah minyak (Solarbio) sesuai dengan instruksi pabrik.

Karakterisasi BP

Scanning electron microscopy (SEM) digunakan untuk mengkarakterisasi morfologi dan ukuran BP. Sampel disiapkan dengan menempatkan setetes larutan BP pada konsentrasi 1 mg/ml dalam air deionisasi ke dalam kisi tembaga berlapis formvar dan kemudian dikeringkan dengan udara. Sampel difoto dengan memindai mikroskop elektron (H-7500; Hitachi, Tokyo, Jepang). Ukuran rata-rata BP dianalisis menggunakan perangkat lunak image Pro Plus (Media Cybernetics Inc., MD, USA). Evaluasi potensi zeta dikonfirmasi oleh Malvern zeta sizer (ZEN3600). Difraksi sinar-X (XRD) dilakukan dengan difraktometer Bruker D8 Discover dalam geometri fokus para Bragg–Brentano dan radiasi Cu Kα. Pola difraksi dikumpulkan antara 10° dan 80° dari 2θ dengan langkah 0,01° 2θ dan waktu perolehan 0,2 dtk per langkah. Data yang dihasilkan dievaluasi menggunakan perangkat lunak HighScore Plus 3.0e. Spektrometer Raman (LabRam HR800) dengan eksitasi laser 514 nm digunakan untuk mengukur spektrum Raman sampel. Komposisi permukaan sampel diukur melalui spektroskopi fotoelektron sinar-X ([XPS] Omicron NanoTechnology GmbH, Jerman).

Perangkat Penghitung Sel‑8 (CCK‑8) Uji

Pengaruh BPs pada proliferasi sel dievaluasi menggunakan alat penghitungan sel (CCK-8) assay. Secara singkat, EMSCs (3000 sel/sumur) disepuh dalam pelat 96-sumur dan diperlakukan dengan BPs (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, dan 512 g/ml) selama 24 jam pada 37 °C. Untuk deteksi CCK8, 10 l reagen CCK8 ditambahkan ke media kultur 4 jam sebelum analisis. Kerapatan optik (OD) pada 450 nm diukur menggunakan pembaca pelat mikro (Thermo Fisher Scientific, Madrid, Spanyol) sesuai dengan instruksi pabrik. Konsentrasi BP yang digunakan untuk penyelidikan lebih lanjut dipilih berdasarkan hasil uji CCK-8. Sedangkan untuk pewarnaan Ki-67, EMSCs (1 × 10 ⁴ ) dikultur dalam plat 24-sumur dan diwarnai dengan imunofluoresensi untuk Ki-67 (poliklonal kelinci; cat. no. ab15580; abcam; 1:300). DAPI digunakan untuk mewarnai inti. Gambar diambil dengan mikroskop fluoresensi (pembesaran, 200×; Eclipse Ti; nikon corporation) dan dianalisis dengan perangkat lunak Image Pro Plus.

Diferensiasi Osteogenik

Untuk diferensiasi osteogenik, EMSC diunggulkan dengan kepadatan 3.000 sel/cm ² dan dikultur dalam media pertumbuhan sampai pertemuan 70%. Sel kemudian diinduksi dengan media diferensiasi osteogenesis selama 2 minggu. Khususnya, untuk menghindari pengaruh -Sodium glycerophosphate, media diferensiasi osteogenesis dilengkapi dengan 10% FBS, 0,1 mM deksametason, dan 0,2 mM asam l-askorbat (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) tetapi tidak dengan -Sodium gliserofosfat. Setelah menginduksi diferensiasi, alkaline phosphatase (ALP) dan pewarnaan merah Alizarin dan RT-qPCR digunakan untuk menilai efek BPs pada diferensiasi osteogenik EMSC. EMSC diunggulkan dengan kepadatan 2  × 10 ⁵ sel/sumur dalam pelat 6-sumur dan diinkubasi dengan media osteogenik. Menurut instruksi pabrik, pewarnaan ALP dinilai menggunakan kit pewarnaan ALP (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) pada hari ke 14. Pewarnaan Alizarin red S diaplikasikan untuk memvisualisasikan pengendapan kalsium fosfat. Secara singkat, sel yang terfiksasi dicuci kembali dengan air deionisasi dan diinkubasi dengan 1 ml/sumur larutan pewarna merah Alizarin (0,5% (b/v) Alizarin Red S (Sigma-Aldrich) dalam PBS selama 10 menit pada 37°C. larutan dihilangkan, sampel dicuci kembali dengan air deionisasi. Area pewarnaan positif yang menunjukkan nodul terkalsifikasi per bidang dihitung dengan perangkat lunak Image-Pro plus dan dinormalisasi ke masing-masing kontrol.

RT-qPCR

RT-qPCR dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, total RNA diisolasi dari monokultur atau disortir menggunakan kit pemurnian RNA (TaKaRa, Jepang), sesuai dengan instruksi pabrik. Dua mikrogram mRNA ditranskripsi balik menjadi cDNA menggunakan kit sintesis cDNA (Fermentas). Primer yang digunakan untuk RT-PCR dirancang dan dibuat oleh Nanjing GenScript Bioengineering Technology and Services Co., Ltd (Nanjing, China), ditunjukkan pada Tabel 1. RT-PCR dimanipulasi menggunakan SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix kit (Fermentas) dengan sistem ABI Prism 7500. Data dinormalisasi menjadi gliseraldehida 3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) untuk menunjukkan tingkat ekspresi relatif. Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga.

Western Blot

Sel-sel yang dikultur dicuci dua kali dengan PBS dan kemudian dilisiskan di atas es selama 30 menit dengan buffer lisis RIPA yang mengandung koktail phosphatase dan protease inhibitor. Untuk mengumpulkan total TG2, lisat sel dan ECM di pelat 6-sumur dikumpulkan oleh pengikis sel. Pelat dicuci dengan PBS, dan cairan pencuci sel juga dikumpulkan. Lisat dipanen dari supernatan dengan sentrifugasi pada 12.000 × g selama 5 menit, dicampur dengan buffer pemuatan SDS dengan volume yang sama, lalu direbus selama 5 menit. Konsentrasi protein ditentukan menggunakan kit BCA Protein Assay (Beyotime, Shanghai, China, P0012). Protein diekstraksi dalam buffer lisis RIPA, dipisahkan pada gel poliakrilamida natrium dodesil sulfat (SDS), dan secara elektroforesis dipindahkan ke membran nitroselulosa (Millipore, LA, USA). Membran diblokir dengan 1% bovine serum albumin (BSA) dalam 0,01 M Tris-buffered saline (TBS) yang mengandung 0,5% Tween 20 (Suolaibao, Beijing, China) dan dihapus dengan antibodi yang ditunjukkan, termasuk anti-TG2 (1:200; sc-48387, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-FN (1:500; cat. no. BA1772; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.) dan anti-LN (1:500; cat. no. BM4921; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), anti-OCN(1:200; sc-390877, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-OPN (1:200; sc-73631, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti- COL I (1:500; cat. no. BA0325; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), pada 4 °C selama 12 jam. Membran kemudian direaksikan dengan horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit-IgG (1:5000; Boster, Wuhan, China) selama 2 jam pada suhu kamar. Pita protein divisualisasikan menggunakan substrat Pierce ECL Plus (Thermo Fisher Scientific) dan kemudian dipindai dengan Sistem Pencitraan Chemiluminescence (Clinx Science Instruments, Shanghai, China).

Eksperimen Penghambatan

Untuk mengkonfirmasi keterlibatan TG2, percobaan penghambatan TG2 dilakukan pada EMSC. Eksperimen netralisasi dilakukan dengan antibodi penetral anti-TG2 (dari BD Biosciences, San Diego, CA). Sel diunggulkan di piring 6-sumur dengan media kultur normal selama 24 jam untuk melekat, dan diperlakukan dengan antibodi anti-TG2 (10 g/ml). Pada saat yang sama, kelompok kontrol ditetapkan. Setelah diunggulkan ke dalam pelat 6-sumur selama 24 jam, osteogenesis EMSC diinduksi selama 14 hari menggunakan media osteogenik dengan BPs (2 g/ml), dan media kultur yang mengandung inhibitor diganti dengan media osteogenik segar setiap 7 hari. Pewarnaan Alizarin red S diaplikasikan untuk memvisualisasikan pengendapan kalsium fosfat. Western blotting digunakan untuk menilai kadar osteokalsin, osteopontin, dan kolagen tipe 1 (masing-masing ekspresi OCN, OPN, dan COL I).

Pewarnaan imunofluoresensi

Sel-sel yang dikultur difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 8 jam pada 4°C. Sel-sel tetap dicuci tiga kali dengan PBS dan permeabilisasi selama 30 menit dalam PBS yang mengandung 0,2% Triton X-100 dan 1% BSA (Suolaibao, Beijing, Cina). Setelah permeabilisasi, sel-sel tetap ini dicuci dengan PBS dan kemudian diinkubasi dengan antibodi primer pada 4 °C selama 8 jam diikuti dengan penghapusan semua antibodi primer. Sel kemudian dicuci tiga kali dengan PBS dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar dengan antibodi sekunder Alexa Fluor-594 (1:800, Life Technologies Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA) pada 37°C selama 2 jam. Nukleus di-counterstain dengan 4′6-diamidino-2-phenylindole ([DAPI]; Sigma-Aldrich). Semua kelompok yang diuji diamati di bawah mikroskop imunofluoresensi.

Analisis Statistik

Data diperoleh dari tiga eksperimen terpisah yang dijelaskan di atas dan disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Analisis distribusi data dilakukan dengan menggunakan t . siswa -tes untuk menganalisis signifikansi perbedaan antara kelompok yang diberi perlakuan dan kelompok kontrol. Analisis varians satu arah (ANOVA) diikuti dengan uji post-hoc Tukey dilakukan untuk menilai perbedaan yang signifikan antar kelompok. p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Karakterisasi BP

Distribusi ukuran BP yang diukur dengan hamburan cahaya dinamis (DLS) relatif sempit pada kisaran 100 hingga 200 nm dengan nilai puncak pada 132 nm. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 1A. Potensi zeta BP ditentukan sebagai 23.7 ± 0.65 mV (Gbr. 1B), yang menegaskan stabilitas BP. Ukuran partikel diselidiki lebih lanjut dengan pemindaian mikroskop elektron (SEM) (Gbr. 1C). Hasilnya sesuai dengan pengukuran distribusi ukuran partikel dengan DLS.

Karakterisasi BP. A Distribusi ukuran nanopartikel fosfor hitam (BPs); B laporan potensi zeta dari BP dengan potensi zeta 23.7 ± 0.65 mV; C pemindaian gambar mikroskop elektron (SEM) dari BP nanosheets (BPNs). D Spektrum Raman dari BPs; E Difraktogram sinar-X dan F P 2p resolusi tinggi X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) spektrum BPs; G Spektrum XPS dari BPs

Hamburan Raman (Gbr. 1D) mengungkapkan tiga puncak yang menonjol pada 362,3, 438,5, dan 466,9 cm ⁻¹ terkait dengan mode fonon di luar bidang (A ¹ _g ) dan dua mode dalam pesawat (B ² _g dan A ² _g ) dari BP, [17, 18], masing-masing. XRD (Gbr. 1E) menunjukkan kemurnian fase bahan yang disiapkan, dengan ukuran kristal rata-rata 102,7 nm. Perluasan pola difraksi menunjukkan ukuran nanometer kristalit individu. Spektrum XPS resolusi tinggi dari P 2 p (Gbr. 1F) menunjukkan puncak utama pada 130 eV sesuai dengan ikatan P–P dari fosfor hitam di samping puncak tambahan pada 135 eV yang berasal dari ikatan P–O yang disebabkan oleh oksidasi permukaan dari BP. Permukaan BP diperiksa dengan sinar-X pemindaian lebar (Gbr. 1G).

Karakterisasi EMSC

Pewarnaan imunofluoresensi mukosa hidung menunjukkan bahwa EMSCs nestin-positif terletak di lamina propria di bawah epitel pernapasan septum hidung (Gbr. 2A). EMSC yang dikultur pada bagian ketiga muncul sebagai sel seperti fibroblastik dan berkembang biak dengan cepat pada pelat plastik (Gbr. 2B). Kami mengevaluasi diferensiasi osteogenik dalam media osteogenik dengan pewarnaan alizarin red pada hari ke 28 (Gbr. 2C). Diferensiasi adipogenik dalam media induksi adipogenik dinilai pada hari ke 21 dengan pewarnaan dengan larutan oil red-O (Gbr. 2D). Pewarnaan imunofluoresensi menunjukkan hampir semua EMSC mengekspresikan penanda sel krista neural, seperti nestin (> 95%) seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2E dan vimentin (> 95%) seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2F. Hasil untuk ekspresi bersama penanda sel punca menunjukkan bahwa EMSC ini adalah jenis sel punca mesenkim.

Identifikasi sel punca mesenkim ektodermal (EMSCs). A EMSC nestin positif (cy3, red) terletak di lamina propria di bawah epitel pernapasan septum hidung; B Gambar kontras fase menunjukkan bahwa EMSC yang dikultur pada bagian ketiga muncul sebagai sel seperti fibroblastik dan berkembang biak dengan cepat pada pelat plastik; C EMSC terdiferensiasi osteogenik dalam media osteogenik diwarnai dengan alizarin red; D EMSC terdiferensiasi adipogenik dalam media induksi adipogenik diwarnai dengan minyak red-O; E , B Pewarnaan imunofluoresensi dari penanda sel krista saraf menunjukkan bahwa hampir semua EMSC mengekspresikan nestin dan vimentin. IgG-Cy3 (merah) digunakan sebagai antibodi kedua untuk pewarnaan imunofluoresensi dan inti diwarnai dengan Hoechst 33342 (biru)

Sitotoksisitas

Sebagai percobaan awal, uji CCK-8 dilakukan untuk menilai sitotoksisitas BPs. Kelangsungan EMSC setelah 24 jam paparan BP ditunjukkan pada Gambar 3. Tidak ada sitotoksisitas yang signifikan setelah paparan hingga 32 g/ml BP yang dicatat. Namun, paparan BPs menyebabkan sitotoksisitas yang signifikan pada dosis yang lebih tinggi (> 32 μg/ml). Ekspresi Ki-67 dalam nukleolus dan kromosom diamati pada kelompok dosis rendah, (Gbr. 4A-C). Namun, rasio antara inti positif Ki-67 dan total populasi inti tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam EMSC yang diobati dengan BP dosis rendah dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati (Gbr. 4D). Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami memilih konsentrasi 2 dan 4 μg/ml BP dalam eksperimen berikut di mana sitotoksisitas yang signifikan tidak diamati.

Sitotoksisitas BPs. Sel diperlakukan dengan BPs (0, 2, 4, 8, 16, 32, 64.128, 256, dan 512 g/ml) selama 24 jam, dan viabilitas EMSC diuji dengan alat penghitungan sel (CCK-8) proliferasi assay (n = 9). Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). **p < 0.01.

Evaluasi proliferasi sel dari kelompok yang diobati dengan BPs. EMSC diobati dengan BPs (0, 2, dan 4 g/ml) selama 24 jam. Proliferasi sel diukur dengan pewarnaan imunofluoresen dengan antibodi anti-Ki67 (merah) dan DAPI (biru), dan gambar gabungan ditampilkan (A –C ). Sel-sel positif-Ki67 di antara sel-sel positif 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihitung dalam dua bidang daya tinggi di masing-masing dari tiga pelat. Data dinyatakan sebagai mean ± SD (D ).

Pewarnaan Alizarin Red S

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5A, mineralisasi dalam sel dievaluasi dengan pewarnaan Alizarin red S setelah dirawat dengan media yang dikondisikan selama 14 hari. Nodul kalsium semua diamati dalam tiga kelompok, sedangkan nodul kalsium tidak berbentuk hadir dalam kelompok kontrol. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, nodul kalsium yang disimpan pada kelompok 2 dan 4 g/ml lebih besar (p < 0,05), tetapi tidak ada perbedaan nyata yang diamati antara kelompok perlakuan (p> 0.05) seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5C.

Alkaline phosphatase (ALP) dan tes pewarnaan Alizarin Red. A EMSC terdiferensiasi osteogenik diwarnai dengan larutan Alizarin Red pada hari ke-14; B Pewarnaan ALP divisualisasikan di bawah mikroskop; C grafik menunjukkan kuantifikasi daerah pengendapan merah Alizarin; D aktivitas ALP yang secara signifikan lebih tinggi ditunjukkan pada kelompok EMSC yang diobati dengan BP daripada kelompok kontrol. Data dinyatakan sebagai mean ± SD. **p < 0.01

Tes ALP

Pewarnaan ALP dilakukan untuk mempelajari diferensiasi osteogenik EMSC. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, EMSC pada kelompok BP 2 dan 4 g/ml berwarna lebih gelap (Gbr. 5B), menunjukkan bahwa penambahan BP menyebabkan peningkatan ekspresi ALP di EMSC. Sel-sel yang diobati dengan BP memiliki aktivitas ALP yang lebih tinggi daripada kelompok kontrol pada hari ke 7 (p> 0,05), tetapi tidak ada perbedaan signifikan antara 2 dan 4 μg/ml yang diamati (p> 0.05) seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5D.

RT-qPCR

Penanda diferensiasi utama, termasuk faktor transkripsi terkait kerdil 2 (RUNX 2), ALP, COL 1, OCN, OPN, dan protein morfogenik tulang 2 (BMP-2), dianalisis pada hari ke-14 seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6. Ekspresi dari semua penanda gen ini ditemukan pada tiga kelompok sel pada hari ke 7. Tidak ada perbedaan nyata dalam ekspresi gen antara kelompok 2 dan 4 g/ml yang ditemukan. Namun, dibandingkan dengan sel kontrol, ekspresi gen yang dijelaskan di atas dalam sel yang diobati dengan BP meningkat secara signifikan.

BPs mempotensiasi osteogenesis EMSCs. EMSC ditumbuhkan dalam media osteogenik dengan 0 μg/ml, 2 μg/ml, 4 μg/ml BPs 14 hari. Ekspresi gen yang terlibat dalam osteogenesis EMSCs diukur dengan kuantitatif reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR). **p < 0.01, *p < 0,05.

BPs Meningkatkan Osteogenesis EMSC dengan Mengatur Ekspresi TG2

Karena dampak signifikan TG2 pada diferensiasi yang dimediasi integrin dan deposisi ECM ditunjukkan untuk berbagai sel, kami menyelidiki apakah BPs akan mempromosikan diferensiasi osteogenik EMSC melalui peningkatan regulasi ekspresi TG2. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, kami mendeteksi peningkatan regulasi yang jelas dari TG2 intraseluler dan ekstraseluler pada kelompok yang diobati dengan BP. Laminin (LN) dan Fibronectin (FN) dalam sel yang diberi tekanan darah 2 dan 4 g/ml memiliki kadar yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gbr. 7A). EMSC yang terpapar BP menunjukkan peningkatan kadar TG2 kira-kira dua kali lipat dibandingkan dengan kelompok kontrol, tetapi tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara kelompok yang diobati dengan BP (Gbr. 7B). Sebagai protein makromolekul, antibodi anti-TG2 gagal melintasi membran sel. Thus, the extracellular TG2 was blocked by the antibody and failed to crosslink various growth factors and ECM proteins. The Alizarin Red S (Fig. 8A, C) results showed that anti-TG2 markedly suppressed the BP-mediated increase in calcium and ECM deposition. Meanwhile, as shown in Fig. 8D, anti-TG2 significantly inhibited BP-treated cells’ increase in ALP activity. Moreover, anti-TG2 effectively abolished the effects of BPs on the bone matrix proteins expression, including OCN, OPN, and COL I (Fig. 9).

Transglutaminase 2 (TG2) was involved in the osteogenic differentiation of EMSCs. EMSCs were incubated with BPs (2 and 4 μg/ml) for 14 days, and fibronectin (FN), LN, and TG2 levels were assessed by immunoblotting. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05.

Osteogenic differentiation of EMSCs with TG2 neutralizing antibody. A ALP staining. B ARS staining performed to examine extracellular mineralization. C Quantitative ALP analysis. D Quantitative Alizarin red staining analysis. **p  < 0.01

Anti-TG2 inhibited BP-induced EMSC osteogenic differentiation. A Representative western blots of osteoponin, osteocalcin, and collagen 1 (OPN, OCN, LN, FN, and COL I, respectively) in differentiated EMSCs following treatment with 2 μg/ml BPs and 2 μg/ml anti-TG2 or 2 μg/ml BPs alone. B Quantification of OPN, OCN, and COL I protein expression. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05

Discussion

To the best of our knowledge, modification of phosphorus was first exhaustively studied as early as 1914; unfortunately, these studies did not receive much attention for an entire century [27]. Phosphorus is one of the essential elements making up about 1% of the total body weight as a bone component in the human body [28], while most of the other materials cannot warrant such a natural biocompatibility. In 2014, BP was introduced as a new member of the 2D layered materials.

In this study, the BP nanoparticles were prepared on a large scale from bulk BP crystals by using an improved mechanical grinding and continuous ultrasound method. Compared with other methods, this ultrasound and mechanical grinding synthesis is facile and efficient and enables production of BPs on a large scale. For characterization of BPs, SEM was carried out to examine the morphology of BPs. SEM images illustrated that BPs were successfully synthesized, and the typical sizes of BPs are about 100 to 150 nm. The size of particles was further investigated using DLS in the relatively narrow range around 133 nm. The result of SEM corresponded well with the measurement of particle size measurements based on DLS. Interestingly, previous studies demonstrated that BP with larger lateral size has higher cytotoxicity than small BP, while ultra-small BPs were even considered nontoxic up to the high concentration of 1000 μg/ml [29, 30]. Thus, for biomedical applications, the BP nanomaterials still need further study. In addition, Raman scattering revealed the presence of three prominent peaks at 361.5, 437.1, and 465.2 cm ⁻¹ that were associated with the out-of-plane phonon mode (A ¹ _g ) and two in-plane modes (B ² _g and A ² _g ) of BPs. These results were consistent with previous reports [31] in which showed that the BPs had been prepared successfully from bulk BP. XRD shows the phase purity of the prepared BPs. Broadening of the diffraction pattern indicates the nanometer size of individual crystallites.

To evaluate the stability and degradation rate of BPs, Wang and co-workers performed an experiment in which normalized absorption spectra of the BP nanosheets were dispersed in water and exposed to air. After 6 days, they found that the absorbance of the BP nanosheets at 450 nm decreased by 43% compared to the initial value, indicating that BP is easily degraded in the physiological environment [32]. Also, it is well-known that BP is sensitive to water and oxygen, but this shortcoming is considered a merit for biomedical applications. Because of these special characteristics compared with other biomaterials, BPs could potentially avoid material accumulation in human body and then reduce cytotoxicity caused by such material noumenon.

Since MSCs play key roles in bone formation, there is no doubt that transplanting MSCs in animal models of bone defects enhance bone regeneration and promotes functional recovery via BMSC acquisition [33]. Unfortunately, BMSC acquisition procedures are painful for the donor and frequently cause surgical site infection, and the number of harvested BMSCs is low [34]. Previous studies from our laboratory and other reports have shown that EMSCs could be isolated from several adult tissues, such as dental pulp and the nasal mucosa, without causing invasive injury. Moreover, EMSCs were easily induced into osteoblasts, rendering those cells as promising seed cells for bone tissue engineering. Therefore, EMSCs were used in this study. We attempted to obtain the maximum safety BP concentration for EMSCs. As shown in the results, we achieved the maximum safe concentration of BPs (less than 64 μg/ml). The concentrations of 2 and 4 μg/ml of BPs were chosen for further study to avoid any possible potential toxic. The Ki-67 assay was also used to quantify and evaluate EMSC proliferation in these samples after treating these cells with BPs (2 and 4 μg/ml) for 24 h. We did not observe any statistically significant suppression of EMSCs growth in the case of BPs. Meanwhile, our results indicate that during treatment with safe concentrations of BPs, promotion of EMSCs proliferation also occurred.

Some reports have shown that the concurrent binding of BP and calcium ions may benefit osteogenic differentiation, thereby leading to enhanced bone regeneration [35, 36]. To investigate these effects, in vitro EMSCs exposed to BPs were used in osteogenic differentiation experiments. Interestingly, the results of the ALP test and Alizarin Red S staining show that exposure to BPs could promote rather than compromise osteogenetic differentiation of EMSCs compared to the control group. Similar findings have been reported in which phosphorus-rich materials can stimulate mineralization and bone regeneration. Co-expression of osteogenesis-related genes, including ALP, OPN, OCN, COL1, and RUNX2, in differentiated EMSCs was detected at days 7 and 14 by RT-qPCR. Indeed, the expression levels of these osteogenic genes significantly increased in differentiated EMSCs treated with BPs, also providing confirmation of the osteogenic potential of the BPs. Similar results were reported in which BP could induce both the proliferation and osteogenic differentiation of human pre-osteoblast cells. Together these results indicate that the BPs were able to induce osteogenic differentiation of EMSCs.

It can be asked, “How do BPs promote osteogenetic differentiation of EMSCs?” It is well accepted that phosphorus can capture Ca ²⁺ in vivo to form calcium phosphate deposits that accelerate bone regeneration, while BP can be the resource of phosphorus ions [36]. Tong et al. believes that BP generate mild heat (40–42 °C), which causes up-regulation of heat shock protein (HSPs) expression and stimulates bone regeneration [37, 38]. Moreover, in this study, the upregulated activation of TG2 levels was also observed in BPs treatment groups. To the best of our knowledge, TG2 has important enzymatic and non-enzymatic functions at these locations in which it crosslinks various ECM proteins and modulates the interactions of cells with the ECM and soluble growth factors by non-covalent interactions with and regulation of integrins [39,40,41]. Obviously, the BPs can react strongly with oxygen and water and finally degrade to non-toxic phosphate in aqueous solutions, which is a crucial component of ATP. Nakano Y et al. reported that ATP can act as a significant phosphate (Pi) source for mineralization in MC3T3-E1 osteoblast cultures, indicating that ATP-hydrolyzing enzymes could induce mineral deposition [42]. They also found that TG2 could not only act as a phosphatase but could be involved in ATP hydrolysis in the osteoblast cultures thus further contributing to the elevation in Pi levels required for mineral deposition, which may be beneficial to EMSC energy metabolism. This process may be part of the contribution that BPs makes toward enhancement of EMSC osteogenic differentiation. On the other hand, thanks to TG2 bio-functions, a wide variety of ECM adhesion proteins, including LN, COL I, and FN, could maintain a stable state. Indeed, in the present study, we observed that ECM (FN, COL I, and LN) were significant higher in BP-treated EMSC groups. BPs provide a favorable ECM microenvironment for promoting greater osteogenic EMSC differentiation and proliferation.

Until now, no secretory signal sequences and hydrophobic or transmembrane domains have been clearly identified in TG2 because the protein is not localized in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi compartments [39, 43], and only few studies reported about these factors that control TG2’s secretion. Therefore, it remains unclear as to the exact mechanism of BP regulation of expression patterns of TG2 in the progress of EMSC osteogenic differentiation.

Conclusion

In the present study, BPs were successfully fabricated using mechanical grinding and continuous ultrasound method. At bio-safe concentrations, BPs activated TG2, and promoted the expression of ECM, which further promoted osteogenic differentiation of EMSCs. From these results, we can conclude that BPs would be suitable for incorporation into tissue-engineered scaffolds that utilize EMSCs to repair bone defects. Although our research highlights the great potential of BPs in nano-biomedicine, large-scale preclinical and clinical studies concerning its safety are needed before any clinical applications are established.

Availability of Data and Materials

The datasets generated during and/or analyzed during the study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abbreviations

BPs:

Black phosphorus nanoparticles

EMSCs:

Ectodermal mesenchymal stem cells

TG2:

Transglutaminase 2

2D:

Two-dimensional

ECM:

Extracellular matrix

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

NMP:

N -Methyl-2pyrrolidone

PBS:

Phosphate-buffered saline

DMEM/F12:

Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F12

FBS:

Fetal bovine serum

SD:

Sprague Dawley

SEM:

Scanning electron microscopy

XPS:

X-ray photoelectron spectroscopy

CCK-8:

Cell counting kit

OD:

Optical density

RT-qPCR:

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

GAPDH:

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

BSA:

Bovine serum albumin

TBS:

Tris-buffered saline

DAPI:

4′6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamic light scattering

Persiapan nanopartikel mPEG-ICA bermuatan ICA dan aplikasinya dalam pengobatan kerusakan sel H9c2 yang diinduksi LPS Mengungkap Struktur Atom dan Elektronik Serat Nano Karbon Piala Bertumpuk