Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomal MicroRNA-133a Menahan Fibrosis Miokard dan Transisi Epitel–Mesenkim pada Miokarditis Viral Tikus Melalui Menekan MAML1
Abstrak
Miokarditis adalah penyakit yang ditandai dengan inflamasi lokal atau difus dari miokardium tanpa pengobatan yang efisien. Studi ini mengeksplorasi mekanisme regulasi microRNA-133 (miR-133) yang disekresikan dari sumsum tulang mesenchymal stem cell-derived exosome (BMSC-Exo) pada fibrosis miokard dan transisi epitel-mesenkim (EMT) pada virus miokarditis (VMC) tikus melalui regulasi seperti dalang 1 (MAML1). BMSC pada tikus diisolasi dan dikultur untuk mengidentifikasi fenotipe imun dan kemampuan osteogenik dan adipogeniknya, dan BMSC-Exo diekstraksi dan diidentifikasi. Eksosom diperoleh melalui ultrasentrifugasi, yang diidentifikasi dengan mikroskop elektron transmisi dan analisis western blot. Tikus disuntik dengan virus Coxsackie B3 untuk persiapan model VMC, dan kardiomiosit diisolasi, dikultur, dan dikelompokkan dengan cara yang sama seperti hewan percobaan (NC
Exo
, Ad-miR-133a
Exo
, Adas-miR-133a
Exo
). Eksperimen in vivo dan in vitro dilakukan untuk mengetahui peran exosomal miR-133a dan MAML1 dalam inflamasi, apoptosis, EMT, fibrosis, dan viabilitas sel. Hubungan penargetan antara miR-133a dan MAML1 diverifikasi oleh uji gen reporter luciferase ganda. BMSC-Exo meningkatkan ekspresi miR-133a pada tikus VMC dan secara efektif meningkatkan fungsi jantung tikus VMC dan fibrosis miokard, meningkatkan viabilitas kardiomiosit dan menghambat proses EMT. Peningkatan miR-133a dalam eksosom memperkuat peningkatan. MiR-133a yang dibungkam secara efektif membalikkan efek BMSC-Exo pada tikus VMC. miR-133a menargetkan MAML1. Penghambatan MAML1 meningkatkan fungsi jantung dan fibrosis miokard pada tikus VMC dan dapat membalikkan efek eksosom yang dibungkam miR-133a pada tikus VMC. Studi kami menunjukkan bahwa peningkatan exosomal miR-133a menekan fibrosis miokard dan EMT pada tikus dengan VMC melalui down-regulating MAML1, sehingga menghambat perkembangan miokarditis.
Pengantar
Miokarditis dianggap sebagai penyakit inflamasi sel otot jantung [1]. Miokarditis jelas lebih umum pada pria dibandingkan dengan wanita [2]. Viral myocarditis (VMC) adalah faktor utama yang menyebabkan kardiomiopati dilatasi (DCM) dan kematian mendadak pada orang muda [3]. Gambaran klinis miokarditis bervariasi, mulai dari keadaan asimtomatik dengan tanda dan gejala yang tidak jelas hingga kerusakan miokard yang serius oleh virus dan sel imun yang menderita syok kardiogenik dan aritmia [1]. Miokarditis dapat diinduksi oleh berbagai elemen infeksi, terdiri dari virus, bakteri, klamidia, riketsia, jamur, dan protozoa, bersama-sama dengan penginduksi noninfeksi. Di antaranya, infeksi virus menjadi penyebab paling umum, terutama pada anak-anak [4]. Virus Coxsackie B3 (CVB3), sebagai virus paling penting yang menyebabkan miokarditis, dapat menyebabkan respons stres oksidatif dan apoptosis dalam patogenesis VMC, tetapi pengobatan khusus VMC belum dilaporkan [5]. Selain itu, patogenesis VMC tidak didokumentasikan dengan baik, dan pengobatan klinis yang tepat juga kurang [3]. Oleh karena itu, target baru sangat dibutuhkan untuk meningkatkan prognosis penyakit.
MicroRNAs (miRNAs) adalah RNA noncoding endogen yang dapat mengatur ekspresi gen penyandi protein [6]. MiR-133a, sebagai salah satu miRNA khusus jantung, terlibat dalam perkembangan jantung dan beberapa penyakit kardiovaskular, yang mengandung infark miokard (MI) [7]. Selain itu, miR-133a adalah salah satu yang diekspresikan secara menyimpang pada kardiomiopati penyakit Chagas kronis [8]. Selain itu, kadar miR-133a di miokardium berhubungan dengan inflamasi, fungsi ventrikel kiri, dan hasil klinis pada kardiomiopati inflamasi [9]. MiRNA ditemukan dalam eksosom yang berasal dari sel mast tikus dan manusia [10]. Eksosom, vesikel berukuran nano yang dikeluarkan oleh sebagian besar jenis sel ditemukan dalam cairan biologis yang berbeda [11]. Eksosom dapat mentransfer muatannya ke sel penerima, yang telah terbukti mengubah komposisi biokimia dan jalur pensinyalan sel penerima [12, 13]. Bukti telah menunjukkan bahwa miRNA eksosom yang berubah terhubung dengan patogenesis miokarditis yang diinduksi CVB3 [14]. Telah dibahas bahwa eksosomal miR-125b-5p dari sel punca mesenkim sumsum tulang yang dikondisikan hipoksia mengurangi apoptosis kardiomiosit dan meningkatkan perbaikan jantung iskemik [15]. Selain itu, miR-25-3p eksosom dari MSC meredakan MI melalui pengurangan apoptosis kardiomiosit dan respons inflamasi [16]. Yang menarik, miR-133a yang diekspresikan jantung eksosom terhubung ke troponinkardiak troponin-I jantung [17]. Mastermind-like 1 (MAML1) adalah gen hilir yang disaring silang dari miR-133a dalam penelitian kami yang telah dilaporkan terlibat dalam cedera iskemia/reperfusi (I/R) miokard [18]. Juga, sebuah penelitian baru-baru ini menyebutkan bahwa knockdown MAML1 memiliki fungsi anti-fibrotik pada fibrosis hati [19].
Diterangkan oleh penelitian sebelumnya, heran bahwa apakah miR-133a eksosom yang diturunkan dari BMSC dapat memediasi miokarditis. Oleh karena itu, penelitian ini dimulai dengan hipotesis bahwa miR-133 yang dibawa oleh BMSC-derived exosome (BMSC-Exo) memperbaiki fibrosis miokard dan transisi epitel-mesenkim (EMT) pada tikus VMC melalui regulasi MAML1.
Bahan dan Metode
Persetujuan Etis
Studi ini diizinkan oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional dari Rumah Sakit Afiliasi Keempat Fakultas Kedokteran Universitas Zhejiang. Hewan diperlakukan secara manusiawi.
Isolasi BMSC
Hewan percobaan adalah tikus jantan Sprague–Dawley (SD) grade Sprague–Dawley (SD) bebas patogen spesifik dewasa (Pusat Hewan Eksperimen Fakultas Kedokteran Universitas Zhejiang, Zhejiang, Cina). Tikus di-eutanasia dengan injeksi intraperitoneal dengan natrium pentobarbital dan disterilkan dengan alkohol 75%. Tulang paha dan tibia dikeluarkan di atas meja yang sangat bersih, otot dan jaringan ikat dikeluarkan, dan rongga sumsum dibilas berulang kali dengan Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) glukosa rendah. Cairan disentrifugasi untuk mengumpulkan endapan yang disuspensikan kembali dan diinkubasi selama 24 jam (medium diganti setiap 2-3 hari). Ketika tumbuh ke fase logaritmik, BMSC dilepaskan dengan 0,25% tripsin (Gibco, Carlsbad, California, AS), disentrifugasi dan disuspensikan kembali dalam larutan kultur MSC (Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, Cina). Suspensi dilewatkan dengan perbandingan 1:2. Operasi di atas diulangi, dan BMSC bagian ke-4 digunakan untuk eksperimen selanjutnya.
Identifikasi BMSC
Antigen permukaan dari BMSC bagian ke-4 dalam pertumbuhan logaritmik diidentifikasi dengan flow cytometry. BMSC dipisahkan dengan tripsin 0,25% (1 mL) yang mengandung asam etilen diamina tetraasetat, disentrifugasi, disuspensikan kembali dengan saline buffer fosfat (PBS) yang sesuai dan disentrifugasi pada 151 g. BMSC kemudian ditangguhkan kembali dengan PBS yang mengandung 2% serum janin sapi segar (FBS) (Gibco) untuk membuat suspensi sel tunggal. Antibodi monoklonal FITC-CD34, PE-CD29, dan PE-CD44 (masing-masing 5 L, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) diinkubasi dengan suspensi sel (100 L), disentrifugasi pada 151 g, disuspensikan kembali dengan 500 L L PBS yang mengandung 1% paraformaldehyde dan difiksasi selama 30 menit. Penanda latar belakang diidentifikasi melalui penggunaan antibodi monoklonal dari kontrol homotipe.
Flow cytometry:suspensi sel tunggal difiksasi dan disentrifugasi pada 151 g. Kemudian BMSC disuspensikan kembali dengan PBS yang mengandung 1% paraformaldehyde, diuji pada flow cytometer MACS Quart dan dianalisis dengan perangkat lunak yang sesuai.
Induksi Osteogenesis dan Adipogenesis BMSC
BMSC di bagian ke-4 diunggulkan ke dalam 6 pelat sumur dengan 200 sel / mL. Larutan induksi osteoblas dan larutan induksi adipogenik (Cyagen Biosciences Inc.) ditambahkan ke dalam BMSC dengan pertemuan 60–70%. BMSC di dua sumur lainnya tidak ditambahkan dengan cairan induksi sebagai kontrol. BMSC diinduksi selama 14 hari dan difiksasi dengan paraformaldehyde 4%. Kemudian osteoblas dan adiposit yang berdiferensiasi diimplementasikan dengan pewarnaan Alizarin red dan pewarnaan O merah minyak (Wuhan Pulande Biological Technology Co., Ltd., Wuhan, China), dan diamati di bawah mikroskop.
Isolasi dan Identifikasi Eksosom
BMSC di bagian ke-4 dikultur selama 48 jam untuk memanen supernatan yang kemudian disentrifugasi (800 g dan 2000 g), disaring dengan membran filter 0,22 m dan 100.000 MW, dan disentrifugasi (100.000 g) untuk mengumpulkan endapan. Kemudian, endapan disuspensikan kembali dengan PBS, disentrifugasi kembali pada 100,00 g untuk mendapatkan pengendapan eksosom. Suspensi BMSC-Exo di PBS menjadi sasaran deteksi konsentrasi dengan asam bicinchoninic (BCA) dan deteksi protein pembuat eksosom (CD63, CD81 dan CD9) dengan analisis western blot (Proteintech, Chicago, IL, USA).
Infeksi Adenovirus Rekombinan Memediasi Modifikasi Gen miR-133a dari BMSC
BMSC dilewatkan dalam semalam. Kontrol normal (jumlah PBS yang sama), kontrol negatif miR-133a (NC), ekspresi berlebih miR-133a (Ad-miR-133a), dan ekspresi rendah miR-133a (Adas-miR-133a) ( Hanbio Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) ditransfeksi dengan BMSC sejalan dengan 100 multiplicity of infection (MOI). BMSC dikultur, dan eksosom yang sesuai (NC
Exo
, NC
Exo
, Ad-miR-133a
Exo
, dan Adas-miR-133a
Exo
) diperoleh melalui ultrasentrifugasi [20].
Pembentukan Model VMC pada Tikus dan Pengelompokan Hewan Percobaan
Tikus SD kelas SPF jantan dewasa dibagi menjadi 10 kelompok, dengan masing-masing delapan ekor tikus. Coxsackievirus B3 (CVB3) disediakan oleh Institute of Medical Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, China).
CVB3 (10 mg/kg) disuntikkan secara intraperitoneal ke tikus sementara PBS atau BMSC-Exo (100 g) disuntikkan melalui vena ekor. Tikus normal untuk kontrol disuntik dengan larutan kultur CVB3 dan PBS. Tikus yang disuntik dengan 10 mg/kg CVB3 selanjutnya disuntik dengan PBS, MSC
exo
, NC
Exo
, Adas-miR-133a
Exo
, Ad-miR-133a
Exo
, si-NC, atau si-MAML1 (RIBOBIO, Guangzhou, China).
Tikus disuntik terus menerus selama 7 hari dan diambil darah bola matanya. Darah disentrifugasi dan serum dikumpulkan, dikemas, dan disimpan pada suhu -20 °C. Setelah tikus di-eutanasia, diambil sampel jantungnya, difiksasi dengan formaldehida 10%, didehidrasi dengan alkohol gradien, dibersihkan dengan xilena dan disematkan dengan parafin, dipotong untuk pengamatan histologis. Sebagian bagian ditempatkan pada suhu 80 °C sebagai bahan percobaan biologi molekuler.
Ekokardiografi
Pada hari ke 7 setelah injeksi virus, tikus diinjeksi secara intraperitoneal dengan natrium pentobarbital 25 mg/kg. Setelah anestesi lengkap, ujung ekstremitas dari mesin elektrokardiogram yang terhubung dengan jarum elektroda dimasukkan secara subkutan di ujung ekstremitas tikus, dan elektrokardiogram sadapan ekstremitas dicatat. Tikus kemudian difiksasi pada posisi terlentang sedikit ke kiri, depilasi dada, dan elektrokardiogram sadapan II disambungkan untuk mendapatkan spektrum Doppler denyut nadi aliran darah aorta pada bagian jantung empat bilik parasternal. Indikatornya termasuk ketebalan dinding posterior ventrikel kiri (LVPW), diameter akhir sistolik ventrikel kiri (LVID), fraksi pemendekan ventrikel kiri (FS), dan fraksi ejeksi ventrikel kiri (LVEF).
Pewarnaan Hematoksilin–Eosin (HE)
Jaringan difiksasi dengan paraformaldehyde 4%, didehidrasi, dibersihkan, dan disematkan dengan parafin. Kemudian bagian 4 m dihilangkan lilinnya, diwarnai dengan hematoxylin (Servicebio, Wuhan, Cina), dibedakan dengan alkohol asam klorida 1%, kembali menjadi biru, dan diwarnai dengan eosin, didehidrasi, dibersihkan dengan xilena, disegel dengan getah netral, dan diamati di bawah mikroskop optik (Olympus, Tokyo, Jepang).
Pewarnaan Masson Collagen
Bagian parafin dihilangkan lilinnya, diwarnai dengan hematoxylin kurang dari 2 menit, diwarnai dengan larutan Lichun magenta, dan dengan cepat dibilas dengan larutan asam asetat glasial 0,5%. Kemudian bagian diwarnai dengan larutan aluminium fosfat 1%, diwarnai dari merah tua menjadi merah terang hingga merah muda, dan diamati di bawah mikroskop. Kemudian bagian diwarnai dengan Aniline blue (Pulande), secara konvensional didehidrasi dengan xilena dan disegel. Perangkat lunak analisis citra medis Image-Proplus 6.0 digunakan untuk mengukur area pewarnaan positif dari serat kolagen, dan fraksi volume kolagen (CVF) = area kolagen/luas bidang total. Lokasi pewarnaan dan warna serat kolagen dibedakan (kardiomiosit berwarna merah, dan serat kolagen berwarna biru atau struktur homogen di ruang antar sel).
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated Deoxyuridine Triphosphate-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL) Pewarnaan
Bagian parafin dihilangkan lilinnya, ditempatkan dalam buffer sitrat dan dipanggang pada 350 W selama 10 menit. Bagian tersebut ditambahkan dengan 50 L larutan TUNEL, digabungkan dengan 50 L agen konversi-peroksidase, dikembangkan dengan DAB, dan diamati di bawah mikroskop. Irisan dimasukkan ke dalam hematoxylin, dicelupkan dengan etanol 95% I–II, digabungkan dengan etanol anhidrat I–II, xilena I–II, dan disegel. Hasilnya dianalisis di bawah mikroskop optik.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Faktor nekrosis tumor (TNF-α), interleukin (IL)-1β dan IL-6 dideteksi dengan kit ELISA (BOSTER Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, China). Darah bola mata disentrifugasi pada 604 g untuk mengumpulkan serum bagian atas. Supernatan yang diperoleh dengan sentrifugasi dari media kultur sel dideteksi dalam percobaan sel. Ada tujuh gradien konsentrasi dalam standar pengenceran sampel. Sumur kosong digabungkan dengan pengencer sampel, dan sumur lain ditambahkan dengan tetrametilbenzidin (TMB), dua sumur duplikat ditetapkan untuk setiap konsentrasi. Sumur sampel digabungkan dengan 50 L pengencer sampel dan sampel secara bergantian. Setiap sumur direaksikan dengan 100 L antibodi primer (kecuali sumur TMB) selama 1 jam, serta dengan 300 L 0,01 M tris-buffered saline (TBS) dan 100 L larutan kerja Kompleks Avidin–Biotin-Peroksidase (kecuali sumur TMB ). Kemudian masing-masing sumur ditambahkan 300 L 0,01 M TBS dan diinkubasi dengan 100 L TMB. Nilai optical density (OD) dan konsentrasi masing-masing sumur segera diukur dan kurva standarnya digambar.
Ekspresi MiR-133a, kolagen , kolagen III, -SMA, TGF-β1, CTGF, E-cadherin, dan FSP-1 di jaringan miokard dan kardiomiosit dideteksi melalui RT-qPCR. Total RNA diekstraksi dari kardiomiosit atau jaringan miokard dan ditranskripsikan secara terbalik ke cDNA melalui kit ekstraksi RNA (Takara, Dalian, Cina), dan primer RT-PCR disintesis melalui Invitrogen (Guangzhou, Cina), urutannya ditunjukkan pada Tabel 1. Ekspresi gen kuantitatif relatif dianalisis dengan menggunakan gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) atau U6 sebagai gen kontrol pemuatan menurut 2
−△△Ct
metode.
Analisis Western Blot
Tikus di-eutanasia dengan anestesi. Jaringan miokard dibekukan dan digiling dalam nitrogen cair. Kemudian larutan stok inhibitor protease phenylmethanesulfonylfluoride dicampur dengan buffer lisis sel dengan perbandingan 1:100 (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China). Sampel dilisiskan dengan larutan campuran dan protein sel diekstraksi. Konsentrasi protein total dideteksi dengan kit BCA. Sampel dicampur dengan 5 x loading buffer pada 4:1, diimplementasikan dengan penangas air mendidih selama 10 menit, penangas es, dan disentrifugasi. Pemisahan elektroforesis dilakukan, dan protein dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (Servicebio) dengan larutan transfer listrik. Kemudian membran diblok dengan 5% susu bubuk skim, dan digabungkan dengan antibodi primer CD63, CD81, dan CD9 (antibodi poliklonal anti tikus kelinci dari Proteintech, 1:100), MAML1 (ab65090, Abcam, MA, USA, 1:1000), dan GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, AS, 1:1000). Kemudian membran ditetesi dengan antibodi sekunder, IgG berlabel peroksidase lobak (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA, 1:1000), dan direndam dalam larutan reaksi chemiluminescence yang ditingkatkan (Pierce, Rockford, IL, USA). Dengan GAPDH sebagai kontrol pemuatan, gambar pencetakan protein dianalisis dengan perangkat lunak ImageJ2x.
Kultur dan Bagian Kardiomiosit
Tikus SD umur 3-5 hari (Experimental Animal Center of Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang, China) diambil. Bagian ventrikel dibilas dengan Hank's Balanced Salt Solution yang telah didinginkan sebelumnya, dipotong kecil-kecil, dan dipisahkan dengan tripsin 0,25%. Potongan-potongan itu ditambahkan dengan jumlah yang sesuai dari 10% medium lengkap untuk penghentian pelepasan dan disentrifugasi pada 151 g. DMEM yang mengandung 20% FBS diterapkan untuk suspensi ulang sel. Kardiomiosit dimurnikan dengan metode kepatuhan diferensial, dan tingkat kelangsungan hidup diamati melalui pewarnaan trypan blue, kardiomiosit yang bertahan dikultur. Setelah 24 jam, kardiomiosit menempel pada dinding dan mulai berdenyut. Setelah 72 jam, pseudopodia melebar.
Konstruksi Model VMC Kardiomiosit
Kardiomiosit pada bagian ke-4 dalam fase pertumbuhan logaritmik dipilih dan diinfeksi dengan MSC
Exo
, NC
Exo
, Adas-miR-133a
Exo
, dan Ad-miR-133a
Exo
. Solusi virus 100 Tcid50 CVB3 (100 L) ditambahkan ke dalam sel untuk menginduksi model VMC sel. Pada saat yang sama, larutan pemeliharaan dalam jumlah yang sama ditambahkan ke sel untuk kontrol, dan eksosom yang sesuai digabungkan ke dalam kardiomiosit setelah infeksi 1 jam selama kultur 47 jam.
Kit Penghitung Sel (CCK)-8 Assay
Kit deteksi sel CCK-8 (Beyotime) diterapkan untuk mendeteksi tingkat kelangsungan hidup kardiomiosit. Ketika tumbuh ke fase logaritmik, sel-sel dipisahkan dengan tripsin 0,25%, dan disemai ke dalam 96 pelat kultur sel pada 2,5 × 10
4
sel/per sumur. Digabungkan dengan larutan CCK-8 (10 L/sumur), sel terus dikultur selama 1-4 jam, dan OD450 nm nilai diukur melalui pembaca pelat mikro.
Flow Cytometry
Metode pewarnaan ganda AnnexinV-APC/propidium iodide (PI) diterapkan untuk mendeteksi apoptosis sel. Sel disentrifugasi, disuspensikan kembali dengan 250 L Binding Buffer (4 mL Binding Buffer + 12 mL air deionisasi), dan disesuaikan dengan 1 × 10
6
sel/mL. Suspensi sel 100 L ditambahkan dengan 5 L Annexin V-APC (BD Biosciences) dan 5 L larutan PI (BD Biosciences), dimuat pada flow cytometer, dan dianalisis secara otomatis oleh komputer.
Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda
Urutan tipe liar (wt) atau tipe mutan (mut) dari MAML1 3-untranslated region (UTR) diklon ke vektor pGL3-M (Promega, WI, USA), kemudian MAML1-3-UTR-wt atau MAML1- 3-UTR-mut dihasilkan. Vektor, bersama dengan miR-133a mimik atau NC, ditransfusikan bersama ke dalam kardiomiosit melalui Lipofectamine 2000. Aktivitas luciferase diuji 48 jam kemudian oleh sistem gen reporter luciferase ganda (Promega) [21]
Uji Imunopresipitasi RNA (RIP)
Kit RIP (Millipore, USA) digunakan untuk mendeteksi pengikatan MAML1 dan miR-133a. Sel dilisiskan oleh buffer uji radio-imunopresipitasi (P0013B, Beyotime, Shanghai, Cina), disentrifugasi pada 1400 g dan diinkubasi dengan antibodi untuk mengendapkan bersama. Manik-manik magnetik (50 L) disuspensikan kembali dalam 100 L RIP Wash Buffer dan diinkubasi dengan 5 g antibodi anti-MAML1 (1 g/mL, ab155786) atau IgG (1:100, ab172730). Kompleks manik-antibodi magnetik disuspensikan kembali dalam 900 L RIP Wash Buffer, berinteraksi dengan 100 L ekstrak sel, dicerna dengan proteinase K, dan dideteksi oleh RT-qPCR [22].
Analisis Statistik
Perangkat lunak statistik SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) digunakan untuk analisis data. Data pengukuran dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Uji t diterapkan untuk perbandingan antara dua kelompok. Analisis varians satu arah (ANOVA) digunakan untuk perbandingan antar kelompok, dan uji post hoc Tukey untuk perbandingan berpasangan. Prediktor disimpan jika signifikan pada P nilai 0,05 atau lebih kecil.
Hasil
Identifikasi BMSC dan BMSC-Exo
Secara mikroskopis, BMSC berbentuk fusiform dan membulat, dan menempel pada dinding dalam pola pusaran atau radial (Gbr. 1A). Setelah pewarnaan minyak merah O pada induksi adipogenesis, tetesan lipid dari BMSC ke-4 berwarna merah, dan ada tetesan lipid bulat dengan ukuran berbeda (Gbr. 1B). Setelah induksi osteogenesis, sel-sel yang mengekspresikan nodul terkalsifikasi menunjukkan warna merah setelah pewarnaan alizarin red, dan distribusi nodul terkalsifikasi yang tidak merata dan sel yang tumpang tindih (Gbr. 1C). Flow cytometry menunjukkan bahwa penanda MSC CD29 dan CD44 (> 95%) diekspresikan, tetapi antigen permukaan sel punca hematopoietik CD34 (< 95%) tidak diekspresikan (Gbr. 1D). Hasil ini menunjukkan bahwa BMSC memiliki kemurnian tinggi dan sesuai dengan standar MSC dari International Society of Cell Therapy.
Pengamatan fenotipe BMSC dan identifikasi BMSC-Exo. A Pengamatan morfologi BMSC di bagian ke-4; B Hasil pewarnaan oil red O pada adiposit; C Hasil pewarnaan alizarin red pada osteoblas; D Fenotipe BMSC terdeteksi melalui flow cytometry. E Pengamatan mikroskop elektron BMSC-Exo; B Pita protein CD9, CD63, dan CD81
Mikroskop elektron transmisi mengamati bahwa BMSC-Exos adalah vesikel oval dengan struktur membran perifer yang jelas, ukuran yang berbeda, dan diameter 40-100 nm (Gbr. 1E). Analisis Western blot menunjukkan bahwa produk yang diekstraksi mengekspresikan eksosom yang berasal dari protein karakteristik CD9, CD63, dan CD81 (Gbr. 1F).
Transfeksi BMSC dengan adenovirus rekombinan miR-133a diamati (Gbr. 2A). Sejumlah besar ekspresi fluoresensi hijau NC, Ad-miR-133a, dan Adas-miR-133a diamati di bawah mikroskop fluoresensi terbalik, yang menunjukkan bahwa vektor adenovirus rekombinan dapat secara efektif mentransfeksi BMSC. Untuk menguji efisiensi transfeksi miR-133a, ekspresi miR-133a dalam BMSC dan eksosomnya diukur dengan RT-qPCR. Ditemukan bahwa up-regulation miR-133a meningkatkan ekspresi miR-133a sementara down-regulation miR-133a menurunkan ekspresi miR-133a (Gbr. 2B). Selanjutnya, kami menyuntikkan eksosom yang mengandung miR-133a pada tikus. Di bawah mikroskop fluoresensi terbalik, ekspresi fluoresensi hijau diamati pada tikus VMC setelah pengobatan NC
Exo
, Ad-miR-133a
Exo
, atau Adas-miR-133a
Exo
, menunjukkan bahwa vektor adenovirus rekombinan menginfeksi jaringan miokard tikus (Gbr. 2C). Eksperimen RT-qPCR juga menemukan bahwa ekspresi miR-133a pada tikus VMC tampaknya menurun; ekspresi miR-133a jelas meningkat pada tikus VMC yang disuntik dengan Ad-miR-133a
Exo
tetapi menurun pada tikus VMC yang disuntik dengan Adas-miR-133a
Exo
(Gbr. 2D). Adapun kondisi umum tikus, diamati bahwa kondisi umum tikus kontrol normal, dan karakteristik VMC ternyata diekspresikan pada tikus VMC dan tikus VMC yang disuntik dengan Adas-miR-133a
Exo
, seperti rambut kasar dan tidak teratur, dispnea, dan sedikit pola makan. Pada tikus VMC yang diberi MSC
Exo
, NC
Exo
, dan Ad-miR-133a
Exo
, tanda-tanda ini ditingkatkan ke derajat yang berbeda. Bobot tikus VMC terus diturunkan dari 1 hari setelah infeksi, dan injeksi MSC
Exo
, NC
Exo
, atau Ad-miR-133a
Exo
meningkatkan berat badan tikus. Bobot tikus VMC yang diberi Ad-miR-133a
Exo
jelas meningkat dan bobot tikus VMC yang disuntik dengan Adas-miR-133a
Exo
jelas menurun (Gbr. 2E).
MiR-133a eksosom yang diatur ke atas meredakan miokarditis A Transfeksi BMSC dari adenovirus rekombinan miR-133a; B Deteksi RT-qPCR dari ekspresi miR-133a dalam BMSC dan eksosomnya setelah mengatur miR-133a; C efisiensi transfeksi miR-133a diuji melalui mikroskop fluoresensi terbalik; D Ekspresi relatif miR-133a dalam jaringan miokard yang diuji melalui RT-qPCR; E Perubahan berat badan tikus pada masing-masing kelompok; B Penentuan LVPW, LVID, FS dan LVEF pada tikus masing-masing kelompok. *P < 0,05; **P < 0.001
Pengamatan fungsi miokard menunjukkan bahwa (Gbr. 2F), tikus VMC telah meningkatkan LVPW dan LVID, dan menurunkan FS dan LVEF. Setelah injeksi eksosom, penurunan LVPW dan LVID, dan jelas peningkatan FS dan LVEF pada tikus VMC. Adas-miR-133a
Exo
perawatan terganggu saat Ad-miR-133a
Exo
meningkatkan fungsi miokard pada tikus VMC.
Up-regulated exosomal miR-133a Menghambat Peradangan pada Jaringan Miokard Tikus VMC
Pewarnaan HE menunjukkan bahwa serat miokard pada tikus kontrol normal tersusun rapat dan tidak ada infiltrasi sel inflamasi di mesenkim. Kardiomiosit pada tikus VMC tidak teratur dan mesenkim disusupi oleh sejumlah besar sel inflamasi. Kardiomiosit pada tikus VMC yang disuntik dengan MSC
Exo
atau NC
Exo
tersusun secara teratur, dengan sejumlah kecil sel inflamasi yang menyusup ke dalam mesenkim. Kardiomiosit pada tikus VMC setelah Adas-miR-133a
Exo
pengobatan diatur secara tidak teratur, dan sel-sel inflamasi di mesenkim disusupi. Kardiomiosit pada tikus VMC yang diobati dengan Ad-miR-133a
Exo
tersusun rapi tanpa infiltrasi sel inflamasi yang jelas (Gbr. 3A).
Peningkatan miR-133a eksosom menahan peradangan pada jaringan miokard dengan VMC. A Pewarnaan HE jaringan miokard tikus pada masing-masing kelompok; B Ekspresi IL-6 dalam serum diuji melalui ELISA; C Ekspresi TNF-α dan IL-1β dalam serum diuji melalui ELISA. *P < 0,05; **P < 0.001
ELISA menunjukkan bahwa (Gbr. 3B, C) faktor inflamasi (TNF-α, IL-1β, dan IL-6) jelas meningkat pada tikus VMC. Tikus VMC disuntik dengan Ad-miR-133a
Exo
telah mengurangi tingkat faktor inflamasi. Adas-miR-133a
Exo
pengobatan menyebabkan peningkatan faktor inflamasi pada tikus VMC.
Elevated Exosomal miR-133a Menurunkan CVF pada Jaringan Miokard Tikus dengan VMC
Pewarnaan Masson mengungkapkan bahwa serat miokard pada tikus normal tersusun rapat, dengan hampir tidak ada serat kolagen biru. Setelah injeksi CVB3, kardiomiosit menjadi hipertrofik, dengan hiperplasia jaringan ikat dan sejumlah besar serat kolagen biru, dan CVF jelas meningkat. Diobati dengan eksosom, kardiomiosit diatur secara teratur, hiperplasia jaringan ikat antar sel berkurang, serat kolagen biru dan CVF jelas menurun. Ruang antar sel miokard tikus VMC yang disuntik dengan Adas-miR-133a
Exo
melebar, sel jelas membesar, serat kolagen biru dan CVF jelas meningkat; ruang antar sel berkurang, distribusi serat kolagen biru dan CVF menurun pada tikus VMC dengan Ad-miR-133a
Exo
pengobatan (Gbr. 4A, B).
MiR-133a eksosom yang diatur ke atas menurunkan CVF di jaringan miokard tikus dengan VMC A Pewarnaan massal jaringan miokard pada tikus; B Fraksi volume kolagen tikus pada masing-masing kelompok. **P < 0.001
Peningkatan Exosomal miR-133a Mengurangi Ekspresi Kolagen I, Kolagen III, TGF-β1, dan CTGF pada Jaringan Miokard Tikus dengan VMC
Kolagen I dan kolagen III adalah komponen utama kolagen, yang terutama didistribusikan di persimpangan sel dan membran sel, zat antar sel, dan sitoplasma. TGF-β1 dan CTGF adalah protein khas fibrosis. Temuan RT-qPCR menunjukkan bahwa tingkat ekspresi mRNA kolagen I, kolagen III, TGF-β1, dan CTGF meningkat pada tikus VMC, tetapi menurun setelah pengobatan eksosom. Tikus VMC yang diberi Ad-miR-133a
Exo
mengalami penurunan tingkat ekspresi mRNA kolagen I, kolagen III, TGF-β1, dan CTGF sedangkan tikus VMC setelah Adas-miR-133a
Exo
pengobatan menunjukkan situasi yang berlawanan (Gbr. 5A-C).
Elevated exosomal miR-133a reduces the mRNA expression of collagen I, collagen III, TGF-β1 and CTGF in myocardial tissues of rats with VMC. A Collagen I mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; B Collagen III mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; C TGF-β1 and CTGF mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR. *P < 0,05; **P < 0.001
Up-regulated Exosomal miR-133a Inhibits the Cardiomyocyte Apoptosis in Myocardial Tissues of Rats with VMC
TUNEL staining showed that the apoptotic cardiomyocytes were brownish black or brownish yellow with nuclear condensation. The number of apoptotic cells was increased in VMC rats which would be attenuated by exosome treatment. The VMC rats injected with Ad-miR-133a
Exo
had reduced number of apoptotic cells and those injected with Adas-miR-133a
Exo
had increased number of apoptotic cells (Fig. 6A, B).
Increased exosomal miR-133a inhibits the cardiomyocyte apoptosis in myocardial tissues of rats with VMC. A TUNEL staining of rat myocardial tissues in each group; B The number of TUNEL positive cells in each group. **P < 0.001
Elevated Exosomal miR-133a Depresses EMT in Myocardial Tissues of Rats with VMC
E-cadherin, α-SMA, and FSP-1 are key indicators of EMT. Results of RT-qPCR demonstrated that α-SMA and FSP-1 mRNA expression levels were elevated and E-cadherin mRNA expression level was decreased in VMC rats. In addition, α-SMA and FSP-1 mRNA expression levels were reduced and E-cadherin mRNA expression level was increased in VMC rats after exosome treatment. α-SMA and FSP-1 mRNA expression levels were elevated and E-cadherin mRNA expression level was decreased in VMC rats treated with Adas-miR-133a
Exo
, while the expression of these indicators was opposite in VMC rats injected with Ad-miR-133a
Exo
(Fig. 7A, B).
Up-regulated exosomal miR-133a represses EMT in myocardial tissues of rats with VMC. A The mRNA expression of α-SMA in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR; B The mRNA expression of FSP-1 and E-cadherin in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR. *P < 0,05; **P < 0.001
Up-regulated Exosomal miR-133a Depresses Inflammation of Cardiomyocytes in VMC
As a result, fluorescence microscopy captured green fluorescent expression in VMC rats treated with NC
Exo
, Ad-miR-133a
Exo
, or Adas-miR-133a
Exo
, indicating that the recombinant adenovirus vector infected cardiomyocytes of rats (Fig. 8A). RT-qPCR and ELISA discovered that (Fig. 8B, D) miR-133a expression was reduced and inflammatory factors (TNF-α, IL-1β, and IL-6) were increased in VMC rats, which would be reversed by exosome treatment. The VMC rats treated with Ad-miR-133a
Exo
had up-regulated miR-133a and decreased inflammatory factors in VMC rats, while those treated with Adas-miR-133a
Exo
presented decreased miR-133a and increased levels of inflammatory factors in VMC rats.
Elevated exosomal miR-133a restrains inflammation of cardiomyocytes in VMC. A miR-133a transfection efficiency tested via inverted fluorescence microscope; B The relative expression of miR-133a in cardiomyocytes of rats in each group; C IL-6 expression in culture supernatant of cardiomyocytes in each group; D TNF-α and IL-1β expression in culture supernatant of cardiomyocytes in each group. *P < 0,05; **P < 0.001
Elevated Exosomal miR-133a Promotes Cell Viability, and Represses Apoptosis of Cardiomyocytes in VMC
The apoptosis and the cell viability were detected via AnnexinV-APC/PI double staining and CCK-8 assay. The results revealed that there was an obvious increase in apoptosis rate, a decrease in cell viability of cardiomyocytes in VMC rats. Exosome treatment reduced apoptosis rate and enhanced the viability of cardiomyocytes. Adas-miR-133a
Exo
enhanced the apoptosis rate and disrupted the viability of cardiomyocytes in VMC rats. Ad-miR-133a
Exo
treatment functioned the opposite effects on cardiomyocytes of VMC rats (Fig. 9A–C).
Increased exosomal miR-133a promotes viability and represses apoptosis in cardiomyocytes in VMC. A The cardiomyocytes apoptosis detected via flow cytometry; B Quantification results of A; C The cell viability detected via CCK-8 assay. *P < 0,05; **P < 0.001
miR-133a Targets MAML1
It has been reported that up-regulated miRNA-193b reduces myocardial I/R damage by targeting MAML1 [18]. Based on that, we cross-screened downstream genes of miR-133a through bioinformatics websites PITA, miRanda, PicTar, microT and miRmap, and selected MAML1 as a target of miR-133a (Fig. 10A). We constructed MAML1-wt or MAML1-mut, and co-transfected cardiomyocytes with miR-133a mimic or NC. The results showed that miR-133a mimic reduced the luciferase activity of MAML1-wt (Fig. 10B). The RIP experiment further verified the targeting relationship between miR-133a and MAML1 (Fig. 10C). RT-qPCR and Western blot detection of MAML1 expression showed that MAML1 expression was decreased in cardiomyocytes transfected with miR-133a mimic (Fig. 10D, E).
miR-133a targets MAML1. A miR-133a’s targets predicted on bioinformatics websites; B The targeting relationship between miR-133a and MAML1 verified by dual luciferase reporter gene experiment; C The targeting relationship between miR-133a and MAML1 verified by RIP experiment; D /E MAML1 expression changes after up-regulation of miR-133a detected by RT-qPCR and Western blot. *P < 0,05; **P < 0.01; ***P < 0.001
Inhibition of MAML1 has a Protective Effect on Rats with Myocarditis and Reverses the Effect of miR-133a-Inhibited Exosomes on Rats with VMC
To further study the effect of miR-133a-regulated MAML1 on rats with VMC, we injected si-MAML1 or si-NC adenovirus into VMC rats or VMC rats that had been treated with miR-133a-silenced exosomes. The injection success was validated by RT-qPCR and Western blot (Fig. 11A, B). The results manifested that injection of si-MAML1, the weight of VMC rats was increased (Fig. 11C), cardiac function was improved (Fig. 11D–G), myocardial tissue pathology and fibrosis were attenuated (Fig. 12A–C), serum inflammation (Fig. 12D, E) and cardiomyocyte apoptosis (Fig. 13A–G) were inhibited. Also, the deleterious effects of miR-133a-silenced exosomes in VMC rats were reversed after injection of si-MAML1.
Inhibition of MAML1 has a protective effect on myocarditis rats and can reverse the effect of miR-133a-silenced exosomes on rats with VMC. A /B MAML1 expression in myocardial tissue of rats detected by RT-qPCR and Western blot; C. Weight change of rats; D –G Determination of LVPW, LVIDs, FS and LVEF in rats; **P < 0.01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001
Inhibition of MAML1 can reverse the effect of miR-133a-silenced exosomes on rats with VMC. A HE staining of rat myocardial tissue; B Masson staining of myocardial tissues in rats; C CVF of rats; D The expression of IL-6 in serum tested via ELISA; E The expression of TNF-α and IL-1β in serum tested via ELISA.****P < 0,0001
Inhibition of MAML1 can reverse the effect of miR-133a-inhibiting exosomes on rats with VMC. A Collagen I mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; B Collagen III mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; C TGF-β1 and CTGF mRNA expression in myocardial tissues of rats was detected by RT-qPCR; D TUNEL staining of rat myocardial tissues in each group; E The number of TUNEL positive cells in each group. B The mRNA expression of α-SMA in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR; G The mRNA expression of FSP-1 and E-cadherin in rat myocardial tissues in each group was detected by RT-qPCR. *P < 0,05; **P < 0.01; ****P < 0,0001
Discussion
Myocarditis is an inflammatory heart illness resulting in DCM and heart failure and is most frequently induced by viral infections such as CVB3 [2]. A study has revealed that miR-133 relieves cardiomyocyte apoptosis and electrical remodeling in mice with VMC [23]. Additionally, changed exosomal miRNAs are also found to be linked with the pathogenesis of CVB3-induced myocarditis [14]. Exosomes derived from cardiac progenitor cells ease CVB3-induced apoptosis via restraining the proliferation of CVB3 in VMC [24]. This study explored the regulatory mechanism of BMSC-derived exosomal miR-133 on myocardial fibrosis and EMT in VMC rats (Additional file 1:Fig. 1).
The study found that the expression of miR-133a was decreased in VMC. As demonstrated before, miR-133a expression is decreased in MI [7]. A study has also suggested that the relative expression of miR-133 in mouse hearts of the VMC is obviously decreased with contrast to the controls [23]. There are some connections of miRNAs with exosomes. The differential expression of exosomes and of exosomal miRNAs in illness has been regarded as biomarkers of disease with performance of noninvasive clinical diagnosis together with their therapeutic potentials [25]. Lin et al. have found that miR-133 is specially sorted into hypoxia/reoxygenation (H/R)-caused human endothelial progenitor cells-derived exosomes to increase fibroblast angiogenesis and EMT [26]. Another study has revealed that MSCs exhibits a communication with brain parenchymal cells and may modulate neurite outgrowth by transfer of miR-133b to neural cells via exosomes [27].
The major finding of this work manifested that up-regulated exosomal miR-133a promoted cell viability, inhibited inflammation, apoptosis, EMT, and fibrosis in rats with VMC. They suits well with a former research that miR-133a silence reverses the Astragalus polysaccharides treatment-induced osteosarcoma MG63 cell proliferation inhibition, together with cell apoptosis promotion [28]. Another study has revealed that overexpressed miR-133a suppresses angiogenesis, apoptosis, fibrosis, and inflammation, while accelerating therapeutic cardiac remodeling in ischemic myocardial illnesses [29]. Similar to our study, Li et al. have stated that miR-133 inhibits cardiomyocyte apoptosis by regulating the expression of apoptosis-related genes in the hearts of VMC mice [23]. The over-expressed miR-133a has been reported to depress hypoxia-induced apoptosis and strengthen cardiomyocyte survival [30]. Meanwhile, the up-regulated serum exosomal miR-30a and miR-181d may have the potentials to be applied as biomarkers for VMC diagnosis [14].
Another finding in our study was that up-regulated exosomal miR-133a decreased CVF, reduced the expression of collagen I and collagen III in rats with VMC. A article has elucidated that released fibroblast growth factor-18 from a collagen membrane causes osteoblastic activity participating in down-regulated miR-133a [31]. In vitro excessive expression of miR-133a depresses cardiomyocyte hypertrophy and reduces collagen expression [32], as evidenced in another study. CVF equals the ratio of collagen area to the sum of myocardial area and collagen area, and the mean value shows the CVF of the section [33]. This finding is also reported by Wang et al. that VMC mice model is successfully constructed by CVB3 infection, manifesting apparent higher CVF expression in contrast with the control group [34]. Moreover, the finding is consistent with that of Ferreira et al. who demonstrates that miR-133a may take on a major role in the modulation of gene expression in chronic Chagas disease cardiomyopathy pathogenesis, with potential link as diagnostic and prognostic tools [8]. Furthermore, evidence has shown that knocking down MAML1 can reduce the hypertrophy of pre-treated cardiomyocytes [35]. In our study, we found that MAML1 was the target gene of miR-133a and inhibition of MAML1 reversed the effects of miR-133a-silenced exosomes on rats with VMC. In myocardial ischemia–reperfusion injury, miR-193b-mediated down-regulation of MAML1 could in part reduce infarction and myocardial enzymes, as well as attenuate apoptosis of cardiomyocytes [18]. Also, there is a report suggesting that deficiency of MAML1 could relieve hepatic fibrogenesis [19].
Conclusion
In conclusion, this present study offers evidence that miR-133a is down-regulated in rats with VMC, and elevated exosomal miR-133a improves cardiac function and restrains myocardial fibrosis and EMT in rats with VMC, as well as enhances viability and represses apoptosis of cardiomyocytes in VMC through targeting MAML1. Our study also suggests that inhibition of MAML1 has a protective effect on rats with myocarditis and reverses the effect of miR-133a-inhibited exosomes on rats with VMC. The identification of the exosomal miR-133a in myocardial fibrosis and EMT of myocarditis may potentially widen our understanding of mechanisms underpinning myocarditis and also bear clinical value as a novel molecular target. More researches should be undertaken for making inroads into the treatment of this disease.
Singkatan
miR-133:
MicroRNA-133
BMSC-Exo:
Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosome
EMT:
Epithelial–mesenchymal transition
VMC:
Viral myocarditis
CVF:
Collagen volume fraction
DCM:
Dilated cardiomyopathy
CVB3:
Coxsackie B3 virus
miRNAs:
MicroRNAs
MI:
Myocardial infarction
SPF:
Specific pathogen-free
SD:
Sprague–Dawley
DMEM:
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
PBS:
Garam dengan buffer fosfat
FBS:
Serum janin sapi
NC:
Negative control
MOI:
Multiplicity of infection
LVPW:
Left ventricular posterior wall thickness
LVIDs:
Left ventricular end-systolic diameter
LVEF:
Left ventricular ejection fraction
HE:
Hematoksilin–eosin
TUNEL:
Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end-labelin
