Menyetel Kimia Permukaan Polieterketon dengan Pelapisan Emas dan Perawatan Plasma
Abstrak
Polyetheretherketone (PEEK) memiliki sifat kimia dan biomekanik yang baik yang sangat baik untuk aplikasi biomedis. Namun, PEEK menunjukkan karakteristik permukaan hidrofobik dan lainnya yang menyebabkan adhesi sel terbatas. Kami telah menyelidiki potensi pengobatan plasma Ar untuk pembentukan permukaan MENGINTIP berstruktur nano untuk meningkatkan adhesi sel. Tujuan khusus dari penelitian ini adalah untuk mengungkapkan efek antarmuka matriks PEEK yang dirawat dengan plasma dan dilapisi emas pada adhesi dan penyebaran fibroblas embrionik tikus. Karakteristik permukaan (polaritas, kimia permukaan, dan struktur) sebelum dan sesudah perlakuan dievaluasi dengan berbagai teknik eksperimental (gravimetri, goniometri, spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS), dan analisis elektrokinetik). Selanjutnya, mikroskop kekuatan atom (AFM) digunakan untuk memeriksa morfologi dan kekasaran permukaan MENGINTIP. Respon biologis sel terhadap PEEK berstruktur nano dievaluasi dalam hal adhesi sel, penyebaran, dan proliferasi. Morfologi sel rinci dievaluasi dengan pemindaian mikroskop elektron (SEM). Dibandingkan dengan perawatan plasma, pelapisan emas meningkatkan keterbasahan MENGINTIP. Metode XPS menunjukkan penurunan konsentrasi karbon dengan bertambahnya waktu perawatan plasma. Adhesi sel yang ditentukan pada antarmuka antara matriks PEEK yang diolah plasma dan dilapisi emas berbanding lurus dengan ketebalan lapisan emas pada sampel. Hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan plasma dalam kombinasi dengan lapisan emas dapat digunakan dalam aplikasi biomedis yang membutuhkan adhesi sel yang ditingkatkan.
Latar Belakang
Salah satu masalah penuaan manusia adalah memakai sendi, yang berhubungan dengan peningkatan tajam dalam kelimpahan berbagai penderitaan dari sistem kerangka dan sendi termasuk patah tulang, degenerasi tulang belakang, arthritis, dan tumor tulang. Operasi ortopedi menggunakan implan buatan saat ini merupakan metode utama yang digunakan untuk pembaruan struktural dan fungsional tulang dan sendi yang rusak. Bahan yang biasa digunakan untuk implan ortopedi terutama logam, keramik, polimer, dan komposit. Implan logam (misalnya, emas) banyak digunakan dalam praktik klinis baik sebagai pengganti permanen (misalnya, penggantian pinggul, gigi tiruan) atau sebagai prostesis temporal (misalnya, cakram, engsel, sekrup, dan batang yang digunakan untuk memperbaiki patah tulang). Logam disukai karena kekuatan mekaniknya, ketahanan aus, dan tidak beracun [1,2,3]. Di sisi lain, kekuatan mekaniknya yang tinggi dan elastisitasnya yang rendah tidak sesuai dengan jaringan kerangka manusia. Ini mungkin berdampak negatif pada implan tulang, yang dapat menyebabkan penyerapan jaringan tulang yang berdekatan dan pelepasan implan. Polimer seperti ultra-high-molecular-weight polyethylene (UHMWPE), polytetrafluorethylene (PTFE), polymethylmethacrylate (PMMA), polylactide (PLA), polyglycolide (PGA), dan polyhydroxybutyrate (PHB) banyak digunakan dalam berbagai aplikasi biomedis. Tetapi hanya sejumlah kecil polimer yang telah digunakan sebagai pengganti tulang atau sendi, karena mereka cenderung terlalu fleksibel dan lemah untuk memenuhi tuntutan yang ditempatkan pada implan ortopedi mekanik [4, 5].
Polyetheretherketone (PEEK) adalah polimer termoplastik aromatik polisiklik linier semikristalin pertama kali disintesis pada tahun 1978 [6]. MENGINTIP umumnya digunakan sebagai bahan untuk spacer intervertebralis dan sekrup tulang [7, 8]. Karena struktur kimianya yang khusus, PEEK memiliki ketahanan yang tinggi terhadap perubahan kimia dan fisika [6, 9, 10]; juga, tahan aus dan stabil di bawah suhu tinggi [6]. Selain itu, biokompatibilitas PEEK terbukti baik secara in vitro maupun in vivo dan tidak menimbulkan efek toksik atau mutagenik [11,12,13]. Keuntungan besarnya adalah elastisitas yang mirip dengan tulang manusia, yang memungkinkan distribusi berat yang seimbang antara implan dan tulang; oleh karena itu, tidak ada efek pelindung stres setelah implantasi. Namun, PEEK menunjukkan sifat hidrofobik dan bioinert, yang tidak menguntungkan untuk adsorpsi protein dan adhesi sel [14, 15]. Jadi, untuk meningkatkan sifat ini, permukaan MENGINTIP perlu dimodifikasi.
Karakteristik permukaan bahan dapat disesuaikan dengan berbagai teknik [16]. Salah satu metode ini adalah modifikasi permukaan biopolimer oleh plasma, yang menggunakan gas terionisasi yang dihasilkan dalam sistem reaktor tertutup yang mengandung gas di bawah tekanan rendah dan peralatan untuk eksitasi gas elektromagnetik. Dibandingkan dengan teknik basah, modifikasi plasma dari permukaan biopolimer menguntungkan untuk fleksibilitas kimia. Partikel reaktif yang dihasilkan secara elektromagnetik berinteraksi dengan permukaan biopolimer dalam reaktor yang menyebabkan perubahan sifat fisik dan kimianya. Sifat mekanik, listrik, dan optik dari bahan massal, relevan dengan penerapannya, tetap tidak berubah [17], yang menguntungkan dalam desain, pengembangan, dan pembuatan polimer biokompatibel. Metode lain yang digunakan untuk meningkatkan sifat permukaan polimer adalah sputtering katoda. Integrasi nanopartikel emas ke dalam film tipis penting untuk berbagai aplikasi, misalnya rekayasa jaringan dan penginderaan biologis [18]. Ukuran nanopartikel mempengaruhi perilaku dan sifat permukaan permukaan material (misalnya, kepadatan, parameter kisi, listrik, dan sifat optik) [19]. Terutama partikel nano yang lebih kecil dari 100 nm sering meningkatkan adhesi dan proliferasi sel [20].
Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk membentuk struktur nano pada PEEK dengan pengobatan plasma dan deposisi emas untuk meningkatkan adhesi dan proliferasi sel, khususnya fibroblas embrionik tikus (L929). Karakteristik permukaan (polaritas, kimia permukaan, dan struktur) sebelum dan sesudah perawatan dievaluasi dengan berbagai teknik (gravimetri, goniometri, spektroskopi fotoelektron sinar-X, dan analisis elektrokinetik). Selanjutnya, mikroskop kekuatan atom digunakan untuk memeriksa morfologi dan kekasaran permukaan MENGINTIP. Hasilnya dibahas dalam konteks aplikasi biomedis potensial, terutama untuk kemungkinan pemanfaatan dalam konstruksi implan tulang belakang dan pengganti ortopedi dan traumatologi lainnya.
Metode
Materi dan Modifikasi
Foil MENGINTIP (ketebalan 50 μm, kerapatan 1,26 g cm
−3
, dipasok oleh Goodfellow Ltd., UK) digunakan untuk semua eksperimen. Semua sampel MENGINTIP (melingkar, ø = 2 cm) diperlakukan dengan plasma yang diikuti dengan lapisan emas setengah dari setiap sampel. Sampel MENGINTIP diperlakukan secara langsung (cahaya, dioda) Ar
+
plasma menggunakan perangkat Balzers SCD 050 (BalTec AG, Pfäffikon, CH) dalam kondisi yang dijelaskan dalam [18, 21]. Waktu perawatan adalah 60 dan 240 d, dan daya pelepasan adalah 8,3 W. Pelapisan emas PEEK dilakukan oleh perangkat Balzers SCD 050 dari target emas (kemurnian 99,95%, dipasok oleh Safina Ltd., CZ). Kondisi pengendapan adalah DC Ar
+
plasma; kemurnian gas 99,995%; waktu sputtering 30, 150, dan 300 dtk, arus 40 mA (daya pengosongan 15 W); dan total Ar
+
tekanan. Jarak elektroda, densitas daya, dan laju deposisi rata-rata disesuaikan dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan dalam [18, 22]. Sampel yang telah disiapkan disimpan pada kondisi laboratorium (24 °C, kelembaban 40–60%) [23].
Teknik Pengukuran
Gravimetri
Rerata ketebalan lapisan emas diukur secara gravimetri menggunakan neraca mikro Mettler Toledo UMX2. Ketebalan dihitung dari berat sampel sebelum dan sesudah sputtering menggunakan massa jenis emas. Sepuluh sampel dari setiap jenis modifikasi digunakan untuk pengukuran. Kesalahan pengukuran gravimetri di bawah 15%.
Sudut Kontak
Keterbasahan sampel ditentukan dengan pengukuran sudut kontak air permukaan (WCA). Selanjutnya, karakterisasi perubahan struktur dan komposisi yang disebabkan oleh perlakuan plasma dan pengendapan emas ditentukan dengan Drop Shape Analysis System DSA 100 (KRÜSS GmbH, DE) pada suhu kamar (24 °C, kelembaban 40–60%) [23]. Tetesan air 2,0 ± 0.2 μL diendapkan pada sampel yang diuji menggunakan jarum stainless steel. Gambar tetesan diambil setelah penundaan 2 detik. Kemudian, sudut kontak dievaluasi menggunakan Sistem ADVANCE. Setidaknya tujuh pengukuran posisi yang berbeda pada setidaknya tiga ulangan dari setiap sampel dilakukan dan dirata-ratakan untuk menghasilkan WCA akhir dan standar deviasinya. Pengukuran WCA dilakukan pada sampel yang “berumur” selama 14 hari.
Spektroskopi Fotoelektron Sinar-X
Komposisi kimia dari sampel yang disiapkan ditentukan dari spektrum fotoelektron sinar-X (XPS) yang diukur (tiga pengukuran) dengan spektrometer Omicron Nanotechnology ESCAProbeP (disediakan oleh Omicron Nanotechnology GmbH, DE) dengan kesalahan relatif 10%. Dimensi area yang terpapar dan dianalisis adalah 2 × 3 mm
2
. Kondisi pengukuran dijelaskan dalam [18, 21]. Karakteristik karbon (1 ), oksigen (1 ), dan emas (4f ) puncak dicari. Pengukuran dilakukan dalam ruang hampa ultra-ringan. Evaluasi spektrum yang diperoleh dilakukan dengan kode CasaXPS [24]. Sampel yang digunakan untuk pengukuran "berumur" selama 14 hari. Sebelum pengukuran, sampel disimpan dalam kondisi laboratorium standar.
Potensi Zeta
Analisis elektrokinetik (potensial elektrokinetik, potensial zeta) dari semua sampel ditentukan dengan Instrumen SurPASS (Anton Paar). Sampel dipelajari di dalam sel celah yang dapat disesuaikan dalam kontak dengan elektrolit (0,001 mol L
−1
KCl) serta dalam larutan buffer (phosphate-buffered saline (PBS)). Untuk setiap pengukuran, sepasang film polimer dengan lapisan atas yang sama dipasang pada dua pemegang sampel (dengan penampang 20 × 10 mm
2
dan jarak di antara keduanya 100 μm). Semua sampel disiapkan dalam dua ulangan; semuanya diukur tiga kali pada pH konstan 6,8 dengan kesalahan percobaan 5%. Untuk penentuan potensi zeta, metode arus streaming digunakan dan persamaan Helmholtz-Smoluchowski diterapkan untuk menghitung potensi zeta [25,26,27]. Sampel berumur yang digunakan untuk pengukuran potensi zeta adalah "berumur" selama 14 hari.
Mikroskop Kekuatan Atom
Morfologi permukaan sampel diperiksa dengan mikroskop gaya atom (AFM) menggunakan sistem VEECO CP II (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). Permukaan diukur dalam “mode penyadapan” menggunakan probe silikon P-doped RTESPA-CP dengan konstanta pegas 20–80 N m
−1
(Bruker Corporation, Billerica, MA, AS). Dengan pengukuran berulang pada wilayah yang sama (1 × 1 μm
2
), kami memverifikasi bahwa morfologi permukaan tidak berubah setelah tiga pemindaian berturut-turut. Sampel yang digunakan untuk pengukuran berumur 14 hari.
Spektroskopi Massa Plasma Gabungan Induktif
Plasma yang digabungkan secara induktif dengan detektor spektroskopi massa (ICP-MS) digunakan untuk menentukan jumlah ion Au yang dilepaskan ke PBS (pH = 7.4). Analisis elemen jejak lindi Au dilakukan dengan menggunakan spektrometer triple quadrupole Agilent 8800 (Agilent Technologies, Jepang) yang terhubung ke auto-sampler. Nebulisasi sampel dilakukan menggunakan perangkat MicroMist yang dilengkapi dengan pompa peristaltik. Ketidakpastian pengukuran (tiga kali lipat dari setiap sampel) kurang dari 3%. Pelarutan untuk ICP-MS disiapkan dengan inkubasi statis sampel dalam PBS dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 pada 37 °C selama 6, 24, dan 72 jam. Lindi diencerkan dengan air suling dengan perbandingan 1:8 dan dianalisis.
Budaya Sel
Menurut standar internasional EN ISO 10993-5, pengujian sitokompatibilitas dilakukan secara in vitro menggunakan garis sel L929 fibroblas tikus (Sigma, USA). Sampel PEEK (murni, diperlakukan plasma, dan dilapisi emas) disterilkan dalam etanol 70% dalam vial penghitung kilau selama 20 menit, dimasukkan ke dalam pelat 12 sumur (Jet Biofil, 2,14 cm), dicuci dengan PBS, dan dipasang ke sumur bawah dengan silinder plastik berongga dari poli (metil metakrilat). Sel L929 diunggulkan di atas sampel dengan kepadatan 30.000 sel per sumur dalam 1 mL medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM, Sigma, USA) glukosa tinggi yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS, Invitrogen, USA) dan 2 mM stabil l-glutamine (l-alanyl-l-glutamine, Sigma, USA). Sel L929 dipertahankan pada suhu 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 .
Mikroskopi Fluoresensi
Setelah waktu inkubasi yang diinginkan (6, 24, dan 72 jam), sel difiksasi dan diwarnai dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan pada [28, 29]. Sel L929 dicuci dengan PBS dan difiksasi dengan formaldehida 4% (Thermo Scientific, USA) dalam PBS (37 °C, 20 menit). Setelah pencucian PBS, aktin-F dari sitoskeleton sel diberi label dengan phalloidin-Atto 565 (Sigma, USA) dalam PBS selama 20 menit. Kemudian, inti sel diwarnai dengan DAPI (4′,6-diminido-2-phenylindole dihydrochloride, Sigma, USA) selama 10 menit, dan sel dibilas dengan PBS, ditutup dengan media pemasangan (Vector Laboratories, USA), dan dipasang di antara kaca objek mikroskopis dan kaca penutup. Semua sampel (“berumur” selama 14 hari) diuji dalam rangkap tiga.
Memindai Mikroskop Elektron
Morfologi terperinci dari sel-sel yang diperiksa tumbuh pada PEEK murni, antarmuka plasma/emas, dan kontrol (kaca penutup kaca) dicirikan dengan pemindaian mikroskop elektron (SEM) TESCAN LYRA3 GMU (Tescan, CZ) dalam mode elektron sekunder. Sel-sel yang dimaksudkan untuk analisis dengan SEM dicuci dengan PBS, difiksasi dengan larutan Karnovsky [30, 31] dalam buffer cacodylate 0,1 M (pH 7,2), dan didehidrasi (peningkatan persentase etanol diikuti oleh dua langkah terakhir inkubasi 10 menit dalam hexamethyldisilazane dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40 °C selama 2 jam). Sampel yang mengalami dehidrasi dilapisi oleh lapisan emas 10 nm.
Hasil dan Diskusi
Semua pengukuran dilakukan menggunakan sampel "berumur" 14 hari setelah perawatan plasma dan sputtering emas. Telah diketahui dengan baik bahwa gugus fungsi yang terbentuk pada permukaan polimer yang diolah dengan plasma tidak stabil dan berubah seiring waktu [32]. Permukaan material cenderung pulih ke keadaan tidak dirawat [33]. Oleh karena itu, terjadi perubahan reorientasi kelompok kimia yang dihasilkan oleh perlakuan plasma menjadi sebagian besar bahan [34, 35].
Ablasi MENGINTIP selama pengobatan plasma diikuti oleh sputtering Au dipelajari oleh gravimetri. Kehilangan massa polimer yang disebabkan oleh ablasi dan pertumbuhan massa oleh sputtering secara berurutan diubah menjadi ketebalan polimer. Kehilangan massa yang ditentukan setelah perawatan plasma (60 dan 240 dtk, kekuatan 8,3 W) ditunjukkan pada Tabel 1. Kehilangan ablasi yang jelas terlihat dengan meningkatnya waktu pemaparan, tetapi hanya dua kali lipat. Kehilangan ringan mungkin disebabkan oleh karakter aromatik PEEK, yang menghasilkan peningkatan ketahanan terhadap pembelahan daripada dalam kasus, misalnya, rantai alifatik poliolefin (UHMWPE). Untuk sputtering emas, periode waktu 30 dan 300 s ditentukan sebagai contoh representatif dari lapisan terputus-putus dan kontinu [19, 36]. Penurunan kehilangan ablasi telah menghasilkan penjangkaran emas yang lebih baik pada permukaan MENGINTIP, seperti yang terlihat jelas untuk sampel dengan lapisan emas 150 dan 300 detik.
Nilai sudut kontak air sampel yang diukur berdasarkan perlakuan plasma dan waktu sputtering emas ditunjukkan pada Tabel 2. Setelah perlakuan plasma, WCA meningkat dari 79,5 ± 2,4° (PEEK murni yang tidak dimodifikasi) menjadi 94,0 ± 5,5° dan menjadi 95,6 ± 2,1° (PEEK dirawat oleh plasma selama 60 dan 240 s, masing-masing). Perbedaan nilai WCA setelah perlakuan plasma dapat diabaikan dibandingkan dengan nilai deviasinya. WCA berkurang dengan pelapisan Au, dan permukaan menjadi lebih hidrofilik dibandingkan dengan sampel yang diolah dengan plasma.
Konsentrasi elemen pada permukaan polimer (kedalaman yang dapat diakses dari enam sampai delapan lapisan atom) diperiksa dengan metode XPS; hasilnya dirangkum dalam Tabel 2. Data XPS diperoleh untuk PEEK murni, sampel yang diolah dengan plasma dan sampel yang diolah dengan plasma diikuti dengan pelapisan Au. Dari pengukuran XPS, seseorang dapat melihat bahwa konsentrasi oksigen telah meningkat dengan pengobatan yang berkepanjangan. Ini mungkin disebabkan oleh reorientasi gugus yang mengandung oksigen ke dalam volume polimer [37,38,39]. Terbukti bahwa orientasi kelompok terjadi segera setelah pengobatan plasma; dengan demikian, dalam "proses penuaan" sampel, perubahan terjadi pada permukaannya. Untuk alasan ini, sampel diukur selama 14 hari setelah perawatan plasma, ketika keadaan "penuaan" sampel stabil [40, 41]. Konsentrasi oksigen meningkat dengan pengobatan plasma berkepanjangan. Permukaan polimer terganggu oleh pelepasan plasma yang lebih kuat dengan pembentukan situs radikal di permukaan; semakin tinggi daya plasma, semakin jelas modifikasi polimernya. Situs-situs ini bereaksi dengan oksigen yang ada di udara dan meningkatkan konsentrasi oksigen pada permukaan yang dirawat [42, 43]. Setelah sputtering emas, konsentrasi oksigen menurun dengan mengorbankan lapisan emas. Konsentrasi emas meningkat dengan waktu sputtering yang lebih rendah, ketika permukaan tidak terlalu banyak terganggu.
Gambar 1 menunjukkan morfologi permukaan PEEK yang diperoleh dengan menggunakan AFM. Perlakuan plasma menyebabkan perubahan yang dapat dideteksi pada permukaan MENGINTIP untuk kedua waktu paparan (60 dan 240 dtk), tetapi seperti yang diharapkan, paparan plasma yang lebih lama menghasilkan permukaan yang lebih kasar yang menyebabkan perbedaan metalisasi sampel. Sampel yang diperlakukan oleh plasma untuk waktu yang lebih lama membentuk kluster logam yang lebih jelas. Efek ini terutama terlihat pada sampel dengan lapisan emas tebal (tergagap selama 300 d) dan juga sangat tipis (tergagap selama 30 d). Sampel yang diperlakukan oleh plasma untuk waktu yang singkat (60 detik) membentuk kelompok yang lebih besar dan tidak beraturan dalam jumlah yang lebih kecil. Untuk lapisan yang tergagap hanya selama 30 dtk, kluster logam mudah dikenali hanya pada substrat yang diberi perlakuan plasma selama 240 dtk. Seperti yang diharapkan, ukuran cluster dan kekasaran permukaan umumnya meningkat dengan waktu sputtering emas yang berkepanjangan. Perilaku ini sesuai dengan pengukuran XPS. Sampel yang disemprot dengan logam selama 30 detik sebagian besar permukaannya sudah tertutup logam dan semburan lebih lanjut sebagian besar menyebabkan pertumbuhan kelompok secara vertikal; oleh karena itu, tidak memiliki dampak yang signifikan pada konsentrasi emas dan masih menyisakan sebagian permukaan polimer yang tidak tertutup. Juga, perbedaan dalam bentuk cluster dalam ketergantungan pada lama pengobatan plasma sesuai dengan temuan XPS. Cluster besar yang tidak beraturan pada sampel yang diperlakukan oleh plasma hanya untuk waktu yang singkat (60 detik) menutupi sebagian besar permukaan PEEK; oleh karena itu, konsentrasi emas yang ditentukan melalui XPS sedikit meningkat. Perbedaan morfologis antara bahan murni yang disemprot dengan lapisan logam dengan ketebalan yang berbeda dapat dibandingkan dengan data yang diperoleh untuk poli-l-asam laktat (PLLA) [44] dan polytetrafluorethylene (PTFE) [45]. PTFE murni memiliki permukaan yang sangat kasar; oleh karena itu, kami tidak mengamati pembentukan kelompok logam kecil tetapi penurunan kekasaran permukaan secara umum. Ini disebabkan oleh fenomena bahwa logam yang tergagap lebih suka mengisi "lembah" pada permukaan polimer untuk tetap berada di "puncak". Di sisi lain, permukaan PLLA menunjukkan peningkatan granulasi dan pembentukan struktur yang mirip dengan struktur pada PEEK, tetapi dengan keteraturan yang lebih rendah. Data ini menunjukkan bahwa pembentukan struktur granular teratur pada polimer tergagap sangat dipengaruhi oleh keteraturan permukaan polimer; oleh karena itu, PEEK (polimer dengan kekasaran permukaan terkecil di antara PEEK, PLLA, dan PTFE) memungkinkan pembentukan sebagian besar kelompok logam biasa di permukaan.
Gambar AFM dari MENGINTIP murni, MENGINTIP diperlakukan oleh plasma (pl) selama 60 dan 240 d, dan emas (Au) tergagap selama 30, 150, dan 300
Analisis elektrokinetik menunjukkan perubahan kimia permukaan dan muatan MENGINTIP setelah langkah individu modifikasi permukaan. Pada langkah pertama, pengobatan plasma menyebabkan penciptaan kelompok kutub baru pada permukaan MENGINTIP yang mengakibatkan peningkatan potensi zeta [19, 25,26,27]. Pada modifikasi kedua, pengendapan kluster emas pada permukaan sampel juga berdampak pada kimia permukaan dan potensi zeta (Gbr. 2). Karena adanya logam pada permukaan polimer, efek dari perubahan muatan permukaan memainkan peran penting-akumulasi elektron [27, 46]. Kami juga mengamati potensi zeta yang berbeda untuk sampel segar dan "tua". Perubahan yang lebih dramatis terdeteksi untuk potensi zeta yang diukur dalam PBS, yang diberikan oleh ion konsentrasi berbeda. Sedangkan dalam larutan KCl, konsentrasi KCl adalah 0,001 mol L
−1
; di PBS, konsentrasi ion tiga orde lebih tinggi. Konsentrasi ion yang lebih tinggi dalam PBS menyebabkan penekanan lapisan ganda listrik dan menghasilkan penurunan potensial zeta (dalam nilai absolut) [27, 46]. Oleh karena itu, konsentrasi ion yang jauh lebih tinggi menyebabkan perubahan muatan permukaan bahkan dari nilai negatif ke positif. Dengan demikian, perubahan potensial zeta PEEK yang ditentukan dalam larutan PBS lebih dramatis dan perubahan kimia permukaan dan muatan lebih jelas. Oleh karena itu, jelas bahwa perawatan plasma dan deposisi Au selanjutnya menyebabkan perubahan dramatis dalam kimia permukaan polimer dan muatan yang bergantung pada lamanya perawatan plasma serta pada deposisi Au. Hasil ini mengkonfirmasi analisis lain yang dilakukan.
Potensi zeta dari sampel PEEK yang diolah plasma (60 dan 240 s) dan Au-sputtered (30, 150, dan 300 s; 40 mA) saat ini dalam larutan KCl 1 mM (kolom hijau —sampel segar; kolom coklat —sampel lama) dan dalam larutan PBS (kolom abu-abu )
Untuk menentukan konsentrasi emas yang dilepaskan ke media kultivasi selama kultivasi sel, kami menggunakan sistem PBS berair sederhana untuk mensimulasikan kondisi ini. Emas yang dilepaskan ke PBS setelah 6 (waktu adhesi sel) dan 72 jam (proliferasi sel) inkubasi statis diukur dengan ICP-MS, dan hasilnya dirangkum dalam Tabel 3. PBS memiliki pH dan osmolaritas yang sama dengan media kultur sel; dengan demikian, itu digunakan untuk pengukuran ICP-MS. Di satu sisi, PBS adalah sistem yang disederhanakan; di sisi lain, tidak ada komponen yang berpotensi mengganggu pengukuran ICP-MS, seperti dalam kasus media kultur sel lengkap. Kami menemukan bahwa konsentrasi Au yang dilepaskan ke PBS lebih tinggi untuk sampel PEEK yang dilapisi dengan Au selama 30 detik dibandingkan dengan 300 detik. Hal ini dapat disebabkan oleh sifat lapisan emas yang terputus-putus sehingga dapat membentuk gugusan-gugusan kecil emas yang lebih cepat larut [47]. Emas dilepaskan ke tingkat yang lebih tinggi dari sampel PEEK/60/300 daripada dari PEEK/240/300 karena permukaannya kurang terablasi dan emas tampaknya kurang berlabuh.
Pada langkah selanjutnya, diperiksa apakah modifikasi permukaan polimer dapat meningkatkan adhesi sel endotel. Permukaan MENGINTIP diaktifkan oleh pengobatan plasma dan sputtering emas. Sitokompatibilitas PEEK ditentukan berdasarkan hasil adhesi sel (6 jam) dan proliferasi (24 dan 72 jam), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3. Masing-masing dua kolom (PEEK/plasma (ab) dan MENGINTIP/(ab) /Au (cde)) mewakili dua bagian dari satu sampel. Perbedaan jumlah sel L929 yang tumbuh pada pristine PEEK dan control tissue culture polystyrene (TCPS) berada pada kisaran kesalahan pengukuran. Adhesi sel dipantau 6 jam setelah penyemaian sel pada permukaan sampel. Jelas bahwa jumlah sel PEEK murni meningkat bila dibandingkan dengan sampel yang dirawat. Setelah 24 jam pertumbuhan sel, kami mengamati hanya sedikit peningkatan jumlah sel, yang mungkin disebabkan oleh fase jeda, ketika sel beradaptasi dengan lingkungan baru [48]. Jelas bahwa 72 jam setelah penyemaian, ada sejumlah kecil sel yang tumbuh pada sampel yang disimpan selama 30 detik (plasma 60 dan 240 detik) bila dibandingkan dengan sampel terukur lainnya. Nilai-nilai ini sesuai dengan hasil pengukuran ICP-MS, di mana emas dilepaskan ke PBS secara maksimal. Dalam hal ini, lapisan Au yang diendapkan pada PEEK (selama 30 dtk) memiliki karakter diskontinu [36]; dengan demikian, kluster Au dapat dilepaskan ke dalam media kultur sel. Dengan proses ini, media mungkin menjadi racun bagi sel yang dibudidayakan. Jumlah sel terbesar yang tumbuh pada lapisan emas (dibandingkan dengan sampel yang diolah dengan plasma) diamati pada sampel PEEK/pl 60 s/150 s, di mana lapisan emas itu terus menerus. Selanjutnya, 72 jam setelah penyemaian, lingkungan yang paling cocok untuk pertumbuhan sel L929 adalah pada sampel yang diberi perlakuan plasma selama 60 atau 240 detik dan kemudian dilapisi dengan emas selama 300 detik. Lapisan Au pada sampel ini juga kontinu [36]. Menurut data dari ICP-MS, hanya sejumlah kecil Au yang dilepaskan ke dalam media kultur sel. Namun, emas yang dilepaskan ini kemungkinan menjadi penyebab peningkatan proliferasi sel pada permukaan yang dirawat dengan plasma.
Jumlah sel L929 setelah 6, 24, dan 72 jam kultivasi pada TCPS, pristine PEEK, dan PEEK dengan antarmuka emas dari daerah perlakuan plasma (60 dan 240 d) dan Au-sputtered (30, 150, dan 300 dtk)
Untuk mengevaluasi lebih lanjut morfologi sel dan koneksi antar sel secara lebih rinci, kami melakukan pemindaian mikroskop elektron resolusi tinggi dari sel L929 yang tumbuh pada substrat yang diuji; hasilnya ditunjukkan pada Gbr. 4. Pemindaian dari analisis SEM dilakukan setelah 72 jam pertumbuhan sel pada PEEK murni dan PEEK yang diolah dengan plasma dan berlapis emas, dan kaca penutup, yang berfungsi sebagai kontrol (biasanya digunakan untuk analisis SEM [49] serta untuk studi imunofluoresensi [29]). Dari Gbr. 4, terlihat bahwa sel-sel tumbuh pada PEEK murni, PEEK diperlakukan dengan plasma selama 60 detik (babak kedua adalah 300 detik Au) dan selama 240 detik (babak kedua adalah 150 dan 300 detik Au), dan pada kaca penutup memiliki bentuk yang sama setelah 72 jam budidaya. Sel-sel tersebar penuh pada permukaan yang diberi perlakuan plasma, dan di atas lapisan sel ini, tampak jelas pembentukan lapisan baru sel-sel yang berproliferasi. Sel memiliki bentuk bulat pada permukaan sampel PEEK/60 (babak kedua adalah 150 s Au) dan PEEK/240/30 s Au, meskipun lingkungan tidak cocok untuk proliferasi sel. Sel yang paling bulat diamati pada Au PEEK/240/300 s, yang sepenuhnya berkorelasi dengan data yang disajikan pada Gambar. 3.
Gambar SEM dari sel L929 yang dibudidayakan selama 72 jam pada MENGINTIP murni, MENGINTIP diperlakukan dengan plasma (60 dan 240 detik), dan bagian berlapis emasnya tergagap selama 30 dan 300 detik (kaca penutup kaca mikroskopis berfungsi sebagai kontrol). bilah skala sesuai dengan 10 μm
Kesimpulan
Kami membandingkan dua cara modifikasi PEEK yang berbeda untuk membuat bahan dengan adhesi dan pertumbuhan sel yang lebih baik. Hasil yang diperoleh mengkonfirmasi perubahan variabel dalam sifat permukaan setelah langkah modifikasi individu. Kedua cara modifikasi yang digunakan menghasilkan perubahan kimia permukaan, morfologi, keterbasahan, dan muatan. Perlakuan plasma selama 240 dtk menyebabkan penurunan berat badan PEEK hingga dua kali lebih tinggi daripada pengobatan selama 60 dtk. Keterbasahan permukaan MENGINTIP tidak berubah secara signifikan dengan pengobatan plasma. Pengukuran XPS mengkonfirmasi fakta umum bahwa dengan bertambahnya waktu perawatan plasma, konsentrasi karbon menurun di permukaan MENGINTIP, sebaliknya, konsentrasi oksigen meningkat. Ketebalan lapisan emas yang diendapkan lebih tinggi setelah perawatan plasma selama 60 detik. Sputtering emas meningkatkan keterbasahan permukaan PEEK. Hasil dari analisis XPS menunjukkan tren yang sama untuk sampel yang diolah dengan plasma (60 dan 240 dtk), dan konsentrasi karbon dan oksigen menurun dengan meningkatnya waktu deposisi yang mendukung peningkatan konsentrasi emas. Gambar AFM juga mengonfirmasi pengukuran XPS, terutama untuk sampel yang diolah dengan plasma selama 60 detik dan dilapisi emas selama 300 detik, di mana kelompok besar yang tidak beraturan menutupi sebagian besar permukaan PEEK; oleh karena itu, konsentrasi emas sedikit meningkat. Ditemukan juga bahwa sampel dengan lapisan emas tipis dan juga lebih tebal tidak cocok untuk perbanyakan sel.
Penelitian ini menunjukkan bahwa pengobatan plasma meningkatkan sitokompatibilitas PEEK dibandingkan dengan yang murni. Juga, pengobatan plasma adalah metode yang lebih baik untuk modifikasi polimer untuk pertumbuhan sel daripada sputtering emas, ketika emas dilepaskan ke dalam media kultur sel.
