Fungsionalisasi Nano-adsorben untuk Pemisahan Afinitas Protein
Abstrak
Silika nanosfer yang difungsikan dengan tiol (SiO2 -SH NSs) dengan diameter rata-rata 460 nm disintesis melalui rute hidrotermal. Selanjutnya disiapkan SiO2 -SH NS dimodifikasi oleh SnO2 titik kuantum untuk membeli SnO2 /SiO2 NS komposit yang memiliki fluoresensi yang jelas, yang dapat digunakan untuk melacak protein target. SnO2 /SiO2 NS dimodifikasi lebih lanjut dengan glutathione tereduksi (GSH) untuk mendapatkan SnO2 /SiO2 -GSH NS, yang secara khusus dapat memisahkan glutathione S -transferase-tagged (GST-tagged) protein. Selain itu, aktivitas peroksidase glutathione peroksidase 3 (GPX3) dipisahkan dari SnO2 /SiO2 -GSH NSs in vitro dievaluasi. Hasil menunjukkan bahwa SnO2 . yang telah disiapkan /SiO2 -GSH NS menunjukkan adsorpsi nonspesifik yang dapat diabaikan, pengikatan protein konsentrasi tinggi (7,4 mg/g), dan sifat penggunaan kembali yang baik. Sementara itu, GPX3 yang diberi tag GST yang dipisahkan oleh NS ini dapat mempertahankan status redoks dan aktivitas peroksidasenya. Oleh karena itu, SnO2 prepared yang disiapkan /SiO2 -GSH NS mungkin menemukan aplikasi yang menjanjikan dalam pemisahan cepat dan pemurnian protein yang diberi tag GST.
Latar Belakang
Kemudahan pemisahan dan pemurnian protein sangat penting dalam biotransformasi xenobiotik, metabolisme obat, biosintesis prostaglandin dan hormon steroid, dan degradasi asam amino aromatik [1,2,3,4,5,6]. Protein yang dipisahkan dapat digunakan untuk antigen dan produksi vaksin, imunologi molekuler dan struktural, dan studi biokimia dan biologi sel. Glutathione S -transferase (GST) mewakili kelompok utama isoenzim detoksifikasi yang dapat digunakan dalam sistem fusi gen GST dan bidang penargetan efek obat atau sebagai penanda tumor [7, 8]. Berbagai metode seperti pengendapan, kromatografi, ultrafiltrasi, dan dialisis saat ini tersedia untuk memurnikan berbagai protein, dan khususnya, pemisahan afinitas berdasarkan afinitas biologis alami antara makromolekul biologis dan ligan komplementer memiliki signifikansi yang luar biasa [9,10,11,12] ,13,14]. Keberhasilan produksi dan pemurnian protein full-length, larut, dan fusi alami, bagaimanapun, masih terhambat oleh berbagai kendala seperti kebutuhan untuk pretreatment untuk menghilangkan puing-puing sel dan kontaminan koloid, waktu operasi yang relatif lama, dan kelarutan protein. Kelemahan ini, untungnya, dapat diatasi dengan menerapkan nanomaterial untuk membantu pemisahan dan pemurnian protein target [15,16,17,18,19]. Misalnya, SiO2 magnetik2 -NiO nanokomposit mampu memisahkan protein His-tagged [20]. Nanomaterials, bagaimanapun, masih memiliki kaki pendek dalam pemisahan berbagai protein karena mereka sering tidak aktif untuk visualisasi dan teknik fluoresensi yang dapat digunakan sebagai alat diagnostik biomolekuler dan medis yang sensitif untuk memerangi perang biologis [21,22,23]. Dalam hal ini, sangat penting untuk menemukan nanomaterial dengan respons fluoresen untuk mempromosikan aplikasinya dalam pemisahan dan pemurnian protein rekombinan seperti glutathione peroxidase 3 (GPX3).
Kami memberikan perhatian khusus pada SnO skala nano2 titik kuantum (QD), karena, sebagai semikonduktor celah pita lebar tipe-n (3,6 eV) dengan stabilitas kimia dan biokompatibilitas yang baik, SnO2 menunjukkan serapan optik di wilayah spektral terlihat. Di sini, kami membuat jalur cerdas untuk memperkenalkan SnO fluoresen2 QD ke permukaan silika nanosfer (NS), berharap untuk mengembangkan SnO2 yang diinginkan /SiO2 struktur nano dengan aplikasi potensial dalam pemisahan dan pemurnian protein bertanda GST. Pertama, nanosfer silika yang difungsikan dengan tiol (SiO2 -SH NSs) disiapkan melalui rute hidrotermal. SiO2 yang dihasilkan2 -SH NS diperparah dengan SnO2 titik kuantum untuk membeli SiO2 /SnO2 NS komposit yang memiliki penyerapan fluoresensi yang jelas. SiO2 /SnO2 NS dimodifikasi lebih lanjut dengan glutathione tereduksi (GSH) untuk mendapatkan SiO2 /SnO2 -GSH NS dengan potensi pemisahan afinitas protein bertanda GST. Kemampuan dan aktivitas peroksidase dari SnO yang disiapkan2 /SiO2 -GSH NS dalam memisahkan protein yang diberi tag GST dievaluasi dengan analisis SDS-PAGE.
Eksperimental
Materi dan Metode
Heksadesiltrimetil amonium bromida (CTAB), timah (IV) klorida (SnCl4 ), trietilamina (TEA), dan isopropanol disediakan oleh Perusahaan Reagen Kimia Kermel Tianjin (Tianjin, Cina). AgNO3 dibeli dari Tianjin Fuchen Technology Development Co., Ltd. (Tianjin, China). 3-Mercaptopropyl-trimethoxysilane (MPS) ditawarkan oleh Alfa-Aesar (Shanghai, Cina). Tetraethyl orthosilicate (TEOS) dipasok oleh Tianjin Fuchen Chemicals (Tianjin, Cina). Dihydronicotinamide adenine dinuclectide phosphate (NADPH), thioredoxin, dan thioredoxin reduktase diperoleh dari Sigma (Beijing, China). Glutathione Sepharose 4B (Stockholm, AS) berasal dari GE Healthcare. Dithiothreitol (DTT) tersedia dari Aladdin Industrial Corporation (Inalco SPA, Italia). Semua reagen kimia adalah reagen analitis dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
Persiapan SnO2 Titik Kuantum
Dalam sintesis tipikal [24], 3,5 g SnCl4 ·5H2 O ditambahkan ke dalam 50 mL H2 O, kemudian 5 mL amonia ditambahkan ke dalam larutan sambil diaduk. Selanjutnya, presipitasi yang diperoleh dengan sentrifugasi dicuci dengan air deionisasi beberapa kali untuk menghilangkan kelebihan Cl
−
ion. Tiga puluh mililiter air deionisasi ditambahkan ke dalam endapan yang diperoleh, dan kemudian, pH larutan diatur menjadi 12 kali 2 mol/L amonia. Campuran larutan dipindahkan ke dalam autoklaf baja tahan karat berlapis Teflon, disegel dan dipanaskan pada suhu 150 °C selama 24 jam. Setelah pemanasan selesai, larutan campuran didinginkan, disentrifugasi, dan dicuci sepenuhnya dengan etanol-isopropanol (perbandingan volume 1:1) untuk mendapatkan SnO2 QD.
Persiapan SnO2 /SiO2 -SH NS
Dalam sintesis tipikal, 0,2 g SnO2 QD dan 0,09 g CTAB dilarutkan dalam pelarut campuran H2 O (42,5 mL) dan alkohol absolut (7 mL) dengan pengadukan magnetik (200 G, r = 180 mm). Ke dalam larutan yang dihasilkan ditambahkan 2,7 mL TEH di bawah tambahan 20 menit pengadukan. Campuran larutan dipanaskan pada suhu 60 °C selama 5 jam sementara 3,5 mL TEOS dan 0,35 mL MPS perlahan-lahan dijatuhkan, diikuti dengan sentrifugasi (12.800 G, r = 180 mm) dan dicuci sepenuhnya dengan HCl-etanol (30 mL) dan air (30 mL) untuk mendapatkan SnO2 /SiO2 -SH NS sebanyak tiga kali, yang didispersikan dalam air (0,12 g/mL).
Modifikasi Permukaan SnO2 /SiO2 -SH NS
Empat mililiter 0,12 g/mL SnO2 /SiO2 -SH NS dicuci dengan PBS (0,01 mol/L, pH = 7.4) sebanyak tiga kali. Ini SnO2 /SiO2 -SH NS ditambahkan ke dalam larutan GSH 30 mL 16,7 mg/mL dan diombang-ambingkan pada 37 °C selama 24 jam (120 putaran/menit) dengan osilator suhu konstan. Pada akhir osilasi, larutan campuran disentrifugasi untuk menghasilkan SnO2 /SiO2 -GSH NS; kemudian, endapan dicuci sepenuhnya dengan 30 mL PBS (0,01 mol/L, pH = 7.4) selama tiga kali untuk menghilangkan GSH yang berlebihan melalui adsorpsi fisik, sehingga menghasilkan SnO2 yang diinginkan. /SiO2 -GSH NS. Resultan SnO2 /SiO2 -GSH NS ditambahkan ke dalam alkohol (25%, v /v ) dan disimpan pada suhu 4 °C.
Pemisahan Protein Bertag GST
Protein campuran dikumpulkan dari lisat sel Escherichia coli , yaitu dengan lisis air (konsentrasi 0,01 mol/L, pH 7,4). Untuk ekspresi protein in vitro, wilayah protein yang mengandung urutan pengkodean glutathione peroksidase 3 (GPX3, asam amino 37-206), Open stomata 1 (OST1), dan ABA insensitive 2 (ABI2, asam amino 100–423) di Arabidopsis thaliana dikloning dan dimasukkan dalam bingkai ke dalam plasmid pGEX-6p1 (GPX3 digunakan sebagai kontrol). konstruksi pGEX-GPX3, pGEX-OST1, dan pGEX-ABI2 diperkenalkan ke E. koli sel BL21 (DE3). Protein bertanda GST rekombinan dimurnikan menggunakan Glutathione Sepharose 4B dan SnO2 /SiO2 -GSH NS. Primer yang digunakan untuk mengkloning gen adalah sebagai berikut:untuk GPX3, primer maju, 5′- GATGGATCCTCGCCATCGACGGTGGAACAA-3′; primer terbalik, 5′- CACCTCGAGTCAAGCAGATGCCAATAGCTT-3′; untuk OST1, primer maju, 5′- GCCGAATTCATGGATCGACCAGCAGTGA-3′; primer terbalik, 5′- CCCGTCGACTCACATTGCGTACACAATC-3′; untuk ABI2, primer maju, 5′- GCGGAATTCGAGAGTAGAAGTCTGTTTG-3′; primer terbalik, 5′- GCGCTCGAGTCAATTCAAGGATTTGCTC-3′.
Setelah dicuci dengan larutan PBS (0,01 mol/L, pH = 7.4), SnO2 yang telah disiapkan /SiO2 -GSH NS secara langsung dimasukkan ke dalam 1000 μL E. koli lisat dan kocok pada 4 °C selama 2 jam (kecepatan rotasi:90 putaran/menit) untuk memungkinkan SnO2 /SiO2 -GSH NS untuk menangkap protein yang diberi tag GST. Setelah pengocokan selesai, NS ini diisolasi dari larutan dengan sentrifugasi dan dicuci sepenuhnya dengan larutan PBS untuk menghilangkan sisa protein yang tidak tertangkap. SnO yang terikat protein dengan tag GST2 /SiO2 -GSH NS dicuci dengan 300 L dan 0,5 mol/L larutan GSH selama tiga kali untuk memisahkan protein bertanda GST dari permukaannya. Larutan protein yang dikumpulkan secara terpisah dideteksi dengan elektroforesis gel natrium dodesilsulfat poliakrilamida (SDS-PAGE). Konsentrasi protein yang dipisahkan ditentukan oleh BCA protein Assay Kit. SnO2 /SiO2 -GSH NS dapat digunakan kembali untuk memisahkan protein target beberapa kali dengan metode yang sama.
Pengukuran Aktivitas Glutathione Peroksidase
Aktivitas GPX3 yang terpisah diukur dengan penentuan spektrometri konsumsi NADPH pada 340 nm seperti yang dijelaskan oleh Delaunay et al. [25]. Tag GST dipotong oleh protease PreScission dari GPX3 yang diberi tag GST, dan kemudian, GPX3 digunakan untuk analisis aktivitas. Pertama, 98 μL larutan penyangga reaksi (termasuk 100 mmol/L Tris-Cl, 0,3 mmol/L NADPH, 1,34 μmol/L tioredoksin, dan 0,18 μmol/L tioredoksin reduktase dari E. coli lisat) ditambahkan ke dalam tabung; setelah tercampur sempurna, 1,35 mol GPX3 murni ditambahkan ke dalam larutan buffer reaksi yang dihasilkan. Kemudian larutan tersebut ditambahkan ke dalam 2 μL H2 O2 (5 mmol/L) untuk memulai reaksi dan konsumsi NADPH pada 340 nm dikumpulkan dengan penentuan spektrometri.
Analisis Status Redoks GPX3 yang Dimurnikan
Tag GST dipotong dari GPX3 yang diberi tag GST oleh protease PreScission. GPX3 yang dipisahkan diperlakukan dengan 5 mmol/L H2 O2 dan 1 mmol/L DTT selama 10 mnt untuk mengubah status redoks GPX3 yang dimurnikan. GPX3 yang dihasilkan digunakan untuk analisis in vitro keadaan redoks. Ekstrak dievaluasi dengan gel SDS-PAGE 15% non-pereduksi.
Karakterisasi
Morfologi dan komposisi SnO yang dibuat2 /SiO2 -GSH NS dianalisis dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, JEM-2010, Jepang), pemindaian mikroskop elektron (SEM, JSM 5600LV, Jepang), difraksi sinar-X (XRD, X' Pert Philips, Holland), dan spektrometer fluoresensi ( FL, FluoroSENS, Inggris, pada panjang gelombang eksitasi 260 nm). Protein bertanda GST yang terpisah dideteksi dengan elektroforesis gel natrium dodesilsulfat poliakrilamida (SDS-PAGE, Power PAC 300, China), dengan tegangan prakonsentrasi 70 V dan tegangan pemisahan 120 V. Osilator suhu konstan berasal dari Shanghai ChemStar Instruments , Co., Ltd. (ATS-03M2R, Tiongkok). Konsentrasi protein yang dipisahkan ditentukan oleh BCA protein Assay Kit (Beijing CoWin Biotech, China).
Hasil dan Diskusi
TEM, SEM, XRD, dan Analisis Fluoresen dari SnO2 QD dan SnO2 /SiO2 -GSH NS
Gambar 1 memberikan gambar resolusi tinggi TEM (HRTEM) dan pola XRD dari SnO2 yang disintesis QD. Terlihat bahwa SnO2 . yang disintesis QD berbentuk bola dan memiliki diameter rata-rata 5 nm, yang menunjukkan distribusi ukuran partikel yang sempit (Gbr. 1a), dan jarak kisi bidang (110) adalah 0,29 nm (Gbr. 1b). Gambar kisi yang diselesaikan dengan baik menunjukkan bahwa SnO2 . yang disiapkan QD memiliki struktur kristal yang sangat teratur. Pola difraksi elektron area terpilih yang sesuai dari SnO2 QD (Gbr. 1c) dapat diindeks ke fase Cassiterite tunggal, yang konsisten dengan pola XRD yang relevan (Gbr. 1d). Yaitu, karakteristik puncak pada 2 theta = 26,6° (110), 33,9° (101), 38,0° (200), 51,8° (211), 65,9° (301), dan 78,7° (321) sesuai dengan standar. Data XRD dari Cassiterite SnO2 (Kartu JCPDS no. 41-1445). Selain itu, puncak XRD yang intens menunjukkan bahwa SnO2 . yang disiapkan QD terkristalisasi dengan baik, dan tidak adanya puncak karakteristik lainnya menunjukkan bahwa mereka tidak mengandung pengotor hematit atau hidroksida.
TEM (a ), HRTEM (b ) gambar, pola difraksi elektron area terpilih (c ) dan pola XRD (d ) dari SnO2 prepared yang disiapkan QD
Gambar 2 memberikan gambar SEM dan TEM dari SnO2 /SiO2 -GSH NS. Dapat dilihat bahwa SnO yang disiapkan2 /SiO2 -GSH NS berbentuk bola dan memiliki diameter rata-rata sekitar 430 nm, dan permukaannya tampaknya agak kasar (Gbr. 2a, b). Sementara itu, terlihat bahwa SnO2 QD (sekitar 5–15 nm) dimodifikasi pada permukaan SiO2 mikrosfer (Gbr. 2c, d), yang konsisten dengan gambar SEM yang sesuai. Diindikasikan bahwa SnO2 dan silika NS telah dikumpulkan.
SEM (a , b ) dan TEM (c , d ) gambar SnO2 . yang disiapkan /SiO2 -GSH NS
Gambar 3a memberikan pola XRD dari SnO yang disintesis2 /SiO2 -GSH NS. Puncak utama pada 2 theta = 110°, 101°, 2000°, 211°, 301°, dan 321° konsisten dengan SnO2 (Gbr. 1d). Selain itu, SnO2 /SiO2 -GSH NSs menunjukkan puncak karakteristik intens silika amorf sekitar 23° (kartu JCPDS no. 76-0933), yang menunjukkan bahwa SnO2 memiliki respons cahaya tampak telah berhasil diperkenalkan ke permukaan SiO2 NS. Gambar 3b menunjukkan spektrum fluoresen SnO2 /SiO2 -GSH NS pada 368 nm. Terlihat bahwa SnO2 /SiO2 -GSH menampilkan emisi fluoresen yang intens, yang dikaitkan dengan kekosongan oksigen SnO2 . Gambar 3c memberikan pencitraan fluoresensi SnO2 /SiO2 -GSH NS ketika NS ini digunakan untuk memisahkan GPX3 yang diberi tag GST di E. koil lisat. Dapat dilihat bahwa ada fluoresensi hijau yang jelas di mana SnO2 . yang disiapkan /SiO2 -GSH NS digunakan. Ini menunjukkan bahwa SnO2 dimodifikasi pada permukaan SiO2 dan SnO2 /SiO2 -GSH NS memiliki sifat fluoresensi yang baik.
Pola XRD (a ), spektrum fluoresensi (b ), dan pencitraan fluoresensi (c ) dari SnO2 prepared yang disiapkan /SiO2 -GSH NS
Analisis SDS-PAGE
Untuk memperkirakan kemampuan SnO yang disiapkan2 /SiO2 -GSH NS dalam memisahkan protein yang diberi tag GST, kami melakukan analisis SDS-PAGE. Gambar 4 menunjukkan hasil analisis SDS-PAGE dari GPX3 yang diberi tag GST yang dipisahkan oleh SnO2 /SiO2 -GSH NS. Terlihat bahwa SnO2 /SiO2 -GSH NS dapat secara efisien memperkaya protein target dari E. koli lisat, dan khususnya, jumlah protein terdisosiasi cenderung meningkat dengan peningkatan konsentrasi GSH dalam kisaran 10-100 mmol/L (jalur 3-6 pada Gambar 4a). Jelas bahwa protein target dapat dipisahkan secara khusus oleh SnO2 . yang disiapkan /SiO2 -GSH NS dari E. koli lisat dan hampir tidak ada yang tidak spesifik.
Analisis SDS-PAGE dari protein bertanda GST murni yang dipisahkan oleh SnO2 /SiO2 -GSH NS. a Jalur 1, penanda; jalur 2, E. koli lisat; jalur 3–6 mengacu pada fraksi yang tersapu dari SnO2 /SiO2 -GSH NS dengan konsentrasi larutan GSH yang berbeda (jalur 1, 10 mmol/L; jalur 2, 20 mmol/L; jalur 3, 50 mmol/L; jalur 4, 100 mmol/L). b Jalur 1, penanda; jalur 2, E. koli lisat; jalur 3, pemisahan 1; jalur 4, pemisahan ke-2; jalur 5, pemisahan ke-3; dan jalur 6, pecahan tersapu dari Glutathione Sepharose 4B
Untuk menyelidiki properti yang digunakan kembali dari SnO2 prepared yang disiapkan /SiO2 -GSH NS, kami berulang kali menggunakannya untuk memisahkan GPX3 yang diberi tag GST. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4b (jalur 1 mengacu pada penanda, jalur 2 mengacu pada E. coli yang mengandung GST-GPX3 lisat, jalur 3 mengacu pada pemisahan pertama, jalur 4 mengacu pada pemisahan ke-2, jalur 5 mengacu pada pemisahan ke-3, dan jalur 6 mengacu pada fraksi dicuci dari Glutathione Sepharose 4B), SnO yang disintesis2 /SiO2 -GSH NS menunjukkan selektivitas khusus terhadap GPX3 bertanda GST yang diekstraksi dari E. koli lisat, dan spesifisitas serta afinitasnya tetap tidak terpengaruh setelah tiga siklus pemisahan berulang.
Untuk menguji universalitas SnO yang disintesis2 /SiO2 -GSH NS untuk memurnikan protein yang diberi tag GST, kami memilih tiga jenis protein yang diberi tag GST (GPX3 yang diberi tag GST, OST1 yang diberi tag GST, dan ABI2) yang diberi tag GST untuk melakukan eksperimen. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, protein GPX3, OST1, dan ABI2 yang diberi tag GST dapat dipisahkan secara khusus oleh SnO2 /SiO2 -GSH NS dari E. koli lisat (jalur 3, 6, 9); kemudian, kita bisa mendapatkan keduanya GPX3 (potong tag GST dari SnO2 /SiO2 -GSH NSs mengikat GST-tagged GPX3) dan tag GST dielusi dari SnO2 /SiO2 -GSH NS (jalur 13, GPX3; jalur 14, tag GST), yang memiliki efek serupa dengan Glutathione Sepharose 4B (jalur 2, 5, 8, 11, 12). Konsentrasi protein yang dimurnikan oleh SnO2 /SiO2 -GSH NS adalah 7,4 mg/g (GPX3 dengan tag GST), 7,1 mg/g (OST1 dengan tag GST), dan 6,8 mg/g (ABI2 dengan tag GST), yang menunjukkan bahwa SnO2 /SiO2 -GSH NS baik untuk memurnikan protein bertanda GST dari E. koli lisat. Untuk membandingkan kapasitas pengikatan antara SnO2 yang disiapkan /SiO2 -GSH NSs dan bahan lainnya, Glutathione Sepharose 4B (dibeli di Stockholm, USA) digunakan sebagai bahan percobaan perbandingan. Total protein yang dimurnikan oleh Glutathione Sepharose 4B adalah masing-masing 7,1 mg/mL (GPX3-tagged GST), 6,9 mg/mL (OST1 tag-GST), dan 5,6 mg/mL (GST-tagged ABI2). Terlihat bahwa kapasitas pengikatan SnO2 . yang dibuat /SiO2 -GSH NS lebih tinggi dari komoditas 4B.
Analisis SDS-PAGE dari protein GPX3, OST1, dan ABI2 rekombinan yang dimurnikan. Jalur 1, 4, dan 7, E. koli lisat; jalur 2, 5, dan 8, protein yang dielusi dari Glutathione Sepharose 4B komersial (GE Healthcare, USA); jalur 3, 6, dan 9, protein dielusi dari SnO2 /SiO2 -GSH NS; jalur 10, penanda; jalur 11 dan 13, GPX3 diperoleh setelah tag GST terputus dari Glutathione Sepharose 4B terikat GST-GPX3 dan SnO2 /SiO2 -GSH NS terikat GST-tagged GPX3; jalur 12 dan 14, tag GST dielusi dari Glutathione Sepharose 4B dan SnO2 /SiO2 -GSH NS
Analisis Status Redoks dan Aktivitas Peroksidase dari GPX3 Tagged GST
Untuk menganalisis status redoks dan aktivitas GPX3 yang diberi tag GST yang dipisahkan oleh SnO2 yang disiapkan /SiO2 -GSH NSs, kami memotong tag GST untuk mendapatkan GPX3 yang terpisah. Gambar 6a menunjukkan uji in vitro keadaan redoks GPX3 yang diberikan (sesuai dengan gel representatif dari tiga eksperimen independen). Jalur 1 dan 2 merujuk ke GPX3 yang diperoleh setelah tag GST terputus dari Glutathione Sepharose 4B terikat GST-tagged GPX3 (jalur 1 adalah GPX3 teroksidasi dan jalur 2 adalah GPX3 tereduksi); jalur 3 dan 4 merujuk ke GPX3 yang diperoleh setelah tag GST terputus dari SnO2 /SiO2 -GSH terikat GST-tagged GPX3 (jalur 3 adalah GPX3 teroksidasi dan jalur 4 adalah GPX3 tereduksi); jalur 5 mengacu pada penanda. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, GPX3 yang dimurnikan dipisahkan dari Glutathione Sepharose 4B (jalur 1 dan 2) dan SnO2 /SiO2 -GSH NS (jalur 3 dan 4) memiliki keadaan teroksidasi dan tereduksi, dan GPX3 tereduksi bermigrasi lebih lambat daripada rekan teroksidasi. Ini sangat konsisten dengan temuan kami sebelumnya bahwa GPX3 hadir dalam keadaan teroksidasi dan tereduksi secara in vitro, dan bentuk tereduksi dan teroksidasinya dapat dipisahkan sebagai hasil modifikasi dari residu Cys tereduksi [26,27,28].
a Uji in vitro status redoks GPX3:jalur 1 dan 3 (GPX3 teroksidasi serta 2 dan 4 (GPX3) mengacu pada GPX3 yang diperoleh setelah tag GST terputus dari Glutathione Sepharose 4B dan SnO2 /SiO2 -GSH terikat GST-tagged GPX3, masing-masing; jalur 5, penanda. b Pengujian aktivitas peroksidase GPX3
Gambar 6b menunjukkan pengujian aktivitas peroksidase GPX3:baris GPX3*, pengujian lengkap GPX3 murni dengan adanya Glutathione Sepharose 4B, thioredoxin, thioredoxin reduktase, NADPH, dan H2 O2; garis GPX3, reaksi lengkap antara SnO2 /SiO2 -GSH NS memisahkan GPX3, thioredoxin, thioredoxin reduktase, NADPH, dan H2 O2; baris No GPX3, reaksi lengkap tanpa adanya GPX3; dan garis No Trx, reaksi lengkap tanpa adanya thioredoxin. Gambar 6b menunjukkan aktivitas glutathione peroksidase dari GPX3 murni yang dipisahkan dari Glutathione Sepharose 4B dan SnO2 /SiO2 -GSH NS secara in vitro. Dapat dilihat bahwa, dengan thioredoxin sebagai substrat, GPX3 yang dimurnikan menunjukkan aktivitas peroksidase yang signifikan, yang menunjukkan bahwa GPX3 terpisah dari SnO2 /SiO2 -GSH NS ada dalam keadaan alami.
Kesimpulan
Metode yang mudah dibuat untuk membuat SnO yang dilindungi silika2 Nanosfer QD (SnO2 /SiO2 NS). SnO2 /SiO2 NS dimodifikasi lebih lanjut oleh glutathione untuk menghasilkan SnO2 /SiO2 -GSH NS untuk pemisahan afinitas glutathione S -transferase-tagged (GST-tagged) protein rekombinan. Temuan menunjukkan bahwa, dalam hal kemampuan untuk memisahkan GPX3 yang diberi tag GST, LOV yang diberi tag GST, dan ABI2 yang diberi tag GST, SiO2 yang disiapkan /SiO2 -GSH NSs menunjukkan pemisahan spesifik, konsentrasi protein yang tinggi, dan sifat penggunaan kembali yang baik. Selain itu, GPX3 yang dipisahkan dari GPX3 yang diberi tag GST mempertahankan status redoksnya secara in vitro dan aktivitas GPX juga, yang berarti bahwa SnO2 yang disiapkan /SiO2 -GSH NS mungkin memiliki potensi yang menjanjikan untuk pemisahan dan pemurnian protein yang diberi tag GST secara cepat.
