Penyerapan Efisien Chlorin e6 dan Transfer Energi yang Ditingkatkan dalam Nanopartikel Hibrid PS–PPO–PNIPAM
Abstrak
Sistem nanosintesis (NS) hibrid PS-PPO-PNIPAM terbentuk dari nanopartikel polistiren (PS) yang di-dop dengan difeniloksazol (PPO) dan dilapisi dengan cangkang poli-N-isopropilakrilamida (PNIPAM) yang terikatan silang. Studi fluorescensi chlorin e₆ yang ditambahkan ke NS ini menunjukkan transfer energi elektronik eksitasi (EEET) yang efisien dari inti PS dan PPO yang tersemat ke penerima chlorin e₆. Efisiensi EEET meningkat tajam dalam jam pertama setelah penambahan chlorin e₆, menunjukkan bahwa PNIPAM terus menyisipkan penyensor selama waktu ini. Memanaskan NS PS-PPO-PNIPAM-chlorin e₆ dari 21 °C ke 39 °C meningkatkan EEET lebih lanjut, sesuai dengan runtuhan termal jaringan PNIPAM yang memperpendek jarak donor-penerima. Namun, hanya sebagian kecil chlorin e₆ bebas yang berasosiasi dengan PNIPAM, yang menunjukkan bahwa optimasi lebih lanjut diperlukan.
Latar Belakang
Keterbatasan utama terapi fotodinamis (PDT) untuk kanker adalah penetrasi yang dangkal cahaya eksitasi ke dalam jaringan. X-ray-driven photodynamic therapy (X-PDT) menawarkan solusi, karena X-ray menembus dalam dan dapat mengaktifkan penyensor yang menghasilkan oksigen singlet ketika dieksitasi oleh X-ray. Kunci X-PDT adalah transfer energi elektronik eksitasi (EEET) yang efisien antara komponen scintillator dan penyensor. Strategi untuk menjaga kedekatan donor-penerima yang optimal termasuk konjugasi kimia, tarikan elektrostatis, lapisan surfaktan, atau cangkang polimer. Dalam pekerjaan sebelumnya, kami meneliti EEET dalam nanopartikel PS-PPO-chlorin e₆, di mana chlorin e₆ ditempelkan ke PS-PPO melalui cangkang natrium dodecilsulfat.
Poli-N-isopropilakrilamida (PNIPAM) adalah polimer responsif rangsangan yang mengalami transisi konformasi di atas suhu kritis solusi bawahnya (LCST) sebesar 32 °C, menjadi lebih hidrofobik dan menyusut. Untuk PNIPAM yang terikatan silang, LCST lebih tinggi, yang memungkinkan perubahan ukuran yang didorong suhu pada suhu fisiologis. Kami memproduksi nanopartikel PS-PPO yang dilapisi cangkang PNIPAM terikatan silang, menghasilkan NS hibrid PS-PPO-PNIPAM. Kami menyelidiki apakah cangkang ini dapat menancapkan chlorin e₆ dan apakah runtuhan PNIPAM yang bergantung pada suhu dapat memperpendek jarak donor-penerima, sehingga meningkatkan EEET dan efektivitas pembelahan sel tumor.
Struktur komponen sistem nanosintesis hibrid PS-PPO-PNIPAM dan chlorin e₆
Citra TEM sistem nanosintesis hibrid PS-PPO-PNIPAM yang diperoleh dengan perbesar lebih rendah (kiri) dan lebih tinggi (kanan)
Eksperimen
Bahan
Stirena (ST, Ukraina) kualitas p.a. difilter melalui metode standar sebelum polimerisasi. N-Isopropilakrilamida (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N,N′-metilenbisakrilamida (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), persulfat kalium (K₂S₂O₈, KPS, Ukraina), fosfat monobasik natrium dehydrat (NaH₂PO₄ × 2H₂O, Ukraina), dan surfaktan anion natrium dodecilsulfat (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) adalah kelas reagen dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Chlorin e₆ (Frontier Scientific Inc.) disediakan ramah oleh T.Y. Ohulchanskyy (Institute for Lasers, Photonics and Biophotonics, State University of New York at Buffalo). Larutan Tris-HCl buffer 50 mM (pH 7,2) berfungsi sebagai pelarut.
Sintesis dan Karakterisasi Nanosintesis
Nanopartikel inti PS-kon-PNIPAM yang di-dop dengan PPO pertama kali disiapkan melalui polimerisasi mikroemulsi. Singkatnya, 0,2 g NIPAM, 0,2 g SDS, dan 0,01 g NaH₂PO₄ × H₂O dilarutkan dalam 90 g H₂O. Selanjutnya, 0,09 g PPO dilarutkan dalam 1,8 g stirena dan ditambahkan secara tetesan selama 30 menit. Campuran diaduk pada 700 rpm, diflus dengan Ar selama 30 menit, kemudian dipanaskan ke 70 °C. 0,01 g K₂S₂O₈ yang dilarutkan dalam 1 mL H₂O memulai polimerisasi. Setelah 4 jam pada 70 °C, tahap ikatan silang dilakukan dengan menambahkan 0,69 g NIPAM dan 0,06 g BIS dalam larutan air, diikuti oleh 3 jam pada 70 °C dan 1 jam pada 90 °C. Produk didinginkan ke suhu ruangan dan dialisis selama 48 jam terhadap selulosa membran (MWCO 3500 Da).
Citra mikroskop transmisi elektron (TEM) (Gambar 2) mengonfirmasi bahwa NS hibrid terdiri dari beberapa inti PS-PPO yang terikat oleh jaringan PNIPAM terikatan silang.
Pengukuran Spektral dan Persiapan Sampel
Spektrum absorpsi direkam dengan spectrophotometer Specord M40 (Carl Zeiss, Jerman). Spektrum eksitasi dan emisi fluoresensi diperoleh menggunakan fluorimeter Cary Eclipse (Varian, Australia). Semua pengukuran dilakukan dalam sel kuarsa 1 × 1 cm pada suhu ruangan. Larutan PS-PPO-PNIPAM dicairkan 100 kali dalam Tris-HCl buffer. Stok chlorin e₆ 10 mM dalam DMF dicairkan menjadi 1 mM dalam buffer, dan konsentrasi akhir chlorin e₆ 2 µM ditambahkan ke larutan NS (DMF ≤ 0,02 %). Spektrum eksitasi dan emisi fluoresensi dikumpulkan pada 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, dan 100 menit setelah penambahan, dengan saturasi tercapai setelah sekitar 80 menit.
Untuk studi bergantung pada suhu, larutan NS dengan chlorin e₆ ditempatkan dalam pemegang termostat (T = 23 °C). Setelah sekitar 88 menit saturasi, sampel dipanaskan ke 39 °C (di atas LCST PNIPAM terikatan silang). Spektrum eksitasi fluoresensi (emisi chlorin e₆ pada 680 nm) direkam pada interval setelah pemanasan. Transisi konformasi PNIPAM dimulai sekitar 3 menit setelah pemanasan, dengan koagulasi terjadi setelah sekitar 18 menit—reversibel pendinginan. Eksperimen diulang tiga kali dengan hasil konsisten.
Hasil dan Pembahasan
Spektrum absorpsi, eksitasi fluoresensi, dan emisi NS PS-PPO-PNIPAM dalam Tris-HCl buffer 50 mM (pH 7,2) ditunjukkan dalam Gambar 3. Profil absorpsi menampilkan pita stirena (≈ 260 nm) dan PPO (≈ 307 nm). Eksitasi fluoresensi pada 250 nm (absorpsi stirena) menghasilkan emisi PPO pada 367 nm, mengonfirmasi EEET hampir lengkap dari stirena ke PPO. Spektrum eksitasi PPO (emisi 380 nm) lebih mengilustrasikan kontribusi pita stirena. Struktur getaran dalam emisi PPO, yang tidak ada dalam PPO air, mengonfirmasi penyisipannya dalam matriks PS.
Spektrum absorpsi (garis hitam padat), eksitasi fluoresensi (emisi pada 380 nm, dinormalisasi; garis hitam putus-pendek), dan emisi (eksitasi pada 250 nm, dinormalisasi; garis merah padat) sistem nanosintesis hibrid PS-PPO-PNIPAM dalam Tris-HCl buffer 50 mM (pH 7,2)
Setelah penambahan chlorin e₆ (2 µM), spektrum absorpsinya sebagian besar tidak berubah (Gambar 4), kecuali penurunan kecil dalam kepadatan optik puncak. Sebaliknya, penambahan chlorin e₆ memicu penurunan fluoresensi PPO yang jelas, yang meningkat selama sekitar satu jam (Gambar 5). Penurunan ini disebabkan oleh EEET (transfer energi donor-ke-penerima) dan reabsorpsi (emisi donor tumpang tindih dengan absorpsi penerima). Awalnya, reabsorpsi mendominasi, tetapi seiring waktu, EEET menjadi penyumbang utama.
Spektrum absorpsi chlorin e₆ (2 µM) bebas (garis hitam) dan dalam kehadiran sistem nanosintesis hibrid PS-PPO-PNIPAM (garis merah) dalam Tris-HCl buffer 50 mM, pH 7,2
Spektrum fluoresensi NS hibrid PS-PPO-PNIPAM bebas (garis hitam padat) dan setelah penambahan chlorin e₆ diukur pada 0 menit (garis hitam putus-pendek) dan 80 menit (garis hitam titik-garis). Eksitasi pada 250 nm. Perbedaan (garis merah) mengilustrasikan kontribusi relatif reabsorpsi dan EEET terhadap penurunan.
Emisi chlorin e₆ muncul pada eksitasi PS pada 250 nm, bergeser ke panjang gelombang lebih lama seiring waktu dan mencapai saturasi setelah sekitar 60 menit (Gambar 6). Red-shift ini menunjukkan pengaruh lingkungan PNIPAM terhadap molekul chlorin e₆ yang terikat. Eksitasi pada pita Soret chlorin e₆ itu sendiri (400 nm) menghasilkan perubahan kecil dalam emisi, yang menggarisbawahi bahwa sebagian kecil chlorin e₆ tetap bebas dalam larutan.
Spektrum fluoresensi chlorin e₆ bebas dan ditambahkan ke NS hibrid PS-PPO-PNIPAM (diukur pada 0, 5, 10, 20, 40, dan 80 menit setelah penambahan). Panjang gelombang eksitasi: 250 nm (panah padat) dan 400 nm (panah putus-pendek). Tris-HCl buffer 50 mM, pH 7,2, digunakan.
Spektrum eksitasi chlorin e₆ (emisi pada 680 nm) menunjukkan pita PS-PPO yang lemah awalnya yang meningkat seiring waktu (Gambar 7), mencerminkan peningkatan EEET dari donor ke penerima. Pita PS-PPO tetap lemah dalam spektrum eksitasi yang direkam pada emisi chlorin e₆ (660 nm) bahkan setelah 100 menit, mengonfirmasi bahwa sebagian besar transfer energi terjadi melalui donor PS-PPO.
Spektrum eksitasi fluoresensi chlorin e₆ bebas dan ditambahkan ke NS hibrid PS-PPO-PNIPAM (diukur pada 0, 10, 80, dan 100 menit setelah penambahan), dan NS PS-PPO-PNIPAM itu sendiri. Panjang gelombang emisi: chlorin e₆ pada 660 nm (intensitas dinormalisasi) dan 680 nm; NS PS-PPO-PNIPAM pada 380 nm. Tris-HCl buffer 50 mM, pH 7,2, digunakan.
Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa chlorin e₆ menembus jaringan PNIPAM, memungkinkan EEET dari PS dan PPO ke penyensor. Efisiensi EEET meningkat selama jam pertama inkubasi dan dapat ditingkatkan lebih lanjut dengan memanaskan sistem di atas LCST PNIPAM terikatan silah, yang menyusutkan jaringan polimer dan memperpendek jarak donor-penerima.
Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa nanopartikel PS-PPO memancarkan fluoresensi PPO di bawah eksitasi X-ray, yang menunjukkan bahwa EEET yang diamati di bawah iluminasi UV juga akan beroperasi di bawah iradiasi X-ray. Namun, mendeteksi emisi yang diinduksi X-ray biasanya memerlukan konsentrasi NP yang tinggi; pengikisian moieti yang mengandung atom berat dapat meningkatkan penyerapan X-ray dan meningkatkan sensitivitas.
Dalam eksperimen bergantung pada suhu (Gambar 8-9), pemanasan dari 23 °C ke 39 °C (setelah saturasi) pertama kali menyebabkan penurunan kecil dalam rasio I_ex320/I_ex404 (dari 0,90 ke 0,85), mungkin mencerminkan affinitas chlorin e₆-PNIPAM yang berkurang. Selanjutnya, rasio naik ke 1,02, yang beriringan dengan peningkatan pencaran cahaya—indikatif runtuhan PNIPAM dan kedekatan donor-penerima yang lebih dekat, sehingga meningkatkan EEET.
Spektrum eksitasi fluoresensi (dinormalisasi pada 404 nm) chlorin e₆ ditambahkan ke NS hibrid PS-PPO-PNIPAM pada 23 °C (garis hitam) dan pada 39 °C (garis merah, 14 menit setelah pemanasan). Emisi pada 680 nm; Tris-HCl buffer 50 mM, pH 7,2.
Ketergantungan waktu rasio I_ex320/I_ex404 untuk chlorin e₆ ditambahkan ke NS hibrid PS-PPO-PNIPAM setelah dipanaskan ke 39 °C. Error bar mencerminkan kebisingan spektral.
Ringkasannya, NS hibrid PS-PPO-PNIPAM memfasilitasi penyerapan chlorin e₆ dan EEET, dengan efisiensi meningkat selama sekitar 1 jam inkubasi dan lebih meningkat lagi pada pemanasan di atas LCST. Namun, hanya sebagian kecil chlorin e₆ yang terikat pada PNIPAM, yang menyoroti kebutuhan untuk optimasi di masa depan.
Skema proses yang diusulkan dalam NS hibrid PS-PPO-PNIPAM dengan chlorin e₆: (1) penyerapan awal, (2) penetrasi ~1 jam dan pembentukan EEET, (3) runtuhan PNIPAM yang diinduksi suhu dan peningkatan EEET lebih lanjut.
Kesimpulan
Analisis fluoresensi mengonfirmasi bahwa chlorin e₆ disisipkan ke dalam NS hibrid PS-PPO-PNIPAM dan bahwa EEET dari matriks PS dan PPO yang tersemat ke chlorin e₆ terjadi. Penyerapan mencapai saturasi setelah sekitar satu jam. Memanaskan sistem dari 21 °C ke 39 °C meningkatkan EEET lebih lanjut, sesuai dengan runtuhan termal cangkang PNIPAM terikatan silah, yang mendekatkan donor dan penerima. Meski hanya jumlah chlorin e₆ yang modest yang tetap terikat pada PNIPAM, temuan ini mendukung potensi NS hibrid ini dalam terapi fotodinamis yang didorong X-ray dan memerlukan studi lebih lanjut untuk meningkatkan pemuatan penyensor.
