Nanoadsorben Fluorescen SnO₂/SiO₂ untuk Pengangkatan Protein Berlabel TSG dengan Efisiensi Tinggi

Abstrak

Kami melaporkan platform nanosphera silika fungsional tiol (SiO₂-SH) yang disintesis secara mudah melalui metode hidrotermal yang kemudian dihiasi dengan titik kuantum (QD) SnO₂. Nanosphera komposit SnO₂/SiO₂ (NS) yang dihasilkan menampilkan fluoresensi yang kuat responsif cahaya terlihat, memungkinkan pelacakan real-time penangkapan protein. Fungsionalisasi dengan glutatjon direduksi (GSH) mengubah NS menjadi SnO₂/SiO₂-GSH, yang secara spesifik mengikat protein berlabel glutatjon S-transferase (TSG). Setelah diterapkan pada lisat E. coli, nanoadsorben menunjukkan adsorpsi non-spesifik yang dapat diabaikan, kapasitas pengikatan protein 7,4 mg g⁻¹, dan mempertahankan status redox serta aktivitas peroksidase peroksidase glutatjon 3 (GPX3) yang terisolasi. Properti ini menempatkan NS SnO₂/SiO₂-GSH sebagai alat yang menjanjikan untuk pemurnian protein berlabel TSG yang cepat dengan hasil tinggi.

Latar Belakang

Pemurnian protein yang efisien mendasari kemajuan dalam metabolisme obat, biologi struktural, dan pengembangan vaksin. Metode kromatografi dan presipitasi konvensional memerlukan tenaga kerja yang banyak dan seringkali mengorbankan integritas protein. Pemurnian affinitas, yang memanfaatkan interaksi alami antara TSG dan ligandnya, tetap menjadi standar emas untuk protein rekombinan yang memiliki label TSG. Namun, resin affinitas TSG konvensional (misalnya, Glutathione Sepharose 4B) menderita kapasitas ikatan yang terbatas, biaya tinggi, dan kurangnya pelaporan visual bawaan.

Nanomaterial dapat mengatasi keterbatasan ini dengan menawarkan luas permukaan tinggi, kimia yang dapat disesuaikan, dan, ketika dirancang dengan tepat, tanda optik. Titik kuantum SnO₂ menarik untuk bioaplikasi: mereka kimiawi stabil, biocompatible, dan menunjukkan fluoresensi yang diinduksi defek yang dapat dimanfaatkan untuk pencitraan. Dengan menancapkan titik kuantum SnO₂ pada nanosphera silika, kami menciptakan platform dual-fungsi yang menggabungkan penangkapan affinitas dengan pemantauan fluoresensi.

Eksperimen

Bahan dan Prosedur Umum

Semua reagen kelas analisis dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Reagen kunci meliputi CTAB, SnCl₄·5H₂O, TEOS, MPS, dan GSH. Titik kuantum SnO₂ disiapkan melalui metode hidrotermal, diikuti dengan pemasangan permukaan pada NS SiO₂-SH dan kemudian konjugasi GSH.

Sintesis Titik Kuantum SnO₂

SnCl₄·5H₂O (3,5 g) dilarutkan dalam 50 mL H₂O; ammonia (5 mL) ditambahkan untuk menendapkan Sn(OH)₄, yang dicuci dan didispersekan kembali dalam 30 mL H₂O. pH disesuaikan menjadi 12 dengan 2 M NH₄OH, kemudian dipindahkan ke autoklav dilapis Teflon dan dipanaskan pada 150 °C selama 24 jam. Produk yang dihasilkan dikumpulkan, dicuci dengan etanol-isopropanol (1:1), dan dikeringkan untuk menghasilkan titik kuantum SnO₂ (~5 nm diameter).

Pembuatan Nanosphera SnO₂/SiO₂-SH

Titik kuantum SnO₂ (0,2 g) dan CTAB (0,09 g) didispersekan dalam campuran air-etanol (42,5 mL + 7 mL). TEA (2,7 mL) ditambahkan, diikuti oleh TEOS (3,5 mL) dan MPS (0,35 mL) dengan pengadukan pada 60 °C selama 5 jam. Campuran diungkit, dicuci dengan HCl-etanol dan air, dan didispersekan kembali untuk menghasilkan NS SnO₂/SiO₂-SH (~460 nm diameter).

Fungsionalisasi GSH

NS SnO₂/SiO₂-SH (4 mL, 0,12 g mL⁻¹) diinkubasi dengan GSH (16,7 mg mL⁻¹) dalam PBS (pH 7,4) pada 37 °C selama 24 jam. Setelah pengungkutan dan pencucian, NS SnO₂/SiO₂-GSH disimpan dalam 25 % etanol pada 4 °C.

Penangkapan Affinitas Protein Berlabel TSG

GPX3, OST1, dan ABI2 berlabel TSG diekspresikan dalam E. coli BL21(DE3) dari konstruk pGEX-6p1. Lisat sel (pH 7,4, 0,01 M) dicampur dengan NS SnO₂/SiO₂-GSH (1 mL) dan dirotasi pada 4 °C selama 2 jam. Setelah pengungkutan dan pencucian, protein terikat dielusi dengan 0,5 M GSH, diukur dengan uji BCA, dan dianalisis dengan SDS-PAGE.

Uji Aktivitas GPX3

GPX3 yang telah dipurnikan dilebalkan dengan protease PreScission dan diuji aktivitas peroksidase dengan memantau konsumsi NADPH pada 340 nm dalam kehadiran thioredoxin, thioredoxin reductase, dan H₂O₂.

Analisis Status Redox

Sampel GPX3 diperlakukan dengan H₂O₂ dan DTT, kemudian dipecah pada SDS-PAGE non-reduktif 15 % untuk membedakan bentuk oksidasi dan reduksi.

Karakterisasi

Morfologi dan komposisi diperiksa dengan TEM (JEM-2010) dan SEM (JSM 5600LV). Pola XRD direkam pada difraktometer X’Pert Philips. Spektrum fluoresensi diukur dengan spektrometer FluoroSENS (eksitasi 260 nm). Kekeruhan protein dievaluasi dengan SDS-PAGE (Power PAC 300). Uji BCA dilakukan dengan kit Beijing CoWin.

Hasil dan Pembahasan

Morfologi, Kristalinitas, dan Fluoresensi Nanoadsorben

Titik kuantum SnO₂ menampilkan morfologi sferik monodispers ~5 nm dengan jarak lattice 0,29 nm bidang (110), mengonfirmasi kristalinitas tinggi mereka (Gambar 1). XRD cocok dengan fasa kasiterit (JCPDS 41-1445). Nanosphera komposit SnO₂/SiO₂-GSH mempertahankan bentuk sferik (~430 nm) dengan permukaan moderat kasar, seperti yang terlihat dalam citra SEM dan TEM (Gambar 2). Kehadiran titik kuantum SnO₂ pada SiO₂ dikonfirmasi oleh TEM (Gambar 2c,d).

Analisis fluoresensi mengungkapkan puncak emisi kuat pada 368 nm, yang dapat diatribusikan pada defek kosong oksigen dalam SnO₂ (Gambar 3b). Pencitraan fluoresensi NS setelah penangkapan protein (Gambar 3c) menunjukkan luminescence yang utuh, memungkinkan pelacakan visual kompleks terikat.

Efisiensi Penangkapan Protein

SDS-PAGE GPX3 TSG yang ditangkap oleh NS SnO₂/SiO₂-GSH menunjukkan pengayaan jelas protein target (Gambar 4a). Peningkatan konsentrasi GSH elusi (10–100 mM) secara bertahap melepaskan protein yang terikat, mengonfirmasi spesifisitas interaksi GSH-TSG. Nanoadsorben menunjukkan adsorpsi non-spesifik yang dapat diabaikan terhadap lisat E. coli secara keseluruhan.

Uji kembali dapat menunjukkan bahwa NS mempertahankan kapasitas ikatannya selama tiga siklus penangkapan berturut-turut (Gambar 4b), yang menggarisbawahi keandalan mereka.

Memperluas pendekatan ke protein TSG lainnya (OST1, ABI2) menghasilkan hasil yang dapat dibandingkan (Gambar 5). Kapasitas ikatan adalah 7,4 mg g⁻¹ (GPX3), 7,1 mg g⁻¹ (OST1), dan 6,8 mg g⁻¹ (ABI2), yang melebihi Glutathione Sepharose 4B komersial (7,1, 6,9, 5,6 mg mL⁻¹, masing-masing).

Pelestarian Status Redox dan Aktivitas GPX3

Setelah penghapusan TSG, GPX3 mempertahankan bentuk oksidasi dan reduksi, seperti yang ditunjukkan oleh migrasi yang berbeda pada SDS-PAGE non-reduktif (Gambar 6a). Uji aktivitas peroksidase (Gambar 6b) menunjukkan bahwa GPX3 yang diisolasi melalui NS SnO₂/SiO₂-GSH menunjukkan aktivitas yang dapat dibandingkan dengan yang diperoleh dengan resin komersial, mengonfirmasi bahwa nanoadsorben mempertahankan fungsi enzimatik.

Kesimpulan

Kami telah mengembangkan nanoadsorben titik kuantum SnO₂ yang dilindungi silika yang fluoresen yang menangkap protein berlabel TSG dengan spesifisitas dan kapasitas tinggi sambil mempertahankan status redox asli dan aktivitas enzimatik mereka. Keandalan penggunaan kembali yang kuat, performa ikatan yang unggul, dan fluoresensi bawaan menjadikannya alternatif yang menarik terhadap resin affinitas konvensional untuk pemurnian protein yang cepat.

Singkatan

ABI2:

ABA insensitive 2

CTAB:

Hexadecyltrimethyl ammonium bromide

DTT:

Dithiothreitol

GPX3:

Glutathione peroxidase 3

GSH:

Glutatjon direduksi

TSG-tagged:

Glutathione S-transferase-tagged

MPS:

3-Mercaptopropyl-trimethoxysilane

NADPH:

Dihydronicotinamide adenine dinucleotide phosphate

OST1:

Open stomata 1

QDs:

Titik kuantum

SDS-PAGE:

Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SEM:

Mikroskop elektron pemindai

SiO₂-SH NSs:

Nanosphera silika fungsional tiol

SnCl₄:

Tin (IV) chloride

TEA:

Triethylamine

TEM:

Mikroskop transmisi elektron

TEOS:

Tetraethyl orthosilicate

XRD:

Diffraksi X-ray