Imunosensor Magnetoelastik Baru untuk Mendeteksi Antigen Karsinoembrionik Secara Ultrasensitif
Abstrak
Sebuah imunosensor nirkabel baru dikembangkan untuk deteksi ultra-sensitif antigen karsinoembrionik. Dimensi optimal dari microchip, sebagai unit sensitif magnetoelastik, dievaluasi dengan simulasi dan eksperimen. Amplifikasi sinyal efek unik dan biokompatibilitas partikel emas berkontribusi pada stabilitas dan sensitivitas sensor. Selanjutnya, untuk meningkatkan sensitivitas, konsentrasi kerja antibodi dan BSA dipilih masing-masing menjadi 50 mg/mL dan 0,1%. Pencitraan mikroskop kekuatan atom menyoroti analisis biologis. Imunosensor Nano-magnetoelastik menunjukkan respons linier terhadap logaritma konsentrasi antigen karsinoembrionik (CEA) mulai dari 0,1 hingga 100 ng/mL, dengan batas deteksi 2,5 pg/mL. Biosensor yang dirancang memiliki keunggulan stabilitas dan sensitivitas yang sangat baik terhadap CEA.
Latar Belakang
Kanker merupakan salah satu penyakit mematikan di dunia [1]. Kanker pada pasien dapat dideteksi secara klinis ketika konsentrasi biomarker tumor mencapai jumlah tertentu dalam serum [2]. Oleh karena itu, sangat diperlukan untuk mencapai tes yang sensitif, cepat, dan akurat untuk penanda tumor, yang memberikan strategi yang efektif untuk diagnosis kanker [3]. Carcinoembryonic antigen (CEA) adalah keluarga glikoprotein permukaan sel dengan berat molekul 180∼200 kDa. Ini pertama kali ditemukan pada jaringan kanker usus besar manusia pada tahun 1965 [4, 5]. CEA biasanya muncul pada tingkat yang sangat rendah (0~5 ng/mL) dalam darah orang dewasa yang sehat [6]. Umumnya, tingkat CEA yang abnormal dapat dianggap sebagai tanda kanker, seperti karsinoma lambung [7], karsinoma pankreas [8], karsinoma kolorektal [9], karsinoma paru-paru [10], dan karsinoma payudara [11]. Artinya CEA dapat digunakan sebagai tumor biomarker. Pemantauan tingkat CEA dalam darah dapat digunakan untuk pra-peringatan, skrining, dan mendiagnosis kanker. Sementara itu, CEA juga dapat digunakan untuk penelitian lanjutan dari mereka yang telah dirawat secara klinis. Sensitivitas CEA terhadap kekambuhan tumor lebih dari 80%, yang lebih awal dari pemeriksaan klinis dan patologis. Jadi, pengamatan CEA yang berkelanjutan memberikan dasar penting untuk diagnosis dan prognosis efek kuratif [12].
Biosensor menanggapi pengenalan spesifik sinyal terukur keluaran molekul biologis oleh beberapa disiplin, memungkinkan tanggapan cepat, sensitivitas tinggi, dan biaya rendah. Baru-baru ini, biosensor imunologis telah dipelajari secara intensif, seperti enzymetic immunoassay [13], fluoro-immunoassay [14], dan electrochemical immunoassay [15,16,17]. Karena spesifisitas dan sensitivitasnya yang sangat baik, imunosensor menyediakan sarana yang menjanjikan untuk analisis biomarker tumor, bahkan ketika senyawa target berada dalam konsentrasi yang sangat rendah [18,19,20,21].
Nanoteknologi menyediakan metode baru untuk penerapan nanopartikel (NP) dalam teknologi biosensing. NP logam menunjukkan banyak karakteristik khusus, yang menyediakan platform yang luar biasa untuk antarmuka elemen bio-rekognisi [22, 23]. Immunoassays berdasarkan NP telah menarik perhatian besar bagi para peneliti [24,25,26]. Biosensor magnetoelastik tidak terpengaruh oleh suhu dan pH sekitar dengan sensitivitas respons yang tinggi. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami mengusulkan metode imunoassay magnetoelastik berdasarkan nanopartikel emas (AuNPs) dan microchip magnetoelastik. Immunosensor berhasil dikembangkan untuk mendeteksi biomarker CEA.
Hasil dan Diskusi
Mengingat bentuk seperti pita dari microchip magnetoelastik (ME), permeabilitas magnetik terbesar sepanjang panjangnya [27]. Hasil awal menunjukkan bahwa lebar dan ketebalan optimal chip ME masing-masing adalah 1 mm dan 28 m [28]. Simulasi digunakan untuk mengoptimalkan panjang chip, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1b.
Panjang optimal chip ME. a Perpindahan relatif berbeda dengan variasi panjang. b Simulasi digunakan untuk mengoptimalkan panjang chip
Perpindahan relatif berbeda dengan variasi panjang pada Gambar. 1a. Perpindahan relatif maksimum diperoleh ketika panjangnya 6 mm di bawah analisis modal orde pertama. Ini berarti sensitivitas tertinggi secara teoritis. Oleh karena itu, dimensi optimal chip dirancang sebagai 6 mm × 1 mm × 28 m dalam makalah ini.
Diagram skema biosensor Nano-ME diilustrasikan pada Gambar. 2. Pertama, chip Nano-ME diolah secara kimia oleh sistein untuk membuat film self-assembling molecular (SAM) di permukaan, sebagai lapisan fungsional untuk imobilisasi CEAAb. Kemudian, bovine serum albumin (BSA) meningkatkan kinerja CEAAb dengan mengurangi ikatan non-spesifik dan halangan sterik. Gambar mikroskop kekuatan atom (AFM) dilakukan untuk mengamati morfologi permukaan chip. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 3a, ketebalan lapisan SAM adalah 120 nm. Pencitraan pada Gambar. 3b mengungkapkan bahwa CEAAb secara kovalen melekat pada lapisan SAM dengan meningkatnya kekasaran. Ditampilkan dengan jelas pada Gambar 3c bahwa CEA secara khusus dikenali dan digabungkan secara efektif, dengan perkiraan ketinggian 200 nm dan ukuran lebih besar.
Skema biosensor Nano-ME yang dibangun
Gambar AFM dari lapisan SAM (a ). Lapisan CEAAb-SAM (b ). Kompleks CEA-CEAAb(c )
Dalam dimensi chip tertentu, konsentrasi antibodi merupakan faktor penting yang berkaitan dengan sensitivitas imunosensor. Oleh karena itu, perlu untuk mengevaluasi sinyal respons dari konsentrasi CEAAb yang berbeda (20, 50, 70, dan 100 g/mL, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a). Hasilnya menunjukkan bahwa respon optimum diperoleh pada sekitar 448 Hz (Gbr. 4b), ketika konsentrasi CEAAb adalah 50 g/mL. Jika konsentrasi CEAAb meningkat menjadi 70 g/mL, respon mulai menurun karena hambatan sterik dan tolakan elektrostatik [29].
a Kurva respons frekuensi versus CEAAb. b Histogram frekuensi
Pada prinsipnya, CEA secara khusus dikenali dengan antibodi, yang mengarah pada penurunan frekuensi respons. Gambar 5a menunjukkan kurva respon real-time dari immunosensor menuju CEA. Sementara itu, kami memperoleh kurva pemasangan linier pada Gambar. 5b.
Respons waktu nyata (a ) dan kurva pas (b ) dari biosensor versus CEA
Secara umum, respons sensor yang stabil dicapai pada 40 menit (Gbr. 5a). Perubahan frekuensi resonansi dicatat dengan konsentrasi CEA yang sesuai. Perubahan Hz secara linear tergantung pada logaritma konsentrasi CEA mulai dari 0,1 hingga 100 ng/mL (R
2
= 0,9688), dengan batas deteksi 2,5 pg/mL (Gbr. 5b). Untuk pengetahuan kita, rentang linier dan batas deteksi jelas lebih rendah daripada metode sebelumnya [28]. Hasilnya menunjukkan bahwa metode nirkabel dan sangat sensitif terhadap CEA berhasil dibuat.
Kesimpulan
Dalam kontribusi ini, imunosensor Nano-ME untuk deteksi CEA yang sangat sensitif berhasil dikembangkan berdasarkan chip ME. AuNPs dan BSA secara efektif meningkatkan sensitivitas dan stabilitas. Imunosensor Nano-ME yang diusulkan menunjukkan rentang penentuan CEA yang luas dari 0,1 hingga 100 ng/mL dengan batas deteksi rendah 2,5 pg/mL. Oleh karena itu, penentuan CEA yang akurat oleh imunosensor yang disiapkan dapat dicapai dengan hasil yang memuaskan. Memanfaatkan kekhususan, kesederhanaan, dan reproduktifitasnya, platform yang diusulkan menunjukkan aplikasi yang menjanjikan dalam pengembangan deteksi kanker non-invasif.
Metode
Di bawah medan magnet yang berubah-ubah waktu, microchip ME bergetar sepanjang waktu. Dalam medan magnet termodulasi untuk membuat microchip ME bergetar, energi medan magnet diubah menjadi energi potensial elastis untuk mencapai nilai maksimum. Karena bentuk chip sensor seperti pita, permeabilitas magnetik paling besar sepanjang panjangnya; karenanya, medan magnet yang datang menghasilkan getaran longitudinal di sensor dari hampir semua orientasi kecuali normal ke bidang dasar sensor. Diberikan oleh Persamaan. (1):
dimana E menunjukkan modulus elastisitas, v adalah rasio Poisson, ρ adalah kepadatan bahan sensor, dan L adalah dimensi longitudinal chip. Ketika suhu uji, kelembaban, dan parameter lingkungan lainnya konstan, perubahan frekuensi resonansi sensor magnetoelastik secara sensitif hanya bergantung pada perubahan massa (△m ) pada permukaannya, seperti yang diberikan oleh Persamaan. (2)
Berdasarkan Persamaan. (2), perubahan frekuensi resonansi sebanding dengan jumlah CEA. Oleh karena itu, konsentrasi CEA dapat dicapai dengan perubahan frekuensi, di mana f0 adalah frekuensi resonansi awal, M adalah massa awal, m adalah perubahan massa, dan f adalah pergeseran frekuensi resonansi sensor. Persamaan 2 menunjukkan bahwa sensitivitas sensor (△f /△m ) berbanding terbalik dengan massa magnetoelastik awal (M) sensor. Sensor dengan dimensi fisik yang lebih kecil memiliki massa awal yang lebih rendah sehingga menghasilkan sensitivitas yang lebih tinggi. Tanda negatif dalam persamaan menunjukkan penurunan frekuensi (△f ) pada penambahan massa non-magnetoelastik (△m ) pada sensornya. Oleh karena itu, pengikatan organisme target ke permukaan biosensor menyebabkan peningkatan massa dengan penurunan frekuensi resonansi fundamental yang sesuai.
Basis magnetoelastik dari paduan Metglas 2826MB (Fe40Ni38Mo4B18) diproses oleh Honey well Corporation (Morristown, NJ, USA). CEA, antibodi CEA, albumin serum sapi (BSA, 99%), dan saline buffer fosfat (PBS, pH = 7.4) dibeli dari Sangon (Shanghai, Cina). Aseton, isopropanol, etanol, 1-etil-3-karbodiimida (EDC), dan N -hidroksisulfosuksinimida (NHS) dibeli dari Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, USA). Semua reagen lainnya adalah kelas analitis. Air ultra murni diperoleh dari sistem Mill-Q (Milli-pore, USA). AFM Park System (ND-100, Korea), Plasma (P3C, Shanghai, China), Gauss ohmmeter (GM500), ZNB Vector Network Analyzer (R&S, Jerman), Laser cutter (AV3620A, Qingdao, China), dan HT20 gauss meter (Hengtong, Shanghai) digunakan.
Basis ME paduan dipotong laser menjadi 6 mm × 1 mm × 28 m microchip, kemudian dibersihkan secara ultrasonik dengan aseton, isopropanol, etanol, dan air deionisasi selama 5 menit dan dikeringkan dengan nitrogen. Aktivasi modifikasi permukaan microchip yang dibersihkan diproses dengan metode plasma. Kedua sisi microchip itu tergagap dengan lapisan krom (100 nm), diikuti dengan pelapisan dengan lapisan AuNP (40 nm) untuk membuat chip Nano-ME. Chip Nano-ME menangani plasma dengan oksigen kemurnian tinggi (0,9999) dan kemudian direndam ke dalam larutan sistein 40 mM dan disimpan selama 12 jam pada suhu kamar. Setelah itu, chip Nano-ME dimodifikasi secara biologis dan diinkubasi dengan konsentrasi CEAAb yang berbeda selama 1 jam pada 37 °C dengan adanya 1-etil-3-karbodiimida (EDC) dan N -hidroksisulfosuksinimida (NHS). CEAAb pertama kali diaktifkan dengan 10 mg/mL EDC dan 10 mg/mL NHS. Terakhir, chip Nano-ME, yang dimodifikasi oleh CEAAb, dilakukan lebih lanjut dengan 0,1% BSA selama 30 menit.
Biosensor Nano-ME dibangun sebagai berikut:tabung kaca dibungkus oleh kumparan dan dihubungkan ke penganalisis jaringan vektor. Sedangkan penambahan medan magnet memberikan arus bolak-balik agar kumparan menghasilkan medan magnet bolak-balik. Frekuensi resonansi biosensor Nano-ME dapat diperoleh dengan penganalisis jaringan vektor. Konsentrasi CEA yang berbeda (0-100 ng/mL) ditambahkan ke dalam tabung reaksi, dan pergeseran frekuensi dicatat setiap 5 menit sampai 40 menit. Setelah itu, chip Nano-ME dibilas dengan PBS untuk karakterisasi AFM.
