Modified Fe3O4 Magnetic Nanoparticle Delivery of CpG Menghambat Pertumbuhan Tumor dan Metastasis Paru Spontan untuk Meningkatkan Imunoterapi
Abstrak
Sebagai agonis reseptor 9 (TLR9) seperti tol baru, oligodeoksinukleotida sitosin-fosfat-guanin (CpG) sintetik yang tidak termetilasi dapat merangsang respons imun Th1 dan berpotensi digunakan sebagai agen terapeutik atau adjuvant vaksin untuk pengobatan kanker. Namun, beberapa kelemahan CpG membatasi aplikasinya, seperti eliminasi cepat oleh degradasi yang dimediasi nuklease dan serapan seluler yang buruk. Oleh karena itu, pengulangan pemberian obat dosis tinggi diperlukan untuk pengobatan. Dalam karya ini, sistem pengiriman CpG berdasarkan 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)-modified Fe3 O4 nanopartikel (FeNPs) dirancang dan dipelajari untuk pertama kalinya untuk mencapai bioaktivitas CpG yang lebih baik. Dalam hasil kami, kami merancang partikel CpG yang dikirim oleh FeNP (FeNP/CpG) dengan ukuran rata-rata kecil sekitar 50 nm dengan memuat CpG ke dalam FeNP. Sistem pengiriman partikel FeNP/CpG, dengan peningkatan pengambilan sel CpG dalam sel dendritik yang diturunkan dari sumsum tulang (BMDCs) in vitro dan melalui injeksi intratumoral, menunjukkan kemampuan antitumor yang signifikan dengan merangsang respons imun humoral dan seluler yang lebih baik pada kanker usus besar C26 dan payudara 4T1 model xenograft kanker in vivo dibandingkan model CpG gratis. Selain itu, tikus yang diobati dengan partikel FeNP/CpG telah menunda pertumbuhan tumor dengan tingkat penghambatan setinggi 94,4%. Selain itu, sekitar 50% tumor pada model C26 tampak mengalami regresi sepenuhnya. Demikian pula, ada metastasis paru yang lebih rendah dan tingkat penghambatan tumor 69% pada model tumor kanker payudara 4T1 dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati. Selain efektivitasnya, persiapan yang mudah, keamanan, dan stabilitas partikel FeNP/CpG yang tinggi juga menjadikannya imunoterapi antitumor yang menarik.
Latar Belakang
Tumor ganas adalah salah satu penyakit utama yang mengancam kesehatan dan kehidupan manusia, dan kejadian tumor terus meningkat [1, 2]. Sayangnya, hasil pengobatan tradisional seperti radioterapi, kemoterapi, dan pembedahan untuk tumor ganas belum terlalu efektif. Berbeda dengan kemoterapi dan radioterapi, yang menargetkan sel-sel yang berkembang biak dengan cepat untuk kematian, imunoterapi dirancang untuk meningkatkan sistem pertahanan kekebalan inang untuk menargetkan dan menghilangkan sel tumor.
Perlu dicatat bahwa CpG imunoterapi telah dipelajari secara ekstensif untuk kemanjurannya dalam pencegahan dan regresi tumor [3]. Meskipun data klinis menggembirakan, penggunaan CpG gratis masih memiliki beberapa kelemahan. Pertama, CpG rentan terhadap degradasi yang dimediasi nuklease dalam kondisi biologis. Kedua, mereka tidak memiliki spesifisitas untuk menargetkan sel setelah pemberian sistemik dan memiliki serapan seluler yang buruk. Oleh karena itu, perbaikan mungkin diperlukan. Karena TLR9 terletak di endosom, kami berhipotesis bahwa penyerapan CpG yang buruk oleh sel-sel inflamasi terkait tumor menyebabkan respons klinis yang lemah. Dengan demikian, metode yang meningkatkan internalisasi CpG dapat mempotensiasi respons imunostimulatornya.
Kecuali untuk kekurangan CpG bebas, rute pemberian CpG mempengaruhi kemampuan antitumor dan toksisitas. CpG bebas dan oligonukleotida fosforothioat stabil lainnya yang diberikan melalui injeksi intravena dibersihkan dengan cepat dan memiliki distribusi jaringan yang luas [4, 5]. Selanjutnya, CpG bebas yang diberikan secara sistemik dapat menginduksi aktivasi imun nonspesifik, yang menyebabkan efek samping yang parah, termasuk kelelahan sel imun, penghancuran folikel limfoid, kerusakan hati, dan eksaserbasi penyakit autoimun [6,7,8]. Sifat-sifat ini dapat menjelaskan kegagalan CpG gratis yang diberikan secara sistemik pada pasien manusia [9]. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa injeksi CpG intratumoral memiliki efek antitumor yang hebat dengan "memfokuskan" stimulasi imun pada lokasi tumor [10]. Bagaimana mengontrol waktu retensi CpG yang disuntikkan ke tumor menjadi masalah.
Dengan menggunakan toll-like receptor-9, sel dendritik, makrofag, dan sel NK dapat mengenali CpG, yang umum terdapat pada DNA bakteri [11]. CpG menginduksi sel imun untuk memproduksi kemokin dan sitokin, dan molekul permukaan sel kostimulatori yang diregulasi dari sel T [12,13,14,15]. Dengan demikian, CpG telah muncul sebagai adjuvant polarisasi tipe 1 yang poten [16, 17]. Selain itu, menyuntikkan CpG langsung ke tumor adalah bentuk imunisasi yang menggunakan tumor in situ sebagai sumber antigen dan memperkenalkan CpG sebagai adjuvant untuk mengaktifkan respon imun di dalam tumor. Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa injeksi CpG intratumor akan menghapus hak kekebalan tumor melalui perekrutan dan pengaktifan sel dendritik lokal, tergantung pada jalur respons sel T antitumor tipe 1.
Untuk mengatasi masalah tersebut, kami mengembangkan platform partikel magnetik yang dimodifikasi berdasarkan Fe3 O4 partikel untuk mengarahkan dan mengontrol pelepasan CpG melalui injeksi intratumoral di lokasi tumor. Karena beberapa karakteristik unik Fe3 O4 partikel magnetik, terutama histokompatibilitasnya yang baik [18], superparamagnetisme [19, 20], toksisitas rendah [21], dan persiapan yang mudah serta penghantaran obat yang ditargetkan dengan medan magnet eksternal [22, 23], pergerakan dan konsentrasinya dapat dikontrol dalam tubuh dengan medan magnet eksternal, memungkinkan Fe3 O4 partikel untuk digunakan sebagai pembawa obat gen dengan efisiensi transfeksi gen ditingkatkan [24]. Selain itu, melapisi APTES pada Fe3 O4 partikel dengan ikatan kovalen mencegah pembentukan agregat dan menawarkan lebih banyak situs modifikasi (gugus amino) [25, 26] untuk bantuan lebih lanjut dalam mengikat CpG. Dalam penelitian ini, Fe3 O4 partikel magnetik disiapkan dengan metode co-presipitasi [27] dan dimodifikasi dengan APTES. CpG terikat kuat pada permukaan Fe3 . yang dimodifikasi O4 partikel dengan interaksi elektrostatik untuk membentuk partikel FeNP/CpG dengan diameter sekitar 50 nm. Studi lebih lanjut menunjukkan bahwa sistem pengiriman partikel FeNP memiliki efisiensi serapan CpG yang ditingkatkan dibandingkan dengan CpG bebas dalam sel dendritik, dan injeksi intratumoral partikel FeNP/CpG merangsang respons imun antitumor tipe Th1 yang efektif tidak hanya untuk menahan tumor di pertumbuhan situ tetapi juga untuk menghambat metastasis tumor pada kanker usus besar C26 dan model kanker payudara 4T1 in vivo. Oleh karena itu, terapi persiapan nano dapat menjadi strategi imunoterapi tumor yang potensial.
Bahan dan Metode
Bahan dan Hewan
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) diperoleh dari Aladdin Company, Inc. Ferric chloride hexahydrate (FeCl3 6H2 O) dan besi klorida tetrahidrat (FeCl2 4H2 O) dibeli dari Institut Penelitian Industri Kimia Halus Tianjin Guangfu. CpG berikut disintesis oleh Invitrogen Co.:5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′. Fluorescein isothiocyanate (FITC) dibeli dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).
Garis sel ginjal embrionik manusia (293T), garis sel tumor payudara murine (4T1), dan garis sel kanker usus besar (C26) diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC), dan sel dendritik yang diturunkan dari sumsum tulang (BMDCs) diperoleh dari BALB/c tikus. Tikus BALB/c betina berumur 6-8 minggu dibeli dari Beijing HuaFuKang Laboratory Animal Co. Ltd. Tikus-tikus tersebut dibiakkan dan dipelihara dalam kondisi bebas patogen. Semua protokol hewan dilakukan sesuai dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari National Institutes of Health.
Persiapan FeNP
Metode kopresipitasi digunakan untuk sintesis Fe3 O4 partikel [29]. Dalam prosedur eksperimental, 11,68 g FeCl3 6H2 O dan 4,30 g FeCl2 4H2 O ditambahkan ke dalam labu leher tiga yang berisi 200 mL air deionisasi pada 80 °C, diikuti dengan penambahan 15 mL 25% NH3 ·H2 O. Selama proses reaksi 1 jam, campuran dibersihkan dengan N2 dan diaduk. Tiga puluh miligram Fe yang disiapkan3 O4 didispersikan ke dalam campuran 60 ml air deionisasi, dan etanol absolut dengan getaran ultrasonik selama 30 menit. 0,3 g Fe yang disiapkan3 O4 didispersikan ke dalam campuran 4 mL air deionisasi dan 600 mL etanol absolut dengan getaran ultrasonik selama 30 menit. Kemudian, 1,2 mL APTES ditambahkan ke dalam campuran di bawah pengadukan mekanis konstan selama 7 jam. Fe3 yang dimodifikasi APTES yang berfungsi dan berfungsi O4 (FeNP) nanopartikel dipisahkan secara magnetis dari supernatan dengan magnet, kemudian dicuci dengan etanol dan dikeringkan pada suhu 40 °C di bawah vakum selama 24 jam. Akhirnya, endapan FeNP disiapkan untuk digunakan lebih lanjut.
Karakterisasi Partikel FeNP/CpG
Spektrum distribusi ukuran partikel Fe3 O4 , FeNP, dan partikel FeNP/CpG ditentukan menggunakan penganalisis ukuran partikel laser Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK) pada 25 °C. Setiap tes dilakukan tiga kali, dan diambil nilai rata-ratanya. Mikroskop elektron transmisi (H-6009IV; Hitachi Ltd., Tokyo, Jepang) dan mikroskop elektron pemindaian (SEM) digunakan untuk mengamati morfologi partikel yang disiapkan.
Uji penghambatan agarosa dilakukan untuk mengevaluasi kemampuan pengikatan CpG partikel FeNP. Secara singkat, Fe3 yang dimodifikasi APTES yang difungsikan O4 partikel (FeNP) dicampur dengan 1 μg CpG pada rasio yang berbeda (FeNP:CpG, w /dengan ) dalam air suling. Setelah inkubasi bersama selama 30 menit pada suhu kamar, campuran dielektroforesis pada 1% (w /v ) gel agarosa pada 120 V selama 30 menit. Gel kemudian diwarnai dengan Golden View™ (0,5 mg/mL) dan difoto dengan iluminator UV (Bio-Rad ChemiDox XRS, USA).
Uji MTT
Sitotoksisitas partikel FeNP terhadap garis sel C26, 4T1, dan 293T dievaluasi dengan uji MTT. Sel C26, 4T1, dan 293T dilapisi dengan kepadatan 5 × 10
3
sel per sumur dalam 100 μL media RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS dalam pelat 96-sumur dan ditumbuhkan selama 24 jam atau 72 jam. Sel-sel yang disiapkan terkena serangkaian partikel FeNP pada konsentrasi yang berbeda:1,25, 0,625, 0,3, 0,15, 0,07, 0,03, 0,01, dan 0 mg/ml dalam sextuplicate. Setelah budidaya untuk waktu yang ditentukan, 100 l medium lengkap dan 10 l MTT dipipet ke dalam setiap sumur dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 4 jam. DMSO ditambahkan ke zat terlarut selama 30 menit, dan formazan terbentuk. Kemudian, absorbansi diukur pada 570 nm dengan Spectramax M5 Microtiter Plate Luminometer (Molecular Devices, USA). Kelangsungan hidup sel dari sel yang tidak diobati dianggap 100%.
Transfeksi In Vitro
BMDC dibuat dari tikus BALB / c. Secara singkat, sel-sel sumsum tulang dari tulang paha dan tibia dikeluarkan dengan media kultur 1640 yang mengandung FBS gratis menggunakan jarum suntik. Sel disentrifugasi pada 1500 rpm selama 3 menit, diperlakukan dengan buffer lisis ACK (Lonza Inc.) untuk menghilangkan sel darah merah, dan disuspensikan kembali dalam media kultur RPMI-1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS, penisilin (100 U/mL) dan streptomisin ( 100 U/mL) pada 37 °C dalam 5% CO2 dengan 20 ng/mL faktor perangsang koloni granulosit-makrofag (GM-CSF). Sel-sel tersebut kemudian diunggulkan ke dalam pelat enam sumur dengan kepadatan 10
6
sel per sumur, dan media pertumbuhan diganti setiap 2 hari. Sel dendritik dipanen pada hari ke 7.
Pada hari ke 7, partikulat setara 0.2 g bebas FITC-conjugated CpG (CpG-FITC) atau FeNP yang memberikan CpG-FITC dengan rasio massa 10:1 ditambahkan ke sumur yang telah dirancang sebelumnya. Satu atau 3 jam pasca transfeksi, media pertumbuhan dibuang, sel diwarnai dengan DAPI selama 10 menit, dan sel dicuci dengan salin fisiologis tiga kali. Gambar setiap sumur diambil dengan mikroskop laser scanning confocal (LSCM), dan efisiensi transfeksi diukur dengan flow cytometry (NovoCyte Flow Cytometer, ACEA Biosciences, USA).
In Vivo Uji Penghambatan Tumor
Seratus ribu sel C26 atau 4T1 disuntikkan secara subkutan pada punggung setiap tikus BALB/c (berusia 6-8 minggu). Volume tumor selanjutnya diukur menggunakan jangka sorong digital dan dihitung dengan rumus berikut:volume tumor =0,5 × panjang (mm) × [lebar (mm)]
2
. Setelah tumor mencapai sekitar 50 mm
3
dalam ukuran, perawatan diterapkan. Tikus (n = 10) menerima injeksi intratumoral CpG/FeNP (dengan rasio 10:1) partikulat yang setara dengan 20 μg CpG atau CpG saja setiap 3 hari selama empat perawatan. Tikus yang menerima setara dengan normal saline (NS) atau partikel FeNP dianggap sebagai kelompok kontrol. Ukuran tumor dan berat badan hewan dipantau setiap 3 hari. Pada hari ke-31, seluruh mencit dikorbankan dengan cara dislokasi vertebra servikal. Jaringan tumor dan organ penting lainnya difiksasi dengan formalin netral 4% diikuti oleh bagian parafin untuk pewarnaan HE untuk mengevaluasi perbedaan morfologi dan untuk imunofluoresensi untuk menguji lingkungan mikro tumor. Dalam model 4T1, kami mengukur berat tumor dan menghitung jumlah nodul metastasis paru.
Eksperimen tantangan ulang tumor diproses dalam model C26. Secara singkat, tikus yang disembuhkan dengan pengobatan FeNP/CpG ditantang ulang dengan 5 × 10
5
Sel C26 atau 4T1 s.c. menjadi dua situs terpisah di sisi berlawanan dari sayap tanpa perawatan lebih lanjut. Tikus dikorbankan saat volume tumor 4T1 tumbuh menjadi 200–300 mm
3
atau 20 hari.
Pengujian Limfosit T Sitotoksik
Uji CTL dilakukan sesuai dengan metode yang diterbitkan. Secara rinci, limfosit limpa sebagai sel efektor diambil dan sel darah merah dikosongkan dengan amonium klorida dan dilewatkan melalui wol nilon pada akhir percobaan pengobatan. 4T1 atau C26 sebagai sel target diberi label dengan 300 mci Na2
51
CrO4 selama 2 jam dan kemudian dicuci dengan PBS dan dituangkan ke dalam pelat 96-sumur. Sel efektor yang disiapkan diinkubasi bersama dengan sel target pada rasio E:T yang berbeda. Supernatan yang mengandung radioaktivitas dari sel target diukur dengan penghitung kilau. Lisis spesifik ditentukan sebagai berikut:% lisis spesifik =100 [(pelepasan dengan adanya pelepasan spontan CTL)/(pelepasan spontan pelepasan maksimal)]. Dalam semua eksperimen, pelepasan spontan kurang dari 30% dari pelepasan maksimum.
Pengujian ELISpot
Splenosit diambil dari tikus kontrol atau yang diberi perlakuan CpG pada akhir percobaan, dan uji ELISpot dilakukan menggunakan kit ELISpot Warna Ganda IFN-γ/IL-4 tikus sesuai dengan instruksi pabrik. Splenosit yang dipanen diinkubasi bersama dengan perlakuan masing-masing selama 96 jam, suspensi dijatuhkan, dan sel dicuci dengan buffer pencuci tiga kali sebelum menambahkan antibodi campuran IFN-γ dan IL-4. Setelah diproses oleh agen kromogenik, jumlah sel pembentuk titik (SFC) dihitung di bawah mikroskop.
Uji ELISA
ELISA dilakukan untuk menentukan kadar titer antibodi serum spesifik Ct sesuai dengan instruksi pabrik. Singkatnya, pelat mikro yang dilapisi dengan protein Ct utuh murni (BestBio Biotechnology Co. Shanghai, China) dibilas dengan larutan PBS yang mengandung 0,05% Tween 20 (PBST) dan kemudian diblokir dengan buffer pemblokiran 100 μl (susu skim 5% dalam PBST) pada 37 °C selama 1 jam. Setelah dibilas lima kali dengan PBST, cawan diinkubasi dengan serum imun (diencerkan pada 1:1000 dalam buffer pemblokiran, 100 l/sumur) atau pencuci vagina (diencerkan pada 1:10 dalam buffer pemblokiran, 100 l/sumur) pada suhu 37 °C selama 2 jam. Setelah dibilas lima kali dengan PBST, pelat diinkubasi dengan antibodi IgG anti-tikus kambing terkonjugasi-HRP (diencerkan pada 1:1000 dalam buffer pemblokiran, 100 l/sumur) atau antibodi IgA anti-tikus kambing terkonjugasi-HRP (diencerkan pada 1:2000 dalam buffer pemblokiran, 100 μl/sumur) pada 37 °C selama 1 jam.
Analisis Histologi
Jaringan tumor dan organ utama yang diambil dari studi penghambatan in vivo diperbaiki dan tertanam dalam parafin. Setelah dewaxing dan rehidrasi, bagian jaringan yang tertanam lilin diwarnai dengan HE Mayer. Untuk menganalisis limfosit infiltrasi (TIL) dalam jaringan tumor dari masing-masing kelompok, bagian menjadi sasaran perbaikan antigen tekanan tinggi, diwarnai dengan anti-tikus FITC-CD4, PE-CD8, dan PE-CD49b (sebagai pembuat NK) (BD, USA) selama 1 jam pada 4°C, lalu diwarnai dengan DAPI selama 10 menit sebelum pencucian PBS untuk pencitraan. Gambar dari setiap kelompok diambil melalui mikroskop fluoresensi positif (Olympus, Jepang).
Analisis Statistik
Data dinyatakan sebagai nilai rata-rata ± standar deviasi. Analisis statistik dilakukan dengan analisis varians satu arah (ANOVA) menggunakan Perangkat Lunak Prism 5.0c (Perangkat Lunak GraphPad, La Jolla, CA, USA) SPSS 17. Perbandingan antar kelompok dilakukan dengan menggunakan uji Tukey untuk analisis varians faktor tunggal (ANOVA). P nilai < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Preparasi dan Karakterisasi Partikel FeNP/CpG
Untuk mengembangkan partikel magnetik untuk pengiriman CpG dengan sitotoksisitas rendah, Fe3 O4 partikel disintesis menggunakan metode co-presipitasi seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a. Pencangkokan gugus aminopropilsilane (–O)3Si–CH2–CH2–CH2–NH2 dari APTES pada permukaan Fe3 O4 untuk membentuk partikel FeNP (Gbr. 1b). CpG (CpG) bermuatan negatif berikatan dengan gugus fungsi efektif yang disediakan oleh APTES untuk membentuk partikel FeNP/CpG melalui interaksi elektrostatik seperti yang ditunjukkan secara skematis pada Gambar 1c. Berdasarkan pengukuran hamburan cahaya dinamis, ukuran Fe yang disiapkan3 O4 partikel adalah 10,7 ± 4,1 nm (Gbr. 2a). Seperti yang diamati melalui TEM (Gbr. 2b) dan SEM (Gbr. 2c), Fe3 O4 dikembangkan dalam karya ini menampilkan bentuk yang seragam dan hampir bulat. Diameter dinamis Fe yang dimodifikasi APTES3 O4 partikel adalah 34.5 ± 5.0 nm (Gbr. 2d), yang sesuai dengan hasil TEM (Gbr. 2e).
Persiapan partikel FeNP/CpG. a Persamaan sintesis Fe3 O4 partikel magnetik dengan metode kopresipitasi. b Reaksi hidrolisis dan kondensasi dengan produksi polimer silan dan reaksi silanisasi APTES pada permukaan magnetit membentuk partikel FeNP. c Diagram skema partikel FeNP/CpG. CpG terikat pada permukaan FeNPs melalui interaksi elektrostatik untuk membentuk partikel FeNP/CpG
Karakterisasi partikel FeNP/CpG. a Ukuran spektrum distribusi Fe3 O4 partikel. b Gambar mikroskopis elektron transmisi (TEM) Fe3 O4 . c Memindai gambar mikroskop elektron Fe3 O4 partikel. d Distribusi ukuran Fe berlapis APTES3 O4 partikel (FeNP). e Gambar TEM partikel FeNP. f Kemampuan mengikat CpG dari FeNPs ditentukan oleh uji keterbelakangan gel. Semua data mewakili tiga eksperimen independen
Untuk mengilustrasikan kemampuan mengikat partikel FeNP ke CpG, uji penghambatan gel dilakukan (Gbr. 2f). Ketika rasio molar FeNP dengan CpG adalah 10:1, tidak ada pita CpG terang yang teramati, menunjukkan bahwa CpG bermuatan negatif dapat sepenuhnya diadsorpsi oleh partikel FeNP melalui interaksi elektrostatik setelah elektroforesis. Oleh karena itu, kami memilih rasio resep tersebut untuk aplikasi lebih lanjut dalam penelitian kami. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa CpG dapat berhasil digabungkan pada permukaan FeNP melalui interaksi elektrostatik, menunjukkan stabilitas dan dimensi yang kecil.
Viabilitas Sel dan Transfeksi Partikel FeNP/CpG In Vitro
Untuk mendeskripsikan lebih lanjut karakterisasi biofisik in vitro, kami mendeteksi sitotoksisitas FeNP dalam sel 293T, 4T1, dan C26 pada titik 24 jam atau 72 jam (Gbr. 3a). Tidak ada hubungan ketergantungan dosis yang jelas antara viabilitas sel dan partikel FeNP dalam sel 293T, C26, dan 4T1. Tingkat kelangsungan hidup sel lebih dari 80% pada 24 jam dan 60% pada 72 jam pada tiga jenis sel, bahkan pada konsentrasi FeNP 1,25 mg/ml. Hasil ini membuktikan biokompatibilitas partikel FeNP baik untuk sel normal (293T) atau sel tumor (C26, 4T1).
Sitotoksisitas dan aktivitas penyerapan partikel FeNP/CpG in vitro. a uji MTT. Kami mendeteksi viabilitas sel 293T, 4T1, dan C26 setelah perawatan dengan berbagai konsentrasi partikel FeNP selama 24 jam atau 72 jam. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam viabilitas sel pada setiap dosis FeNPs. b , c Deteksi penyerapan FeNP/CpG di BMDC. BMDC disiapkan setelah GM -CSF pengobatan selama 7 hari ditransfeksi dengan CpG-FITC atau CpG-FITC yang dikirim oleh FeNP selama 1 atau 3 jam sebelum dicuci, difiksasi, dan diberi label secara intensif dengan DAPI. Gambar diambil dengan laser scanning confocal microscopy (LSCM). Dibandingkan dengan CpG berlabel FITC gratis, FeNP/CpG dengan intensitas fluoresensi yang ditingkatkan (b ) dan efisiensi transfeksi signifikan secara statistik (c ). Data ini mewakili tiga eksperimen independen, mean ± standard error; *P < 0,05, *P < 0,01, dan ***P < 0,001 vs kelompok yang tidak diberi perlakuan
Sel dendritik sebagai sel reseptor utama CpG berperan penting dalam respon imun antitumor yang dimediasi oleh TLR9. CpG sebagai ajuvan polarisasi tipe 1 yang kuat menginduksi DC untuk mengaktifkan respons imun di dalam tumor dengan mengeluarkan kemokin dan sitokin. Oleh karena itu, pengiriman CPG yang efisien ke dalam sel DC sangat penting untuk mencapai respons antitumor. Dalam penelitian kami, CpG terkonjugasi FITC digunakan untuk menyelidiki kemampuan pengiriman partikel FeNP ke DC in vitro. Setelah 1- atau 3 jam pasca-transfeksi, melalui pemindaian laser confocal microscopy (LSCM), intensitas fluoresensi seluler dalam kelompok yang diberi perlakuan partikel FeNP berlapis CpG terkonjugasi (FeNP/CpG-FITC) lebih tinggi daripada untuk jumlah grup CpG gratis yang setara (Gbr. 3b). Partikel FeNP/CpG-FITC mampu mentransfeksi hingga 18,3% DC setelah 1 jam. Kemudian, 3 jam setelah transfeksi, rasio sel positif meningkat menjadi 39,2% (Gbr. 3c). Sementara itu, mengenai sel yang diobati dengan CpG terkonjugasi FITC gratis, fluoresensi minimal dapat diamati bahkan 3 jam pasca-transfeksi, dengan kurang dari 10% transfeksi. Dengan demikian, disarankan bahwa pengiriman CpG oleh partikel FeNP meningkatkan serapan seluler CpG.
FeNPs Memberikan CpG ke Xenograft dan Menghambat Pertumbuhan Tumor dan Metastasis Paru Spontan Di Vivo
Aktivitas antikanker partikel CpG/FeNP pertama kali dievaluasi pada kanker usus besar C26 dan model tumor transplantasi subkutan kanker payudara 4T1 in vivo. Saat volume tumor kira-kira 50 mm
3
, tikus secara acak dibagi menjadi empat kelompok untuk memulai pengobatan (n = 10). Tikus diperlakukan dengan injeksi intratumoral partikel CpG/FeNP tiga kali selama seluruh percobaan (Gbr. 4a). Dalam penelitian kami, injeksi intratumoral partikel FeNP/CpG menghasilkan penghambatan signifikan pertumbuhan tumor xenograft dibandingkan dengan kelompok kontrol, dan tingkat penghambatan naik hingga 69% (P < 0,05 versus NS) (Gbr. 4b). Dibandingkan dengan kelompok perlakuan normal saline (NS) (0,90 ± 0,08 g) dan kelompok FeNP (0,81 ± 0,03 g), kelompok perlakuan partikel FeNP/CpG mengalami penurunan berat tumor yang signifikan secara statistik (0,38 ± 0,03 g, P < 0,001). Sebagai perbandingan, kelompok CpG bebas menunjukkan kemampuan antikanker minimal (0,68 ± 0,03 g) (Gbr. 4c). Selain itu, tikus dalam kelompok kontrol PBS mengembangkan metastasis paru yang luas, sebagai perbandingan, tikus yang diobati dengan partikel FeNP/CpG menunjukkan penurunan 64,1% dalam jumlah nodul tumor di paru-paru (Gbr. 4d, e), menunjukkan kekuatan partikel FeNP/CpG dalam mengobati tumor metastatik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4f, pewarnaan H&E paru-paru menunjukkan pengurangan beban paru-paru dengan metastasis paru yang jelas setelah pengobatan FeNP/CpG dibandingkan kelompok lain. Hasil ini menunjukkan bahwa pengiriman FeNP CpG ke dalam sel 4T1 tidak hanya secara signifikan menghambat pertumbuhan tumor 4T1 (P < 0.001 versus NS) tetapi juga menekan metastasis kanker payudara ke paru-paru.
Kemampuan antitumor partikel FeNP/CpG in vivo. a Jadwal pengobatan antitumor oleh partikel FeNP/CpG baik pada model xenograft kanker kolon C26 maupun kanker payudara 4T1 melalui injeksi intratumoral in vivo. b –d Perawatan partikel FeNP/CpG menghambat pertumbuhan tumor 4T1. b Kurva pertumbuhan tumor representatif dari model tumor 4T1. c Berat tumor rata-rata. d Rata-rata nodul tumor paru pada masing-masing kelompok jelas menunjukkan metastasis paru setelah injeksi intratumoral FeNP/CpG. e , f Pencitraan Brightfield dan pewarnaan H&E paru-paru:e Jumlah metastasis paru-paru yang terlihat, panah menunjukkan metastasis paru-paru. f Pewarnaan H&E pada metastasis paru. Batang timbangan, 100 μm untuk pewarnaan H&E. g , h Partikel FeNP/CpG secara signifikan menghambat pertumbuhan tumor xenograft C26:e kurva pertumbuhan tumor masing-masing kelompok selama percobaan dan f berat tumor rata-rata. Setiap kelompok berjumlah 10 ekor tikus. g Eksperimen tantangan ulang tumor. saya Dalam model C26, tikus yang disembuhkan dengan pengobatan FeNP/CpG ditantang ulang dengan 5 × 10
5
Sel C26 (sayap kanan) atau 4T1 (sayap kiri) s.c. menjadi dua situs terpisah di sisi berlawanan dari sayap tanpa perawatan lebih lanjut. Gambar yang ditampilkan adalah tikus representatif pada 20 hari setelah tumor re-challenge. Semua data mewakili tiga eksperimen independen, mean ± SEM; *P < 0,05, *P < 0,01, dan ***P < 0,001
Demikian pula, peningkatan efek antitumor yang signifikan dengan kelompok perlakuan FeNP/CpG diamati pada model subkutan tikus yang diinkubasi C26. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4g, tumor tumbuh dengan cepat pada tikus kontrol, kelompok kendaraan, dan kelompok CpG, dengan volume tumor rata-rata sekitar 2300 ± 239,4 mm
3
, 2116.7 ± 360.9 mm
3
, dan 1353,3 ± 158,9 mm
3
, masing-masing, pada hari ke 31. Sebaliknya, pada kelompok FeNP/CpG, pertumbuhan tumor sangat terhambat, dengan volume tumor rata-rata sekitar 153,7 ± 62,7 mm
3
(P < 0,01 versus NS) dan tingkat penghambatan 94,4%. Tumor tampaknya tumbuh perlahan setelah perawatan awal, dan sebagian tumor mulai menghilang secara bertahap setelah akhir dari tiga perawatan. Lebih penting lagi, dalam kelompok perlakuan partikel FeNP/CpG, tumor di hampir setengah dari tikus telah hilang sepenuhnya pada akhir percobaan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4h, kelompok perlakuan FeNP/CpG memiliki berat tumor rata-rata yang jauh lebih rendah daripada kelompok lain (P < 0,001:kelompok perlakuan FeNP/CpG (0,14 ± 0,08 g), kelompok NS (2,41 ± 0,26 g), kelompok FeNP (2,50 ± 0,4 g), dan kelompok CpG (1,44 ± 0,32 g). Untuk menentukan apakah partikel FeNP/CpG cukup untuk memediasi respon antitumor spesifik, percobaan tantangan ulang tumor diproses dalam model C26 (Gbr. 4i). Tikus yang tumornya benar-benar regresif setelah pengobatan partikel FeNP/CpG dalam model kanker usus besar C26 diinokulasi dengan tumor 4T1 dan C26 pada posisi yang berbeda pada tikus BALB/c secara subkutan, dan tidak ada pengobatan lebih lanjut yang diberikan. Semua tumor 4T1 tumbuh dengan cepat, dan volumenya melampaui 1000 mm3 pada hari ke-20 pasca-tantangan. Sebaliknya, ada tumor padat yang tidak terlihat dengan mata telanjang dalam model C26, menunjukkan kelompok partikel FeNP/CpG merangsang respon antitumor tertentu. Hasil ini menunjukkan bahwa injeksi intratumoral partikel FeNP/CpG secara efisien menghambat pertumbuhan xenograft subkutan.
Partikel FeNP/CpG Merangsang Peningkatan Respon Kekebalan Antitumor Sistematis
Mekanisme antitumor in vivo partikel FeNP/CpG dalam dua model di atas dipelajari lebih lanjut. Untuk mempelajari jenis respons imun, kami menerapkan uji ELISpot untuk menganalisis level IFN-γ/IL-4 dari limpa tikus. Jika kadar IFN-γ pada limfosit limpa (menunjukkan eritema pada papan ELISpot) secara signifikan lebih dari kadar IL-4 (menunjukkan bintik-bintik biru pada papan ELISpot), jenis respon imun yang dirangsang adalah Th1, yaitu mengaktifkan CD8
+
limfosit T dan terutama respons CTL tubuh. Jika tidak, jenis respon imun adalah Th2, yaitu, untuk mengaktifkan CD4
+
limfosit T, sehingga merangsang limfosit B dan memproduksi antibodi spesifik antigen. Uji ELISpot dua warna dilakukan untuk mengukur ekspresi IFN-γ dan IL-4 dalam perlakuan yang berbeda (Gbr. 5a). Dibandingkan dengan tiga kelompok lainnya, jumlah sel pembentuk titik (SFC) IL-4 dan IFN-γ yang disekresikan dari limfosit limpa tikus memiliki tren yang meningkat pada kelompok perlakuan partikel FeNP/CpG, dan jumlah SFC mensekresi IFN-γ 1,5 kali lipat lebih besar daripada IL-4 (P < 0,05), yang menyiratkan peningkatan respons imun seluler antitumor setelah injeksi intratumoral partikel FeNP/CpG. Selain itu, serum dari tikus yang diobati dengan NS, FeNP, CpG, dan FeNP/CpG dianalisis menggunakan uji ELISA untuk mengetahui keberadaan total IgG spesifik tumor setelah tiga imunisasi. Dalam model tumor C26, meskipun tikus yang diimunisasi FeNP/CpG mengembangkan titer IgG spesifik tumor yang secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok lain (Gbr. 5b), tidak ada perbedaan statistik antara tikus yang diimunisasi FeNP/CpG dan tikus yang diimunisasi CpG .
The mechanism of antitumor immune response. a ELISpot assay. Splenocytes were harvested from NS or treated mice after the final treatment, and ELISpot assays were performed using the mice IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot kit in the C26 xenograft model. b In the C26 model, serum antibody titers in tumor-bearing mice treated by FeNP/CpG particles were tested using an ELISA assay. Each symbol represents an individual mouse, and horizontal lines indicate the median as determined by Mann–Whitney U tes. c CTL assays. The cytotoxicity of splenocytes against C26 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay. d Representative immunofluorescence images showing infiltrating immune cells in tumor tissues in each group. The FeNP/CpG particles treatment groups with enhanced CD4
+
T, CD8
+
T and NK (CD57
+
) cell infiltration in tumors compared to that of other groups. e The cytotoxicity of splenocytes against 4T1 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay
To assess the cell-mediated immune response stimulated by the FeNP/CpG, CTL activity was assessed using the 51Cr release assay on C26 and 4T1 cells ex vivo (Fig. 5c, e). When the killing activity of CTL was at a 100:1 ratio of effector cells to target cells, in the C26 cells, the effectors in the FeNP/CpG groups showed 8.2-fold more tumor-killing activity than that in the NS group and 9.7-fold and 1.7-fold more than that in the FeNP and CpG groups (P < 0.05 versus NS) (Fig. 5c). Similarly, this observation was coincident with the result in the 4T1 cells; the FeNP/CpG group had 7.4-fold more tumor-killing activity than that of the NS group and 6.6-fold and 1.4-fold more than that of the FeNP and CpG groups (P < 0.01 versus NS). These results illustrated that compared to that of free CpG, the use of APTES-coated Fe3 O4 to deliver CpG can stimulate a more intense humoral immune response and result in a better antitumor efficiency in vivo.
The FeNP/CpG Increases Infiltrating Lymphocytes in Tumors and Alters Tumor Microenvironments
Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), a primary immune component infiltrating solid tumors, are considered the manifestation of the host antitumor reaction. Immunofluorescence analyses were performed to study TILs in tumors. The intensity of infiltration by CD4
+
T cells, CD8
+
T cells and CD49B
+
NK cells was studied (Fig. 5d). There was a significant increase in the intensity of infiltration of NK cells, CD4
+
T cells, and CD8
+
T cells in tumors from the FeNP/CpG groups compared with that in the FeNP, CpG, and NS groups (P < 0.005), which suggests that FeNP/CpG not only stimulates a higher immune response but also alters the tumor microenvironment by activating more immune cells into the tumor tissues. During the entire experiment, the mouse body weight and state were observed, and there was no piloerection, poor appetite, weight loss, or abnormal behavior in the C26 xenograft model (Fig. 6a). As shown in Fig. 6b, no significant pathological changes in heart, liver, spleen, lung, or kidney were observed through HE analysis. No histopathological changes and changes of body weight were observed in the 4T1 subcutaneous xenograft model (data not shown). Overall, our data suggested that the developed FeNP particles for CpG delivery were capable of treating cancer and inhibiting tumor metastasis with high safety.
Safety and toxicity evaluation of FeNP/CpG formulation. (a ) Body weight changes in NS, FeNP, CpG, and FeNP/CpG groups. b The section of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in each group was collected and stained with H&E staining. No significantly pathological changes were observed in any group (magnification, × 200)
Diskusi
Synthetic CpG, identified as an effective drug in immunotherapy by simulating the immune activation of natural bacterial DNA [28,29,30], have been characterized in a variety of tumor models. CpG intratumoral injection is one of treatments in clinical trials on CpG. Molenkamp and his colleagues showed that the intratumoral injection of CpG alone or combined with radiotherapy could obviously increase the tumor-specific CD8
+
T cell immune response in lymphoma or melanoma patients, causing systemic tumor regression [31]. So far, CpG combined with other treatments showed both a great antitumor effect and good security, which suggests that CpG are quite effective in tumor immunotherapy. However, the greater challenge of CpG truly coming into clinical application is if they can efficiently be delivered into the cells to combine with receptors such as TLR9 to stimulate an immune response. Nanotechnology can address such concerns by enhancing the delivery of CpG to antigen-presenting cells, and a number of nanocarriers have been explored for this purpose [32,33,34]. The nanoparticle formulations explored include gelatin particles, liposomes [35, 36], and DNA origami structures, but these were only explored in the context of combination treatments.
In this study, we first developed a non-viral delivery system, FeNPs, which were easily formed via APTES-modified Fe3 O4 , to deliver CpG into BMDCs. The CpG surrounded the surface of the modified magnetic Fe3 O4 particles via electrostatic interactions to form FeNP/CpG particles with a small size distribution. The FeNP/CpG particles not only showed enhanced transfection efficiency compared to that of free CpG but also had a great antitumor effect in subcutaneous tumor models of C26 colon cancer, with 94.5% tumor inhibition, and 4T1 breast cancer, with a 64.3% inhibitory rate, though intratumoral injection in vivo. Moreover, FeNP/CpG treatments significantly stimulate an effective antitumor immune response and alter the tumor microenvironment by recruiting a number of immune cells to tumor tissues.
We further discuss possible reasons to account for the enhanced transfection and therapeutic efficiency of FeNP/CpG particles over that of free CpG. First, the developed FeNPs take advantage of characteristics such as their good histocompatibility, superparamagnetism, and a strong positive charge (for the Fe3 O4 particles) to assist in delivering the CpG into the intracellular space, resulting in drug-carrier particles focusing on the tumor site to increase the drug concentrations in the area, reduce the drug loss, and improve drug utilization. Simultaneously, APTES was used to modify Fe3 O4 , providing more CpG binding sites to firmly bind the CpG onto the carrier. FeNPs exerted higher cell viability on 293T, C26, and 4T1 cells in vitro, and there was no remarkable pathological change after FeNP/CpG treatment by intratumoral injection that could avoid the side effects due to CpG entering into circulation by systemic administration. Second, the FeNP load CpG into DCs with a higher transfection efficiency than that of free CpG, increasing opportunities for integration with intracellular TLR9, which is widely expressed in macrophages, NK cells, DCs, and so on. The combination of CpG and TLR9 induces the secretion of local cytokines and chemokines, recruiting and activating immune cells of the innate immune response to stimulate the antitumor immune response; additionally, NK cells and CTLs could kill tumor cells directly or use IFN-γ or granzyme B to kill tumor cells [37, 38]. We suspected that FeNP/CpG may be taken up by the recruited immune cells to trigger the secondary cascade amplification of the immune response. Third, some studies have indicated that CpG can react with tumor cells expressing TLR9, aiming to induce tumor cell autophagy [39]. Autophagy may enhance the sensitivity of tumor cells to the immune response, and the ATP dependent on autophagy could be released extracellularly and used to recruit DCs into the tumor tissue, activating the tumor-specific T cell immune response. This therapy is a form of immunization that uses the in situ tumor as a source of antigen and introduces CpG as an adjuvant to activate an immune response within the tumor. In our study, although the FeNP/CpG was injected without any specific tumor antigen, a cell-specific and systematic immune response could be elicited, and the contralateral tumors appear regressive, as shown in the tumor re-challenge experiment and the two-tumor site model. In addition, being coated with the lysate of tumor cells in a 96-well plate, the ELISA assay showed after FeNP/CpG intratumoral injection in mice that the antitumor antibody titer in the serum appeared to significantly increase. The ELISpot assay suggested that FeNP/CpG treatment, to a great degree, increased the spleen lymphocyte secretion of IFN-γ and IL-4, especially that of IFN-γ , which indicated that the humoral immunity responses and cellular immunity responses were both enhanced by treatment with FeNP/CpG in mice. In addition, immunohistochemistry analyses were performed to study TILs in the tumor microenvironment. Compared to that in the other groups, in the FeNP/CpG group, the number of CD4
+
T, CD8
+
T, and NK cells in the tumors showed a significant increase. Taken together, our study suggested that FeNP/CpG particle intratumoral injection may be a potential tumor immunotherapy strategy.
In recent years, treatment strategies based on nucleic acids have become one of the important areas of tumor treatment. The negative charge of the lipid bilayer of cell membranes makes it difficult for nucleic acid drugs with the same charge to pass through the cell membrane into the cell. Thus, APTES-modified Fe3 O4 as a safe and efficient delivery system is expected to be used for other nucleic acid drugs to contribute to the carrier solution.
Conclusion
In summary, magnetic APTES-modified Fe3 O4 particles (FeNP) were used to deliver CpG adjuvants via intratumoral injection to treat C26 colon carcinoma and 4T1 breast cancer, with enhanced antitumor ability over that of free CpG. The prepared FeNPs showed high stability, low toxicity, and high transfection ability for CpG in vitro and in vivo. Our results demonstrated the potential capacity of FeNP particles in non-viral nucleic acid drug delivery and offered an alternative strategy for CpG immunotherapy.
