Pengiriman Doxorubicin Tertarget dengan Liposom Disfungsionalisasi Aptamer Anti-EpCAM: Efektivitas pada Model Kanker Kolon C26

Abstrak

Dalam penelitian ini, kami melakukan fungsionalisasi permukaan PEGylated-nanoliposomal doxorrubicin (DOX) dengan aptamer anti-EpCAM (molekul asersi sel epitelial) melalui penambahan pasca (post-insertion) dari konjugat aptamer anti-EpCAM-DSPE-mPEG₂₀₀₀ ke dalam Caelyx® (ED-lip). Ukuran, muatan, profil pelarutan, serta sitotoksikasi dan penyerapan seluleri formulasi diuji. Karakterisasi ED-lip menunjukkan peningkatan kecil pada ukuran dan PDI, serta penurunan potensial zeta yang mengindikasikan bahwa penambahan pasca berhasil dilakukan. Hasil citometri aliran dan mikroskopi fluoresens menunjukkan bahwa ED-lip meningkatkan laju penyerapan sel pada sel C26 dibandingkan Caelyx®. ED-lip juga memberikan efek sitotoksik yang lebih kuat dibandingkan Caelyx®, yang menunjukkan efektivitas aptamer anti-EpCAM sebagai ligand target. Data farmakokinetik dan distribusi jaringan formulasi pada tikus yang membawa tumor C26 menunjukkan bahwa ED-lip tidak mengubah profil distribusi DOX dibandingkan Caelyx® pada model hewan. Selain itu, ED-lip secara efektif meningkatkan akumulasi DOX pada tumor dan mempromosikan kelangsungan hidup hewan dibandingkan Caelyx®. Hasil ini menunjukkan bahwa fungsionalisasi Caelyx® dengan aptamer anti-EpCAM menjanjikan dalam pengobatan kanker dan patut untuk diteliti lebih lanjut.

Pendahuluan

Sistem pengiriman obat nano (NDDS) dengan ukuran 100–200 nm terakumulasi secara pasif di mikroenvironment tumor melalui efek permeabilitas dan retensi yang ditingkatkan (EPR). Hal ini terjadi melalui lapisan endotel yang longgar dan drainase limfatik yang lemah. Namun, data terbaru menunjukkan bahwa kurang dari 1% obat yang di administrasi dapat sampai ke situs tumor [1]. Kurangnya kemampuan untuk menembus matriks selular ekstra (ECM) tumor yang padat, pengembalian obat yang dilepaskan ke sirkulasi, dan heterogenitas tumor adalah alasan kegagalan ini [2]. Berbagai strategi telah digunakan untuk meningkatkan akumulasi tumor NDDS menggunakan stimulus endogen dan eksogen [3]. NDDS ini dapat merespons stimulus eksogen seperti cahaya dan memiliki kapasitas untuk digunakan dalam citra tumor [4]. Terdapat banyak nanomaterial anorganik yang memiliki kemampuan untuk digunakan sebagai agen antikanker [5, 6]. Namun, dalam hal nanomaterial anorganik, perhatian harus diberikan pada toksisitas dan keamanan lingkungan mereka [7, 8, 9, 10, 11].

Pengiriman target aktif adalah pendekatan penting yang membantu NDDS untuk mengirimi agen terapeutis secara lebih efisien ke tumor sambil meminimalkan paparan pada jaringan non-target [12, 13]. Agen target ideal untuk pengiriman target adalah molekul yang memiliki affinensi terhadap protein atau reseptor permukaan sel yang diekspresi lebih tinggi oleh sel atau komponen jaringan tertentu [14].

Molekul asersi sel epitelial (EpCAM) adalah glikoprotein transmembran yang dianggap sebagai kandidat ligand untuk target aktif. Temuan terbaru menunjukkan bahwa EpCAM memiliki ekspresi rendah pada sel epitelial sehat, sedangkan pada sel kanker ekspresinya menjadi lebih tinggi (hingga 1000 kali lipat) [15, 16, 17]. Selama perkembangan kanker, pola ekspresi EpCAM berubah dari membrane basal dan basolateral pada epitel normal menjadi permukaan apical pada sel epitelial tumor [18]. Ekspresi diferensial ini membuat EpCAM sebagai ligand yang sangat menarik untuk pengiriman obat yang dapat meningkatkan indeks terapeutis obat [19].

EpCAM terbukti sebagai marker sel root kanker (CSC) atau sel inisiasi tumor (TIC), yang ekspresinya pada kanker berkaitan dengan prognosis buruk [20]. CSC atau TIC adalah sel yang memiliki kemampuan pembaruan diri, kemampuan untuk menghasilkan lebih banyak sel jenis yang sama, yang memiliki peran kunci dalam perkembangan dan metastasis tumor [21]. Overekspresi EpCAM telah dilaporkan pada CSC dari berbagai tumor padat [22]. Akhirnya, aptamer telah menarik perhatian yang besar dalam berbagai bidang penelitian dan muncul sebagai molekul yang potensial kuat yang dapat digunakan dalam NDDS sebagai ligand target [23, 24]. Aptamer adalah sekuens nukleotida berbasis DNA atau RNA yang memiliki struktur sekunder dan tersier yang memiliki affinensi terhadap target mereka seperti reseptor permukaan sel [23, 24]. Aptamer juga memiliki beberapa keuntungan, misalnya, mereka non-imunogenik dan memiliki bobot molekuler rendah (8–25 kDa) dengan stabilitas kimia dan termal. Selain itu, sintesis dan modifikasi kimianya berbiaya rendah dan dapat diskalakan [25]. Targeting selektif NDDS melalui aptamer spesifik anti-EpCAM dapat dianggap sebagai opsi target yang efektif untuk mengirimi agen kemoterapi ke mikroenvironment tumor [19, 26]. Hal ini, berbagai studi menunjukkan bahwa nanokarier yang difungsionalisasi aptamer anti-EpCAM dapat secara efektif meningkatkan pengiriman obat antikanker ke sel tumor [15, 27, 28].

Tujuan penelitian ini adalah mengembangkan nanoliposom yang difungsionalisasi DNA aptamer anti-EpCAM (SYL3C)-PEGylated dan dimuat doxorrubicin (DOX) (ED-lip) sebagai model NDDS. Fungsionalisasi dilakukan melalui kimia coupling EDC/NHS antara grup amina aptamer dan grup karboksil DSPE-mPEG₂₀₀₀, yang ditambahkan pasca ke dalam liposom seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. ED-lip dikarakterisasi untuk ukuran, potensial zeta, dan persentase enkapsulasi doxorrubicin, profil pelarutan, dan sitotoksikasi. Kemudian, kami mengevaluasi apakah ED-lip ini dapat meningkatkan penyerapan sel in vitro dan mengirimi DOX ke tumor melalui targeting pada tikus yang membawa tumor kanker kolon C26.

Pengiriman Doxorubicin Tertarget dengan Liposom Disfungsionalisasi Aptamer Anti-EpCAM: Efektivitas pada Model Kanker Kolon C26 — Persiapan Caelyx® difungsionalisasi anti-EpCAM (ED-lip). a Penghubungan aptamer anti-EpCAM ke DSPE-mPEG₂₀₀₀ melalui ikutan kovalen amina primer (-NH2) aptamer anti-EpCAM ke grup karboksil (-COOH) DSPE-mPEG₂₀₀₀. b Metode penambahan pasca untuk persiapan Caelyx® difungsionalisasi anti-EpCAM (ED-lip)

Hasil dan Pembahasan

Caelyx®, doxorrubicin liposom PEGylated, adalah salah satu agen kemoterapi yang paling banyak digunakan dan adalah nanopartikel pertama yang disetujui FDA yang diindikasikan untuk pengobatan kanker ovarium, sarkoma Kaposi terkait AIDS, dan multiple mieloma. Caelyx® menembus ke situs tumor secara pasif melalui efek EPR [29]. Meskipun Caelyx® secara signifikan telah meningkatkan farmakokinetik dan setengah hayat DOX; namun, keterbatasan utama Caelyx® adalah penyerapan sel yang tidak memadai dan laju pelarutan obat yang rendah pada situs tumor [29]. Di sini, kami menggunakan aptamer SYL3C sebagai ligand target untuk difungsionalisasi doxorrubicin liposom (ED-lip) untuk menargetkan molekul EpCAM pada permukaan sel kanker, yang memungkinkan pengiriman DOX ke situs target spesifik melalui proses target aktif.

Konjugasi DSPE-mPEG₂₀₀₀ ke Aptamer

Dalam penelitian saat ini, kami menggunakan kimia coupling EDC/NHS untuk konjugasi aptamer anti-EpCAM yang difungsionalisasi amina ke grup karboksil aktif DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH. Keuntungan reaksi coupling ini menggunakan kimia coupling EDC/NHS dan pembentukan ikatan amida adalah stabilitasnya dan pengurangan interaksi tidak spesifik di antara aptamer [30]. Aptamer dapat dimodifikasi dengan grup amina primer atau tiol dan dikonjugasi kovalent ke grup karboksil atau pirrol aktif maleimida, masing-masing [31]. Aptamer yang dimodifikasi dengan grup tiol dikonjugasi ke grup fungsional maleimida DSPE-PEG₂₀₀₀. Kemudian, DSPE-PEG₂₀₀₀-aptamer ditambahkan pasca ke struktur liposom untuk menghias permukaan luar liposom [32]. Satu keterbatasan penting dengan kimia maleimida tiol adalah bahwa selama penyimpanan, grup tiol aptamer dapat terpengaruh oleh oksidasi dan mengakibatkan pembentukan ikatan disulfide (S-S) di antara dua aptamer yang dimodifikasi tiol. Aptamer dimer ini tidak dapat bereaksi dalam reaksi konjugasi dengan grup fungsional maleimida DSPE-PEG₂₀₀₀ [30]. Oleh karena itu, penggunaan reaksi EDC/NHS meningkatkan hasil produk dan meningkatkan metode penambahan pasca.

Aptamer memiliki beberapa keuntungan dibandingkan antibodi, termasuk kemudahan sintesis dan penskalaan, toksisitas sistemik rendah, dan kurangnya imunogenisitas [33]. Di sini, setelah konjugasi aptamer ke lipid, metode penambahan pasca digunakan untuk membuat Caelyx® dihiasi aptamer anti-EpCAM (ED-lip). Secara umum, teknik penambahan pasca adalah metode sederhana dan efektif untuk melampirkan aptamer ke permukaan liposom dan memberikan tingkat integrasi aptamer ke dalam liposom yang lebih tinggi [34].

Kami menggunakan uji pergeseran mobilitas elektroforesis gel untuk evaluasi penambahan pasca aptamer anti-EpCAM pada liposom. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, aptamer yang bermuatan negatif bermigrasi dalam gel dan pita mereka terlihat sementara tidak ada pita sebanding untuk formulasi ED-lip, karena ED-lip terjebak di garis sumur dan tidak dapat bergerak melalui gel. Hasil ini menunjukkan bahwa miksel yang dikonjugasi aptamer berhasil ditambahkan pasca ke permukaan liposom.

Karakterisasi Fisikokimia ED-lip

Karakterisasi fisikokimia Caelyx® dan ED-lip ditunjukkan dalam Tabel 1. Ukuran dan muatan formulasi yang disiapkan menunjukkan bahwa modifikasi Caelyx® dengan aptamer anti-EpCAM tidak memiliki efek signifikan pada ukuran partikel (p > 0,05). Ukuran liposom sebelum penambahan aptamer (Caelyx®) sekitar 96 nm dengan PDI 0,11, setelah penambahan pasca (ED-lip) ukuran liposom sebagian meningkat menjadi 117 nm dengan PDI 0,14 yang memiliki ukuran yang diinginkan untuk pengiriman ke tumor. Hasil studi sebelumnya juga menunjukkan bahwa integrasi ligand target mengakibatkan peningkatan ukuran dan PDI liposom [35, 36]. Selain itu, potensial zeta ED-lip (−19,25) menjadi lebih negatif dibandingkan Caelyx® (−12). Ditunjukkan bahwa konjugasi aptamer RNA ke dalam liposom mengakibatkan penurunan potensial zeta liposom [37]. Peningkatan ukuran dan potensial zeta negatif ED-lip dapat menjadi bukti keberhasilan penambahan pasca aptamer terkonjugasi pada permukaan liposom [38]. Hasil ini konsisten dengan studi kami sebelumnya yang menunjukkan bahwa melampirkan aptamer ke permukaan Caelyx® mengakibatkan peningkatan kecil pada ukuran partikel dan potensial zeta yang lebih negatif pada Caelyx® yang difungsionalisasi aptamer [38, 39]. Namun, efektivitas penambahan pasca harus diuji dalam hal waktu inkubasi dan suhu untuk mencapai liposom yang ditambahkan pasca lebih efisien dengan ukuran dan PDI yang lebih baik. Efisiensi enkapsulasi Caelyx® dan ED-lip adalah 100% (lihat Tabel 1).

Jumlah aptamer yang ditambahkan pasca pada permukaan liposom ditentukan seperti yang dijelaskan [6]. Jumlah total konten fosfolipid formulasi liposom yang ditentukan dengan uji fosfat adalah 14 mM. Karena jumlah rata-rata molekul lipid dalam liposom dengan ukuran rata-rata 100 nm adalah 8× 10⁴, jumlah liposom dalam setiap mililiter adalah hampir 10¹⁴ [38]. Bobot molekuler aptamer adalah g/mol. Jumlah DSPE-mPEG₂₀₀₀-aptamer ditentukan berdasarkan metode uji fosfat di mana mol molekul fosfat sesuai dengan mol molekul terkonjugasi. Berdasarkan data ini, jumlah molekul aptamer dalam setiap mililiter larutan aliquot adalah 10¹⁵.

Profil Pelarutan DOX

Penyisipan miksel yang dikonjugasi aptamer ke permukaan luar Caelyx® mungkin mempengaruhi profil pelarutan DOX. Oleh karena itu, kami mengevaluasi pelarutan DOX dari ED-lip dibandingkan Caelyx® dalam 5% dextrosa dengan 50% FBS. Medium ini dapat meniru perilaku pelarutan formulasi dalam plasma [40]. Gambar 3 menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan signifikan dalam pelarutan DOX dari formulasi Caelyx® dan ED-lip selama 24 jam penelitian dan hanya jumlah DOX yang sangat kecil yang dilepaskan. Hal ini konsisten dengan studi kami sebelumnya yang menunjukkan bahwa penyisipan aptamer ke permukaan liposom tidak mempengaruhi stabilitas membran dan profil pelarutan DOX [38, 39]. Ini terutama karena stabilitas formulasi Caelyx® yang diformulasikan menggunakan metode pemuatan jarak jauh driven gradien pH [41].

Interaksi Sel dan Penyerapan Sel oleh Mikroskopi Fluoresens

Interaksi sel dan penyerapan sel formulasi liposom dievaluasi pada 4 °C dan 37 °C dan ditunjukkan pada Gambar 4. Evaluasi efektivitas targeting ED-lip menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan antara intensitas fluoresens rata-rata (MFI) sel CHO-K1 yang dirawat dengan Caelyx® dan ED-lip pada 4 °C dan 37 °C (Gambar 4a, c). Namun, data menunjukkan bahwa ED-lip target secara signifikan memiliki penyerapan yang lebih tinggi oleh sel C26 dibandingkan Caelyx® pada 4 ° dan 37 °C (Gambar 4b, d) yang secara signifikan statistik pada 37 °C (p < 0,0001). ED-lip memiliki penyerapan signifikan dibandingkan Caelyx® (p < 0,001). Hasil ini menunjukkan bahwa ED-lip meningkatkan spesifitas target karena aptamer anti-EpCAM memiliki affinensi yang lebih tinggi terhadap sel C26 dibandingkan sel CHO-K1. DOX bebas melalui lapisan lipid secara bebas dan masuk ke sel sehingga memiliki penyerapan sel tertinggi di antara formulasi dan consequently memiliki sitotoksikasi tertinggi. Dalam hal Caelyx®, PEGylation membatasi laju endositosis dan menghasilkan penurunan sitotoksikasi. Namun, kehadiran aptamer anti-EpCAM pada permukaan liposom (ED-lip) meningkatkan laju internalisasi formulasi ke dalam sel dan meningkatkan sitotoksikannya dibandingkan Caelyx® [38]. Data mikroskopi fluoresens menunjukkan bahwa perbedaan antara penyerapan seluler ED-lip dan DOX bebas pada sel C26 pada 37 °C tidak signifikan (Gambar 5). Namun, penskalaan berdasarkan intensitas DOX internal yang ditunjukkan pada Tabel 2 di mana baik ED-lip maupun DOX menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dengan Caelyx® pada penyerapan seluler C26 (p < 0,001). Meskipun sel C26 mengekspresi tingkat EpCAM yang rendah pada permukaannya [42], data studi ini menunjukkan bahwa kehadiran aptamer anti-EpCAM dapat meningkatkan laju proses internalisasi liposom [43].

Studi Sitotoksikasi

Efek sitotoksikasi DOX bebas, Caelyx®, dan formulasi ED-lip ditunjukkan pada Gambar 6. Berbagai konsentrasi formulasi digunakan untuk merawat sel selama 1, 3, dan 6 jam dan diizinkan untuk menginkubasi selama 72 jam berikutnya. Data menunjukkan bahwa semua formulasi memiliki efek pada sel secara waktu dan dosis tergantung. Kehidupan sel C26 yang dirawat dengan formulasi ED-lip menurun dibandingkan sel yang dirawat Caelyx®. Karena sel CHO-K1, sebagai sel negatif EpCAM, menunjukkan respons yang lebih rendah terhadap ED-lip dibandingkan sel C26, tampaknya aptamer anti-EpCAM meningkatkan pengiriman spesifik Caelyx® ke sel target. Hasil ini dapat mengonfirmasi penyerapan seluler spesifik ED-lip oleh sel C26. Hasil ini menekankan pentingnya penggunaan pengiriman obat target dengan agen target spesifik untuk pengiriman obat selektif ke sel target dengan mengurangi efek samping obat dengan menghindari target tidak sasaran [44]. Seperti yang telah dilaporkan sebelumnya, target aktif Caelyx® dengan ligand target spesifik seperti aptamer dan antibodi mengarah pada peningkatan target tumor aktif dan pengiriman obat spesifik ke sel target yang pada gilirannya meningkatkan efektivitas terapeutis DOX [35, 39].

Distribusi Jaringan dan Farmakokinetik

Untuk mengevaluasi bagaimana aptamer anti-EpCAM mempengaruhi distribusi DOX, kami menginjeksi dosis 10 mg/kg ED-lip dan Caelyx® pada tikus yang membawa tumor kanker kolon C26 subkutan. Konsentrasi DOX dalam plasma pada 3, 12, 24, 48, dan 72 jam setelah injeksi dengan Caelyx® dan ED-lip ditunjukkan pada Gambar 7. Hasil menunjukkan bahwa perilaku konsentrasi DOX plasma pada kedua grup serupa dan tidak ada perbedaan signifikan di antara kedua formulasi. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3, konjugasi aptamer anti-EpCAM ke permukaan liposom sedikit mengurangi setengah waktu sirkulasi dari 39,3 jam menjadi 34,2 jam dan MRT dari 47,6 menjadi 42,9 jam (lihat Tabel 3). Parameter farmakokinetik menunjukkan bahwa konjugasi aptamer anti-EpCAM pada liposom sedikit mengurangi t_½ dan MRT yang konsisten dengan laporan sebelumnya yang menunjukkan bahwa konjugasi aptamer pada permukaan liposom mempercepat pembersihan liposom [38]. Adsorpsi protein dan pembersihan konsekuensial oleh sistem fagosit mononuclear (MPS) dapat menjadi alasan percepatan pembersihan darah nanopartikel yang dikonjugasi ligand [45].

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8, konsentrasi DOX pada organ utama yang dipanen pada grup yang menerima Caelyx® dan ED-lip dibandingkan. Efek samping utama DOX bebas adalah kardiotoksisitas yang Caelyx® secara signifikan mengurangi risiko efek samping ini [46]. Distribusi ED-lip pada hati, paru-paru, dan limpa secara signifikan lebih tinggi dibandingkan Caelyx® pada waktu 3 jam. Kehadiran pembuluh darah bocor dan peningkatan ukuran serta PDI ED-lip setelah penambahan pasca dapat menjadi alasan lebih banyak akumulasi ED-lip pada jaringan ini pada waktu lebih awal. Ditunjukkan bahwa peningkatan ukuran nanopartikel menjadi 150 nm meningkatkan akumulasi nanopartikel pada hati, paru-paru, dan limpa [47]. Sementara itu, hasil studi distribusi jaringan secara jelas menunjukkan mekanisme EPR dalam akumulasi nanopartikel pada tumor. Gambar 8 secara jelas menunjukkan bahwa baik ED-lip maupun Caelyx® secara bertahap mengakumulasi di situs tumor dan mencapai maksimum pada sekitar 12 jam, tetap plat hingga 24 jam dan kemudian menurun pada 48 dan 72 jam, secara bertahap. Menariknya pada semua titik waktu 3, 12, 24, 48, dan 72 jam; akumulasi ED-lip pada tumor secara signifikan lebih banyak dibandingkan Caelyx®, yang dapat disebabkan oleh efektivitas target aktif dengan aptamer anti-EpCAM. Hasil ini menunjukkan bahwa pemasangan aptamer pada permukaan liposom tidak mempengaruhi distribusi DOX pada ginjal. Oleh karena itu, tampaknya aptamer anti-EpCAM secara efektif mempromosikan penetrasi spesifik tumor liposom yang juga dapat disebabkan oleh overexpression molekul EpCAM pada sel endotel vaskular tumor [48]. Sebelumnya, telah ditunjukkan bahwa aptamer anti-EpCAM dapat meningkatkan penetrasi tumor pada tumor xenograft [49]. CSC atau TIC juga merupakan target terapi anti-EpCAM. Administrasi aptamer anti-EpCAM sebagai ligand target untuk menargetkan EpCAM menunjukkan efek menjanjikan dalam menargetkan CSC [22, 50]. Di sini, dapat disarankan bahwa sebagian dari efek antitumor efisien ED-lip dapat disebabkan oleh targeting CSC yang berhasil.

Aktivitas Antitumor In Vivo

Efektivitas terapeutis ED-lip dievaluasi pada model tumor kanker kolon C26. Ukuran tumor, berat badan, dan kelangsungan hidup dipantau selama hampir 2 bulan dan hasilnya diringkas pada Gambar 9 dan Tabel 4. Data menunjukkan bahwa ED-lip tidak memiliki pengaruh yang jelas terhadap berat badan tikus serta Caelyx® (lihat Gambar 9a). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 9b, setelah injeksi intravena Caelyx® dan ED-lip, laju pertumbuhan tumor secara efisien terhambat hingga hari 30 pasca injeksi, dan tidak ada perbedaan signifikan di antara grup liposom. Setelah 30 hari pasca-injeksi, laju pertumbuhan tumor bercepat, namun laju pertumbuhan di grup yang menerima obat masih lebih lambat dibandingkan grup yang menerima PBS. Perbedaan antara grup Caelyx® dan ED-lip tidak signifikan selama 30 hari pasca-injeksi. Hasil kelangsungan hidup ditampilkan dalam plot Kaplan–Meier. Gambar 9c menunjukkan ED-lip meningkatkan kurva kelangsungan hidup dibandingkan PBS atau Caelyx®. Indikator utama studi kelangsungan hidup diringkas pada Tabel 4. Tumor pada tiga tikus dari grup ED-lip sembuh sepenuhnya sehingga MST untuk grup ini tidak terdefinisi. Pengobatan dengan ED-lip meningkatkan TTE dari 41,1 menjadi 49,7 hari dan menghasilkan aktivitas antitumor yang efektif dengan TGD 90,27% dengan MST yang tidak terdefinisi karena pengeringan tumor sepenuhnya pada tiga tikus (lihat Tabel 4).

Data ukuran tumor menunjukkan bahwa ED-lip dapat secara dramatis menghambat pertumbuhan tumor. Hasil analisis kelangsungan hidup menunjukkan bahwa pengobatan dengan ED-lip meningkatkan MST dan TTE. Grup yang menerima ED-lip memiliki persentase TGD yang lebih besar dan lebih efektif dibandingkan Caelyx®. Temuan kami konsisten dengan tingkat konsentrasi DOX yang tinggi pada jaringan tumor grup yang dirawat ED-lip. Oleh karena itu, doxorrubicin liposom yang dikonjugasi aptamer meningkatkan penetrasi mereka dan consequently meningkatkan akumulasi obat pada situs tumor, yang pada gilirannya mengarah pada peningkatan efektivitas Caelyx® dan TGD% yang lebih tinggi pada data kelangsungan hidup. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa aptamer anti-EpCAM dapat berfungsi sebagai agen target yang penting untuk pengiriman obat.

Kesimpulan

Di sini, kami telah difungsionalisasi permukaan Caelyx® dengan aptamer anti-EpCAM (SYLC3) melalui penambahan pasca (ED-lip). Citometri aliran dan mikroskopi fluoresens menunjukkan tingkat penyerapan DOX yang tinggi pada sel C26 yang mengindikasikan bahwa aptamer dapat meningkatkan laju proses internalisasi ED-lip. Data farmakokinetik menunjukkan bahwa penambahan pasca DSPE-mPEG-EpCAM tidak mengubah farmakokinetik DOX dibandingkan Caelyx®. Namun, distribusi jaringan menunjukkan bahwa lebih banyak akumulasi tumor ED-lip dibandingkan Caelyx® bahkan setelah 72 jam pasca-injeksi. Kami menunjukkan bahwa ED-lip memiliki efek terapeutik yang ditingkatkan pada tikus yang membawa tumor C26. Parameter kelangsungan hidup yang ditingkatkan pada tikus yang dirawat ED-lip menunjukkan bahwa liposom DOX target-EpCAM adalah pengiriman obat yang menjanjikan untuk pengobatan kanker dan patut untuk diteliti lebih lanjut.

Bahan dan Metode

Bahan

Aptamer DNA anti-EpCAM 5′-Amine (sekuens 5′ -CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3′) (SYL3C) dibeli dari BIONEER (perusahaan bioteknologi, Daejeon, Korea Selatan). DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH dibeli dari Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Dowex®, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimida (EDC), N-Hidroxisuksinimida (NHS), penicillin streptomycin dan Fluoroshield™ dengan DAPI dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Caelyx® yang tersedia secara komersial dibeli dari Perusahaan Behestan Darou (Tehran, Iran).

Konjugasi DSPE-mPEG₂₀₀₀ ke Aptamer

Aptamer anti-EpCAM dihubungkan ke DSPE-mPEG₂₀₀₀ melalui ikutan kovalen amina primer (-NH2) aptamer anti-EpCAM ke grup karboksil (–COOH) DSPE-mPEG₂₀₀₀ (Gambar 1). Konjugasi dilakukan melalui kimia coupling EDC/NHS [51]. Secara singkat, DSPE-mPEG₂₀₀₀ dispersi dalam larutan penyangga asam 2-(N-morfolino)etanosulfat (MES) (pH 6,5) dan EDC/NHS 400 mM EDC dan 100 mM NHS ditambahkan ke dispersi. Dispersi diaduk selama 15 menit untuk mengaktifkan grup karboksil lipid. Kemudian, aptamer anti-EpCAM ditambahkan ke dispersi dan diaduk selama 2 jam berikutnya pada suhu ruang dalam kegelapan. Rasio molar lipid:aptamer anti-EpCAM adalah 1:1 dan rasio molar EDC/NHS adalah 10 kali lipat lipid.

Modifikasi Caelyx® dengan Aptamer DSPE-mPEG-Anti-EpCAM

ED-lip disintesis dengan metode penambahan pasca. Untuk melakukan penambahan pasca, miksel DSPE-mPEG-aptamer anti-EpCAM ditambahkan ke 1 ml caelyx® selama 30 menit pada 60 °C. Jumlah DSPE-mPEG-aptamer EpCAM ditentukan sesuai uji fosfat Bartlett [52]. Berdasarkan jumlah aproksimasi liposom per mililiter caelyx® yang sekitar 10¹⁴, volume DSPE-mPEG-aptamer anti-EpCAM disesuaikan untuk mencapai 10 aptamer per setiap liposom [36]. Elektroforesis gel agaros digunakan untuk mengonfirmasi penambahan pasca [39].

Karakterisasi Fisikokimia

Ukuran partikel, indeks polidispersi (PDI), dan muatan permukaan ditentukan dengan alat Dynamic Light Scattering (DLS) (Nano-ZS; Malvern, Inggris). Untuk menghapus DOX bebas, liposom dicampur dengan harsin Dowex® dan diputar selama 60 menit dan dijalankan melalui kolom Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories Inc.) untuk menghapus Dowex® [53]. Jumlah DOX dalam formulasi liposom ditentukan menggunakan spektrofotometer fluoresensi LS-45 (Perkin-Elmer, Inggris), (penguapan: emisi 485:590 nm).

Studi Pelarutan

Untuk mengevaluasi pelarutan DOX, 1 ml formulasi ditambahkan ke 9 ml dextrosa (dengan 50% serum fetus sapi (FBS)) dan pada interval waktu tertentu (0, 1, 2, 4, 6, 12, dan 24 jam), sampel diambil. Setelah menghapus DOX bebas dengan harsin Dowex® jumlah obat yang tersisa dalam liposom ditentukan oleh spektrofotometer fluoresensi dan persentase pelarutan dihitung [39].

Budidaya Sel

Garis sel kanker kolon C26 dan hamster ovarium China (CHO-K1) dibeli dari Institut Pasteur Iran. Garis sel dibudidayakan dalam medium RPMI1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS yang diperoleh dari Gibco (Thermos Fisher Scientific, AS) dan 100 IU/ml penicillin, dan 100 mg/ml streptomycin. Sel diinkubasi pada 37 °C dengan atmosfer 5% CO₂ dan 95% udara yang disertasi kelembaban.

Uji Interaksi Sel dan Penyerapan Selular

Interaksi sel dan penyerapan sel formulasi dievaluasi pada 4 °C dan 37 °C, masing-masing. Dua garis sel, CHO-K1 dan C26, dipilih dalam uji ini. Sel ditanam di setiap sumur piring 12-sumur (2,5 × 10⁵ per sumur). Setelah menginkubasi selama malam hari pada 37 °C, perawatan ditambahkan ke sel dan piring ditempatkan pada 4 °C dan 37 °C dan diinkubasi selama 3 jam lagi. Kemudian sel dicuci dengan PBS dan ditripsin. Intensitas fluoresensi untuk DOX ditentukan menggunakan citometri aliran (cytometer BD FACSCalibur). Data dianalisis dengan perangkat lunak FlowJo versi 7.0.

Evaluasi Mikroskopi Fluoresens

Jumlah 1 × 10⁶ sel per sumur sel C26 ditanam ke dalam piring 6-sumur di mana selaput kaca mikroskopi steril telah disisipkan. Setelah menginkubasi selama malam hari pada 37 °C dan 5% kelembaban, sel dirawat dengan DOX bebas, Caelyx® dan ED-lip selama 24 jam untuk penyerapan sel yang lengkap [54]. Kemudian sel dicuci dengan PBS dan dikonstanta dengan formaldehida 4%. Selaput kaca diwarnai dengan Fluoroshield™ dengan DAPI dan dipasang pada gelas objek. Perawatan dilakukan secara triplikasi. Dari setiap gelas objek, enam zona dipilih di bawah bidang pembesaran × 200. Fluoresensi intrinsik DOX digunakan untuk evaluasi penyerapan obat sel. Penskalaan dilakukan berdasarkan persentase sel yang menunjukkan penyerapan sel DOX di setiap bidang mikroskopi:

1: 0–20%, 2: 20–40%, 3: 40–60%, 4: 60–80%, dan 5: 80–100%

Evaluasi Sitotoksikasi

Nilai IC50 DOX bebas, caelyx®, dan ED-lip ditentukan dengan uji MTT. Untuk melakukan ini, sel CHO-K1 dan C26 ditanam dengan kepadatan 5 × 10³ sel per sumur dalam piring 96-sumur pada 37 °C. Setelah menginkubasi selama malam hari, formulasi liposom dan larutan DOX bebas diencerkan secara berturut-turut dalam medium bebas FBS dan ditambahkan ke budaya sel dan diinkubasi 1, 3, dan 6 jam pada 37 °C. Kemudian, sel dicuci dan diizinkan untuk menginkubasi 72 jam. Kepadatan optik (OD) diukur menggunakan absorbansi spektrometrik 570 nm terhadap latar belakang 630 nm pada pembaca mikropiring Stat-Fax 2100 (Awareness Technology Inc. AS). Kemudian nilai IC50 dihitung.

Studi Hewan

Tikus BALB/c betina (4–6 minggu, 18–20 g) dipertahankan dalam kandang terpisah pada 22 ± 2 °C dan dirawat dengan diet pelet standar dan air ad libitum. Injeksi intraperitoneal (i.p) ketamin dan xilazin (100 mg/kg ketamin dan 10 mg/kg xilazin) digunakan untuk menganestesi hewan [55]. Jumlah 3 × 10⁵ sel C26 per tikus dalam 60 μl PBS diinjeksi pada sisi kanan, subkutan. Dua minggu setelah inokulasi ketika ukuran tumor tumbuh sekitar 5 mm³, tikus dibagi secara acak menjadi 3 grup (n = 3 untuk distribusi dan n = 5 untuk studi antitumor tikus per grup). Semua protokol eksperimental disetujui oleh komite etika hewan Universitas Ilmu Kesehatan Mashhad dan dilakukan sesuai dengan aturan internasional yang mempertimbangkan hak hewan.

Studi Distribusi dan Farmakokinetik Jaringan

Empatbelas hari setelah inokulasi tumor, tikus dirawat dengan dosis 10 mg/kg caelyx® dan ED-lip secara intravena (i.v.) melalui vena ekor. Grup kontrol menerima 200 μl larutan PBS. Pada interval waktu tertentu (3, 12, 24, 48, dan 72 jam) pasca-injeksi tikus diutanasikan dan sampel darah serta sampel jaringan (hati, limpa, ginjal, paru-paru, jantung, dan tumor) dikumpulkan. Kemudian, konsentrasi doxorrubicin dalam setiap sampel diukur berdasarkan intensitas fluoresensi setiap sampel menggunakan spektrofotometer fluoresensi LS-45 (Perkin-Elmer, Inggris). Konsentrasi doxorrubicin setiap sampel diukur dan analisis non-kompartemen parameter farmakokinetik dihitung dari profil konsentrasi darah versus waktu. Kemudian parameter termasuk kurva konsentrasi-waktu (AUC) dan luas kurva momen pertama (AUMC), setengah hayat (t_1/2), volume distribusi (V_d), C_max, T_max, waktu tinggal rata-rata (MRT), dan pembersihan (Cl) dihitung.

Aktivitas Antitumor In Vivo

Untuk mengevaluasi aktivitas antitumor, 10 hari setelah inokulasi tumor, tikus dengan ukuran tumor dapat diraba menerima dosis tunggal i.v. 10 mg/kg Caelyx® dan ED-lip. PBS diinjeksi pada tikus yang dianggap sebagai kontrol negatif. Parameter termasuk waktu untuk mencapai titik akhir (TTE), persentase penundaan pertumbuhan tumor (TGD), waktu kelangsungan hidup median (MST), dan kelangsungan hidup ditentukan. Selama studi, tikus diamati untuk kesehatan dan perubahan berat badan. Volume tumor juga diukur menggunakan pengukur digital dan dihitung sebagai berikut:

$$ \mathrm{Volume}\ \mathrm{Tumor}=\left(\mathrm{Tinggi}\times \mathrm{Panjang}\times \mathrm{Lebar}\right)\times 0,52 $$

Mempertimbangkan aspek etika, tikus dikeluarkan jika pertumbuhan tumor > 1000 mm³, atau > 20% penurunan berat badan atau tanda kelemahan diamati.

Analisis Statistik

Data dianalisis menggunakan GraphPad Prism 6.0 (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, AS). Data ditunjukkan sebagai rata-rata ± SEM dari setidaknya tiga eksperimen independen. Uji t digunakan untuk mengevaluasi hasil studi pelarutan, citometri aliran, dan distribusi formulasi. ANOVA digunakan untuk mengevaluasi hasil mikroskopi fluoresens dan volume tumor. Metode Kaplan–Meier digunakan untuk menghitung parameter kelangsungan hidup termasuk TTE, MST dan TGD%. P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.