Peptida gH625 vs. Asam Folat: Meningkatkan Serapan Nanopartikel Magnetis Fe3O4 Melintasi Barier Darah-Otak

Abstrak

Kami mengembangkan sintesis dua tahap yang kuat dari nanopartikel magnetis Fe₃O₄ (MNP) yang sudah difungsionalisasi awal dengan monolaier asam fosfonik bifiksi. Platform ini memungkinkan pelepasan kovalent peptida membranotrop gH625, yang dikenal karena sifatnya yang mampu menembus sel secara efisien, dan sebagai referensi, lapisan PEG/folat/rhodamin (PEG,FA@MNPs) disiapkan. Mikroskopi konfokal laser pemindaian pada sel endotel mikrovascular otak manusia yang diimmortalkan (HBMECs) mengungkapkan bahwa, setelah 24 jam, MNP yang dihiasi gH625 diserap hampir dua kali lebih efisien dibandingkan partikel yang difungsionalisasi folat. Kedua kimia permukaan dengan mudah diserap oleh sel glioblastoma A-172, yang menunjukkan bahwa gH625 tidak menargetkan sel tumor. Temuan ini menunjukkan bahwa difungsionalisasi gH625 adalah strategi yang menjanjikan untuk pengiriman nanostruktur magnetis melintasi barier darah-otak (BBB) dan ke dalam sel tumor otak.

Latar Belakang

BBB adalah antarmuka yang sangat selektif yang melindungi sistem saraf pusat tetapi juga menghambat pengiriman obat. Sel endotel, astrosit, dan sel peri sel membentuk lapisan tunggal yang terhubung erat yang mengecualikan ~98% molekul kecil dan semua terapi besar dari otak. Penawa berbasis nanopartikel, terutama nanopartikel magnetis oksida besi MNP, menawarkan keuntungan unik—manipulasi magnetik, citra, dan kompatibilitas biologis—namun kemampuannya untuk melintasi BBB tetap terbatas.

Peptida mampu menembus sel (CPP) seperti gH625 (20 residu, berasal dari glikoprotein H HSV-1) telah menunjukkan kemampuan melintasi membran yang luar biasa dan telah berhasil digunakan untuk mengangkut muatan melintasi BBB. Sebaliknya, asam folat (FA) adalah ligan yang sudah terbukti untuk menargetkan reseptor folat yang overexpressed pada banyak tumor, termasuk glioblastoma, namun efektivitasnya untuk penetrasi BBB lebih rendah.

Metode

Bahan-bahan

Semua reagien, termasuk FeCl₂·4H₂O, FeCl₃·6H₂O, asam 3-aminopropilfosfonik, PEG-NHS (MW 5 kDa), FA, NHS, dan Rhod-NHS, dibeli dari Sigma-Aldrich dan digunakan sebagaimana adanya. Air Milli-Q (18,2 MΩ cm) digunakan sepanjang waktu.

Sintesis MNP Fe₃O₄

Nanopartikel Fe₃O₄ diperoleh melalui co-precipitasi alkaline (Fe³⁺:Fe²⁺ = 2:1) pada 80 °C di bawah N₂. Suspensi coklat kehokohan yang dihasilkan dicuci, dipisahkan secara magnetik, dan dikeringkan.

Difungsionalisasi Asam Fosfonik (NH₂@MNPs)

200 mg MNP polos disperdi dalam 25 mL air, diultrasonikasi selama 30 min, dan bereaksi dengan 100 mg asam 3-aminopropilfosfonik (NH₂-PA) selama 2 jam pada suhu ruangan. Setelah pemisahan magnetik dan pencucian yang menyeluruh, NH₂@MNPs diperoleh.

Konjugasi gH625 (gH625@MNPs)

300 mg NH₂@MNPs dicampur dengan 1,2 mg gH625 yang dilabeli NBD dalam 20 mL DMSO dan diinkubasi selama semalaman pada 25 °C. Pemisahan magnetik dan pencucian menghasilkan gH625@MNPs.

Konjugasi PEG/FA/Rhodamin (PEG,FA@MNPs)

300 mg NH₂@MNPs bereaksi dengan 30 mg PEG-NHS, 3 mg FA-NHS, dan 3 mg Rhod-NHS dalam 15 mL DMSO selama semalaman. Setelah pemisahan magnetik dan pencucian, PEG,FA@MNPs dikumpulkan.

Karakterisasi

XRD mengonfirmasi fase campuran magnetit/maghemit (a = 8,389 Å, ukuran kristal ≈ 11 nm). XPS memverifikasi penegakan fosfonat dan rasio Fe³⁺/Fe²⁺ yang terpelihara. FT-IR menunjukkan pita P–O–Fe karakteristik (1040 cm⁻¹) dan sinyal amida (1650 cm⁻¹). UV/Vis PEG,FA@MNPs menampilkan puncak serapan FA pada 274 nm, mengonfirmasi konjugasi yang berhasil.

Pencaharan cahaya dinamis (PBS, pH 7,4) memberikan diameter hidrodinamis 73 ± 3 nm (NH₂@MNPs), 104 ± 4 nm (gH625@MNPs), dan 51 ± 2 nm (PEG,FA@MNPs). Semua sistem menunjukkan potensi zeta yang sangat negatif (< −30 mV), yang memastikan stabilitas koloidal selama setidaknya 72 jam.

Viabilitas Sel

Uji MTT pada HBMECs dan sel A-172 (10–20 µg mL⁻¹, 24–72 jam) menunjukkan tidak ada sitotoksisitas yang signifikan untuk MNP yang difungsionalisasi keduanya.

Serapan Seluler

HBMEC yang diinkubasi dengan 15 µg mL⁻¹ dari setiap jenis MNP selama 24 jam menunjukkan fluoresensi hijau yang jauh lebih kuat (gH625@MNPs) daripada merah (PEG,FA@MNPs), mengonfirmasi serapan yang superior. Pengukuran kuantitatif menunjukkan peningkatan ~2× dalam fluoresensi seluler dalam gH625@MNPs dibandingkan PEG,FA@MNPs pada 24 jam. Setelah 72 jam, perbedaan mengecil, mungkin karena internalisasi non-spesifik partikel yang dihiasi FA.

Pada sel glioblastoma A-172, serapan gH625@MNPs dan PEG,FA@MNPs setelah 24 jam adalah setara, yang menunjukkan bahwa gH625 tidak merusak penargetan sel tumor.

Kesimpulan

MNP Fe₃O₄ yang difungsionalisasi dengan peptida gH625 melalui penambang asam fosfonik menunjukkan serapan yang jauh lebih baik oleh sel endotel BBB dibandingkan dengan yang difungsionalisasi FA. Platform asam fosfonik memastikan permukaan yang stabil dan sangat negatif serta mempertahankan integritas nanopartikel seiring waktu. MNP yang dihiasi gH625 oleh karena itu merupakan kendaraan yang potente untuk pengiriman obat magnetis melintasi BBB dan ke dalam tumor otak, menawarkan alternatif yang lebih aman dan lebih efisien dibandingkan strategi ligan tradisional.