Perbandingan Antara Asam Folat dan Fungsionalisasi Berbasis Peptida gH625 dari Nanopartikel Magnetik Fe3O4 untuk Peningkatan Internalisasi Sel
Abstrak
Rute sintetis serbaguna berdasarkan magnet Fe3 O4 prafungsionalisasi nanopartikel (MNP) dengan monolayer asam fosfonat telah digunakan untuk mengikat peptida gH625 secara kovalen pada permukaan partikel nano. gH625 adalah peptida membranotropik yang mampu dengan mudah melintasi membran berbagai sel termasuk komponen sawar darah-otak manusia yang khas. Rute sintetik serupa digunakan untuk menyiapkan kelas MNP lain yang memiliki lapisan fungsional berdasarkan PEG, rhodamin, dan asam folat, molekul target yang terkenal, untuk membandingkan kinerja dua sistem penetrasi sel (yaitu, gH625 dan asam folat). AC id). Hasil kami menunjukkan bahwa penyerapan MNP yang didekorasi dengan gH625 dalam sel endotel mikrovaskular otak manusia yang diabadikan setelah 24 jam lebih terbukti dibandingkan dengan MNP yang difungsikan dengan asam folat sebagaimana dibuktikan oleh mikroskop pemindaian laser confocal. Di sisi lain, kedua sistem yang difungsikan terbukti mampu diinternalisasi dalam garis sel tumor otak (yaitu, glioblastoma A-172). Temuan ini menunjukkan bahwa fungsionalisasi MNPs dengan gH625 meningkatkan internalisasi sel endotel, menyarankan strategi yang layak dalam merancang struktur nano fungsional yang mampu pertama melintasi BBB dan, kemudian, mencapai sel-sel otak tumor tertentu.
Latar Belakang
Penghalang darah-otak (BBB) adalah antarmuka dinamis antara darah dan otak yang memainkan peran penting dalam pemeliharaan homeostasis sistem saraf pusat (SSP). Komponen utama BBB adalah sel endotel (yaitu, astrosit dan perisit), yang membentuk lembaran kontinu yang menutupi permukaan bagian dalam pembuluh darah otak. Mereka saling berhubungan oleh persimpangan ketat, yang sangat penting untuk kontrol permeabilitas vaskular BBB [1] dan untuk perlindungan otak dari berbagai racun yang bersirkulasi dan molekul berbahaya lainnya [2, 3]. Neuron dan mikroglia, yang merupakan komponen unit neurovaskular lainnya, memainkan peran berbeda dalam BBB [4, 5].
Karena lembaran sel endotel yang terus menerus, 98% obat molekul kecil dan 100% obat molekul besar tidak melewati BBB, sehingga gagal mengantarkan obat ke jaringan otak [6]. Oleh karena itu, untuk mengembangkan sistem pengiriman yang efisien untuk pengobatan banyak penyakit otak, sangat penting untuk menyelidiki kemampuan pembawa melalui BBB [7].
Dalam dekade terakhir, sistem berbasis nanopartikel telah dipelajari secara luas sebagai agen terapeutik yang efektif untuk penargetan dan terapi kanker. Dalam konteks ini, nanopartikel besi magnetik fungsional organik (MNPs) telah menarik banyak minat karena mereka menggabungkan keserbagunaan fungsionalisasi permukaan dengan sifat magnetik dan sifat biokompatibel non-toksik dari intinya. MNP secara luas diadopsi untuk aplikasi theranostic (diagnostik dan terapeutik) seperti protein dan penyortiran dan manipulasi sel [8, 9], pelabelan sel [10, 11], pengiriman obat yang dikendalikan secara magnetis [12, 13], magnetic resonance imaging (MRI) [14, 15], dan hipertermia [16,17,18,19]. Agar dapat digunakan secara efisien untuk aplikasi biomedis, MNP harus mampu melintasi membran sel dan, khususnya, melewati berbagai hambatan biologis. Modifikasi permukaan MNP dengan molekul fungsional sering digunakan untuk meningkatkan internalisasi selnya, tetapi dalam banyak kasus, persilangan BBB tetap menjadi masalah.
Dalam konteks ini, penggunaan cell-penetrating peptides (CPPs), sekelompok peptida yang relatif pendek (5–40 asam amino) yang berasal dari sumber alami atau dari konstruksi yang dirancang secara sintetis, yang dapat dengan mudah melintasi bilayer membran, dapat dilihat. sebagai pendekatan yang menjanjikan. Di antara banyak CPP yang tersedia, 20-residu peptida gH625, yang diturunkan dari glikoprotein H (gH) dari virus herpes simpleks 1, baru-baru ini dikembangkan dan digunakan untuk melintasi BBB untuk meningkatkan penyerapan berbagai muatan [20, 21] ke dalam sitosol.
Dalam penelitian ini, MNP telah difungsikan dengan dua kelas pelapis penargetan yang berbeda berdasarkan pada lapisan kopling asam 3-aminopropilfosfonat (NH2 -PA). Kedua lapisan diperoleh dengan menghubungkan ke NH2 -MNP yang dimodifikasi PA (NH2 @MNPs) baik molekul penetrasi sel gH625 (gH625@MNPs) atau molekul PEG dan asam folat (PEG,FA@MNPs). Secara khusus, pengenalan asam folat (FA) ke dalam nanopartikel PEGylated bertujuan untuk meningkatkan baik serapan seluler dalam sel tumor melalui internalisasi yang dimediasi reseptor FA [22] dan biokompatibilitas keseluruhan sistem nano [23]. Efek dari dua pelapis permukaan pada penyerapan intraseluler MNP ke dalam sel endotel mikrovaskular primer dari otak manusia (HBMECs) telah dievaluasi dengan mikroskop pemindaian laser confocal. Untuk tujuan ini, probe luminescent dimasukkan ke dalam kedua sistem. Secara khusus, gH625 diberi label dengan probe 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD), sedangkan probe karboksi-X -rhodamine (rhod) probe ditambahkan ke cangkang PEG,FA@MNPs.
Studi tentang serapan intraseluler dari MNP yang dimodifikasi gH625 dalam sel endotel dan perbandingannya dengan MNP yang dimodifikasi FA, sejauh pengetahuan kami, belum pernah dilaporkan sebelumnya.
Selain kemampuan melintasi BBB, penargetan sel tumor otak merupakan persyaratan penting lainnya untuk agen terapi tumor otak. Oleh karena itu, internalisasi seluler dari dua MNP berlapis berbeda di salah satu glioma ganas manusia yang paling umum, glioblastoma A-172, juga dievaluasi.
Perhatikan bahwa meskipun nanopartikel besi yang difungsikan gH625 baru-baru ini disiapkan oleh Perillo et al. [24], dalam karya ini, kami melaporkan strategi sintetis yang berbeda berdasarkan platform asam fosfonat yang sangat serbaguna. Secara khusus, kimia asam fosfonat memungkinkan pembentukan ikatan yang kuat antara MNP dan lapisan tunggal fosfonat yang stabilitasnya sebanding dengan MNP silan. Selain itu, karena self-condensation P-O-P dapat diabaikan, penggunaan phosphonic linker mengatasi kelemahan pembentukan oligomer yang sering ditemui saat menggunakan silane [25].
Metode
Materi
Semua reagen yang digunakan untuk sintesis dan fungsionalisasi MNP, FeCl2 ·4H2 O, FeCl3 ·6H2 O, asam 3-aminopropilfosfonat, asam metoksipolietilen glikol asetat N -succinimidyl ester (PEG-NHS) dengan berat molekul 5000 Da, asam folat, N -hidroksisuksinimida (NHS), dan karboksi-X -rhodamin N -succinimidyl ester (Rhod-NHS) dibeli dari Sigma-Aldrich dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Asam amino yang dilindungi 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) yang digunakan untuk sintesis peptida dibeli oleh Romil Del Chimica, Chemicals, dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Airnya memiliki kadar Milli-Q (18,2 MO cm) dan disaring melalui filter 0,22 m.
Sintesis MNP
MNP oksida besi telanjang disintesis oleh kopresipitasi alkali Fe
3+
dan Fe
2+
, menurut protokol yang dijelaskan dalam literatur [26]. Secara singkat, FeCl2 ·4H2 O dan FeCl3 ·6H2 O (rasio molar 1:2) dilarutkan dalam air (50 ml) di bawah N2 atmosfer dengan pengadukan yang kuat. NH3 25% di H2 O (5 ml) ditambahkan ke dalam larutan pada 80 °C, dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit. Suspensi yang dihasilkan didinginkan sampai suhu kamar dan dicuci dengan air ultra murni. Nanopartikel magnetik telanjang yang diperoleh (MNP telanjang) diisolasi dari pelarut dengan dekantasi magnetik.
Sintesis gH625
Peptida disiapkan seperti yang dilaporkan sebelumnya [27] mengadopsi metode fase padat standar 9-fluorenilmetoksi karbonil (Fmoc). Secara singkat, 50 mol peptida disintesis pada resin Wang (0,75 mmol/g) dengan siklus deproteksi dan kopling berturut-turut. Peptida yang terikat resin kemudian direaksikan dengan 4-kloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl); reaksi dilakukan semalaman dengan adanya DIPEA. Peptida dibelah dari resin dan dideproteksi dengan perlakuan dengan campuran asam trifluoroasetat (TFA) dan pemulung dan setelah diendapkan dalam eter etil dingin. Peptida dilarutkan dalam air dan dikeringkan-beku. Karakterisasi peptida mentah dilakukan dengan ionisasi elektrospray (ESI) LC-MS yang mengadopsi gradien linier asetonitril (0,1% TFA) dalam air (0,1% TFA) dari 20 hingga 80% dalam 15 menit. Kemudian dimurnikan dengan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik preparatif (RP-HPLC).
Sintesis N -Hydroxysuccinimide Ester of Folic Acid (FA-NHS)
FA-NHS disiapkan dengan metode yang diterbitkan berikut [28]. Lima ratus miligram asam folat (FA) dilarutkan dalam 10 ml dimetil sulfoksida (DMSO) dengan 240 ml trietilamina. NHS (260 mg) dan N ,T -dicyclohexylcarbodiimide (470 mg) ditambahkan, dan campuran direaksikan semalaman pada suhu kamar dalam gelap. Produk sampingan, disikloheksilurea, dihilangkan dengan penyaringan. Larutan DMSO kemudian dipekatkan di bawah tekanan tereduksi, dan FA-NHS diendapkan dalam dietil eter. Produk dicuci beberapa kali dengan eter anhidrat dan dikeringkan di udara.
Sintesis MNP yang Difungsikan
Sintesis NH2 @MNP
MNP (200 mg) tersebar di H2 O (25 ml) menggunakan penangas ultrasonik selama 30 menit. NH2 -PA (100 mg) ditambahkan, dan suspensi diaduk selama 2 jam pada suhu kamar. Partikel dipisahkan secara magnetis dan dicuci empat kali dengan H2 O dan kemudian dengan etanol dan dikeringkan di bawah udara.
Sintesis gH625@MNPs
NH2 @MNPs (300 mg) dan gH625 (1,2 mg) didispersikan dalam DMSO (20 ml). Solusinya dicampur semalaman pada suhu 25 °C. Partikel yang diperoleh dipisahkan secara magnetis; dicuci dengan DMSO, H2 O, dan etanol; dan dikeringkan di bawah udara.
Sintesis PEG,FA@MNPs
NH2 @MNPs (300 mg), PEG-NHS (30 mg), FA-NHS (3 mg), dan Rhod-NHS (3 mg) didispersikan dalam DMSO (15 ml), dan larutan dicampur semalaman pada suhu 25 °C . Partikel yang diperoleh dipisahkan secara magnetis; dicuci dengan DMSO, H2 O, dan etanol; dan dikeringkan di bawah udara.
Contoh Karakterisasi
Pengukuran difraksi serbuk sinar-X (XRD) dilakukan dengan θ –θ 5005 Difraktometer Bruker-AXS (Zeiss, Oberkochen, Jerman) menggunakan radiasi Cu Kα yang beroperasi pada 40 kV dan 30 mA. Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) dilakukan dengan spektrometer ESCA-Auger multi-teknik 5600 PHI 5600 dengan sumber sinar-X Al-Kα standar. Analisis dilakukan dengan sudut fotoelektron 45° (relatif terhadap permukaan sampel) dengan sudut penerimaan ± 7°. Skala energi ikat (B.E.) XPS dikalibrasi dengan memusatkan puncak C 1s karena gugus hidrokarbon dan karbon tambahan pada 285,0 eV. Pengukuran UV/Vis dilakukan dengan spektrofotometer UV/Vis JASCO V-560, dan spektrum direkam dengan resolusi ± 0.2 nm. Pengukuran hamburan cahaya dinamis (DLS) dan potensi zeta dari MNP dilakukan pada 25 °C dengan Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) yang dilengkapi dengan laser He–Ne (633 nm) dan detektor hamburan balik (173° ). Pengukuran FT-IR transmisi direkam dengan spektrometer JASCO FTIR 430, menggunakan teknik pelet KBr, dengan 100 pemindaian dikumpulkan per spektrum (rentang pemindaian 560–4000 cm
− 1
, resolusi 4 cm
− 1
).
Budaya Sel
Sel endotel mikrovaskular otak manusia (HBMEC) dan garis sel glioblastoma manusia A-172 ditumbuhkan untuk bertemu dalam labu kultur jaringan berlapis kolagen tipe I, menurut metode yang dilaporkan [29]. Secara singkat, HBMEC ditumbuhkan dalam media sel endotel yang dilengkapi dengan 5% serum janin sapi (FBS) dan 1% suplemen pertumbuhan sel endotel. Garis sel A-172 ditanam di DMEM yang mengandung 2 mM glutamin dan 10% FBS seperti yang dijelaskan sebelumnya [30]. Dalam kedua kasus, 100 U/ml penisilin dan 100 μg/ml streptomisin juga ditambahkan ke dalam biakan.
Uji Viabilitas Sel
Viabilitas sel ditentukan dengan [3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H -tetrazolium bromida] (MTT) tes [31]. Dalam semua kondisi percobaan, konsentrasi FBS dikurangi menjadi 1% (medium kelaparan). Sel-sel diunggulkan dalam pelat 96-sumur pada 7000 sel / sumur untuk mendapatkan kepadatan sel yang optimal selama percobaan. Dalam semua pengujian, sel pertama kali diinkubasi pada 37 °C dengan MTT selama 3 jam; kemudian, isopropanol dengan 0,04 M HCl ditambahkan, dan absorbansi diukur pada 1 jam dalam pembaca pelat (Synergy 2-BioTek) dengan panjang gelombang uji 570 nm [32].
Mikroskopi Confocal
Mikroskop confocal dilakukan pada sel glioblastoma HBMEC dan A-172 yang ditumbuhkan pada kaca penutup mikroskop yang ditempatkan di pelat 24-sumur. Setelah inkubasi dengan atau tanpa MNP, sel difiksasi dengan menambahkan paraformaldehida 4% dalam PBS dan diproses untuk imunositokimia seperti yang dijelaskan sebelumnya [33]. Analisis mikroskop confocal dilakukan dengan mikroskop pemindaian laser confocal (LSM) Olympus FV1000 yang dilengkapi dengan sumber eksitasi berikut:laser dioda (405 nm), laser Ar multiline (457, 488, dan 515 nm), laser HeNe(G) ( 543 nm), dan laser HeNe(R) (633 nm). Sebuah tujuan minyak imersi (60xO PLAPO) digunakan, dan cahaya yang dipancarkan terdeteksi dalam mode berurutan melalui sistem penyaringan spektral. Keuntungan detektor ditetapkan pada nilai konstan, dan gambar diambil untuk semua sampel di lokasi acak di seluruh area sumur. Parameter akuisisi berikut digunakan:λ ex/em = 405/425 − 475 nm (saluran biru, pewarnaan nuklir oleh DAPI); λ ex/em = 488/500 − 530 nm (saluran hijau, pelabelan gH625@MNP oleh NBD); dan λ ex/em = 633/650 − 700 nm (saluran merah, pelabelan PEG,FA@MNPs oleh rhod). Analisis kuantitatif fluoresensi dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ (versi 1.50i, NIH).
Hasil dan Diskusi
Sintesis dan Karakterisasi MNP
Strategi keseluruhan yang diterapkan untuk mempersiapkan gH625@MNPs dan PEG,FA@MNPs dari Fe3 O4 nanopartikel, diperoleh dengan pengendapan bersama, melibatkan dua langkah seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 1. Langkah pertama, yang sama untuk kedua kelas nanopartikel, didasarkan pada fungsionalisasi MNP dengan asam fosfonat yang mengandung gugus amino (NH2 -PA). Pada langkah kedua, NH2 -MNP prafungsional PA (NH2 @MNPs) selanjutnya terkonjugasi dengan molekul fungsional spesifik melalui reaksi kopling NHS. Khususnya, N Bentuk gH625 teraktivasi -hidroksisuksinimida berlabel NBD digunakan untuk preparasi gH625@MNPs, dan N -hidroksisuksinimida bentuk aktif PEG, FA, dan Rhod digunakan untuk mendapatkan PEG,FA@MNPs. Perhatikan bahwa baik gH625@MNPs dan PEG,FA@MNPs telah diberi label dengan probe luminescent (yaitu, NBD dan Rhod, masing-masing) untuk melakukan studi mikroskop pemindaian laser confocal.
Skema reaksi. Langkah-langkah reaksi untuk persiapan MNP yang difungsikan
Karakterisasi difraktometrik sinar-X (XRD) dari MNP telanjang yang diperoleh setelah langkah ko-presipitasi serupa dengan yang dilaporkan dalam makalah kami sebelumnya [34, 35]. Secara singkat, pola tipikal (Gbr. 2a) menunjukkan empat puncak difraksi (2θ = 30,16°, 35,48°, 43,10°, dan 57,04°) yang konsisten dengan adanya magnetit, maghemit, atau komposisi antara antara dua fase. Konstanta kisi, a , yang ditemukan 8,389(4) sesuai dengan parameter kisi magnetit curah (8,396 Å), serta ukuran kristal rata-rata 11,2, ditentukan dengan menerapkan persamaan Debye–Scherrer, sebanding dengan nilai sebelumnya dilaporkan [34, 35].
Spektrum XRD dan XPS khas MNP. Pola XRD dari a) MNP telanjang dan Fe 2p resolusi tinggi3/2 Daerah spektral XPS dari b) MNP telanjang dan c) NH2 @MNP
Perhatikan bahwa karena struktur kristal Fe3 O4 magnetit sangat mirip dengan -Fe2 O3 maghemite, sangat sulit untuk membedakan kedua fasa dengan XRD. Untuk alasan ini, spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) digunakan untuk menganalisis MNP lebih lanjut. Gambar 2b menunjukkan Fe 2p3/2 spektrum XPS resolusi tinggi dari MNP telanjang. Centroid pita, diamati pada 710,9 eV, sesuai dengan Fe 2p3/2 puncak. Nilai ini lebih rendah dari yang dilaporkan untuk Fe
3+
baik di lubang oktahedral -Fe2 O3 (711,6 eV) [36, 37] atau dalam lubang campuran tetrahedral dan oktahedral -Fe2 O3 (711,4 eV), dan konsisten dengan keadaan oksidasi campuran Fe dalam Fe3 O4 [37, 38].
Akhirnya, karakterisasi magnetik terperinci dari MNP serupa dilaporkan dalam makalah kami sebelumnya [34, 35].
Proses fungsionalisasi dievaluasi dengan FT-IR dan XPS. Setelah fungsionalisasi dengan lapisan tunggal fosfonik, Fe 2p3/2 pita (Gbr. 2c) tidak menunjukkan modifikasi yang relevan, sehingga menegaskan bahwa Fe3 O4 fase dipertahankan. Namun, sedikit pergeseran (0,4 eV) dari Fe 2p3/2 centroid menuju energi ikat yang lebih rendah (B.E) diamati, yang dikaitkan dengan penahan monolayer fosfonik. Pergeseran serupa, pada kenyataannya, diamati dalam adsorpsi fosfat dari berbagai oksida besi [39] dan dapat dianggap berasal dari beberapa transfer muatan dari adsorbat ke atom Fe. Fe 2p3/2 posisi 710,5 eV dipertahankan setelah semua langkah fungsionalisasi untuk penahan PEG dan FA.
Gambar 3 melaporkan perbandingan daerah spektral P2p, N1s, dan C1s dari NH2 @MNPs, PEG,FA@MNPs, dan gH625@MNPs, masing-masing. Posisi puncak P2p (133,2 eV) dari NH2 @MNPs biasanya dikaitkan dengan keberadaan asam fosfonat yang ditambatkan di permukaan dengan cara bidentat [40,41,42,43]. Posisi pita P2p dalam spektrum gH625@MNPs dan PEG,FA@MNPs sama dengan yang diamati pada NH2 Spektrum @MNPs, sehingga mengungkapkan bahwa molekul fosfonik tidak dihilangkan selama reaksi penggabungan untuk imobilisasi peptida dan asam folat.
Karakterisasi XPS dari MNP yang difungsikan. Daerah spektral XPS P 2p, C 1s, dan N 1s resolusi tinggi dari a) NH2 @MNPs, b) PEG,FA@MNPs, dan c) gH625@MNPs
Bentuk dan posisi puncak spektrum N1s NH2 @MNPs konsisten dengan keberadaan NH berlabuh2 -PA. Pita ini terdiri dari dua komponen berbeda:yang pertama pada 399,9 eV dikaitkan dengan gugus –NH dari aminopropilfosfat berlabuh, dan komponen kedua yang berpusat pada 401,5 eV disebabkan oleh gugus amino yang berinteraksi dengan permukaan Fe3 O4 melalui protonasi atau pembentukan ikatan –H.
Setelah penahan gH625 peptida atau FA, PEG, dan Rhod, komponen N1s pada 399,8 eV meningkat dibandingkan dengan komponen pada 401,8 eV terkait dengan gugus amino terprotonasi dari NH2 @MNP. Peningkatan ini disebabkan oleh sinyal tumpang tindih dari atom N yang terlibat dalam ikatan amida (400,2 eV) antara aminopropilfosfat yang ditambatkan dan molekul terkonjugasi (misalnya, gh625, FA, PEG, dan Rhod) serta atom N dari gh625 dan FA (pada 399,1 dan 400,6 eV).
Pita C 1s dari NH2 Spektrum @MNPs terdiri dari satu puncak pada 285,0 eV yang ditetapkan untuk karbon alifatik, seperti yang dilaporkan sebelumnya [40].
Dalam spektrum C1s dari gH625@MNPs dan PEG,FA@MNPs, keberadaan komponen C1s pada 288,3 eV disebabkan oleh gugus karboksilat dan amida dari molekul gh625, FA, dan Rhod.
Spektrum FT-IR NH2 @MNPs, gH625@MNPs, dan PEG,FA@MNPs dilaporkan pada Gambar. 4. Dalam semua sampel, spektrum tidak menunjukkan pita pada 1250 cm
− 1
karena P=O dan puncak yang tajam pada 900–1050 cm
− 1
rentang karena peregangan P–O–H [44,45,46], tetapi pita lebar dan kuat pada 1040 cm
− 1
, yang terkait dengan getaran PO3
2−
kelompok yang terikat pada permukaan besi. Pita ini menunjukkan, menurut hasil XPS, bahwa asam fosfonat terdeprotonasi dan ditambatkan ke permukaan melalui ikatan P-O-Fe seperti yang dilaporkan sebelumnya [34, 40, 41]. Wilayah spektral IR antara 1500 dan 1700 cm
− 1
menunjukkan pita milik kelompok amino dan amida gH625 dan FA. Khususnya, spektrum NH2 @MNPs menunjukkan puncak yang tajam sekitar 1650 cm
− 1
terkait dengan NH2 membungkuk [47]. Setelah penahan PEG, Rhod, dan FA, 1700–1500 cm
− 1
wilayah PEG,FA@MNPs menunjukkan pita yang lebih luas karena konvolusi getaran NH2 yang tidak bereaksi , gugus amida, dan cincin benzena FA dan Rhod (1630–1600 cm
− 1
) [35]. Secara analog, setelah penahan peptida, pita lebar sekitar 1650–1600 cm
− 1
dapat disebabkan oleh kontribusi beberapa getaran karena NH yang tidak bereaksi2 dan gugus amino dari rantai samping peptida dan pada regangan C=O dari ikatan amida peptida [48]. Selain itu, komponen sekitar 1540 cm
− 1
karena gabungan δ (N–H)/ν(C–N) getaran peptida [48] juga ada.
Karakterisasi FT-IR dari MNP yang difungsikan. Wilayah spektral FT-IR pada 850–1900 cm
−1
rentang dari a) NH2 @MNPs, b) gH625@MNPs, dan c) PEG,FA@MNPs
Penjangkaran FA pada MNPs juga telah dibuktikan dengan spektrum UV/Vis dari larutan koloid PEG,FA@MNPs. Gambar 5 membandingkan spektrum NH2 @MNPs dan PEG,FA@MNPs dispersi koloid. Spektrum larutan FA (5 μM) telah ditambahkan sebagai referensi. Pita yang jelas pada 274 nm tipikal FA terlihat jelas baik dalam referensi maupun larutan koloid PEG,FA@MNPs, sehingga mengonfirmasi keberadaan FA dalam MNP. Perhatikan bahwa sedikit pergeseran dari penyerapan FA-NHS pada 280 nm ke nilai 274 nm setelah penahan kemungkinan disebabkan oleh perubahan lingkungan dari FA-NHS bebas dan FA berlabuh nanopartikel. Adanya pergeseran variabel pita serapan pada 280 nm setelah penahan permukaan FA atau konjugasi dengan molekul lain telah diamati dalam literatur [49,50,51].
Karakterisasi UV/Vis dari MNP yang difungsikan. Spektrum UV/Vis larutan FA-NHS 5 μM dan NH2 @MNPs, dan dispersi koloid PEG,FA@MNPs. Perhatikan bahwa latar belakang tinggi diamati pada spektrum NH2 @MNPs dan PEG,FA@MNPs disebabkan oleh hamburan dispersi koloid nanopartikel
Diameter hidrodinamik rata-rata, indeks polidispersitas (PDI), dan potensi zeta dari MNP yang difungsikan ditentukan oleh DLS dalam buffer PBS pada pH 7,4 pada dispersi MNP yang disiapkan dan setelah 72 jam penuaan (Tabel 1). Diameter hidrodinamik NH2 -PA@MNPs, gH625@MNPs, dan PEG,FA@MNPs masing-masing adalah 73.0 ± 3.0 nm, 104.0 ± 4.0 nm, dan 51 ± 2 nm, dan nilai PDI menunjukkan distribusi ukuran partikel yang cukup sempit. Seperti yang diharapkan, konjugasi dengan gH625 meningkatkan ukuran nanopartikel, sedangkan penurunan ukuran PEG,FA@MNPs disebabkan oleh dispersi yang lebih baik daripada NH2 @MNPs, terkait dengan keberadaan rantai PEG.
Bagaimanapun, perhatikan bahwa potensi zeta yang sangat negatif (< − 30 mV) diamati untuk semua sistem. Nilai potensial zeta negatif tersebut memastikan stabilitas jangka panjang dan menghindari agregasi partikel yang ekstensif [52, 53]. Memang, muatan permukaan negatif hanya sedikit bergantung pada lapisan tetapi terutama dihasilkan dari kombinasi inti Fe3 yang bermuatan negatif. O4 nanopartikel [54] dan efek gugus asam fosfonat seperti yang diamati untuk sistem serupa [52, 34]. Oleh karena itu, dibandingkan dengan strategi sintetik lain yang digunakan untuk memfungsikan MNP, penggunaan monolayer asam fosfonat sebagai penghubung tidak hanya memungkinkan pembentukan ikatan yang stabil antara permukaan dan gugus fungsi, tetapi juga menginduksi potensi zeta yang sangat negatif. Setelah 72 jam penuaan, ukuran dan potensi zeta NH2 -PA@MNPs, gH625@MNPs, dan PEG,FA@MNPs tetap kurang lebih sama, menunjukkan bahwa semua permukaan yang dihias stabil dari waktu ke waktu.
Viabilitas Sel
Kelangsungan hidup sel HBMEC dan A-172 yang diinkubasi dengan gH625@MNPs dan FA,PEG@MNPs dievaluasi menggunakan uji MTT pada waktu inkubasi yang berbeda dan dengan adanya konsentrasi nanopartikel yang berbeda (10 dan 20 μg/ml). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, tidak ada efek sitotoksik konsentrasi dan/atau bergantung waktu (24–48–72 jam) dari sistem dekorasi pada sel HBMEC dan A-172 yang diamati.
viabilitas sel. Viabilitas sel a HBMEC dan b Sel A-172 diinkubasi selama 24, 48, dan 72 jam dengan gH625@MNPs 10 μg/ml (batang hitam), gH625@MNPs 20 μg/ml (batang merah), PEG,FA@MNPs 10 μg/ml (bilah biru ), dan PEG,FA@MNPs 20 μg/ml (batang magenta)
Serapan Intraseluler
Untuk menentukan apakah kemampuan penetrasi sel peptida gH625 dipertahankan setelah imobilisasi pada permukaan nanopartikel, dan untuk membandingkan kemampuan gH625 dan FA melintasi BBB, internalisasi ke dalam sel endotel otak manusia dari label NBD gH625@MNPs dan PEG berlabel Rhod, FA@MNPs telah diselidiki dengan mikroskop pemindaian laser confocal.
Setelah 24 jam inkubasi, penyerapan PEG-FA@MNPs tidak terlihat jelas, sementara internalisasi gH625@MNPs terlihat jelas (Gbr.7). Konjugasi dengan gH625 menghasilkan penyerapan yang lebih cepat dan intensitas fluoresensi intraseluler yang hampir dua kali lipat lebih tinggi (Gbr. 8).
Mikrograf fluoresensi LSM dari HBMEC. Mikrograf fluoresensi LSM dari HBMEC yang diinkubasi selama 24 jam (b , f ) dan 72 j (h , h ) dengan gH625@MNPs berlabel NBD 15 μg/ml (b , d ) dan kontrolnya (a , c ) atau PEG berlabel rhod,FA@MNPs 15 μg/ml (f , h ) dan kontrolnya (e , g ). Bilah skala = 20 μm
Intensitas fluoresensi intraseluler yang dinormalisasi. Analisis kuantitatif fluoresensi intraseluler setelah inkubasi HBMEC pada 24 dan 72 jam dengan gH625@MNPs berlabel NBD dan FA berlabel Rhod,PEG@MNPs
Untuk waktu inkubasi yang lebih lama (72 jam), perbedaan antara internalisasi kedua sistem berkurang. Perilaku ini tidak terduga karena untuk waktu inkubasi yang lama, proses internalisasi FA,PEG@MNPs yang tidak spesifik dapat terjadi dan hasil kami lebih lanjut mengkonfirmasi apa yang kami laporkan sebelumnya untuk penyerapan nanopartikel polistiren yang berfungsi dan tidak berfungsi [55].
Untuk mengeksplorasi lebih lanjut kemungkinan menggunakan gH625@MNPs sebagai agen terapeutik untuk tumor otak, serapan seluler gH625@MNPs dan FA,PEG@MNPs diselidiki menggunakan garis sel glioblastoma A-172. Glioblastoma adalah salah satu tumor otak primer yang paling umum dan juga salah satu kanker yang paling mematikan.
Serapan seluler gH625@MNPs dan FA,PEG@MNPs setelah 24 jam inkubasi sebanding, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 9.
Mikrograf fluoresensi LSM sel glioblastoma. Mikrograf fluoresensi LSM sel glioblastoma. Gambar biru-hijau yang digabungkan:sel kontrol (a ) dan sel diinkubasi dengan 15 μg/ml gH625@MNP berlabel NBD (b ). Gambar biru-merah yang digabungkan:sel kontrol (c ) dan sel diinkubasi dengan 15 μg/ml PEG,FA@MNP berlabel rhod (d ). Bilah skala = 20 μm
Perilaku ini menunjukkan bahwa gH625 mampu menargetkan tumor otak dengan efisiensi yang sama dari unit penargetan FA yang lebih sering diadopsi.
Kesimpulan
Fe3 O4 nanoparticles have been functionalized with the gH625 viral cell penetrating peptide adopting a versatile route based on MNP prefunctionalization with a monolayer consisting of a bifunctional phosphonic linker, 3-aminopropylphosphonic acid. The cell internalization capabilities of this system have been evaluated by comparing them with those of a reference system based on MNPs functionalized with PEG, rhodamine, and folic acid, obtained adopting the same NH2 -PA-based platform. The uptake of the two differently decorated MNPs was assessed in primary microvascular endothelial cells from human brain, which are the main components of the BBB and simulate an in vitro model of the BBB. These surface modifications influence the internalization of MNPs in HBMEC and, therefore, their capability to cross the BBB. In fact, conjugation with the gH625 peptide upgraded the delivery of nanoparticles across the in vitro BBB, leading to significant higher cell uptake in HBMEC after 24 h compared with that of FA bearing MNPs (FA,PEG@MNPs). Note that also other strategies have been used to enhance nanoparticle uptake across the BBB. A common approach is to attach targeting ligands in order to activate receptor-mediated endocytosis. As examples, transferrin-coupling nanoparticles can penetrate into the BBB through a transferrin receptor-mediated process [56]. Analogously, the linkage of the apolipoprotein E to the nanoparticles enhances the BBB penetration [57]. Besides, nanoparticles having a surface charges modified with polyethylenimine (PEI) has been reported to cross the BBB by absorptive-mediated transcytosis [58]. Finally, the ability of MNPs to pass through human brain microvascular endothelial cells, used as an in vitro BBB model, can be also facilitated by an external magnet [59]. In our work, we studied a different approach which use a cell penetrating peptide, the gh625, to improve internalization capabilities of Fe3 O4 nanopartikel. These results are in accordance with those previously obtained by D. Guarnieri et al. using different kinds of MNPs [55, 60] confirming that the gH625-decorated magnetic nanoparticle has a relevant role in crossing the BBB and could be used as a safe and effective drug delivery system.
Singkatan
A-172:
Human glioblastoma cell line
B.E.:
Binding energy
BBB:
Blood-brain barrier
CNS:
Central nervous system
CPPs:
Cell-penetrating peptides
DIPEA:
T ,T -Diisopropylethylamine
DLS:
Hamburan cahaya dinamis
DMEM:
Medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco
DAPI:
4′,6-Diamidino-2-phenylindole
DMSO:
Dimethyl sulfoxide
FA:
Folic acid
FA-NHS:
Activated form of FA with NHS
FBS:
Serum janin sapi
Fmoc:
9-Fluorenylmethoxycarbonyl
FT-IR:
Fourier transform infrared spectroscopy
gh625:
20-Residue peptide derived from the glycoprotein H (gH) of the Herpes simplex virus 1
