Zirkonia (ZrO2 ) adalah salah satu oksida logam yang banyak digunakan untuk aplikasi bio potensial seperti biosensor, terapi kanker, implan, dan kedokteran gigi karena kekuatan mekaniknya yang tinggi dan toksisitas yang lebih rendah. Karena aplikasinya yang luas, potensi paparan nanopartikel (NP) ini telah meningkat, yang telah menarik perhatian luas. Oleh karena itu, sangat penting untuk menyelidiki profil toksikologi ZrO2 NP. Titanium dioksida (TiO2 ) adalah bahan nano lain yang banyak digunakan yang dikenal sangat beracun. Dalam penelitian ini, TiO2 NP disajikan sebagai kontrol untuk mengevaluasi biokompatibilitas ZrO2 NP. Kami mendeteksi sitotoksisitas TiO2 dan ZrO2 NP dalam sel 3T3-E1 mirip osteoblas dan menemukan bahwa spesies oksigen reaktif (ROS) memainkan peran penting dalam TiO2 dan ZrO2 Sitotoksisitas yang diinduksi NP dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Kami juga menunjukkan TiO2 dan ZrO2 NP dapat menginduksi apoptosis dan perubahan morfologi setelah dikultur dengan sel 3T3-E1 pada konsentrasi tinggi. Selain itu, TiO2 dan ZrO2 NP pada konsentrasi tinggi dapat menghambat diferensiasi osteogenik sel, dibandingkan dengan konsentrasi rendah. Kesimpulannya, TiO2 dan ZrO2 NP dapat menginduksi respon sitotoksik in vitro dengan cara yang bergantung pada konsentrasi, yang juga dapat mempengaruhi osteogenesis; ZrO2 NP menunjukkan efek toksik yang lebih kuat daripada TiO2 NP.
Selama beberapa dekade terakhir, penerapan rekayasa nanopartikel (NP) telah berkembang di berbagai bidang, seperti elektronik, aplikasi biomedis, dan farmasi. Zirkonia (ZrO2 ) NP adalah salah satu nanomaterial utama yang digunakan untuk mensintesis refraktori, pasir pengecoran, dan keramik. Karena kekuatan mekanik yang disukai, bahan ini juga digunakan dalam bidang biomedis, termasuk biosensor, terapi kanker, implan, endoprostesis sendi, dan kedokteran gigi [1, 2]. Namun, penerapan partikel secara luas telah menimbulkan kekhawatiran tentang potensi risikonya terhadap kesehatan dan lingkungan, di mana memastikan keselamatan kerja dan konsumen merupakan perhatian penting. Sejauh ini, studi toksikologi pada ZrO2 NP terbatas, dan hasilnya kontroversial.
Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa ZrO2 NP menunjukkan biokompatibilitas yang lebih baik bila dibandingkan dengan bahan nano lainnya, termasuk oksida besi, titanium dioksida (TiO2 ), dan seng oksida (ZnO) [3,4,5,6]. Sesuai dengan hasil ini, yang lain telah melaporkan ZrO2 NP dapat menginduksi efek sitotoksik ringan [3, 7] atau tanpa efek sitotoksik [8,9,10], dan hanya sedikit penelitian yang menunjukkan potensi sitotoksik ringan. Namun, Stoccoro dkk. [11] mengembangkan efek toksik ZrO2 NP dan TiO2 NP dilapisi atau tidak, mereka menemukan bahwa semua jenis NP menunjukkan efek toksik pada tingkat yang berbeda. Selain itu, perubahan morfologi sel, dan retakan pada permukaan sel diamati pada penelitian lain setelah ZrO2 Pengobatan NP pada konsentrasi hingga 1 mg/mL dalam sel darah merah [12]. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami mengevaluasi efek sitotoksik ZrO2 NP, memberikan wawasan yang berguna untuk aplikasi masa depan mereka in vivo. Sementara itu, kami memperlakukan sel dengan TiO2 NP sebagai kelompok kontrol, yang profil toksikologinya telah berkembang dengan baik [13].
Studi sebelumnya menunjukkan bahwa NP telah banyak digunakan sebagai bahan rekayasa jaringan dan memiliki kemampuan untuk meningkatkan diferensiasi osteogenik osteoblas [14,15,16,17]. Satu laporan menunjukkan bahwa silika (Si) NP dapat membalikkan kehilangan tulang terkait usia pada tikus, mungkin karena pembentukan tulang yang diinduksi Si NP [16]. Liu dkk. [14] menemukan bahwa paduan baja tahan karat berlapis perak (Ag) NP/poli (DL-laktat-co-glikolat) memiliki kemampuan antibakteri yang kuat dan dapat mendorong proliferasi dan pematangan sel MC3T3-E1 osteoblastik in vitro. Selain itu, nanotube karbon dilaporkan menginduksi kalsifikasi tulang, kemungkinan besar hasil dari struktur nano mereka yang mirip dengan ukuran organel intraseluler [18].
ZrO2 NP telah diterapkan sebagai komponen utama dari implan biokeramik, karena biokompatibilitasnya dan ketahanannya terhadap bio-korosi [19]. Meskipun sebagian besar penelitian telah difokuskan pada sifat menguntungkan dari ZrO2 NP, efek biologis yang merugikan tidak mungkin diabaikan. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami menggunakan TiO2 , sebagai kelompok kontrol, yang merupakan bahan nano tradisional yang menunjukkan sifat fisikokimia yang serupa. Kami bertujuan untuk menyelidiki efek TiO2 dan ZrO2 NP pada viabilitas sel, stres oksidatif, morfologi sel, dan respons osteogenik osteoblas MC3T3-E1 setelah kultur bersama dan dengan demikian mengungkapkan osteoinduktivitas TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP.
TiO2 NP (Nomor CAS 637262) dan ZrO2 NP (Nomor CAS 544760) dibeli dari Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dan dicirikan oleh mikroskop elektron transmisi (TEM, MFP-3D-S, Asylum Research, Santa Barbara, CA, USA) , Potensi Zeta, dan pengukuran analisis ukuran partikel hamburan cahaya dinamis (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK). NP didispersikan dalam alkohol untuk deteksi TEM, yang dapat menunjukkan morfologi dan ukuran partikulat NP dengan lebih jelas. Selain itu, ukuran partikel agregat dideteksi melalui DLS, di mana media kultur lengkap digunakan untuk menyesuaikan dengan karakter partikel yang diterapkan dalam kultur sel. Sebelum perawatan sel, larutan stok didispersikan dengan Ultrasonic Cell Disruption System (Ningbo Xinzhi Biotechnology, China) selama 30 menit disertai dengan pendinginan es dan diencerkan ke konsentrasi yang berbeda dengan media kultur lengkap sebelum eksperimen sel.
Garis sel 3T3-E1 (Bank Sel Infrastruktur Shanghai untuk Penelitian dan Pengembangan Publik Akademi Ilmu Kedokteran Cina, Shanghai, Cina) dikultur dalam alfa medium esensial minimum (α-MEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA , USA) yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS, Thermo Fisher Scientific, USA) dan 1% antibiotik/antimikotik (Thermo Fisher Scientific, USA). Sel diinkubasi pada suhu 37 °C dengan 5% CO2 dalam 95% atmosfer yang dilembabkan, dan media kultur diganti setiap dua hari sekali.
Viabilitas seluler terdeteksi menggunakan uji CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, kota Kumamoto, Jepang). Sel-sel diunggulkan dalam pelat 96-sumur pada 5.000 sel per sumur. TiO2 NP dan ZrO2 NP kemudian ditambahkan ke pelat 96-sumur pada konsentrasi seri 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, dan 150 g/mL diikuti dengan inkubasi selama 24 dan 48 jam pada 37°C dengan 5% CO2 , disertai dengan N -asetil-l-sistein (NAC) atau tidak, yang digunakan untuk menghambat produksi ROS. Kelompok kontrol dibiarkan tidak diobati. Kemudian, uji CCK-8 dilakukan dengan menambahkan 110 L reagen deteksi ke setiap sumur, dan 96 pelat sumur kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 °C. Untuk mencegah NP mengganggu pengujian analitik ini, reagen yang akan diuji di pelat 96-sumur dipindahkan ke pelat 96-sumur baru setelah waktu reaksi 2 jam; NP dan sel yang disimpan dibiarkan di pelat primer. Kerapatan optik (OD) masing-masing sumur diukur pada panjang gelombang tunggal 450 nm dengan pembaca pelat mikro (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Setiap perlakuan dilakukan dalam enam ulangan.
Sel dikultur dalam pelat 12-sumur dengan kepadatan 30.000 sel / sumur untuk pertemuan. Setelah TiO2 NP dan ZrO2 Perawatan NP selama 48 jam, sel dicuci dengan PBS dan dikumpulkan menggunakan buffer tripsin bebas EDTA. Sel disuspensikan kembali dengan buffer PBS pada konsentrasi 25.000 sel/mL dan disentrifugasi pada 1000×g . Kemudian, sel diwarnai dengan FITC Annexin V dan PI (Invitrogen™, USA) pada suhu kamar tanpa paparan cahaya. Terakhir, sel dicampur dengan 400 μL buffer pengikat dan segera dianalisis dengan flow cytometry (BD FACSAria III, BD, Franklin Lakes, NJ, USA).
Pembentukan ROS intraseluler ditentukan menggunakan Reactive Oxygen Species Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China). Secara singkat, setelah dicuci dengan PBS, sel-sel disemai di piring 6-sumur pada 20.000 sel/sumur dalam media kultur 2 mL dan diperlakukan dengan TiO2 NP dan ZrO2 NP pada konsentrasi 0, 10, 50, dan 100 μg/mL selama 48 jam, disertai dengan NAC atau tidak. Setelah pengobatan dengan TiO2 NP dan ZrO2 NP, sel dikumpulkan dan diinkubasi dengan 10 μM DCFH-DA selama 30 menit pada 37 °C dan 5% CO2 . Intensitas fluoresen dianalisis pada BD FACSAria III (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).
Karena sebagian besar sel telah berubah menjadi status apoptosis, kami memilih 24 jam sebagai titik waktu untuk mengamati perubahan struktur sitoskeleton sel dalam penelitian kami. Sel 3T3-E1 diunggulkan pada kaca penutup dan dikultur dengan adanya TiO2 NP dan ZrO2 NP selama 24 jam. Sel dicuci segera setelah perlakuan dengan buffer PBS sebanyak tiga kali dan difiksasi dengan paraformaldehyde 4%, ditembus dengan 0, 1% Triton X-100, dan diblokir dengan PBS yang mengandung 5% BSA. Kemudian, sel diinkubasi untuk -tubulin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, 1:4000) pada suhu 4 °C semalaman dan diisi dengan antibodi sekunder terikat FITC pada suhu 37 °C selama 1 jam hari berikutnya setelahnya. pencucian dengan PBS sebanyak tiga kali. Akibatnya, sitoskeleton diwarnai dengan rhodamin-phalloidin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, 1:1000) selama 1 jam dalam gelap, dan inti diwarnai dengan Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selama 20 menit. Coverslips diperiksa menggunakan mikroskop confocal FV10i (Olympus, Tokyo, Jepang).
Sel-sel 3T3-E1 diunggulkan dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 15.000 sel/sumur. Sel diperlakukan dengan TiO2 NP dan ZrO2 NP pada konsentrasi 10 dan 100 g/mL, dan media kultur yang mengandung nanomaterial diganti setiap hari; sel-sel dicuci dengan lembut melalui PBS untuk menghilangkan sisa bahan nano sebelum setiap media kultur berubah. Setelah dikultur selama 7, 14, dan 21 hari dengan adanya TiO2 NP dan ZrO2 NP, sel diwarnai dengan alizarin red S. Secara singkat, sel difiksasi dengan paraformaldehida 4% pada 4 °C selama 30 menit dan diwarnai dengan larutan alizarin red S (40 mM, pH 4,1) pada suhu sekitar selama 20 menit. Setelah dicuci dengan air suling tiga kali, nodul mineral diamati dengan mikroskop cahaya (Olympus, Jepang).
Total RNA diekstraksi melalui reagen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kemudian, konsentrasi RNA dievaluasi menggunakan spektrofotometer ultraviolet. RNA yang diisolasi ditranskripsikan secara terbalik ke cDNA menggunakan kit reagen RT (TaKaRa Bio, Dalian, China). PCR waktu nyata dilakukan menggunakan reagen hijau SYBR (TaKaRa Bio, Dalian, China). Gen terkait osteogenesis terdeteksi, termasuk faktor transkripsi terkait kerdil 2 (RUNX2), kolagen 1α1 (Col1α1), alkaline phosphatase (ALP), osteopontin (OPN), osteocalcin (OC), dan sialoprotein tulang (BSP). Data dianalisis menggunakan 2 −ΔΔ metode CT. Primer yang digunakan tercantum dalam Tabel 1.
Hasilnya direpresentasikan sebagai mean ± SEM. Semua data dianalisis secara statistik dengan uji ANOVA. Uji homogenitas varians dilakukan, dan uji Bonferroni dan Dunnett's T3 digunakan ketika varians yang sama diasumsikan dan ketika tidak ada homogenitas, masing-masing. p nilai kurang dari 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Kami pertama-tama mengkarakterisasi TiO2 NP dan ZrO2 Serbuk NP melalui mikroskop elektron transmisi (TEM) dan hamburan cahaya dinamis (DLS) (Gbr. 1a, b, Tabel 2). Gambar TEM dan SEM mengungkapkan bentuk dan ukuran partikel. TiO2 NP adalah bola berbentuk batang kecil dengan ukuran rata-rata 25,4 ± 2,8 nm. ZrO2 NP adalah bola berbentuk batang kecil dengan ukuran rata-rata 31,9 ± 1,9 nm. Untuk mengukur ukuran TiO2 NP dan ZrO2 NP dalam larutan, DLS digunakan dan partikel TiO2 NP dan ZrO2 NP masing-masing diperluas menjadi 81,2 nm dan 93,1 nm, yang menunjukkan efek aglomerasi. Potensi zeta dari TiO2 NP dan ZrO2 NP masing-masing adalah 32,9 ± 5,4 mV dan 42,4 ± 7,4 mV.
Karakterisasi TiO2 dan ZrO2 NP. TiO2 (a ) dan ZrO2 (b ) Morfologi dan ukuran NP dideteksi menggunakan TEM. (c ) Situasi kultur bersama sel 3T3 dan bahan nano diamati setelah TiO2 dan ZrO2 Perlakuan NP konsentrasi 10, 50, dan 100 μg/mL. (d ) Hasil TEM diperoleh setelah TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP selama 1 jam
Kemudian, kami mengamati foto sel 3T3 setelah TiO2 NP dan ZrO2 Paparan NP pada berbagai konsentrasi. Kami menemukan bahwa NP didistribusikan secara merata pada sel atau menyebar. NP menunjukkan kemampuan agregasi yang kuat pada konsentrasi tinggi karena sebagian kecil NP dengan skala mikro yang diamati, sementara massa besar NP kecil dengan skala nano dan mungkin mentranslokasi ke dalam sel yang sulit dilihat (Gbr. 1c). Selanjutnya hasil TEM sel setelah TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP selama 1 jam telah diperoleh; data kami menunjukkan bahwa NP dapat ditranslokasikan ke dalam vesikel seluler. Sementara itu, beberapa kerusakan organel juga diamati, misalnya, terjadi pembengkakan mitokondria dan vakuola.
Kami menilai viabilitas sel setelah TiO2 NP dan ZrO2 Perlakuan NP dalam konsentrasi seri (10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 μg/mL). Untuk TiO2 NP (Gbr. 2a), setelah inkubasi 24 jam, kami menemukan bahwa TiO2 NP tidak beracun pada dosis yang lebih rendah (≤ 20 μg/mL), sedangkan penurunan nyata dalam viabilitas sel diamati pada konsentrasi yang lebih tinggi (> 20 μg/mL) (p < 0,001). Penurunan viabilitas sel yang lebih dramatis pada kelompok perlakuan 20 g/mL diamati setelah 48 jam inkubasi; TiO2 NP pada konsentrasi 20 μg/mL menginduksi penurunan viabilitas sel (p < 0,01). Selain itu, dosis TiO yang lebih tinggi2 NP (> 20 μg/mL) menunjukkan penurunan viabilitas sel yang signifikan pada 48 jam (p < 0,001). Namun, viabilitas sel tetap stabil saat diobati dengan 10 μg/mL TiO2 NP selama 48 jam. Selain itu, untuk ZrO2 NP (Gbr. 2b), hasil serupa diamati bila dibandingkan dengan TiO2 NP; efek toksik yang lebih tinggi diamati pada konsentrasi 150 μg/mL selama 48 jam, di mana viabilitas sel menurun di bawah 50%. Hasil ini menunjukkan bahwa TiO2 dan ZrO2 NP biokompatibel pada dosis yang lebih rendah. Namun, kedua nanomaterial ini menunjukkan sedikit sitotoksisitas pada konsentrasi toksik yang tinggi.
TiO2 dan ZrO2 Viabilitas sel yang diinduksi NP menurun dalam sel 3T3-E1. Sel 3T3-E1 diperlakukan dengan TiO2 (a ) dan ZrO2 (b ) NP pada konsentrasi 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, dan 150 μg/mL selama 24 dan 48 jam, kemudian viabilitas sel dideteksi melalui uji CCK-8. Sementara itu, perubahan viabilitas sel terdeteksi setelah pengobatan NAC, yang dapat menghilangkan ROS intraseluler. Hasil mewakili mean ± SEM. *p < 0,05; **p < 0.01; ***p < 0.001, dibandingkan dengan kontrol
Kami kemudian mendeteksi efek penghambatan NAC yang merupakan agen pemulung ROS. Hasil penelitian menunjukkan bahwa NAC berpotensi menghambat TiO2 (Gbr. 2a), dan ZrO2 NP (Gbr. 2b) menginduksi viabilitas sel setelah perawatan 24 jam dan 48 jam. Setelah penghambatan NAC, viabilitas sel dipertahankan selama 24 jam pada semua konsentrasi TiO2 dan ZrO2 Perlakuan NP kecuali konsentrasi tertinggi (150 μg/mL). Meskipun efek penghambatan sedikit menurun pada sel yang diobati dengan TiO konsentrasi tinggi2 (100 dan 150 μg/mL) dan ZrO2 NP (80, 100, dan 150 μg/mL) pada titik waktu 48 jam, tidak ada perubahan viabilitas sel yang kuat yang diamati untuk konsentrasi di bawah 80 μg/mL, di mana viabilitas sel secara signifikan lebih tinggi daripada yang tanpa NAC.
Kami selanjutnya mendeteksi generasi ROS setelah TiO2 dan ZrO2 Paparan NP dalam sel 3T3-E1 (Gbr. 3). Hasil kami menunjukkan bahwa TiO2 dan ZrO2 NP menginduksi pembentukan ROS setelah 24 jam, yang paling signifikan pada konsentrasi 100 g/mL. Tidak ada generasi ROS yang signifikan untuk TiO2 NP pada konsentrasi 10 μg/mL, sedangkan ZrO2 NP menginduksi generasi ROS yang kuat pada konsentrasi yang sama. Sementara itu, NAC secara signifikan dapat menghambat TiO2 dan ZrO2 Generasi ROS yang diinduksi NP dalam sel 3T3-E1 pada semua konsentrasi.
TiO2 dan ZrO2 Generasi ROS yang diinduksi NP dalam sel 3T3-E1. Sel 3T3-E1 diperlakukan dengan TiO2 dan ZrO2 NP pada berbagai konsentrasi selama 48 jam, dan NAC (10 mM) diinkubasi secara bersamaan, dan kemudian tingkat ROS dalam sel 3T3-E1 terdeteksi. Hasil mewakili mean ± SEM. *p < 0,05; **p < 0.01; ***p < 0.001, dibandingkan dengan kontrol
Apoptosis dan nekrosis sel terdeteksi setelah berbagai konsentrasi TiO2 dan ZrO2 Paparan NP pada 48 jam (Gbr. 4). Titik merah yang terletak di kuadran ketiga mewakili sel normal, sedangkan titik merah yang terletak di kuadran pertama dan kuadran keempat masing-masing mewakili sel apoptosis awal dan sel apoptosis akhir atau nekrotik. Menariknya, hasil kami menunjukkan bahwa TiO2 dan ZrO2 NP dapat menginduksi apoptosis dalam cara yang bergantung pada konsentrasi dan waktu. Mengikuti TiO2 Paparan NP selama 48 jam, tidak ada apoptosis sel signifikan yang terdeteksi pada konsentrasi 10 g/mL; namun, pada konsentrasi 50 dan 100 μg/mL, persentase sel yang mengalami apoptosis atau nekrotik terlambat mencapai tingkat yang tinggi. Mengikuti ZrO2 Paparan NP selama 48 jam, kami tidak menemukan apoptosis sel pada konsentrasi 10 g/mL juga, tetapi persentase sel yang mengalami apoptosis atau nekrotik terlambat adalah 43,7% pada kelompok 50 g/mL. Yang paling menarik, apoptosis awal yang signifikan diamati (34,1%) pada konsentrasi 100 μg/mL setelah 48 jam pengobatan. Kami menemukan bahwa tingkat apoptosis awal TiO2 NP secara signifikan lebih tinggi dari ZrO2 NP; namun, tingkat apoptosis atau nekrotik yang terlambat berada dalam batas.
TiO2 dan ZrO2 Apoptosis yang diinduksi NP dalam sel 3T3-E1. a Setelah sel 3T3-E1 diperlakukan dengan TiO2 dan ZrO2 NP pada berbagai konsentrasi selama 48 jam, tingkat apoptosis sel terdeteksi. b Tingkat apoptosis termasuk apoptosis awal dan tingkat apoptosis akhir dihitung, dan kemudian data dilakukan statistik. Hasil mewakili mean ± SEM. *p < 0,05; **p < 0.01; ***p < 0.001, dibandingkan dengan kontrol
Untuk mempelajari perubahan morfologi sel 3T3-E1 setelah terpapar TiO2 dan ZrO2 NP, kami melakukan pewarnaan fluoresensi diikuti dengan mikroskop confocal (Gbr. 5 dan 6). Dibandingkan dengan sel kontrol yang tidak diobati, tidak ada perubahan morfologis setelah 10 μg/mL TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP pada 24 jam, saat sel berubah menjadi bulat dan lebih kecil setelah 100 μg/mL TiO2 dan ZrO2 pengobatan NP. Yang paling menarik, sedikit penurunan area sel diamati setelah 50 μg/mL TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP, di mana TiO2 menunjukkan penurunan area sel yang lebih kuat. Secara konsisten, hasil kuantitatif mengkonfirmasi penurunan yang signifikan pada area sel setelah 100 μg/mL TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP (Gbr. 5).
TiO2 dan ZrO2 Perubahan area sel yang diinduksi NP dalam sel 3T3-E1 Setelah sel 3T3-E1 diperlakukan dengan TiO2 (a ) dan ZrO2 (b ) NP pada konsentrasi 10 dan 100 μg/mL selama 24 jam, sel-selnya diisi dengan tubulin (hijau), aktin (merah), dan Hoechst 33342 (biru). Morfologi sel diamati berdasarkan perubahan sistem aktin (merah) dan tubulin (hijau), dan perubahan distribusi area sel dihitung
TiO2 dan ZrO2 Perubahan sitoskeleton yang diinduksi NP dalam sel 3T3 Setelah sel 3T3-E1 diperlakukan dengan TiO2 (a ) dan ZrO2 (b ) NP pada konsentrasi 10 dan 100 μg/mL selama 24 jam, perubahan sitoskeleton dinilai berdasarkan perubahan sistem aktin (merah) dan tubulin (hijau)
Kami mempelajari lebih lanjut perubahan sitoskeleton pada filamen aktin dan tingkat mikrotubulus (Gbr. 6). Demikian pula, tidak ada perbedaan signifikan yang ditunjukkan antara kelompok kontrol dan 10 μg/mL TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP, dan sel-sel pada kedua kelompok mengungkapkan struktur eksplisit filamen aktin dan sistem mikrotubulus. Sebaliknya, 100 μg/mL ZrO2 Perawatan NP menginduksi penyusutan sel 3T3-E1, bersama dengan inti seperti piknosis dan filamen aktin dan struktur mikrotubulus yang tidak jelas. Untuk TiO2 NP, begitu banyak titik aktin yang diamati, dan filamen aktin yang terletak di membran sel berkabut dan kasar. Untuk ZrO2 NP, gangguan sitoskeleton yang lebih kuat terdeteksi, dan struktur aktin dan mikrotubulus kasar dan rusak.
Selanjutnya, kami mendeteksi status mineralisasi sel 3T3 dengan pewarnaan alizarin red dan mengamati pembentukan nodul termineralisasi di bawah mikroskop cahaya (Gbr. 7). Sel diwarnai setelah induksi osteogenik selama 7, 14, dan 21 hari dengan adanya berbagai konsentrasi TiO2 dan ZrO2 NP. Kami menemukan bahwa nodul termineralisasi menjadi terlihat setelah 14 dan 21 hari induksi. Tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada mineralisasi setelah induksi 14 dan 21 hari antara kelompok kontrol dan TiO2 dan ZrO2 Pengobatan NP pada 10 μg/mL. Namun, penurunan mineralisasi mungkin diamati setelah TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP pada 100 μg/mL, karena nodul termineralisasi yang semakin kecil dan buram.
TiO2 dan ZrO2 Efek mineralisasi yang diinduksi NP dalam sel 3T3. Setelah sel 3T3-E1 didiferensiasikan menggunakan larutan mineral selama 7 hari, 14 hari dan 21 hari, disertai dengan TiO2 (a ) dan ZrO2 NP (b ) pada berbagai konsentrasi. Pewarnaan merah alizarin digunakan untuk mendeteksi nodul termineralisasi (panah hitam)
Untuk menyelidiki mekanisme TiO2 dan ZrO2 Osteogenesis yang diinduksi NP dalam sel 3T3, kami mendeteksi tingkat gen terkait osteogenesis dalam sel 3T3 setelah TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP, termasuk gen yang secara istimewa diregulasi selama awal (Runx2 , Kol1α1 , dan Alp ) dan terlambat (Buka , Ocn , dan Bsp ) fase osteogenesis (Gbr. 8). Kami menemukan bahwa 10 μg/mL TiO2 dan ZrO2 NP menginduksi level ekspresi tertinggi Runx2 setelah 3 hari perawatan, sedangkan pada hari ke 7, Runx menurun ke level terendah setelah ZrO2 Perawatan NP pada 100 μg/mL. Kol1α1 meningkat setelah 10 μg/mL TiO2 dan ZrO2 Perlakuan NP baik pada hari ke 3 dan 7, sedangkan untuk sel yang diberi TiO 100 μg/mL2 dan ZrO2 NP, Kol1α1 pertama kali diregulasi secara signifikan pada hari ke-3 tetapi menurun secara dramatis setelah 7 hari. Kami juga mendeteksi penurunan signifikan Alp ekspresi setelah TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP pada 100 μg/mL selama 3 hari.
TiO2 dan ZrO2 Perubahan gen terkait osteogenesis yang diinduksi NP dalam sel 3T3 Setelah sel 3T3-E1 didiferensiasikan menggunakan larutan mineral selama 3, 7, 14, dan 21 hari, disertai dengan TiO2 dan ZrO2 NP pada berbagai konsentrasi. Perubahan gen terkait osteogenesis dideteksi menggunakan RT-PCR. Hasil mewakili mean ± SEM dari tiga percobaan independen. *p < 0,05; **p < 0.01; ***p < 0.001, dibandingkan dengan kontrol
Untuk gen yang diregulasi pada fase akhir induksi osteogenik, tingkat ekspresi Opn , Ocn , dan Bsp meningkat secara signifikan setelah 10 μg/mL TiO2 dan ZrO2 Perawatan NP selama 14 hari, dan Buka terus diregulasi ke level yang lebih tinggi pada hari ke-21. Hasil ini menunjukkan bahwa dibandingkan dengan Ocn dan Bsp , Buka adalah penanda tahap selanjutnya dari TiO2 dan ZrO2 osteogenesis yang diinduksi NP. Menariknya, 100 μg/mL TiO2 dan ZrO2 NP gagal meningkatkan ekspresi Open , Ocn , atau Bsp pada hari ke-14; selain itu, gen ini menunjukkan penurunan regulasi yang signifikan pada hari ke-21.
ZrO2 NP adalah komponen penting dalam refraktori, keramik, dan peralatan biomedis, termasuk implan, endoprostesis sendi, dan bahan kedokteran gigi. Hingga saat ini, TiO2 NP sebagai salah satu NP lain dengan sifat fisikokimia yang serupa, banyak penelitian berfokus pada data toksikologinya. Mereka menemukan bahwa TiO2 NP dapat bertranslokasi ke dalam sel dan menunjukkan potensi kerusakan sel karena karakteristik fisikokimia yang berbeda [20, 21]. Sementara itu, data toksikologi untuk ZrO2 NP masih kurang. Dalam penelitian kami, kami menganggap TiO2 NP sebagai kelompok kontrol dan mengeksplorasi efek toksikologi TiO2 dan ZrO2 NP pada sel 3T3-E1. Sifat fisikokimia NP, terutama ukuran dan morfologi, telah diketahui secara efektif berdampak pada keamanan hayati. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa partikel skala nano secara signifikan lebih beracun daripada partikel skala mikro [22, 23]. Dalam kebanyakan kasus, morfologi partikel juga dilaporkan mempengaruhi toksisitas [24,25,26]. Dalam penelitian kami, kami menunjukkan bahwa TiO2 dan ZrO2 NP adalah bola berbentuk batang. Dibandingkan dengan laporan sebelumnya [5, 27, 28], TiO2 our kami dan ZrO2 NP memiliki efek aglomerasi yang relatif lebih lemah dalam air di mana partikel membesar hingga ukuran 81,2 dan 93,1 nm, sementara kami juga dapat mengamati beberapa bahan skala mikro dalam media kultur setelah paparan NP dengan cara yang bergantung pada konsentrasi, yang mengkonfirmasi efek aglomerasi dalam penelitian ini bahkan setelah menggunakan teknologi dispersi ultrasonik. Namun, efek aglomerasi tidak dapat menghambat translokasi NP ke dalam sitoplasma, karena NP yang kuat terdeteksi dalam vesikel intraseluler. Organel, seperti mitokondria, mungkin adalah salah satu target utama.
Kami telah mendeteksi viabilitas sel 3T3-E1 pada berbagai konsentrasi TiO2 dan ZrO2 pengobatan NP. Hasil kami menunjukkan bahwa 10 μg/mL TiO2 dan ZrO2 NPs adalah konsentrasi biosafety untuk sel 3T3-E1. Viabilitas sel menurun dengan cara yang bergantung pada waktu dan konsentrasi, yang menyiratkan bahwa TiO2 dan ZrO2 NP berpotensi sitotoksik setelah paparan lebih lama dari dosis yang lebih tinggi dibandingkan dengan nanopartikel logam oksida lainnya, seperti silikon dioksida dan ZnO [4, 28, 29]. Selain itu, ZrO2 NP menunjukkan efek toksik yang lebih kuat daripada TiO2 NP dalam penelitian kami pada konsentrasi toksik yang tinggi.
Oxidative stress, a byproduct of outpaced ROS generation and decreased antioxidant factors, is known as one crucial factor in nanomaterial-induced cytotoxicity, and it is reported to trigger cell apoptosis through distinct mechanism [30, 31]. Furthermore, Kozelskaya et al. [12] observed that ZrO2 NPs induced the increase of membrane microviscosity, cell morphology changes, and surface cracks on the red blood cells due to the oxidative stress. In agreement with these studies, we detected the ROS levels in 3T3-E1 cells after TiO2 and ZrO2 NP treatment and found that TiO2 and ZrO2 NPs could induce significant ROS generation in concentration-dependent manners, and ZrO2 NPs induced more potent oxidative stress effects. Moreover, the elevated ROS levels could be eliminated by NAC which is a ROS scavenger. These results suggested the important role of ROS in TiO2 and ZrO2 NP-induced cell cytotoxicity.
Apoptosis is a type of cell death which clears the senescent and abnormal cells, so as to sustain the cell biological functions [32]. Some studies have reported that apoptosis was one of the main toxic responses after treating with oxide metal nanomaterials, such as TiO2 , ZnO, Si, and Ag [33,34,35,36]. In our study, we found that TiO2 and ZrO2 NPs could induce apoptotic/necrotic body formation in 3T3-E1 cells in time/concentration-dependent manners, which was correlated with the decreased cell viability shown previously. Moreover, we found that when large parts of late apoptotic or necrotic cells were observed after ZrO2 NP treatment, the cell status for TiO2 NPs largely was early apoptosis. These phenomena applied that ZrO2 NPs induced more rapid and potent apoptosis effects. Similarly, other studies also showed that ZrO2 NPs induced significant apoptotic and necrotic processes in MSTO cells [4, 11].
The cytoskeleton metabolism is a dynamic biological process involving polymerization and depolymerization, which could sustain cell morphology and promote cell function. Some studies have shown that nanomaterials could affect the cell morphology and cytoskeleton system [37,38,39]. We found 3T3-E1 cells became smaller and rounded in the high-dose group of TiO2 and ZrO2 NPs (100 μg/mL), along with decreased cell area due to cytoskeleton disruptions. These findings were also supported by previous reports that ZrO2 NP treatment could induce cell morphology changes in MSTO cells at higher concentration [4]. Another study showed the disrupted blood cell morphology after ZrO2 NP treatment [12].
Alizarin red staining is a key indicator of osteogenic responses. In our study, no impact on osteogenic induction has been shown by TiO2 and ZrO2 NP treatment (10 μg/mL), except that cells treated with a cytotoxic dose of TiO2 and ZrO2 NPs (100 μg/mL) had a significant decrease of mineralized nodules due to the potential inhibition of osteoinductive properties. In addition, the expression level of osteogenesis-related genes was important biomarkers. Our results showed that lower concentration (10 μg/mL) of TiO2 and ZrO2 NPs promoted the expression of osteogenesis-related genes; however, TiO2 and ZrO2 NPs at high concentrations (100 μg/mL) could significantly inhibit gene expression for both early- and late phases of mineralization, indicating that TiO2 and ZrO2 NPs at high concentrations indeed inhibited osteoinductive properties. Other studies also obtained similar results; they claimed that TiO2 NPs inhibited the osteogenesis of osteoblasts in a size-dependent manner while potentially promoted osteoclastogenic process [33]. Sengstock et al. [40] found that sub-toxic concentrations of Ag NPs and Ag ions could significantly impair the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. More ongoing or newly initiated researches are focused on developing nanoparticles with acceptable biosafety and osteogenic potential to promote osseointegration for in vivo application [18, 41].
In conclusion, our data indicated that ZrO2 NPs were nanoparticles with good biocompatibility, just like TiO2 NPs, while they could induce toxic effects at high toxic concentrations on 3T3-E1 cells. ROS played a key role on TiO2 and ZrO2 NP-induced cytotoxicity, including cell viability, apoptosis and necrosis, and changes in cell morphology. Moreover, TiO2 and ZrO2 NPs at high concentrations showed inhibitory effects on osteogenic differentiation of 3T3-E1 cells. Our findings could provide deep insights into the biocompatibility and potential application of ZrO2 NPs.
Silver
Alkali fosfatase
Collagen 1α1
Hamburan cahaya dinamis
Fetal bovine serum
T -acetyl-l-cysteine
Nanopartikel
Osteocalcin
Optical density
Osteopontin
Phosphate-buffered saline solution
Reactive oxygen species
Runt-related transcription factor 2
Silica
Mikroskop elektron transmisi
Titanium dioxide
Zirconia
Minimum essential medium-alpha
bahan nano
Abstrak Magnetit (Fe3 O4 )-emas (Au) core-shell nanopartikel (NPs) memiliki sifat magnetik dan optik yang unik. Ketika dikombinasikan dengan bagian biologis, NP ini dapat menawarkan strategi baru untuk aplikasi biomedis, seperti pengiriman obat dan penargetan kanker. Di sini, kami menyajikan metode
Abstrak Dalam karya ini, titik kuantum perovskit (PQD) yang didoping timah anorganik dimasukkan ke dalam sel surya perovskit (PSC) berbasis karbon untuk meningkatkan kinerja fotovoltaiknya. Di satu sisi, dengan mengontrol konten Sn2+ doping, tingkat energi dari PQD yang didoping timah dapat disesua
Abstrak Nano-hidroksiapatit (nano-HA) telah menarik perhatian besar di bidang kedokteran regeneratif. Interaksi sel endotel (EC)-sel punca mesenkim (MSC) diperlukan untuk rekonstruksi tulang, tetapi cara nano-HA berinteraksi dalam proses ini masih belum diketahui. Di sini, kami menyelidiki efek sit
Abstrak Hipertermia adalah salah satu metode yang paling ramah pasien untuk menyembuhkan penyakit kanker karena non-invasif, efek samping dan toksisitas yang diinduksi minimal, dan implementasi yang mudah, mendorong pengembangan metode terapi baru seperti sistem dosis pemicu fototermal. Penelitian
