Nanopartikel Zirkonia Memicu Sitotoksisitas Mediasi ROS dan Menekan Diferensiasi Osteogenik dalam Osteoblast 3T3-E1
Abstrak
Nanopartikel zirkonia (ZrO2) semakin banyak digunakan dalam biosensor, terapi kanker, implan, dan gigi karena kekuatan mekanis tinggi dan toksisitas yang rendah yang dilaporkan. Namun, seiring dengan penggunaan yang semakin luas, paparan manusia yang potensial juga meningkat, sehingga profil toksikologis yang jelas sangat penting. Nanopartikel titanium dioksida (TiO2), yang dikenal memiliki toksisitas lemah, digunakan sebagai acuan dalam studi ini. Kami memeriksa sitotoksisitas TiO2 dan ZrO2 NP pada sel osteoblas-like 3T3-E1, dengan fokus pada generasi spesies reaktif oksigen (ROS), apoptosis, perubahan morfologi, dan diferensiasi osteogenik. Keduanya NP menginduksi ROS secara bergantung pada konsentrasi, yang mengarah pada apoptosis dan perubahan morfologi sel pada konsentrasi tinggi. Dosis tinggi juga mengurangi diferensiasi osteogenik, dengan ZrO2 NP menunjukkan toksisitas yang lebih jelas dibandingkan TiO2 NP. Temuan ini menyoroti kebutuhan akan manajemen dosis yang hati-hati ketika mempertimbangkan nanoparticle ZrO2 dalam aplikasi biomedis.
Pendahuluan
Nanopartikel (NP) yang direkayasa telah menyebar ke berbagai sektor, dari elektronika hingga kedokteran. Nanopartikel zirkonia (ZrO2), yang dihargai karena keandalan mekanisnya, sekarang umum dalam biosensor, terapeutik kanker, implan, dan bahan gigi [1, 2]. Meskipun keuntungannya, penggunaan yang semakin luas ZrO2 NP menimbulkan keberatan yang sah tentang risiko kesehatan dan lingkungan yang potensial. Data toksikologis yang ada masih langka dan kadang-kadang bertentangan: beberapa studi melaporkan kompatibilitas biologis yang sangat baik dibandingkan oksida lain seperti oksida besi, TiO2, atau ZnO [3–6], sementara studi lain telah mendeteksi sitotoksisitas ringan atau kerusakan seluler [7–12].
Pekerjaan sebelumnya juga telah menunjukkan bahwa nanoparticle dapat meningkatkan diferensiasi osteogenik dalam osteoblast [14–17]. Namun, profil keamanan ZrO2 NP, terutama terkait fungsi sel tulang, masih tidak jelas. Studi ini mengevaluasi efek sitotoksik ZrO2 NP pada sel 3T3-E1, menggunakan TiO2 NP sebagai kontrol yang baik. Hasil yang dinilai meliputi vitalitas sel, produksi ROS, apoptosis, morfologi, dan penanda osteogenik.
Bahan dan Metode
Persiapan dan Karakterisasi Bahan
TiO2 (CAS 637262) dan ZrO2 (CAS 544760) NP dibeli dari Sigma-Aldrich dan dikarakterisasi oleh mikroskopi transmisi elektron (TEM), potensi zeta, dan pencaharan cahaya dinamis (DLS). TEM menyediakan morfologi dan ukuran partikel primer, sementara DLS menilai aglomerasi dalam medium kultur lengkap. Sebelum paparan sel, NP di-sonikasi selama 30 menit dan dicairkan ke konsentrasi yang diinginkan dalam α-MEM.
Kultur Sel 3T3-E1
Sel 3T3-E1 dipertahankan dalam α-MEM yang dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% antibiotik/antimikotik, pada 37 °C, 5% CO2. Medium diperbarui setiap hari lain.
Uji Proliferasi Sel
Vitalitas sel diukur menggunakan uji CCK-8. Sel (5 × 103 per lubang) diekspos kepada TiO2 atau ZrO2 NP (0–150 μg/mL) selama 24 atau 48 jam, dengan atau tanpa N-asetil-l-sistein (NAC) 10 mM. Setelah inkubasi 2 jam dengan CCK-8, reagent dipindahkan ke piring baru untuk menghindari interferensi NP, dan absorbansi diukur pada 450 nm.
Analisis Apoptosis Annexin V
Setelah paparan 48 jam, sel dipanen, diwarnai dengan FITC-Annexin V dan iodida propidium, dan dianalisis dengan citometri aliran untuk mengukur apoptosis awal dan akhir.
Analisis Generasi ROS
ROS seluler diukur menggunakan DCFH-DA setelah paparan NP (0–100 μg/mL) selama 48 jam. Fluoresensi terdeteksi oleh citometri aliran.
Mikroskopi Konfokal
Pada 24 jam, sel pada coverslip diperbaiki, dimepermeabilisasi, dan diwarnai untuk α-tubulin (hijau), F-aktin (merah), dan inti (biru). Citra dilakukan dengan mikroskopi konfokal Olympus FV10i.
Deteksi Induksi Mineralisasi
Sel dibudidayakan selama 7, 14, atau 21 hari dengan 10 atau 100 μg/mL NP, kemudian diperbaiki dan diwarnai dengan alizarin merah S untuk memvisualisasikan nodul mineralisasi.
Ekstraksi RNA dan RT-PCR
RNA total diisolasi, ditranskripsi balik, dan dikuantifikasi dengan RT-PCR green SYBR. Gen osteogenik (RUNX2, COL1α1, ALP, OPN, OCN, BSP) diperiksa pada hari 3, 7, 14, dan 21.
Analisis Statistik
Data diekspresikan sebagai rata-rata ± SEM. ANOVA dengan tes pasca-uji Bonferroni atau Dunnett’s T3 mengevaluasi signifikansi (p < 0,05).
Hasil
Karakterisasi Nanopartikel
TEM menunjukkan TiO2 dan ZrO2 NP sebagai bola berbentuk batang dengan diameter primer 25,4 ± 2,8 nm dan 31,9 ± 1,9 nm, masing-masing. DLS menunjukkan ukuran hidrodinamik 81,2 nm (TiO2) dan 93,1 nm (ZrO2), yang mengindikasikan aglomerasi sedang dalam medium. Potensi zeta adalah +32,9 mV (TiO2) dan +42,4 mV (ZrO2), yang menunjukkan stabilitas koloid yang baik (Gambar 1).
Gambar 1. (a) Citra TEM TiO2 dan ZrO2 NP. (b) Distribusi ukuran DLS. (c) Distribusi NP pada sel 3T3-E1 setelah paparan 1 jam.
Penilaian Sitotoksisitas
Uji CCK-8 menunjukkan tidak ada toksisitas yang signifikan pada 10 μg/mL untuk keduanya NP. Vitalitas menurun pada konsentrasi di atas 20 μg/mL, mencapai <50% pada 150 μg/mL setelah 48 jam (Gambar 2). NAC secara parsial memulihkan vitalitas, mengonfirmasi keterlibatan ROS.
Gambar 2. Vitalitas sel setelah paparan TiO2 (a) dan ZrO2 (b) NP, dengan dan tanpa NAC.
Generasi ROS
Keduanya NP menginduksi ROS secara bergantung pada konsentrasi, mencapai puncak pada 100 μg/mL setelah 48 jam. ZrO2 NP menghasilkan tingkat ROS yang lebih tinggi pada konsentrasi lebih rendah daripada TiO2. NAC secara efektif menekan ROS (Gambar 3).
Gambar 3. Tingkat ROS setelah paparan NP.
Apoptosis dan Nekrosis
Citometri aliran menunjukkan apoptosis yang bergantung pada dosis. Pada 50 μg/mL, sel apoptotik/nekrotik akhir naik menjadi 43% (ZrO2) dan 29% (TiO2). Pada 100 μg/mL, apoptosis awal lebih jelas dengan TiO2 (34%) dibandingkan ZrO2 (17%) (Gambar 4).
Gambar 4. Profil apoptosis dan nekrosis setelah paparan NP.
Perubahan Morfologi
Citra konfokal menunjukkan perubahan minimal pada 10 μg/mL. Pada 100 μg/mL, sel menyusut, menunjukkan morfologi bundar, dan menampilkan filamen aktin dan mikro tubus yang terganggu. Analisis kuantitatif mengonfirmasi penurunan luas sel (Gambar 5).
Gambar 5. Perubahan luas sel setelah paparan 24 jam.
Gambar 6. Organisasi sitoskeletal setelah perawatan NP.
Mineralisasi
Pewarnaan alizarin merah tidak menunjukkan mineralisasi yang signifikan pada 10 μg/mL selama 14–21 hari. Pada 100 μg/mL, nodul mineral terpadu berkurang dan kurang terdefinisi, mengindikasikan kapasitas osteogenik yang terpengaruh (Gambar 7).
Gambar 7. Pewarnaan alizarin merah nodul mineral terpadu.
Ekspresi Gen
RT-PCR menunjukkan pengaturan naik RUNX2, COL1α1, dan ALP pada 10 μg/mL, mencapai puncak pada hari 3. Paparan dosis tinggi (100 μg/mL) menurunkan gen-gen ini pada hari 7. Penanda fase akhir (OPN, OCN, BSP) meningkat pada 10 μg/mL tetapi tertekan pada 100 μg/mL (Gambar 8).
Gambar 8. Ekspresi gen osteogenik dari waktu ke waktu.
Diskusi
Data kami mengonfirmasi bahwa ZrO2 NP kompatibel biologis pada konsentrasi rendah tetapi menjadi sitotoksik di atas 20 μg/mL, terutama melalui apoptosis yang diusulkan ROS dan gangguan sitoskeletal. Dibandingkan dengan TiO2, ZrO2 menimbulkan stres oksidatif yang lebih kuat dan apoptosis yang lebih cepat pada setara dosis. Produksi ROS yang diamati kemungkinan berasal dari interaksi nanoparticle dengan membran mitokondria, selaras dengan laporan sebelumnya tentang kerusakan organel oleh ZrO2 [12].
Pengurangan diferensiasi osteogenik pada dosis NP tinggi selaras dengan mineralisasi yang berkurang dan pengaturan bawah gen osteogenik kunci. Temuan ini menyoroti pentingnya optimasi dosis untuk setiap bahan biomedik berbasis ZrO2, terutama dalam implan yang menahan beban di mana oseointegrasi sangat penting.
Kesimpulan
Nanopartikel zirkonia umumnya aman untuk sel tulang pada konsentrasi rendah tetapi menunjukkan sitotoksisitas yang bergantung pada dosis, generasi ROS, apoptosis, dan penekanan osteogenesis pada tingkat yang lebih tinggi. Wawasan ini penting untuk desain rasional bahan biomedik yang mengandung ZrO2.
