Penilaian Efisiensi Serapan Seluler Menurut Beberapa Inhibitor Nanopartikel Cangkang Inti Fe3O4-Au:Kemungkinan untuk Mengontrol Endositosis Spesifik pada Sel Kanker Kolorektal
Abstrak
Magnetit (Fe3 O4 )-emas (Au) core-shell nanopartikel (NPs) memiliki sifat magnetik dan optik yang unik. Ketika dikombinasikan dengan bagian biologis, NP ini dapat menawarkan strategi baru untuk aplikasi biomedis, seperti pengiriman obat dan penargetan kanker. Di sini, kami menyajikan metode yang efektif untuk penyerapan seluler yang dapat dikontrol dari sistem NP cangkang inti magnetik yang dikombinasikan dengan bagian biologis. Vimentin, yang merupakan protein struktural, telah dikonfirmasi secara biokimia untuk mempengaruhi fagositosis secara kuat. Selain itu, vimentin mempengaruhi internalisasi bahan eksogenik ke dalam sel meskipun di bawah beberapa penghambatan bagian biologis. Dalam penelitian ini, kami mendemonstrasikan kinerja internalisasi seluler Fe3 O4 -Au core-shell NP dengan modifikasi permukaan menggunakan kombinasi bagian biologis. Fotofluoresensi NP yang ditandai vimentin tetap tidak terpengaruh di bawah beberapa tes penghambatan, menunjukkan bahwa NP secara minimal dipengaruhi oleh nistatin, dynasore, cytochalasin D, dan bahkan antibodi Muc1 (Ab). Akibatnya, hasil ini menunjukkan bahwa Muc1 Ab dapat menargetkan molekul tertentu dan dapat mengontrol endositosis spesifik. Selain itu, kami menunjukkan kemungkinan mengendalikan endositosis spesifik dalam sel kanker kolorektal.
Pengantar
Nanomaterials telah membuka jalan baru untuk diagnostik klinis dan terapi. Terutama, nanopartikel (NP) adalah salah satu alat yang paling penting dan telah digunakan dalam aplikasi seperti biosensor [1, 2], diagnostik [3, 4], dan sistem penghantaran obat yang ditargetkan [5, 6]. Untuk aplikasi biomedis, NP umumnya terdiri dari bahan organik yang mengelilingi permukaan pada bahan inti [7,8,9]. Bahan inti, yang terdiri dari bahan magnetik, bahan semikonduktor, atau jenis bahan lainnya, memiliki sifat fisikokimia yang berguna, dan permukaan organik luar memberikan stabilitas dan fungsionalitas kimia pada NP. Untuk aplikasi dalam sistem penargetan biologis, tidak hanya sifat fisikokimia tetapi juga permukaan organik luar, yang difungsikan untuk penargetan, merupakan parameter penting. Contoh bagian penargetan untuk fungsionalisasi adalah antibodi atau ligan yang spesifik untuk suatu target. Tergantung pada bahan biofungsional pada permukaan luar, mekanisme endositosis NP ditentukan. Mekanisme yang memungkinkan NP untuk memasuki sel telah menjadi subjek dari banyak penelitian terbaru karena kepentingannya dalam aplikasi nanomedicine [10,11,12,13,14,15].
Secara khusus, NP magnetik telah banyak digunakan di banyak aplikasi penargetan situs tertentu, termasuk penyortiran sel [16, 17], MRI [18], isolasi DNA [19], pengiriman obat [20], pengobatan hipertermia [21], dan kanker. menargetkan [22]. Di antara berbagai NP magnetik, nanocrystals magnetit telah paling banyak digunakan dalam aplikasi biomedis karena biokompatibilitas dan stabilitas kimianya. Meskipun banyak upaya telah dikhususkan untuk aplikasi biomedis menggunakan NP magnetik, masih ada beberapa masalah penting seperti dispersibilitas yang baik dalam larutan berair, fungsionalitas, dan biokompatibilitas. Untuk mengatasi masalah ini, banyak penelitian telah difokuskan pada modifikasi permukaan NP menggunakan berbagai gugus fungsi (misalnya, gugus karboksil dan amina) [23]. Namun, perlekatan gugus fungsi ke permukaan NP magnetit adalah proses yang memakan waktu dan melelahkan. Mengingat fakta ini, NP magnetik berlapis Au tipe cangkang inti menarik karena permukaan Au dapat terhubung dengan mudah ke biomolekul dan bahan organik.
Khususnya, sifat magnetik dari inti magnetik-Au shell NP memungkinkan pemisahan magnetik, meningkatkan resolusi dalam pencitraan MRI, dan dapat diterapkan pada terapi hipertermia. Selain itu, sifat pengikatan kimia emas yang unggul menguntungkan untuk membangun sistem pengiriman yang dimediasi reseptor untuk penargetan kanker tertentu [24,25,26].
Selama beberapa dekade terakhir, banyak peneliti telah melaporkan sistem pengiriman yang dimediasi reseptor untuk penargetan kanker [27,28,29].
Penargetan sel kanker yang dimediasi reseptor adalah bentuk penargetan aktif. Pilihan target adalah kunci untuk penargetan aktif yang efektif, dan target harus diekspresikan secara berlebihan pada membran ekstraseluler. Kebanyakan peneliti telah menggunakan antibodi monoklonal untuk pengobatan kanker, dan efek terapeutik bisa sangat meningkat ketika terapi antibodi monoklonal dikombinasikan dengan kemoterapi konvensional [30]. Terlepas dari keberhasilan terapi antibodi monoklonal, antibodi monoklonal menghadirkan beberapa keterbatasan dalam penargetan kanker. Ukurannya yang besar (sekitar 150 kDa) merupakan hambatan utama untuk penetrasi tumor [31, 32], dan stabilitasnya yang rendah serta kelarutannya yang rendah menghambat penggunaannya secara luas [33]. Arah keterikatan yang tidak homogen pada pembawa penargetan juga dianggap sebagai hambatan untuk pengikatan nonspesifik. Untuk menghasilkan antibodi dengan penetrasi tumor yang lebih baik, berbagai format antibodi telah direkayasa dan diuji [34]. Terlepas dari antibodi klasik, format antibodi unik hadir pada spesies dari keluarga Camelidae. Apa yang disebut antibodi rantai berat (HCAbs) terjadi secara alami dalam darah tepi dan susu spesies ini. Fragmen pengikat antigen dari HCAb tersebut terdiri dari satu domain tunggal, domain variabel rantai berat (VH) dari HCAb unta (VHH). VHH, diperoleh secara rekombinan setelah kloning dan ekspresi pada bakteri atau jamur, disebut nanobody. Ia memiliki berat molekul 11-15 kDa dan merupakan antibodi terkecil di antara semua mAbs [35,36,37]. Tidak hanya ukurannya yang kecil membuatnya berpotensi cocok sebagai probe penargetan terhadap antigen di lokasi yang terisolasi, tetapi juga ujung terminalnya yang mudah dimodifikasi menarik untuk aplikasi dalam penargetan kanker.
Pengiriman NP yang efisien dengan penargetan yang sesuai dan internalisasi sel juga merupakan faktor penting dalam sistem pengiriman. Telah dilaporkan bahwa vimentin berperan penting sebagai komponen perlekatan patogen dan jalur masuk intraseluler. Membungkam ekspresi gen vimentin menghambat fagositosis [38], sedangkan vimentin terbelah adalah sinyal yang secara signifikan meningkatkan fagositosis [39]. Oleh karena itu, menetralkan resistensi fagositosis sel yang disebabkan oleh vimentin pada permukaan sel penting untuk pengiriman nanopartikel yang efisien.
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki jalur endositosis Fe3 . yang diberi tag nanobody O4 -Au core-shell NP dimodifikasi dengan spacer PEG (polyethylene glycol) dengan panjang berbeda. Vimentin, yang diketahui memiliki efek kuat pada fagositosis oleh eksperimen biokimia [39], dibandingkan sebagai kontrol, dan dipastikan bahwa ia secara efektif bekerja pada internalisasi sel NP. Selain itu, Muc1, yang merupakan glikoprotein permukaan sel dan diekspresikan secara berlebihan pada berbagai kanker, seperti kanker pankreas, payudara, paru-paru, dan perut, digunakan sebagai biomarker penargetan kanker. Kami mengkonfirmasi internalisasi Fe3 efficient yang efisien O4 Au core-shell NP dan metode penargetan yang dapat dikontrol ke sel kanker melalui jalur endositosis yang dimediasi reseptor Muc1 dalam sel kolon.
Bahan dan Metode
Materi
Emas (III) asetat (Au(OOCCH3)3, 99,9%) diperoleh dari Alfa Aesar. Bahan kimia lainnya termasuk besi (III) asetilasetonat (Fe(akac)3 , 99,9%), 1,2-hexadecanediol (C14H29CH(OH)CH2(OH), 90%), poli(etilena glikol)-blok-poli(propilen glikol)-blok-poli(etilena glikol) (PEG-PPG- PEG), dan oktil eter (C8H17OC8H17, 99%) dibeli dari Sigma-Aldrich dan digunakan saat diterima. Alpha-pyridyl-2-disulfid-omega-carboxy succinimidyl ester poly(ethylene glycol) (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K, dan 10K) dibeli dari Nanocs. Sodium bicarbonate, WST-1, chlorpromazine, nistatin, cytochalasin D, dynasore, brefeldin A (BFA), monensin, dan trypan blue dibeli dari Sigma-Aldrich. Cy3 dan Cy7.5 dibeli dari Lumiprobe. Anti-Muc1 Ab dibeli dari Abcam Inc. (Cambridge, MA). Phosphate-buffered saline (PBS), medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco, dan serum janin sapi dibeli dari Invitrogen Corp.
Sintesis Fe3 O4 -Au Core-Shell NP
Fe3 O4 -Au inti-shell NP disintesis melalui metode nanoemulsion. Proses sintetik untuk NP cangkang inti terdiri dari dua langkah:(1) pembentukan Fe3 O4 NP inti dan (2) pelapisan kulit Au pada NP magnetik. Pada langkah pertama, Fe3 O4 NP dibuat dari larutan campuran Fe(acac)3 (0,1766 g atau 0,5 mmol), 1,2-hexadecandiol (0,6468 g atau 2,5 mmol), dan kopolimer blok (poli(etilen oksida)-poli(propilena oksida)-poli(etilen oksida); PEO-PPO-PEO) ( 0,4 ~ 1,2 g) dalam oktil eter. Campuran larutan dipanaskan pada suhu 300 °C untuk mereduksi prekursor Fe. Pembentukan Fe3 O4 NP inti diselesaikan dengan mendinginkan larutan yang dipanaskan. Proses kedua terus dilakukan tanpa proses pemurnian setelah pembentukan inti magnet. Prekursor Au (0,2338 g atau 0,62 mmol) dan 1,2-hexadecandiol (0,88 g, 3,4 mmol) ditambahkan ke dalam emulsi yang terdiri dari Fe3 O4 NP, kemudian larutan campuran dipanaskan pada suhu 230 °C. Setelah pendinginan hingga suhu kamar, emulsi diendapkan dengan sentrifugasi dan NP cangkang inti dipisahkan.
Reaksi berantai polimerase (PCR) dilakukan dengan menggunakan primer maju 5′-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3′ dan primer terbalik 5′-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3′. Produk PCR dicerna dengan EcoRI dan XhoI dan dimurnikan dengan menggunakan Kit Ekstraksi Gel cepat QIA (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Produk PCR yang dimurnikan diklon ke dalam EcoRI/XhoI-digested pET-23a (Novagen, Darmstadt, Jerman). Escherichia coli (E.coli ) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) ditransformasikan dengan konstruksi yang dihasilkan dengan kejutan panas dan dipilih pada pelat agar LB yang mengandung ampisilin 100 μg/mL (Duchefa Biochemie, Haarlem, Belanda).
Ekspresi dan Pemurnian Protein Rekombinan
Untuk mengekspresikan dan memurnikan protein anti-Muc1-VHH 5-24 K10 rekombinan, E. koli Strain BL21 (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) ditransformasikan dengan pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Bakteri kemudian ditumbuhkan dalam kaldu LB yang mengandung ampisilin (100 μg/mL). Ekspresi protein diinduksi oleh isopropil -d-thiogalactoside (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Belanda) pada konsentrasi akhir 0,4 mM selama 5 h pada 37 °C. Pelet bakteri disuspensikan kembali dalam buffer lisis (50 mM NaH2 PO4 , pH 8.0; 300 mM NaCl) diikuti dengan sonikasi di atas es selama 10 min. Lisat yang disonikasi disentrifugasi pada 20.000×g selama 20 min pada 4 °C dan dikenai Ni-NTA His·Bind Resin (Peptron, Daejeon, Korea). Protein-nya yang terikat pada resin dielusi dengan buffer elusi (50 mM NaH2 PO4 , pH 8.0; 300 mM NaCl; 150 mM imidazol). Protein murni dipisahkan pada gel SDS-PAGE 15%.
Modifikasi Core-Shell Fe3 O4 -Au NP
OPSS-PEG-NHS pada berbagai panjang (2, 5, dan 10 K) dilarutkan dalam 0,1 M natrium bikarbonat untuk aktivasi gugus tiol. OPSS-PEG-NHS yang telah diaktifkan ditambahkan ke dalam larutan Fe3 cangkang inti yang disintesis O4 -Au NP dan diaduk selama 12 h pada 4 °C. Kelompok tiol dari OPSS-PEG-NHS yang diaktifkan secara kovalen terkait dengan permukaan Au dari NP cangkang inti. Kemudian, larutan nanobody (0,25 mg/mL) ditambahkan ke PEGylated Fe3 O4 -Au core-shell NP selama 12 h pada 4 °C. Gugus amina dari sepuluh ekor lisin (K) di terminal secara kovalen terkait dengan gugus NHS dari OPSS-PEG-NHS pada pH 8.3. Cy3 dan Cy7.5 ditandai dengan gugus amina residu dari badan nano.
Kurva Internalisasi
Sel CT26 diunggulkan pada 5 × 10
3
sel per sumur dalam pelat 96-sumur yang jelas dan diinkubasi dalam 250 μL media kultur selama 24 h pada 37 °C dalam 5% CO2 dalam gelap. Media dihilangkan, dan 250 μL media kultur segar mengandung 50 μg/mL Fe berlabel Cy33 O4 -Au NP dan NP berlabel PEG-Cy3 atau PEG-nanobody-Cy3 ditambahkan ke setiap sumur. Sel-sel selanjutnya diinkubasi untuk periode yang berbeda (0, 10, 20, 30, 60, 120, dan 360 min). Sel-sel kemudian dicuci tiga kali dengan PBS untuk menghilangkan NP bebas, dan fluoresensi masing-masing sumur diukur dengan trypan blue sebagai pemadam fluoresensi kedap-membran oleh SpectraMAX GEMINI (Perangkat Molekuler, CA, USA). Setiap percobaan dilakukan dengan jumlah NP yang sama (50 μg/mL) dan diulang tiga kali [40].
Uji Inhibisi
Sel CT26 diunggulkan pada 5 × 10
3
sel per sumur dalam pelat 96-sumur yang jelas dan diinkubasi dalam 250 μL medium selama 24 h pada 37 °C dalam 5% CO2 dalam gelap. Media dihilangkan dan 250 μL media kultur segar yang mengandung 20 μg/mL klorpromazin (CPZ), 50 μg/mL nistatin, 20 μg/mL cytochalasin D, 25 μg/mL dynasore, 20 μg/mL BFA, 140 μg/ mL monensin, atau 5 μM anti-Muc1 Ab ditambahkan, dan sel diinkubasi selama 1 jam.
Media dipindahkan lagi, dan 250 μL media kultur yang mengandung 50 μg/mL Fe berlabel Cy33 O4 -Au NP, NP berlabel PEG-Cy3, NP berlabel PEG-nanobody-Cy3, atau NP berlabel vimentin-Cy3 telah ditambahkan.
Setelah 1 jam pada 37 °C dan 5% CO2 , sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS untuk menghilangkan NP bebas, dan fluoresensi diukur dengan trypan blue sebagai pemadam fluoresensi kedap-membran oleh SpectraMAX GEMINI (Perangkat Molekuler, CA, USA). Setiap percobaan dilakukan dengan jumlah NP yang sama (50 μg/mL) dan diulang empat kali.
Hasil dan Diskusi
NP inti-kulit disintesis dengan metode yang diterbitkan [16, 17]. Pengamatan mikroskop elektron transmisi (TEM) pada Gambar 1a, b menunjukkan bahwa Fe3 O4 -NP cangkang inti Au berbentuk bola dengan diameter rata-rata 13,5 nm dan distribusi ukuran yang sempit.
Karakterisasi Fe3 . yang disintesis O4 -Au inti-shell NP. a , b Pengamatan TEM Fe3 . yang disintesis O4 -Au inti-shell NP. c , d NP dalam larutan berair, sebelum dan sesudah menerapkan medan magnet eksternal. e Puncak absorbansi UV dari NP cangkang inti yang disintesis muncul pada ~ 530 nm. f Loop histeresis magnetik Fe3 O4 inti
Peningkatan dari ~ 8.5 nm NP inti (Fe3 O4 ) berasal dari pelapisan kulit Au setebal ~ 2,5 nm pada permukaan inti, menghasilkan NP cangkang inti. Gambar TEM resolusi tinggi dengan analisis transformasi Fourier (FFT) cepat dari Fe3 O4 -Au core-shell NP disertakan dalam Informasi Tambahan Gambar. S1.
Produk yang diproduksi dalam pelarut organik dimurnikan menggunakan pemisahan magnetik dan dipindahkan ke dalam air.
NP cangkang inti tersebar dengan baik dan stabil dalam air tanpa modifikasi permukaan apa pun, karena kopolimer blok residu yang ada pada NP.
Gambar 1c dan d menunjukkan NP dalam larutan berair sebelum dan sesudah menerapkan medan magnet eksternal. Di bawah medan magnet eksternal, NP cangkang inti dengan cepat berubah dari dispersi homogen (Gbr. 1c) menjadi larutan bening dan transparan (Gbr. 1d).
Pita serapan NP cangkang inti diselidiki menggunakan spektrometri UV-Vis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1e, puncak absorbansi muncul pada ~ 530 nm, menunjukkan adanya Au pada permukaan NP (Informasi Tambahan Gambar. S2 mencakup hasil data EDX untuk Fe3 O4 -Au inti-shell NP). Saat sampel telah dimurnikan, hasil optik menunjukkan pembentukan struktur cangkang inti.
Loop histeresis magnetik diperoleh dari pengukuran sampel bergetar untuk menyelidiki sifat magnetik Fe3 O4 inti dan NP inti-kulit. Kedua NP menunjukkan perilaku superparamagnetik dengan koersivitas mendekati 0 Oe pada suhu kamar (Gbr. 1f).
Seperti yang dilaporkan dalam karya sebelumnya, kerentanan NP cangkang inti lebih tinggi daripada NP magnetit, yang sebagian dapat disebabkan oleh efek kedekatan dan konfigurasi spasial yang unik [41, 42]. Selain itu, magnetisasi saturasi dari NP inti dan NP cangkang inti masing-masing adalah ~ 37 emu/g dan ~ 21 emu/g pada 10 kOe. Perbedaan Ms berasal dari keberadaan komponen nonmagnetik (Au) di NP cangkang inti.
Gen VHH 5-24 K10 dikloning dalam bingkai untuk menghasilkan pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 setelah amplifikasi PCR (Gbr. 2a). Protein rekombinan diekspresikan dalam E. koli BL21 yang ditransformasi dengan pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 setelah diinduksi dengan IPTG dan dimurnikan dengan Ni-NTA His·Bind Resin. Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 rekombinan siap diekspresikan dalam E. koli sebagai protein 18-kDa yang larut. Dari kultur 1-L, kami memperoleh 1 ± 0,5 mg anti-Muc1-VHH 5-24 K10 rekombinan murni.
Ekspresi dan pemurnian protein fusi anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Gen VHH 5-24 K10 dikloning dalam bingkai untuk menghasilkan a pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 setelah b pemurnian protein fusi Muc1-VHH 5-24 K10. Protein murni dipisahkan pada 15% SDS-PAGE. Jalur 1 tangga protein. Jalur 2 protein murni. c Ilustrasi skema NP berlabel PEG-nanobody-dye yang digunakan dalam penelitian ini
Protein yang dimurnikan diverifikasi oleh 15% gel SDS-PAGE. Pewarnaan biru Coomassie dari protein murni mengungkapkan bahwa itu> 95% murni (Gbr. 2b). Fe3 . yang disintesis O4 -Au NP dimodifikasi dalam tiga langkah, yaitu PEGylation, penandaan antibodi, dan pelabelan pewarna (Gbr. 2c). Setelah setiap langkah modifikasi, potensi zeta diukur untuk memastikan modifikasi yang berhasil. Tabel 1 menunjukkan efek modifikasi pada potensial zeta yang sesuai. Potensi zeta dari NP cangkang inti telanjang adalah 19,8 ± 6,68 mV. PEGilasi NP dilakukan menggunakan OPSS-PEG-NHS. Untuk menghasilkan serangkaian nanokompleks dengan ukuran yang berbeda, digunakan OPSS-PEG-NHS dengan berbagai panjang (2 K, 5 K, dan 10 K).
Setelah PEGylation, potensi zeta berkurang ( 44,9 ± 8,19 mV, 40,7 ± 7,88 mV, dan 39,6 ± 8,74 mV untuk masing-masing 2 K, 5 K, dan 10 K).
Menariknya, setelah penandaan nanobody, potensi zeta jelas meningkat ( 38,5 ± 5,61 mV, 23,3 ± 8,61 mV, dan 31,8 ± 7,37 mV untuk 2 K, 5 K, dan 10 K, masing-masing).
Setelah penandaan pewarna, potensi zeta juga meningkat ( 12,5 ± 7,25 mV, 17,7 ± 3,94 mV, dan 10,6 ± 4,72 mV untuk 2, 5, dan 10 K, masing-masing).
Potensi zeta dari Fe telanjang3 O4 -Au core-shell NP adalah 19,8 ± 6,68 mV. Setelah PEGylation, potensi zeta berkurang hingga mendekati 40 mV. Hasil ini menunjukkan bahwa molekul PEG terikat dengan baik secara kovalen ke kulit Au dari NP cangkang inti karena molekul PEG memiliki gugus fungsi N-hidroksisuksinimida yang bermuatan negatif. Sementara itu, potensi zeta meningkat setelah dye tagging pada nanobody (− 38,5 ± 5,61 mV untuk NP-PEG2 K-nanobody dan 12,5 ± 7,25 mV untuk NP-PEG2 K-nanobody-dye). Hasil ini masuk akal karena nanobody rekombinan memiliki sepuluh ekor lisin di ujung terminal. Setiap jenis nanobody dikategorikan berdasarkan pengukuran potensial zeta, dan untuk menentukan ikatan antibodi pada nanobody, kami mengukur fluoresensi untuk setiap jenis nanobody.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, kami mengkonfirmasi bahwa semua jenis nanopartikel dan nanobody memiliki serapan dan internalisasi seluler yang baik tanpa adanya pembatasan inhibitor. Kurva internalisasi seluler diperoleh dari sel yang diinkubasi dengan adanya Fe berlabel Cy3 50 μg/mL3 O4 -Au NP, NP berlabel PEG-Cy3, dan NP berlabel PEG-nanobody-Cy3 untuk periode yang berbeda (antara 0 dan 360 menit) setelah mengeluarkan media, mencuci NP gratis, dan akhirnya mengukur total fluoresensi sel dengan trypan biru (Gbr. 3).
Fotofluoresensi sel musin CT26 yang dinormalisasi setelah inkubasi dengan 50 μg/mL a Biaya3 O4 -Au NP, b NP PEGylated dan PEG-nanobody-tagged NP, dan c Biaya3 O4 -Au NP, NP bertanda nanobody, dan NP bertanda vimentin pada 37 °C dalam 5% CO2 untuk periode yang berbeda (10, 20, 30, 60, 120, dan 360 min)
Menurut hasil pengukuran intensitas fluoresensi, kita dapat menentukan NP diinternalisasi dalam sel dalam 1 jam (Gbr. 3a). Intensitas fluoresensi NP mencapai maksimum dalam 1 h, dan intensitas fluoresensi secara bertahap menurun setelah mencapai kondisi mapan. Meskipun ada sedikit perbedaan waktu tergantung pada keberadaan Ab, intensitas fluoresensi per waktu budidaya tidak berbeda secara signifikan dari hasil NP telanjang (Gbr. 3b). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3c, dikonfirmasi bahwa efek Ab, dengan menggunakan Ab heterogen dari Muc1 dan vimentin, dapat diabaikan dalam penyerapan seluler dan internalisasi NP.
Dengan uji WST-1, viabilitas (%) sel musin CT26 tergantung pada konsentrasi dan modifikasi permukaan Fe3 O4 -Au core-shell NP diperkirakan mengikuti berbagai waktu pemaparan (Gbr. 4a, b). Kelangsungan hidup sel CT26 tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan setelah 24 jam dan 48 jam paparan, baik dengan dosis yang bervariasi atau setelah modifikasi permukaan NP. Viabilitas sel lebih besar dari 90% pada kedua Fe3 O4 -Au NP (Gbr. 4a) dan NP yang dimodifikasi permukaan (Gbr. 4b).
Viabilitas sel musin CT26 yang diobati dengan Fe3 O4 -Au core-shell NP dan Fe yang dimodifikasi permukaan3 O4 -Au NP pada konsentrasi yang berbeda. a Biaya3 O4 -Au NP dan b NP berlabel PEG-nanobody-Cy3. Setiap grafik eksperimental mewakili rata-rata dari serangkaian empat eksperimen yang berbeda
Gambar 5 menunjukkan bahwa NP memasuki sel musin CT26 melalui berbagai jalur endositosis (dimediasi clathrin, dimediasi caveolae, dan jalur fagositosis / makropinositosis). Menariknya, Gambar 5b menunjukkan bahwa anti-Muc1 Ab juga terutama mempengaruhi endositosis NP berlabel PEG-nanobody-Cy3. Untuk memahami jalur internalisasi NP, kami mencoba untuk menghambat jalur endositosis dengan inhibitor kimia tertentu (Gbr. 5). Jalur endositosis diketahui dibagi menjadi tiga jenis:clathrin-mediated, caveolae-mediated, dan macropinocytosis/phagocytosis.
Fotofluoresensi yang dinormalisasi dari sel musin CT26 yang diobati dengan inhibitor endositosis kimia selama 1 jam dan diinkubasi dengan 50 μg/mL a NP cangkang inti telanjang dan b NP bertanda nanobody pada 37 °C dalam 5% CO2 selama 30 menit. Inhibitor dengan efek statistik pada internalisasi (Siswa t tes, p (*) <0,05 dan p (**) <0,01) ditandai dengan tanda bintang hitam
Dalam penelitian ini, inhibitor digunakan sebagai pendekatan pertama untuk menyelidiki internalisasi NP yang ditandai dengan nanobody. CPZ (inhibitor endositosis yang dimediasi clathrin), nistatin (inhibitor endositosis yang dimediasi caveolae), dynasore (inhibitor dinamin), cytochalasin D (inhibitor fagositosis/makropinositosis), BFA (penghancur aparatus Golgi), monensin (inhibitor lisosom), atau anti-Muc1 Ab (pesaing spesifik reseptor / transporter) diinkubasi dengan sel selama 1 jam. CPZ, nistatin, dynasore, dan cytochalasin D mempengaruhi endositosis NP (Gbr. 5a).
Bagian penargetan adalah kunci keberhasilan penargetan kanker, yang sangat penting dalam terapi kanker. Untuk penargetan, modifikasi permukaan yang efektif sangat penting untuk meningkatkan efisiensi terapeutik dan membatasi efek samping. Fe dengan tag nanobody3 O4 -Au core-shell NP berhasil dibuat dari NP yang disintesis dan nanobody rekombinan. Tabel 1 dengan jelas menunjukkan bahwa setiap langkah modifikasi berhasil dilakukan.
Viabilitas sel adalah salah satu elemen penting untuk aplikasi biologis bahan nano. Viabilitas sel lebih besar dari 90% pada NP cangkang inti telanjang dan NP yang dimodifikasi (Gbr. 4a, b). Hasil ini menyiratkan bahwa Fe3 O4 -Au NP dan NP yang dimodifikasi tidak menyebabkan sitotoksisitas yang bergantung pada konsentrasi dan modifikasi yang signifikan dan bahwa NP yang dimodifikasi cocok untuk aplikasi biologis.
Studi efisiensi internalisasi dan efek penghambat NP memberikan informasi penting untuk memahami mekanisme melalui mana NP memasuki sel. NP PEGylated relatif lambat diinternalisasi ke dalam sel dibandingkan dengan NP telanjang, tetapi NP nanobody-tagged diinternalisasi ke dalam sel sedikit lebih cepat daripada NP telanjang (Gbr. 3a, b). Karena PEGylation adalah metode modifikasi permukaan yang terkenal untuk mencegah internalisasi NP, kecenderungan internalisasi NP PEGylated mudah dijelaskan. Selain itu, nanobody menginduksi endositosis NP. Untuk memeriksa spesifisitas nanobody, kami mengkonfirmasi tingkat internalisasi NP bertanda Ab vimentin. Menariknya, NP bertanda-A vimentin tidak mendorong internalisasi seluler (Gbr. 3c).
Hasil ini menunjukkan bahwa nanobody dapat secara efektif menginduksi internalisasi nanomaterial ke dalam sel musin CT26 dan menyiratkan bahwa kecenderungan internalisasi dapat dikontrol dengan modifikasi spesifik membran luar NP. Selain itu, mekanisme endositosis NP yang ditandai dengan nanobody ditunjukkan dengan jelas melalui tes penghambatan dan pencitraan mikroskop confocal. Fotofluoresensi dari kedua NP nanobody-tagged dan NP non-tag menunjukkan nilai penurunan yang sama ketika dikultur dengan CPZ, nistatin, atau dynasore (Gbr. 5a, b). CPZ, nistatin, dan dynasore berperan dalam menghambat, masing-masing, endositosis yang dimediasi clathrin, endositosis yang dimediasi caveolae, dan dinamin, yang merupakan GTPase besar yang terlibat dalam tunas dan pemotongan vesikel yang baru lahir dari membran induk. Dengan demikian, nilai fotofluoresensi dalam kedua kasus menurun dengan cepat karena dinamin terkait erat dengan produksi vesikel untuk endositosis yang dimediasi clathrin dan caveolae. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, baik NP non-tagged (Gbr. 5a) dan nanobody-tagged (Gbr. 5b) menunjukkan penurunan cepat dalam fotofluoresensi.
Secara khusus, NP yang ditandai dengan nanobody menunjukkan nilai fotofluoresensi yang lebih rendah secara signifikan di CPZ, nistatin, dan dynasore. Selain itu, kami mengkonfirmasi bahwa NP non-tagged lebih kuat terpengaruh daripada NP nanobody-tagged ketika diterapkan pada cytochalasin D, yang merupakan toksin permeabel sel yang menghalangi polimerisasi filamen aktin untuk fagositosis [43]. Hasil ini menyiratkan bahwa NP yang tidak ditandai diinternalisasi melalui berbagai mekanisme seperti endositosis yang dimediasi clathrin, endositosis yang dimediasi caveolae, dan fagositosis. Akibatnya, internalisasi seluler NP yang ditandai nanobody bergantung pada endositosis yang dimediasi clathrin dan caveolae. Selain itu, jumlah serapan seluler dari nanobody-tagged NP berkurang jauh ketika sel dikultur dengan antibodi Muc1 (Gbr. 5b). Hasil ini menunjukkan bahwa antibodi Muc1 bebas berperan sebagai pesaing nanobody pada NP yang dimodifikasi dalam menempel pada membran sel CT26 dan bahwa antibodi Muc1 memainkan peran penting dalam internalisasi sel dari NP yang dimodifikasi. Khususnya, NP bertanda-A vimentin menunjukkan perbedaan yang jelas dibandingkan dengan NP bertanda-nanobody dalam hal kemampuan penghambatan. Fotofluoresensi NP yang ditandai vimentin tetap tidak terpengaruh di bawah beberapa tes penghambatan, menunjukkan bahwa NP dipengaruhi secara minimal oleh nistatin, dynasore, cytochalasin D, dan bahkan Muc1 Ab. Fenomena ini bisa menjadi bukti kemanjuran vimentin, yang telah dikonfirmasi secara biokimia untuk secara potensial mempengaruhi fagositosis [39]. Akibatnya, hasil ini menunjukkan bahwa Muc1 Ab dapat menargetkan molekul tertentu dan dapat mengontrol endositosis tertentu.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, hasil analog diperoleh ketika sel diperlakukan dengan NP cangkang inti telanjang berlabel Cy7.5 dan NP bertanda-nanobody PEG, menunjukkan serapan seluler yang serupa dalam kedua kasus tanpa adanya penghambatan dynasore. Penghambatan dynasore menginduksi internalisasi seluler yang jelas lebih rendah dari NP bertanda-nanobody PEG dibandingkan dengan NP telanjang (Gbr. 6b, baris bawah). Hasil ini menyiratkan bahwa ada dua mekanisme endositosis, yaitu endositosis non-spesifik dari NP telanjang dan endositosis terbatas dari NP yang ditandai nanobody melalui molekul dinamin. Setelah nanobody menempel pada membran sel eksternal, NP yang ditandai nanobody dapat dengan mudah melewati membran sel karena aktivasi simultan dari mekanisme yang dimediasi clathrin dan caveolae. Akibatnya, kita dapat menduga bahwa mekanisme utamanya adalah endositosis yang dimediasi clathrin dan caveolae untuk internalisasi NP yang ditandai nanobody dalam sel musin CT26.
Pencitraan mikroskopis confocal dari sel musin CT26 yang diinkubasi dengan a Biaya3 O4 -Au NP dan b PEG-nanobody-tagged NPs for 1 h at 37 °C in 5% CO2 incubator, before and after dynasore inhibition (1 ng/mL)
Kesimpulan
Nanomaterials for cancer targeting and controllable insertion of exogenic materials such as drugs, genes, and peptides are critical advances in biomedical applications. These familiar but creative concepts can offer strategies for new therapeutic methods. In this paper, we demonstrated enhanced cellular uptake of Fe3 O4 -Au core-shell NPs after PEGylation with the Muc1 antibody. The main endocytosis mechanisms of nanobody-tagged NPs were demonstrated, showing the possibility of controllable specific endocytosis in colorectal cancer cells. These findings provide insight into the targeting between nanobody-tagged NPs and colorectal cancer cells to aid the design of high-efficiency targeting carriers.
Ketersediaan Data dan Materi
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang dipublikasikan ini.
