Optimisasi Serapan Nanopartikel Core-Shell Fe3O4-Au untuk Endositosis Terarah pada Sel Kanker Kolorektal
Abstrak
Nanopartikel (NP) core-shell magnetit (Fe3O4)-emas (Au) memiliki properti magnetik dan optik yang unik. Ketika digabungkan dengan mojoritas biologis, NP ini dapat menawarkan strategi baru untuk aplikasi biomedis, seperti pengiriman obat dan penargetan kanker. Di sini, kami menyajikan metode efektif untuk serapan selular yang dapat dikontrol dari sistem NP core-shell magnetik yang digabungkan dengan mojoritas biologis. Vimentin, yang merupakan protein struktural, telah dikonfirmasi secara biokimiawi mempengaruhi fagositosis secara kuat. Selain itu, vimentin mempengaruhi internalisasi materi eksogen ke dalam sel meskipun di bawah inhibisi ganda dari mojoritas biologis. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan kinerja internalisasi selular NP core-shell Fe3O4-Au dengan modifikasi permukaan menggunakan kombinasi mojoritas biologis. Fotofluoresensi NP yang ditandai vimentin tidak terpengaruh di bawah tes inhibisi ganda, menunjukkan bahwa NP minimal dipengaruhi oleh nystatin, dynasore, cytochalasin D, dan bahkan anti-Muc1 Ab. Akibatnya, hasil ini menunjukkan bahwa anti-Muc1 Ab dapat menargetkan molekul spesifik dan dapat mengontrol endositosis spesifik. Selain itu, kami menunjukkan kemungkinan mengontrol endositosis spesifik dalam sel kanker kolorektal.
Pendahuluan
Nanomaterial telah membuka jalur baru untuk diagnostik klinis dan terapi. Terutama, nanopartikel (NP) merupakan salah satu alat paling penting dan telah digunakan dalam aplikasi seperti biosensor [1, 2], diagnostik [3, 4], dan sistem pengiriman obat terarah [5, 6]. Untuk aplikasi biomedis, NP umumnya terdiri dari bahan organik yang melingkupi materi inti [7,8,9]. Materi inti, yang terdiri dari materi magnetik, materi semiconductor, atau jenis materi lainnya, memiliki properti fisikokimia yang berguna, dan permukaan organik luar memberikan stabilitas kimia dan fungsionalitas pada NP. Untuk aplikasi dalam sistem penargetan biologis, tidak hanya properti fisikokimia tetapi juga permukaan organik luar, yang difungsikan biologis untuk penargetan, adalah parameter krusial. Contoh mojoritas penargetan untuk difungsikan adalah antibodi atau ligand yang spesifik untuk target. Bergantung pada bahan yang difungsikan biologis pada permukaan luar, mekanisme endositosis NP ditentukan. Mekanisme yang memungkinkan NP masuk ke dalam sel telah menjadi subjek banyak karya penelitian terbaru karena pentingnya dalam aplikasi nanomedisin [10,11,12,13,14,15].
Secara khusus, NP magnetik telah banyak digunakan dalam banyak aplikasi penargetan situs spesifik, termasuk pengurutan sel [16, 17], MRI [18], isolasi DNA [19], pengiriman obat [20], terapi hipertermia [21], dan penargetan kanker [22]. Di antara berbagai NP magnetik, kristal magnetit telah paling banyak digunakan dalam aplikasi biomedis karena kompatibilitas biologis dan stabilitas kimianya. Meskipun banyak upaya telah dianugerahi untuk aplikasi biomedis menggunakan NP magnetik, masih ada beberapa masalah krusial seperti dispersibilitas yang baik dalam larutan air, fungsionalitas, dan kompatibilitas biologis. Untuk mengatasi masalah ini, banyak studi telah berfokus pada modifikasi permukaan NP menggunakan berbagai grup fungsional (misalnya, grup karboksil dan amina) [23]. Namun, pemasangan grup fungsional ke permukaan NP magnetit adalah proses yang memakan waktu dan tenaga kerja. Mengingat fakta ini, NP magnetik berjenis core-shell yang dilapis Au menarik karena permukaan Au dapat dengan mudah dihubungkan ke biomolekul dan bahan organik.
Terutama, properti magnetik dari NP core magnetik-lapisan Au memungkinkan pemisahan magnetik, meningkatkan resolusi dalam citra MRI, dan dapat diterapkan pada terapi hipertermia. Selain itu, properti ikatan kimia yang unggul dari emas menguntungkan untuk membangun sistem pengiriman yang diterima reseptor untuk penargetan kanker spesifik [24,25,26].
Selama beberapa dekade terakhir, banyak peneliti telah melaporkan sistem pengiriman yang diterima reseptor untuk penargetan kanker [27,28,29].
Penargetan sel kanker yang diterima reseptor adalah bentuk penargetan aktif. Pemilihan target adalah kunci untuk penargetan aktif yang efektif, dan target harus overekspresi pada membran seluler ekstraseluler. Sebagian besar peneliti telah menggunakan antibodi monoklonal untuk pengobatan kanker, dan efek terapeutik dapat ditingkatkan secara signifikan ketika terapi antibodi monoklonal digabungkan dengan kemoterapi konvensional [30]. Meskipun suksesnya terapi antibodi monoklonal, antibodi monoklonal mempresentasikan beberapa keterbatasan dalam penargetan kanker. Ukurannya yang besar (sekitar 150 kDa) adalah hambatan utama untuk penetrasi tumor [31, 32], dan stabilitas serta kelerendarannya yang rendah menghambat penggunaan yang luas [33]. Arah yang tidak homogen dari pemasangannya pada pembawa penargetan juga dianggap sebagai hambatan terhadap ikatan non-spesifik. Untuk menghasilkan antibodi dengan penetrasi tumor yang ditingkatkan, berbagai format antibedi telah dirancang dan diuji [34]. Selain antibodi klasik, format antibodi unik ada pada spesies dari keluarga Camelidae. Jadi-jadian antibodi rantai berat (HCAbs) terjadi secara alami dalam darah perifer dan susu spesies ini. Fragmen yang terikat antigen dari HCAbs tersebut terdiri dari satu domain tunggal, domain variabel rantai berat (VH) dari HCAbs kamelid (VHH). VHH, yang dihasilkan secara rekombinan setelah kloning dan ekspresi dalam bakteri atau jamur, disebut nanobody. Ini memiliki bobot molekuler 11–15 kDa dan adalah antibodi terkecil di antara semua mAb [35,36,37]. Tidak hanya ukuran kecilnya membuatnya potensial cocok sebagai sonda penargetan terhadap antigen di lokasi terisolasi, tetapi juga ujung terminal yang mudah dimodifikasinya menarik untuk aplikasi dalam penargetan kanker.
Pengiriman NP yang efisien dengan penargetan yang sesuai dan internalisasi sel juga merupakan faktor penting dalam sistem pengiriman. Telah dilaporkan bahwa vimentin berperan penting sebagai komponen jalur penyerapan patogen dan masuk seluler. Menyisihkan ekspresi gen vimentin menghambat fagositosis [38], sedangkan vimentin yang terbelah adalah sinyal yang secara signifikan meningkatkan fagositosis [39]. Oleh karena itu, menyeimbangkan resistensi fagositosis sel yang disebabkan oleh vimentin pada permukaan sel penting untuk pengiriman nanoparticle yang efisien.
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki jalur endositosis dari NP core-shell Fe3O4-Au yang ditandai nanobody dan dimodifikasi dengan spasi PEG (polyetilena glikol) dengan panjang yang berbeda. Vimentin, yang diketahui memiliki efek kuat pada fagositosis oleh eksperimen biokimia [39], dibandingkan sebagai kontrol, dan dikonfirmasi bahwa itu secara efektif bertindak pada internalisasi selular NP. Selain itu, Muc1, yang merupakan glikoprotein permukaan sel dan overekspresi dalam berbagai kanker, seperti kanker payudara, paru-paru, dan lambung, digunakan sebagai biomarkera penargetan kanker. Kami mengonfirmasi internalisasi yang efisien dari NP core-shell Fe3O4Au dan metode penargetan yang dapat dikontrol ke sel kanker melalui jalur endositosis yang diterima reseptor Muc1 dalam sel kolonik.
Bahan dan Metode
Bahan
Asetat emas (III) (Au(OOCCH3)3, 99,9%) diperoleh dari Alfa Aesar. Bahan kimia lain termasuk asetilasetonat besi (III) (Fe(acac)3, 99,9%), 1,2-heksadekanediol (C14H29CH(OH)CH2(OH), 90%), polietilena glikol-blok-polipropilena glikol-blok-polietilena glikol (PEG-PPG-PEG), dan eter oktil (C8H17OC8H17, 99%) dibeli dari Sigma-Aldrich dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. OPSS-PEG-NHS (2K, 5K, dan 10K) dibeli dari Nanoks. Bikarbonat natrium, WST-1, klorpromazin, nystatin, sitokalasin D, dynasore, brefeldin A (BFA), monensin, dan trypan blue dibeli dari Sigma-Aldrich. Cy3 dan Cy7.5 dibeli dari Lumiprobe. Anti-Muc1 Ab dibeli dari Abcam Inc. (Cambridge, MA). Larutan penyangga fosfat (PBS), medium Dulbecco’s modified Eagle’s, dan serum sapi janin dibeli dari Invitrogen Corp.
Sintesis NP Core-Shell Fe3O4-Au
NP core-shell Fe3O4-Au disintesis melalui metode nanoemulsi. Proses sintesis NP core-shell terdiri dari dua langkah: (1) pembentukan NP inti Fe3O4 dan (2) pelapisan lapisan Au pada NP magnetik. Dalam langkah pertama, NP Fe3O4 disiapkan dari larutan campuran Fe(acac)3 (0,1766 g atau 0,5 mmol), 1,2-heksadekanediol (0,6468 g atau 2,5 mmol), dan blok kopolimer (polietilena oksida-polipropilena oksida-polietilena oksida; PEO-PPO-PEO) (0,4 ~ 1,2 g) dalam eter oktil. Larutan campuran dipanaskan pada 300 °C untuk mengurangi precursor Fe. Pembentukan NP inti Fe3O4 selesai dengan mendinginkan larutan yang dipanaskan. Proses kedua dilakukan secara berkelanjutan tanpa proses pemurnian setelah terbentuknya inti magnetik. Precursor Au (0,2338 g atau 0,62 mmol) dan 1,2-heksadekanediol (0,88 g, 3,4 mmol) ditambahkan ke dalam emulsi yang terdiri dari NP Fe3O4, dan kemudian larutan campuran dipanaskan pada 230 °C. Setelah mendingin hingga suhu ruang, emulsi diendapkan dengan sentrifugasi dan NP core-shell dipisahkan.
Rantai polimerase (PCR) dilakukan menggunakan primer depan 5′-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3′ dan primer belakang 5′-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3′. Produk PCR dienkam dengan EcoRI dan XhoI dan difilter gel menggunakan QIA quick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, AS). Produk PCR yang difilter dikloning ke dalam pET-23a yang dienkam EcoRI/XhoI (Novagen, Darmstadt, Jerman). Escherichia coli (E. coli) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) ditransformasi dengan konstruksi yang dihasilkan melalui heat shock dan dipilih pada plate agar LB yang mengandung 100 μg/mL ampisilin (Duchefa Biochemie, Haarlem, Belanda).
Ekspresi dan Pemurnian Protein Rekombinan
Untuk mengekspresikan dan memurnikan protein rekombinan anti-Muc1-VHH 5-24 K10, strain E. coli BL21 (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) ditransformasi dengan pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Bakteri kemudian dibudidayakan dalam caldo LB yang mengandung ampisilin (100 μg/mL). Ekspresi protein diinduksi oleh isopropyl β-d-tiogalaktosida (IPTG) (Duchefa Biochemie, Haarlem, Belanda) pada konsentrasi akhir 0,4 mM selama 5 jam pada 37 °C. Pelet bakteri disuspendi dalam larutan lysis (50 mM NaH2PO4, pH 8,0; 300 mM NaCl) diikuti dengan sonikasi di atas es selama 10 menit. Lisat yang diiksonikasi di sentrifugasi pada 20.000×g selama 20 menit pada 4 °C dan ditampilkan pada Ni-NTA His·Bind Resin (Peptron, Daejeon, Korea). Protein ber-tag His yang terikat pada resin dielusi dengan larutan elusi (50 mM NaH2PO4, pH 8,0; 300 mM NaCl; 150 mM imidazol). Protein yang difilter dipisahkan pada gel SDS-PAGE 15%.
Modifikasi NP Core-Shell Fe3O4-Au
OPSS-PEG-NHS dengan berbagai panjang (2, 5, dan 10 K) dilarutkan dalam natrium bikarbonat 0,1 M untuk aktivasi grup tiol. OPSS-PEG-NHS yang diaktifkan ditambahkan ke dalam larutan NP core-shell Fe3O4-Au yang telah disintesis dan diaduk selama 12 jam pada 4 °C. Grup tiol dari OPSS-PEG-NHS yang diaktifkan terikat kovalen pada permukaan Au dari NP core-shell. Kemudian, larutan nanobody (0,25 mg/mL) ditambahkan ke dalam NP core-shell Fe3O4-Au yang telah di-PEGylate selama 12 jam pada 4 °C. Grup amina dari sepuluh ekor lysine (K) di ujung terikat kovalen pada grup NHS dari OPSS-PEG-NHS pada pH 8,3. Cy3 dan Cy7.5 ditandai pada grup amina sisa dari nanobody.
Kurva Internalisasi
Sel CT26 diseed pada 5 × 10³ sel per lubang pada plate 96-lubang dasar jernih dan diinkubasi dalam 250 μL medium kultur selama 24 jam pada 37 °C dalam 5% CO2 dalam kegelapan. Medium dihilangkan, dan 250 μL medium kultur segar yang mengandung 50 μg/mL NP Fe3O4-Au yang ditandai Cy3 dan NP yang ditandai PEG-Cy3 atau PEG-nanobody-Cy3 ditambahkan ke setiap lubang. Sel kemudian diinkubasi lebih lanjut untuk berbagai periode (0, 10, 20, 30, 60, 120, dan 360 menit). Sel kemudian dicuci tiga kali dengan PBS untuk menghilangkan NP bebas, dan fluoresensi setiap lubang diukur dengan trypan blue sebagai penangkal fluoresensi tidak melalui membran oleh SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, AS). Setiap eksperimen dilakukan dengan jumlah NP yang sama (50 μg/mL) dan diulang tiga kali [40].
Tes Inhibisi
Sel CT26 diseed pada 5 × 10³ sel per lubang pada plate 96-lubang dasar jernih dan diinkubasi dalam 250 μL medium selama 24 jam pada 37 °C dalam 5% CO2 dalam kegelapan. Medium dihilangkan dan 250 μL medium kultur segar yang mengandung 20 μg/mL klorpromazin (CPZ), 50 μg/mL nystatin, 20 μg/mL sitokalasin D, 25 μg/mL dynasore, 20 μg/mL BFA, 140 μg/mL monensin, atau 5 μM anti-Muc1 Ab ditambahkan, dan sel diinkubasi selama 1 jam.
Medium dihilangkan lagi, dan 250 μL medium kultur yang mengandung 50 μg/mL NP Fe3O4-Au yang ditandai Cy3, NP yang ditandai PEG-Cy3, NP yang ditandai PEG-nanobody-Cy3, atau NP yang ditandai vimentin-Cy3 ditambahkan.
Setelah 1 jam pada 37 °C dan 5% CO2, sel dicuci tiga kali dengan PBS untuk menghilangkan NP bebas, dan fluoresensi diukur dengan trypan blue sebagai penangkal fluoresensi tidak melalui membran oleh SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, AS). Setiap eksperimen dilakukan dengan jumlah NP yang sama (50 μg/mL) dan diulang empat kali.
Hasil dan Pembahasan
NP core-shell disintesis melalui metode yang diterbitkan [16, 17]. Observasi mikroskop transmisi elektron (TEM) pada Gambar 1a, b menunjukkan bahwa NP core-shell Fe3O4-Au berupa bola dengan diameter rata-rata 13,5 nm dan distribusi ukuran sempit.
Karakterisasi NP core-shell Fe3O4-Au yang telah disintesis. a, b Observasi TEM dari NP core-shell Fe3O4-Au yang telah disintesis. c, d NP dalam larutan air, sebelum dan setelah menerapkan medan magnet eksternal. e Puncak serapan UV dari NP core-shell yang telah disintesis muncul pada ~ 530 nm. f Loop histeresis magnetik dari inti Fe3O4
Peningkatan dari ~ 8,5 nm dari NP inti (Fe3O4) berasal dari pelapisan lapisan Au tebal ~ 2,5 nm pada permukaan inti, resulting in a core-shell NP. Citra TEM resolusi tinggi dengan analisis transformasi Fourier cepat (FFT) dari NP core-shell Fe3O4-Au disertakan dalam Informasi Pendamping Gambar S1.
Produk yang diproduksi dalam pelarut organik difilter menggunakan pemisahan magnetik dan dipindahkan ke dalam air.
NP core-shell terdisersi dengan baik dan stabil dalam air tanpa modifikasi permukaan, thanks to residual block co-polymers yang ada pada NP.
Gambar 1c dan d menunjukkan NP dalam larutan air sebelum dan setelah menerapkan medan magnet eksternal. Di bawah medan magnet eksternal, NP core-shell dengan cepat berubah dari dispersi homogen (Gambar 1c) menjadi larutan jernih dan transparan (Gambar 1d).
Pita serapan NP core-shell diselidiki menggunakan spektrometri UV-Vis. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1e, puncak serapan muncul pada ~ 530 nm, yang menunjukkan keberadaan Au pada permukaan NP (Informasi Pendamping Gambar S2 menyertakan hasil data EDX untuk NP core-shell Fe3O4-Au). Sebelum sampel difilter, hasil optik menunjukkan pembentukan struktur core-shell.
Loop histeresis magnetik diperoleh dari pengukuran getar sampel untuk menyelidiki properti magnetik dari inti Fe3O4 dan NP core-shell. Keduanya menunjukkan perilaku superparamagnetik dengan koersi mendekati 0 Oe pada suhu ruang (Gambar 1f).
Seperti yang dilaporkan dalam karya sebelumnya, kerentanan NP core-shell lebih tinggi daripada NP magnetit, yang mungkin sebagian disebabkan oleh efek dekat dan konfigurasi spasial unik [41, 42]. Selain itu, magnetisasi jenuh dari NP inti dan NP core-shell adalah ~ 37 emu/g dan ~ 21 emu/g pada 10 kOe, masing-masing. Perbedaan dalam Ms berasal dari keberadaan komponen non-magnetik (Au) dalam NP core-shell.
Gen VHH 5-24 K10 dikloning secara in-frame untuk menghasilkan pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 setelah amplifikasi PCR (Gambar 2a). Protein rekombinan diekspresi dalam E. coli BL21 yang ditransformasi dengan pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 setelah induksi dengan IPTG dan difilter dengan Ni-NTA His·Bind Resin. Anti-Muc1-VHH 5-24 K10 rekombinan dengan mudah diekspresi dalam E. coli sebagai protein larut 18-kDa. Dari kultur 1-L, kami mendapatkan 1 ± 0,5 mg protein rekombinan anti-Muc1-VHH 5-24 K10 yang difilter.
Ekspresi dan pemurnian protein fuersi anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Gen VHH 5-24 K10 dikloning secara in-frame untuk menghasilkan a pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 setelah b pemurnian protein fuersi Muc1-VHH 5-24 K10. Protein yang difilter dipisahkan pada gel SDS-PAGE 15%. Lorong 1 penanda protein. Lorong 2 protein yang difilter. c Ilustrasi skematik NP yang ditandai PEG-nanobody-dye yang digunakan dalam penelitian ini
Protein yang difilter diverifikasi oleh gel SDS-PAGE 15%. Pewarnaan biru Coomassie dari protein yang difilter mengungkapkan bahwa itu > 95% murni (Gambar 2b). NP Fe3O4-Au yang telah disintesis dimodifikasi dalam tiga langkah, yaitu PEGylate, tagging antibodi, dan labeling warna (Gambar 2c). Setelah setiap langkah modifikasi, potensial zeta diukur untuk mengonfirmasi modifikasi yang berhasil. Tabel 1 menunjukkan efek modifikasi pada potensial zeta yang sesuai. Potensial zeta NP core-shell polos adalah − 19,8 ± 6,68 mV. PEGylate dari NP dilakukan menggunakan OPSS-PEG-NHS. Untuk menghasilkan serangkaian nanokompleks dengan ukuran yang berbeda, OPSS-PEG-NHS dengan berbagai panjang (2 K, 5 K, dan 10 K) digunakan.
Setelah PEGylate, potensial zeta berkurang (− 44,9 ± 8,19 mV, − 40,7 ± 7,88 mV, dan − 39,6 ± 8,74 mV untuk 2 K, 5 K, dan 10 K, masing-masing).
Menariknya, setelah tagging nanobody, potensial zeta secara jelas meningkat (− 38,5 ± 5,61 mV, − 23,3 ± 8,61 mV, dan − 31,8 ± 7,37 mV untuk 2 K, 5 K, dan 10 K, masing-masing).
Setelah tagging warna, potensial zeta juga meningkat (− 12,5 ± 7,25 mV, − 17,7 ± 3,94 mV, dan − 10,6 ± 4,72 mV untuk 2, 5, dan 10 K, masing-masing).
Potensial zeta NP core-shell Fe3O4-Au polos adalah − 19,8 ± 6,68 mV. Setelah PEGylate, potensial zeta berkurang mendekati − 40 mV. Hasil ini menunjukkan bahwa molekul PEG terikat dengan baik secara kovalen pada lapisan Au dari NP core-shell karena molekul PEG memiliki grup fungsional N-hidroksisuccinimide yang bermuatan negatif. Sementara itu, potensial zeta meningkat setelah tagging warna pada nanobody (− 38,5 ± 5,61 mV untuk NP-PEG2 K-nanobody dan − 12,5 ± 7,25 mV untuk NP-PEG2 K-nanobody-dye). Hasil ini wajar karena nanobody rekombinan memiliki sepuluh ekor lysine di ujung terminal. Setiap jenis nanobody dikategorikan oleh pengukuran potensial zeta, dan untuk menentukan ikatan antibodi pada nanobody, kami mengukur fluoresensi untuk setiap jenis nanobody.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, kami mengonfirmasi bahwa semua jenis nanopartikel dan nanobody memiliki serapan selular dan internalisasi yang baik dalam ketiadaan keterbatasan inhibitor. Kurva internalisasi selular diperoleh dari sel yang diinkubasi dalam kehadiran 50 μg/mL NP Fe3O4-Au yang ditandai Cy3, NP yang ditandai PEG-Cy3, dan NP yang ditandai PEG-nanobody-Cy3 untuk periode yang berbeda (antara 0 dan 360 menit) setelah medium dihilangkan, NP basih dicuci, dan akhirnya mengukur fluoresensi total sel dengan trypan blue (Gambar 3).
Fotofluoresensi ternormalisasi dari sel mukin CT26 setelah inkubasi dengan 50 μg/mL a NP Fe3O4-Au, b NP yang telah di-PEGylate dan NP yang ditandai PEG-nanobody, dan c NP Fe3O4-Au, NP yang ditandai nanobody, dan NP yang ditandai vimentin pada 37 °C dalam 5% CO2 untuk periode yang berbeda (10, 20, 30, 60, 120, dan 360 menit)
Berdasarkan hasil pengukuran intensitas fluoresensi, kami dapat menentukan bahwa NP diinternalisasi dalam sel dalam waktu 1 jam (Gambar 3a). Intensitas fluoresensi NP mencapai maksimum dalam waktu 1 jam, dan intensitas fluoresensi secara bertasama menurun setelah mencapai kondisi stabil. Meskipun ada perbedaan waktu yang kecil tergantung pada keberadaan Ab, intensitas fluoresensi per waktu budidaya tidak secara signifikan berbeda dari hasil NP polos (Gambar 3b). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3c, dikonfirmasi bahwa efek Ab, dengan menggunakan Ab heterogen dari Muc1 dan vimentin, sangat kecil pada serapan dan internalisasi selular NP.
Dengan uji WST-1, kelangsungan hidup (%) sel mukin CT26 bergantung pada konsentrasi dan modifikasi permukaan NP core-shell Fe3O4-Au diperkirakan setelah berbagai waktu paparan (Gambar 4a, b). Kelangsungan hidup sel CT26 tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan setelah paparan 24 jam dan 48 jam, baik dengan dosis yang bervariasi atau setelah modifikasi permukaan NP. Kelangsungan hidup sel lebih dari 90% baik pada NP Fe3O4-Au polos (Gambar 4a) maupun pada NP yang telah dimodifikasi permukaannya (Gambar 4b).
Kelangsungan hidup sel mukin CT26 yang diobati dengan NP core-shell Fe3O4-Au polos dan NP Fe3O4-Au yang telah dimodifikasi permukaannya pada konsentrasi yang berbeda. a NP Fe3O4-Au dan b NP yang ditandai PEG-nanobody-Cy3. Setiap grafik eksperimen mewakili rata-rata dari serangkaian empat eksperimen yang berbeda
Gambar 5 menunjukkan bahwa NP masuk ke dalam sel mukin CT26 melalui berbagai jalur endositosis (jalur yang diterima klatrin, yang diterima kavitasi, dan jalur fagositosis/makropinokitosis). Menariknya, Gambar 5b menunjukkan bahwa anti-Muc1 Ab juga terutama mempengaruhi endositosis NP yang ditandai PEG-nanobody-Cy3. Untuk memahami jalur internalisasi NP, kami mencoba untuk menghambat jalur endositosis dengan inhibitor kimia spesifik (Gambar 5). Jalur endositosis diketahui terbagi menjadi tiga jenis: yang diterima klatrin, yang diterima kavitasi, dan makropinokitosis/fagositosis.
Fotofluoresensi ternormalisasi dari sel mukin CT26 yang diobati dengan inhibitor endositosis kimia selama 1 jam dan diinkubasi dengan 50 μg/mL a NP core-shell polos dan b NP yang ditandai nanobody pada 37 °C dalam 5% CO2 selama 30 menit. Inhibitor dengan efek statistik pada internalisasi (uji t Student, p (*) < 0,05 dan p (**) < 0,01) ditandai dengan bintang hitam
Dalam penelitian ini, inhibitor digunakan sebagai pendekatan pertama untuk menyelidiki internalisasi NP yang ditandai nanobody. CPZ (inhibitor endositosis yang diterima klatrin), nystatin (inhibitor endositosis yang diterima kavitasi), dynasore (inhibitor dinamnin), sitokalasin D (inhibitor fagositosis/makropinokitosis), BFA (penghancur aparat Golgi), monensin (inhibitor lisosom), atau anti-Muc1 Ab (kompetitor spesifik reseptor/transporter) diinkubasi dengan sel selama 1 jam. CPZ, nystatin, dynasore, dan sitokalasin D mempengaruhi endositosis NP (Gambar 5a).
Mojoritas penargetan adalah kunci kesuksesan penargetan kanker, yang sangat penting dalam terapi kanker. Untuk penargetan, modifikasi permukaan yang efektif sangat penting untuk meningkatkan efisiensi terapeutik dan membatasi efek samping. NP core-shell Fe3O4-Au yang ditandai nanobody berhasil dibuat dari NP yang telah disintesis dan nanobody rekombinan. Tabel 1 secara jelas menunjukkan bahwa setiap langkah modifikasi dilakukan dengan berhasil.
Kelangsungan hidup sel adalah salah satu elemen penting untuk aplikasi biologis nanomaterial. Kelangsungan hidup sel lebih dari 90% pada NP core-shell polos dan NP yang telah dimodifikasi (Gambar 4a, b). Hasil ini mengimplikasikan bahwa NP Fe3O4-Au polos dan NP yang telah dimodifikasi tidak menyebabkan sitotoksisitas yang signifikan yang bergantung pada konsentrasi dan modifikasi dan bahwa NP yang telah dimodifikasi cocok untuk aplikasi biologis.
Studi efisiensi internalisasi dan efek inhibitor NP memberikan informasi penting untuk memahami mekanisme melalui mana NP masuk ke dalam sel. NP yang telah di-PEGylate relatif lebih lambat diinternalisasi ke dalam sel dibandingkan dengan NP polos, tetapi NP yang ditandai nanobody diinternalisasi ke dalam sel sedikit lebih cepat daripada NP polos (Gambar 3a, b). Karena PEGylate adalah metode modifikasi permukaan yang terkenal untuk mencegah internalisasi NP, kecenderungan internalisasi NP yang telah di-PEGylate dapat dengan mudah dijelaskan. Selain itu, nanobody menginduksi endositosis NP. Untuk memeriksa spesifisitas nanobody, kami mengonfirmasi laju internalisasi NP yang ditandai antibodi vimentin. Menariknya, NP yang ditandai antibodi vimentin tidak mempromosikan internalisasi selular (Gambar 3c).
Hasil ini menunjukkan bahwa nanobody dapat secara efektif menginduksi internalisasi nanomaterial ke dalam sel mukin CT26 dan mengimplikasikan bahwa kecenderungan internalisasi dapat dikontrol dengan modifikasi spesifik dari membran luar NP. Selain itu, mekanisme endositosis NP yang ditandai nanobody ditunjukkan secara jelas melalui tes inhibisi dan citra konfokal mikroskopi. Fotofluoresensi baik NP yang ditandai nanobody maupun NP yang tidak ditandai menunjukkan nilai yang menurun serupa ketika dibudidayakan dengan CPZ, nystatin, atau dynasore (Gambar 5a, b). CPZ, nystatin, dan dynasore berperan dalam menghambat, masing-masing, endositosis yang diterima klatrin, endositosis yang diterima kavitasi, dan dinamnin, yang merupakan GTPase besar yang terlibat dalam pembentukan dan pemecahan vesikel nasab dari membran induk. Oleh karena itu, nilai fotofluoresensi dalam kedua kasus menurun dengan cepat karena dinamnin berkaitan erat dengan produksi vesikel untuk endositosis yang diterima klatrin dan yang diterima kavitasi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5a, baik NP yang tidak ditandai (Gambar 5a) maupun NP yang ditandai nanobody (Gambar 5b) menunjukkan penurunan yang cepat dalam fotofluoresensi.
Secara khusus, NP yang ditandai nanobody menampilkan nilai fotofluoresensi yang secara signifikan lebih rendah pada CPZ, nystatin, dan dynasore. Selain itu, kami mengonfirmasi bahwa NP yang tidak ditandai lebih banyak dipengaruhi daripada NP yang ditandai nanobody ketika diterapkan sitokalasin D, yang merupakan toksin yang dapat menembus sel yang mencegah polimerisasi filamen aktin untuk fagositosis [43]. Hasil ini mengimplikasikan bahwa NP yang tidak ditandai diinternalisasi melalui berbagai mekanisme seperti endositosis yang diterima klatrin, endositosis yang diterima kavitasi, dan fagositosis. Akibatnya, internalisasi selular NP yang ditandai nanobody bergantung pada endositosis yang diterima klatrin dan endositosis yang diterima kavitasi. Selain itu, jumlah serapan selular NP yang ditandai nanobody berkurang secara signifikan ketika sel dibudidayakan dengan antibodi Muc1 (Gambar 5b). Hasil ini menunjukkan bahwa antibodi Muc1 bebas berperan sebagai kompetitor nanobody pada NP yang telah dimodifikasi dalam menempel pada membran sel CT26 dan bahwa antibodi Muc1 memainkan peran penting dalam internalisasi selular NP yang telah dimodifikasi. Khususnya, NP yang ditandai antibodi vimentin menunjukkan perbedaan yang jelas dibandingkan dengan NP yang ditandai nanobody dalam hal kemampuan inhibisi. Fotofluoresensi NP yang ditandai vimentin tidak terpengaruh di bawah tes inhibisi ganda, menunjukkan bahwa NP minimal dipengaruhi oleh nystatin, dynasore, sitokalasin D, dan bahkan anti-Muc1 Ab. Fenomena ini dapat menjadi bukti keefektifan vimentin, yang telah dikonfirmasi secara biokimiawi memengaruhi fagositosis secara kuat [39]. Akibatnya, hasil ini menunjukkan bahwa anti-Muc1 Ab dapat menargetkan molekul spesifik dan dapat mengontrol endositosis spesifik.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6, hasil serupa diperoleh ketika sel diobati dengan NP core-shell polos yang ditandai Cy7.5 dan NP yang ditandai PEG-nanobody, yang menunjukkan serapan selular yang serupa dalam kedua kasus dalam ketiadaan inhibisi dynasose. Inhibisi dynasose menginduksi internalisasi selular yang secara jelas lebih rendah dari NP yang ditandai PEG-nanobody dibandingkan dengan NP polos (Gambar 6b, baris bawah). Hasil ini mengimplikasikan bahwa ada dua mekanisme endositosis, yaitu endositosis non-spesifik dari NP polos dan endositosis yang terbatas dari NP yang ditandai nanobody melalui molekul dinamnin. Setelah nanobody menempel pada membran sel eksternal, NP yang ditandai nanobody dapat dengan mudah melewati membran sel karena aktivasi bersamaan dari mekanisme yang diterima klatrin dan yang diterima kavitasi. Akibatnya, kami dapat mengasumsikan bahwa mekanisme utama adalah keduanya, endositosis yang diterima klatrin dan yang diterima kavitasi, untuk internalisasi NP yang ditandai nanobody dalam sel mukin CT26.
Citra mikroskopi konfokal dari sel mukin CT26 yang diinkubasi dengan a NP Fe3O4-Au dan b NP yang ditandai PEG-nanobody selama 1 jam pada 37 °C dalam inkubator 5% CO2, sebelum dan setelah inhibisi dynasose (1 ng/mL)
Kesimpulan
Nanomaterial untuk penargetan kanker dan pemasukan yang dapat dikontrol dari bahan eksogen seperti obat, gen, dan peptid adalah kemajuan krusial dalam aplikasi biomedis. Konsep yang familiar namun kreatif ini dapat menawarkan strategi untuk metode terapi baru. Dalam makalah ini, kami menunjukkan serapan selular yang ditingkatkan dari NP core-shell Fe3O4-Au setelah PEGylate dengan antibodi Muc1. Mekanisme endositosis utama dari NP yang ditandai nanobody telah ditunjukkan, menunjukkan kemungkinan endositosis spesifik yang dapat dikontrol dalam sel kanker kolorektal. Temuan ini memberikan wawasan tentang penargetan antara NP yang ditandai nanobody dan sel kanker kolorektal untuk mendukung desain pembawa penargetan dengan efisiensi tinggi.
Ketersediaan Data dan Bahan
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini termasuk dalam artikel yang diterbitkan ini.
