Photothermal/pH Dual-Responsive Drug Delivery System of Amino-Terminated HBP-Modified rGO and the Chemo-Photothermal Therapy on Tumor Cells
Abstrak
Dalam makalah ini, metode sederhana untuk menyiapkan grafena oksida (rGO) tereduksi hidrofilik diusulkan melalui reduksi GO oleh polimer hipercabang yang diakhiri amino (NHBP), NrGO yang disiapkan dapat menghadirkan dispersibilitas yang sangat baik, absorbansi cahaya inframerah dekat (NIR), fototermal kemampuan konversi dan stabilitas. Kemudian, doksorubisin hidroklorida (DOX) dikonjugasikan dengan NrGO untuk menyiapkan sistem pemuatan obat, dan perilaku pengiriman obat responsif ganda pH/fototermal dicirikan. Pada lingkungan asam atau di bawah iradiasi laser NIR, laju pelepasan obat dapat ditingkatkan, yang bermanfaat untuk mengontrol pelepasan obat anti tumor di jaringan tumor. Terlebih lagi, percobaan sel in vitro mengungkapkan bahwa NrGO biokompatibel dengan baik, dan di bagian penghambatan tumor, dibandingkan dengan kelompok kontrol tanpa pengobatan apa pun, DOX@NrGO memperoleh terapi sinergis kemo-fototermal yang efisien, tingkat penghambatan yang jauh lebih tinggi dari kemoterapi tunggal DOX yang dilepaskan. Oleh karena itu, DOX@NrGO yang telah disiapkan memperoleh aplikasi potensial yang besar dalam terapi tumor dan kandidat yang sangat baik dalam aplikasi biomedis lainnya.
Pengantar
Terapi fototermal (PTT) di bawah iradiasi inframerah dekat (NIR) telah menarik perhatian untuk penghambatan tumor, karena efek samping yang kecil dan sifat invasif yang minimal [1]. Cahaya NIR (700~1100 nm) menembus lebih dalam ke jaringan tubuh tanpa banyak menyerap baik kerusakan jaringan atau sel sehat [2, 3]. Jadi, di bawah iradiasi laser NIR, agen fototermal dapat menaikkan suhu di lokasi implan melalui kemampuan konversi fototermalnya. Selain itu, agen fototermal yang diterapkan memerlukan biokompatibilitas yang baik, efikasi konversi fototermal, dan stabilitas.
Untuk penelitian beberapa tahun terakhir, berbagai bahan dirancang dan disiapkan untuk menyembuhkan jaringan tumor sebagai agen PTT, seperti logam mulia (gold nanorods [4], gold nanoplates [5]), semikonduktor nanomaterial (CuS [6], MoS2 [7], FeS [8]), bahan organik (polidopamin [9], nanopartikel polipirol [10]), bahan nano karbon (karbon nanotube [11], nanopartikel karbon [12], dan graphene [13]). Sebagai jenis nanomaterial karbon yang menjanjikan, graphene banyak digunakan dalam penghambatan tumor melalui metode PTT karena nanosheet dua dimensinya yang khusus, yang memperoleh luas permukaan spesifik yang sangat tinggi dan potensi besar untuk efisiensi pemuatan obat yang tinggi [14, 15]. Namun, grafena oksida tereduksi (rGO) yang dibuat melalui metode normal termasuk urea dan hidrazin hidrat, proses hidrotermal selalu menunjukkan hidrofobisitas yang tinggi, yang tidak bermanfaat untuk aplikasi dalam fenomena air pada jaringan tubuh [16].
Dalam hal ini, kami mengusulkan ide baru untuk menggunakan polimer yang larut dalam air dengan kemampuan reduktif untuk menyiapkan rGO hidrofilik. Dalam pekerjaan kami sebelumnya, kami mensintesis polimer hyperbranched amino-terminated (NHBP) dan mencoba menggunakannya untuk merawat nanopartikel oksida logam dan menyiapkan nanosfer logam, yang sangat hidrofilik tanpa aglomerasi yang jelas, seperti nanopartikel perak yang dimodifikasi HBP dan aplikasinya dalam anti -bidang bakteri [17, 18].
Untuk meningkatkan kemampuan penghambatan tumor, obat anti tumor biasanya dimuat pada agen fototermal untuk membuat sistem yang memuat obat [19]. Di satu sisi, agen fototermal dapat menghadirkan efek PTT di bawah iradiasi laser NIR. Di sisi lain, peningkatan suhu dapat mempercepat laju penghantaran obat karena peningkatan laju pergerakan molekul. Dengan demikian, agen fototermal yang dimuati obat dapat memberikan efek terapi sinergis kemo-fototermal untuk penghambatan tumor [20, 21]. Di sini, kami menggunakan HBP yang diakhiri amino untuk menyiapkan rGO hidrofilik (NrGO, Gambar 1), dan sifat fisikokimia serta kemampuan fototermal dikarakterisasi. Setelah itu, obat anti tumor (doxorubicin, DOX) dimasukkan ke dalam NrGO, kemudian perilaku pengiriman obat dalam kondisi yang berbeda dan kemanjuran penghambatan tumor diuji secara in vitro.
Ilustrasi skema persiapan dan terapi kemo-fototermal DOX@NrGO
Metode/Eksperimental
Materi
Grafena oksida (GO, ketebalan 0,8~1,2 nm dan lebar 0,5~5 m) dipasok oleh XFNANO Co., Ltd. DOX dibeli dari HuaFeng United Technology Co., Ltd. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), tripsin, penisilin (100 U/ml) dan streptomisin (100 g/ml) semuanya dibeli dari Thermo Fisher Scientific Inc. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) dan propidium iodida (PI) diperoleh dari Beyotime Biotechnology Co., Ltd. Semua reagen lainnya dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. tanpa pemurnian lebih lanjut.
Polimer hyperbranched yang diakhiri amino disintesis sebagai pekerjaan kami sebelumnya [16]. Tetraetilenapentamin (94 ml, 0,5 mol) ditambahkan ke dalam labu alas bulat leher tiga 250 ml yang dilengkapi dengan pelindung gas nitrogen dan pengaduk magnet. Campuran reaksi diaduk dengan agitator magnetik pemanas dan didinginkan dengan penangas es, sementara larutan metil akrilat (43 ml, 0,5 mol) dalam metanol (100 ml) ditambahkan tetes demi tetes ke dalam labu. Kemudian, campuran dikeluarkan dari penangas es dan dibiarkan diaduk selama 4 jam lagi pada suhu kamar. Campuran dipindahkan ke labu berbentuk terong untuk penguapan vakum putar otomatis, dan suhu dinaikkan menjadi 150 °C menggunakan penangas minyak, dan dibiarkan selama 4 jam sampai diperoleh skala HBP kental kekuningan dengan berat rata-rata berat molekul sekitar 7759 .
Persiapan NHBP-Reduced GO (NrGO)
GO pertama kali didispersikan dalam air deionisasi dan ultrasonikasi dicampur dengan HBP yang sesuai (rasio berat GO dan NHBP adalah 1:10, 1:20, dan 1:30) selama 10 menit, terus diaduk dan direaksikan pada suhu 90 °C selama 1 jam. Kemudian, hasil (ditandai sebagai NrGO-10, NrGO-20, dan NrGO-30) disentrifugasi dan dicuci dengan air deionisasi selama tiga kali.
Persiapan NrGO yang Dimuat DOX (DOX@NrGO)
Suspensi NrGO yang telah disiapkan didispersikan dalam larutan DOX dengan rasio berat 1:1, dan terus diaduk selama 24 jam pada suhu kamar. Kemudian, larutan komposit disentrifugasi dan dicuci untuk mengumpulkan DOX@NrGO.
Pengukuran
Morfologi permukaan dikarakterisasi melalui mikroskop elektron transmisi (TEM, JEM-2100, JEOL, Jepang). Spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR, Nicolet iS10, Thermo Scientific, America) dilakukan untuk menggambarkan perubahan komponen kimia antara GO dan NrGO. Semua spektrum diukur dalam rentang panjang gelombang 400~4000 cm
−1
dengan resolusi 4 cm
−1
. Potensi permukaan dan ukuran partikel diselidiki melalui penganalisis ukuran partikel potensial Zeta (NanoBrook 90plus Zeta, Brookhaven, USA). Penyerapan NrGO di wilayah NIR dipelajari dengan UV-vis (Evolution 300, Thermo Fisher, USA) dengan rentang panjang gelombang 400~900 nm dan resolusi 1 cm
−1
.
Sifat fototermal diukur dengan menggunakan perangkat laser NIR (SFOLT Co., Ltd., Shanghai, Cina) dan termometer termokopel (DT-8891E, Shenzhen Everbest Machinery Industry Co., Ltd., Cina). Sifat fototermal NrGO diukur di bawah iradiasi laser 808 nm. Area titik laser sekitar 0,25 cm
2
, dan perubahan suhu suspensi sampel yang diuji dipantau secara real time. Di sini, air murni dan suspensi GO diterapkan sebagai kelompok kontrol:(1) air murni 0,2 ml, GO, dan suspensi NrGO (NrGO-10, NrGO-20, dan NrGO-30) dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 0,25 ml, kemudian NIR laser disinari dengan kerapatan daya 1 W/cm
2
selama 5 mnt; (2) 0.2 ml Suspensi NrGO-30 dengan konsentrasi yang berbeda (100, 200, dan 300 μg/ml) diiradiasi (1 W/cm
2
) selama 5 mnt; (3) 0.2 ml Suspensi NrGO-30 (200 μg/ml) diiradiasi dengan densitas daya yang berbeda (1, 1,5, dan 2 W/cm
2
) selama 5 mnt; (4) 0,2 ml NrGO-30 (200 μg/ml) suspensi diiradiasi (1 W/cm
2
) selama tiga siklus hidup/mati.
DOX@NrGO yang dikumpulkan dibagi menjadi tiga kelompok untuk perlakuan yang berbeda untuk menyelidiki perilaku pengiriman obat:(1) menyebar dalam larutan PBS dengan pH = 7.4, ditandai sebagai kelompok kontrol; (2) terdispersi dalam larutan PBS dengan pH = 4,0, ditandai sebagai gugus asam; (3) didispersikan dalam larutan PBS dengan pH = 7.4 dan disinari dengan laser NIR, ditandai sebagai gugus NIR. Tiga kelompok di atas (masing-masing kelompok diatur tiga paralel) dimasukkan ke dalam kantong dialisis (5 ml) dengan berat molekul cut-off 8000, dan kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dengan 20 ml larutan PBS yang sesuai. Setelah itu, semua tabung dimasukkan ke dalam shaker 37 °C dengan kecepatan 100 rpm, 10 ml larutan PBS setiap tabung diambil pada titik waktu yang telah ditentukan untuk analisis pelepasan obat, dan volume yang sama dari PBS segar yang sesuai ditambahkan kembali. Selain itu, kelompok NIR diperlakukan sebagai cahaya NIR yang disinari selama 5 menit setelah setiap titik waktu yang telah ditentukan. Semua larutan yang ditarik dianalisis dengan spektrofotometri UV-vis, dan profil pengiriman obat diperoleh.
Sitotoksisitas NrGO terhadap sel tumor (HeLa) diselidiki dengan uji MTT. Secara singkat, sel-sel HeLa disemai di pelat 96-sumur dengan kepadatan 5 × 10
3
sel per sumur dan terus diinkubasi sampai 80% sumur tertutup. Kemudian, media lama diganti dengan media baru dengan NrGO (3,125, 6,25, 12,5, 25, dan 50 g/ml), media tanpa NrGO ditetapkan sebagai kelompok kontrol. Setelah inkubasi selama 24 dan 48 jam, uji MTT digunakan untuk mengukur viabilitas sel relatif melalui Persamaan. (1):
di mana ODcontoh dan ODkontrol mewakili serapan terukur sel yang diobati dengan NrGO dalam konsentrasi dan kelompok kontrol yang berbeda.
Kemudian, terapi sinergis kemo-fototermal diselidiki melalui perawatan sel HeLa dengan DOX@NrGO (3.125, 6.25, 12.5, 25, dan 50 g/ml) di bawah iradiasi NIR. Setelah diinkubasi dengan DOX@NrGO selama 4 jam, sel HeLa diiradiasi dengan laser NIR selama 5 menit dan terus diinkubasi selama 20 jam. Setelah itu, viabilitas sel diuji melalui uji MTT lagi. Untuk pengamatan sel, sel HeLa kemudian diwarnai dengan DAPI dan PI, masing-masing, dan diamati di bawah CLSM dan mikroskop fluoresensi.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi Fisika dan Kimia
Setelah bereaksi dengan NHBP, larutan GO berubah menjadi hitam dari coklat, menunjukkan bahwa GO berhasil direduksi menjadi rGO dan terdispersi dalam air. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, b, gambar TEM dari GO dan NrGO-30 masing-masing dipamerkan, sementara tidak ada kerutan atau aglomerasi yang jelas ditemukan pada NrGO, mengungkapkan perlakuan HBP tidak akan menyebabkan perubahan morfologi apa pun pada reaksi reduksi. Berdasarkan spektrum FT-IR pada Gambar 3, kurva transmitansi NrGO-30 sangat mirip dengan NHBP. Secara signifikan, puncaknya pada 1725 cm
−1
GO menghilang setelah reaksi reduksi, yang diduga merupakan penyerapan getaran C=O dari gugus karboksi [22]. Menurut struktur molekul NHBP yang diakhiri amino, gugus amino reduktif bereaksi dengan GO dan puncak FT-IR baru dihasilkan pada 1633 cm
−1
, yang seharusnya C-N dari ikatan amido. Hasil potensial zeta disajikan pada Gambar 4, jelas, semua sampel NrGO berpotensi positif sedangkan GO negatif, menunjukkan bahwa gugus karboksi GO direaksikan dengan gugus amino dari HBP. Spektrum UV-vis-NIR (Gbr. 5) digunakan untuk menggambarkan penyerapan NIR dari NrGO; kurva sampel NrGO dengan rasio bahan baku yang berbeda menunjukkan tren yang sama dengan penyerapan tinggi di wilayah NIR, yang bermanfaat untuk aplikasi di PTT. Sedangkan larutan GO dan HBP hampir tidak menunjukkan penyerapan di wilayah NIR, menunjukkan keberhasilan fabrikasi agen fototermal dari GO dan NHBP. Selain itu, ukuran nano NrGO juga diukur (Gbr. 6), yang tidak menunjukkan perubahan nyata dengan peningkatan rasio NHBP.
Gambar TEM dari GO (a ) dan NrGO (b ). Gambar sisipan adalah foto optik sesuai dispersi sampel dengan konsentrasi 1 mg/ml
Spektrum FT-IR GO, NrGO, dan NHBP
Uji potensi Zeta sampel GO dan NrGO
Spektrum UV-vis-NIR sampel GO, HBP, dan NrGO
Pengukuran nano dari sampel NrGO
Pengukuran Sifat Fototermal
Berdasarkan NrGO yang diperoleh, sifat fototermal diselidiki di bawah iradiasi laser 808 nm. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7, kurva pemanasan air, GO, dan NrGO menunjukkan tren yang berbeda. Suhu air murni hampir tidak menunjukkan pertumbuhan, dan GO hanya naik lebih rendah dari 5 °C, sementara NrGO meningkat hingga 40 °C dan NrGO-20 dan NrGO-30 bahkan mencapai lebih tinggi dari 45 °C. NrGO dapat menyerap laser NIR untuk memicu perilaku fototermal, dan efikasi konversi fototermal ditingkatkan dengan peningkatan rasio HBP; oleh karena itu, NrGO-30 dipilih untuk menyelesaikan penyelidikan berikut. Seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 7b, c, suhu yang dicapai dinaikkan dengan konsentrasi NrGO atau peningkatan daya laser, dan faktor yang terakhir terpengaruh lebih kuat. 41–43 °C terbukti tepat dalam penghambatan sel tumor dengan sedikit efek negatif pada sel normal; dengan demikian, NrGO yang disiapkan dapat memenuhi kebutuhan PTT dalam dosis rendah dan bubuk laser. Kemudian, stabilitas fototermal diuji dan ditunjukkan pada Gambar. 7d, tidak ada perbedaan yang jelas setelah tiga siklus hidup/mati. Dengan demikian, NrGO memperoleh sifat fototermal yang bagus di wilayah NIR. Untuk mengkonfirmasi stabilitas penyerapan NrGO sebelum dan sesudah iradiasi laser NIR, spektrum UV-vis ditunjukkan pada Gambar. 8. Jelas, kurva tidak berubah setelah iradiasi NIR, mengungkapkan iradiasi NIR tidak akan mempengaruhi penyerapan NrGO.
Pengukuran sifat fototermal. a Kurva pemanasan sampel air, GO, dan NrGO (200 μg/ml) di bawah penyinaran laser 808 nm (1 W/cm
2
). b Kurva pemanasan NrGO-30 dengan konsentrasi berbeda di bawah penyinaran laser 808 nm (1 W/cm
2
). c Kurva pemanasan NrGO-30 (200 μg/ml) di bawah penyinaran laser 808 nm pada kerapatan daya yang berbeda. d Kurva perubahan suhu NrGO-30 (200 μg/ml) di bawah penyinaran laser 808 nm untuk penyinaran siklus tiga kali (1 W/cm
2
)
Spektrum UV-vis-NIR NrGO sebelum dan sesudah penyinaran laser NIR
Tes Perilaku Penyaluran Obat
Setelah DOX dimuat pada NrGO, percobaan pengiriman obat dilakukan. Karena lingkungan jaringan tumor yang agak asam, pengaruh penyinaran NIR dan pH dipelajari. Di sini, PBS dengan pH 7,4 atau 4,0 diterapkan masing-masing untuk meniru jaringan normal atau tumor. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 9, tingkat pengiriman obat jelas dipercepat di bawah pH rendah dan iradiasi NIR. Di satu sisi, gugus amino NrGO akan terionisasi di bawah nilai pH rendah, kemudian gaya tolak menolak antara DOX dan gugus amino terionisasi akan ditingkatkan di bawah kondisi pH rendah, yang mempercepat penghantaran obat dan menunjukkan sensitivitas pH. Selain itu, kelarutan DOX yang baik pada kondisi pH rendah juga dapat meningkatkan kecepatan penghantaran obat [23]. Di sisi lain, dengan iradiasi laser NIR, suhu lokal dinaikkan dan kecepatan gerak molekul dipercepat. Dengan demikian, DOX@NrGO sensitif terhadap pH/fototermal dalam perilaku penghantaran obat, yang bermanfaat untuk mengontrol laju penghantaran obat dalam jaringan tumor dan memberikan terapi sinergis kemo-fototermal.
Profil pelepasan obat in vitro DOX@NrGO dalam kondisi berbeda
Sitotoksisitas NrGO
Biokompatibilitas adalah sifat dasar yang dibutuhkan dalam biomaterial; dengan demikian, sitotoksisitas NrGO dengan konsentrasi yang berbeda pada awalnya diuji selama percobaan in vitro melalui uji MTT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 10a, hasil uji MTT 24 jam menunjukkan bahwa viabilitas sel tetap lebih dari 80% ketika konsentrasi NrGO mencapai 50 μg/ml, yang dapat membuktikan bahwa NrGO biokompatibel dengan baik dan dianggap sebagai agen PTT biokompatibel yang menjanjikan dalam tumor. penghambatan.
a Uji sitotoksisitas NrGO pada konsentrasi yang berbeda selama 24 jam dan 48 jam. b Investigasi penghambatan sel tumor DOX@NrGO dengan pengobatan berbeda
Penghambatan Sinergis DOX@NrGO pada Sel Tumor
Berdasarkan biokompatibilitas NrGO, kemanjuran penghambatan tumor DOX@NrGO dipelajari secara in vitro. Untuk menguji pengaruh perilaku fototermal, laser NIR disinari pada sel tumor yang sesuai selama 5 menit dengan kepadatan daya 0,5 W/cm
2
. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10b, ketika sel tumor diobati dengan DOX@NrGO selama 24 jam, viabilitasnya jelas menurun dengan peningkatan konsentrasi, menunjukkan bahwa DOX yang dilepaskan dapat menghambat proliferasi sel tumor. Selain itu, viabilitas menurun jauh lebih cepat ketika iradiasi NIR diterapkan juga, yang menunjukkan peningkatan suhu dan laju pelepasan DOX dapat memainkan terapi sinergis kemo-fototermal.
Setelah pewarnaan dengan DAPI, sel-sel diamati di bawah mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM), nukleus diwarnai menjadi biru dan gambar perlakuan yang berbeda masing-masing ditampilkan pada Gambar 11a-c. Sel-sel yang dikultur dengan NrGO tersebar secara berlebihan (Gbr. 11a) di piring kultur dengan jumlah yang besar, sementara jumlahnya menurun ketika diobati dengan DOX@NrGO (Gbr. 11b), mengungkapkan bahwa DOX yang dilepaskan dapat menghambat proliferasi tumor. Secara signifikan, sel tumor di wilayah paparan laser NIR dihancurkan dan terlepas secara efisien, yang mengakibatkan area gelap pada gambar (Gbr. 11c).
Gambar CLSM dari inti sel bernoda DAPI (biru) setelah diobati dengan NrGO (a ), DOX@NrGO (b ), dan DOX@NrGO+NIR (c ). (× 400)
Selain itu, PI diterapkan untuk mengamati penghambatan sel tumor setelah pengobatan sinergis kemo-fototermal, yang merupakan sejenis pewarna molekul kecil untuk menodai sel mati menjadi fluoresensi merah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar.12, sel-sel yang jarang mati (titik merah pada gambar) diamati pada Gambar.12a ketika tidak ada pengobatan yang dilakukan, sedangkan setelah pengobatan kemo-fototermal, sel tumor di luar daerah paparan menderita kerusakan DOX dan suhu tinggi untuk lebih mengurangi viabilitas sel (Gbr. 12b). Menurut hasil di atas, DOX@NrGO terbukti menjadi kandidat yang diinginkan untuk terapi tumor.
Pewarnaan PI sel tumor dengan perlakuan berbeda. a Kontrol. b DOX@NrGO+NIR
Kesimpulan
Singkatnya, NrGO hidrofilik baru dirancang dan berhasil disiapkan melalui reaksi sederhana GO dan HBP yang diakhiri amino. Karakterisasi yang bervariasi menunjukkan bahwa NrGO memperoleh sifat fototermal yang stabil dan luar biasa. Setelah pemuatan DOX, penghantaran obat menunjukkan perilaku respons ganda pH dan fototermal, yang dapat dipercepat pada nilai pH rendah dan penyinaran NIR. Selain itu, hasil percobaan sitotoksik in vitro menunjukkan bahwa NrGO yang telah dibuat memiliki biokompatibilitas yang baik. Karena keuntungannya, sel tumor dapat dihambat secara efektif berdasarkan terapi sinergis kemo-fototermal, dan NrGO yang mengandung obat antitumor memperoleh aplikasi yang menjanjikan dalam terapi tumor.
